CN104914207B - 一种裂殖壶菌藻粉中dha含量的测定方法 - Google Patents

一种裂殖壶菌藻粉中dha含量的测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104914207B
CN104914207B CN201510364991.6A CN201510364991A CN104914207B CN 104914207 B CN104914207 B CN 104914207B CN 201510364991 A CN201510364991 A CN 201510364991A CN 104914207 B CN104914207 B CN 104914207B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
schizochytrium limacinum
algae powder
fatty acid
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510364991.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104914207A (zh
Inventor
张凤枰
罗彬月
杜雪莉
刘耀敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hainan Weier Testing Technology Co ltd
Sichuan Willtest Technology Co ltd
Tongwei Agricultural Development Co Ltd
Original Assignee
Tongwei Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tongwei Co Ltd filed Critical Tongwei Co Ltd
Priority to CN201510364991.6A priority Critical patent/CN104914207B/zh
Publication of CN104914207A publication Critical patent/CN104914207A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104914207B publication Critical patent/CN104914207B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，所述的测定方法包括：准备标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，以十三烷酸内标溶液为内标物，对加入有内标物的裂殖壶菌藻粉样品提前油脂、皂化、甲酯化后制备得到供试品溶液，使用气相色谱仪进行检测，测定结果以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，并按内标法计算各脂肪酸的含量，具有样品处理简单，操作简便、快速的特性，测定结果重现性好、可行度高，并为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供了检测方法依据。

Description

一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法
技术领域
本发明是一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，具体涉及裂殖壶菌中不饱和脂肪酸DHA的定量测定，属于不饱和脂肪酸的检测技术领域。
背景技术
脂肪酸是细胞的重要组成部分，不仅为细胞活动提供能量，含有3～5个双建的多不饱和脂肪酸还是***素和白细胞三烯的合成前体，据研究表明，α-亚麻酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等n-3多不饱和脂肪酸还具有抗发炎、抗血栓、抗心律失常、降血脂和软化血管等作用。n-3 多不饱和脂肪酸的主要来源有植物油，例如：例如: 菠菜、马齿苋、亚麻的种子、亚麻仁以及胡桃等， 其中以亚麻籽油中含α- 亚麻酸(高达57%) 最多， 其次是菜籽油、大豆油和小麦胚芽油( 7%～13%) ；其他来源包括一些坚果、种子、蔬菜和水果、蛋黄、禽肉，其中，鱼类是主要的EPA和DHA 来源；除此之外，海洋微生物以及一些藻类植物也是多不饱和脂肪酸的良好来源，裂殖壶菌即是其中一种。
裂殖壶菌（Schizochytrium）作为一类藻类的海洋真菌，该菌易培养、生长快，已实现工业化生产，其细胞内积累了大量的油脂，90% 以上油脂以人体易吸收的甘油三脂（TG）形式存在，不饱和脂肪酸含量很高，主要为DHA，其它多不饱和脂肪酸含量很低。毒性3+试验证明使用裂殖壶菌作为食品添加剂饲喂大鼠、兔和猪是安全可靠的，其安全性已得到美国FDA的认可。目前，壶菌藻粉作为一种理想的 DHA 新生资源，已广泛应用于食品、药品和保健品。国内外公开报道裂殖壶菌藻粉文献较多，大多集中在裂殖壶菌的工业化生产、油脂提取、营养成分分析等，如《裂殖壶菌DHA提取方法的优化和工业化应用》（南京科技大学，硕士论文，dingweicui，2012.05）记载的对微生物油脂的提取方法，和《富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研究》（中国海洋大学，博士学位论文，宋晓金，2008.06.01）记载的工业化生产及脂肪酸的提取技术，但关于裂殖壶菌藻粉中DHA的定量测定，尚未见公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，该测定方法是对裂殖壶菌藻粉中提取的油脂进行的气相色谱检测，使用气相色谱内标法定量测定油脂中的脂肪酸含量，具有样品处理简单，操作简便、快速的特性，测定结果重现性好、可行度高，并为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供了检测方法依据。
本发明通过下述技术方案实现：一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，所述的测定方法包括以下步骤：
A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入内标物和盐酸，混合后提取油脂，所述的内标物为十三烷酸内标溶液，所述的标准溶液选用Supelco37种脂肪酸甲酯混合标准溶液，其浓度为10 mg/mL；
B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在脂肪酸甲酯溶液中加入异辛烷和饱和NaCl溶液，经混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用；
C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：
色谱柱：石英毛细管柱，
柱温：60～240℃，
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250～270℃，
汽化室温度：240～260℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速0.8～1.2mL/min，空气流速300～400mL/min，氢气流速30～40mL/min，
分流比：（5～20）：1。
本发明方法操作简便、快速、重复性好，适合于批量裂殖壶菌藻粉样品脂肪酸的定量测定。裂殖壶菌藻粉样品中的油脂提取后，经皂化、甲酯化后衍生为相应的脂肪酸甲酯，制备成供试品溶液后，以石英毛细管柱分离，氢火焰离子化检测器测定，以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，按内标法计算各脂肪酸的含量，测定结果表明，在本发明涉及的色谱条件下，37种脂肪酸甲酯在65 min内均获得较好的分离。
在本发明中，内标物选用浓度为10.0 mg/mL的十三烷酸内标溶液，具有测定结果重现性好、可信度高等良好的使用效果，当然，为提高内标物的使用效果，在所述的步骤A中，所述盐酸的浓度为4 mol/L，所述裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的质量比为（0.2～0.8）：（4～6）：（4～6）。
在所述的步骤A中，油脂的提取包括：
A.1：将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡、沸水浴加热和速冷降温后，制得样品溶液，盐酸浓度为4mol/mL，通常使用漩涡混匀1min后，再送至水槽进行恒温振荡；
A.2：在步骤A.1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的三氯甲烷—甲醇混合溶剂，混合均匀后进行离心操作，取氯仿层备用；
A.2：在步骤A.2制得的氯仿层加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操作，取氯仿层，移至干燥瓶中旋转蒸发，蒸发后得到油脂。
在所述的步骤A.1中，恒温振荡时，温度控制在50～70℃，振荡30～50min，振荡频率80～120次/min；沸水浴的加热时间为4～6min；使用-10～-30℃的温度进行速冷降温。
所述离心操作的时间控制在8～12次/min，转速控制在4000～6000r/min。
在所述的步骤B中，脂肪酸甲酯溶液的制备包括：
B.1：皂化，在步骤A提取的油脂中加入0.5 mol/L的氢氧化钾—甲醇，充N2，水浴加热并回流；
B.2：甲酯化：回流8～12min后，加入13～15%的三氟化硼-甲醇，水浴加热并回流15～30min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
皂化反应方式式如下：
甲酯化反应方程式如下：
制得的脂肪酸甲酯溶液为二十二碳六烯酸甲酯，其结构式为：
在所述的步骤B中，异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和NaCl溶液，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为（40～60）：（40～60）：（15～30），加入异辛烷的目的是：异辛烷作为弱极性溶剂，经过涡旋混合，待测的二十二碳六烯酸甲酯（DHA）全部从KOH-三氟化硼-甲醇混合溶液中转移到异辛烷中；加入饱和NaCl溶液目的是：为了使异辛烷溶液与 KOH-三氟化硼-甲醇-水混合溶液完全分层，在实现上述过程时，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的使用量应按照上述质量比范围严格操作，才能保证操作过程的顺利进行。
在所述的步骤C中，气相色谱仪的测定条件中，色谱柱的初始温度为60 ℃，以4℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃，其目的是：通过程序升温，保证裂殖壶菌藻粉脂肪酸分离度完全满足定量测定需要。
进一步的，所述气相色谱仪的测定条件中：
色谱柱为Supelco SPTM-2560石英毛细管柱，100 m×0.25 mm i.d.×0.20 μm；
检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为260℃；
汽化室温度：250℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速1.0mL/min，空气流速350mL/min，氢气流速35mL/min；
柱流速：1.0 mL/min；
尾吹流速：40 mL/min；
分流比：10：1。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明是以十三烷酸为内标物，采用气相色谱定量测定裂殖壶菌藻粉中的脂肪酸（DHA）的检测方法，测定结果以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，并按内标法计算各脂肪酸的含量，具有样品处理简单，操作简便、快速的特性，测定结果重现性好、可行度高，并为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供了检测方法依据。
（2）本发明选择十三烷酸作为内标物，十三烷酸（CH3(CH2)11CO2H，分子量 214.34）是一种直链脂肪酸， 其结构与裂殖壶菌藻粉中C16:0、C22:6（DHA）相似，且在所选定的色谱条件下，十三烷酸与C16:0、C22:6得到完全分离，且商品化的十三烷酸纯度可达98%以上；另一方面，在裂殖壶菌藻粉油脂提取过程就加入十三烷酸作为内标，可保证内标物与DHA完成同样的前处理过程，即酸热法提取-皂化-甲酯化，从而保证DHA测定结果的准确性。
（3）本发明使用酸热法对裂殖壶菌藻粉中的油脂进行提取，利用盐酸的加入，保证了裂殖壶菌藻粉样品溶液在水浴中振荡后，使原来结构紧密的细胞壁变得疏松，再经沸水浴及速冻降温处理后，使细胞壁进一步的被破坏，有利于细胞壁中糖、蛋白质、油脂等成分的析出，再用极性较强的三氯甲烷-甲醇混合溶剂进一步有效地浸提出裂殖壶菌藻粉细胞中的油脂，操作简单、快速。
（4）本发明在对油脂进行皂化、甲酯化反应的过程中，需要在反应容器中充入N2，目的是保护脂肪酸，避免氧气进入，保证皂化、甲酯化反应的正常进行，N2冲入时要保证把反应容器中的空气全部排出，替换为N2，充入时间大概持续1 min，反应容器连接冷凝器，便于水浴加热过程中的蒸发的试剂回流。
（5）本发明使用的色谱柱为石英毛细管柱，如：SPTM-2560毛细管柱，可最大限度分离裂殖壶菌藻粉脂肪酸及其异构体，从而保证DHA测定结果的准确性，测定结果表明，本发明方法对37种脂肪酸甲酯在65 min内均获得较好的分离。
（6）经过本发明色谱条件的选择发现，本发明对4种主要脂肪酸的峰面积与其质量浓度均有良好的线性关系，相关系数均大于0.998；加标回收率（n=6）为91.0～105.3%，相对标准偏差为2.20～3.57 %；最低定量限（S/N=10）为2.0 mg/kg。
（7）本发明裂殖壶菌藻粉样品的使用量与内标物和盐酸的使用量存在密切的关系，首先，内标物的加入量要与裂殖壶菌藻粉样品的量存在一定的对应关系，以保证添加的内标质量与待测样品所含的DHA质量接近，提高检测结果的准确性；其次，盐酸的加入量要保证裂殖壶菌藻粉水解完全，在这里，样品量增加与盐酸的加入量呈正比，以保证裂殖壶菌藻粉水解完全，以保证DHA测定结果的准确性和可信度，因此，在实际操作过程中，为提高检测结果的准确性，裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸（4 mol/L）的质量比控制在（0.2～0.8）：（4～6）：（4～6）。
附图说明
图1为本发明37种脂肪酸甲酯混合标准溶液出峰顺序图。
图2为本发明未加内标物时供试品溶液的色谱图。
图3为本发明供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明是对裂殖壶菌藻粉中DHA的含量提出的使用气相色谱仪进行检测的测定方法，检测对象选择裂殖壶菌藻粉，它与现有技术中如《裂殖壶菌DHA提取方法的优化和工业化应用》和《富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研究》中涉及的试验对象不同，现有技术选择的试验对象是裂殖壶菌，属于真菌门（Eumycota）、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。裂殖壶菌藻粉，即裂殖壶菌干粉，成分大致为脂质55%，DHA（C22:6n-3) 20%，C16:0 20%，其它脂肪酸含量低，该菌可通过异养繁殖生产，该产品生产不受季节影响，无毒物污染，成分稳定；且全面面临鱼油供应紧缺，其被认为是一种极具实现工业化生产DHA潜力的微生物，同时，裂殖壶菌藻粉也是一种理想的 DHA新生资源，已广泛应用于食品、药品和保健品。因此，基于目前对裂殖壶菌藻粉中DHA的相关报道较少，而裂殖壶菌藻粉的应用已广泛普及的情况，本发明提出了一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，旨在为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供检测方法的依据。
本发明方法作为裂殖壶菌藻粉DHA质量控制的检测依据，还满足以下条件：
（1）样品处理过程简单、操作程序简捷；
（2）测定结果重现性好、准确度和可行度较高；
（3）适合批量裂殖壶菌藻粉样品脂肪酸的定量测定；
（4）检测效率高，能满足37种脂肪酸甲酯获得较好的分离。
以下是对本发明技术方案的进一步描述：
本发明所涉及的检测方法是使用气相色谱法对裂殖壶菌藻粉中提取的油脂进行的定量检测，标准溶液选择Supelco 37种脂肪酸甲酯混合标准溶液（浓度为10 mg/mL），裂殖壶菌藻粉样品作为检测对象，测定过程中，选择十三烷酸内标溶液作为内标物，内标物在裂殖壶菌藻粉油脂提取过程中加入，可以保证内标物与DHA完成同样的前处理过程，即酸热法提取油脂—皂化—甲酯化—供试品溶液，从而保证了DHA测定结果的准备性。
使用气相色谱仪进行检测时，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，检测条件满足：
色谱柱：石英毛细管柱，如：SPTM-2560毛细管柱，
柱温：60～240℃，
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250～270℃，
汽化室温度：240～260℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速0.8～1.2mL/min，空气流速300～400mL/min，氢气流速30～40mL/min，
分流比：（5～20）：1。
由上述检测条件可知，本发明以SPTM-2560毛细管柱分离，氢火焰离子化检测器测定，以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，按内标法计算各脂肪酸的含量。检测结果表明，在上述色谱条件下，37种脂肪酸甲酯在65 min内获得较好的分离，其中，4种主要脂肪酸的峰面积与其质量浓度有良好的线性关系，相关系数均大于0.998；加标回收率（n=6）为91.0～105.3%，相对标准偏差为2.20～3.57 %；最低定量限（S/N=10）为2.0mg/kg。
为验证上述结果，现按照上述质谱检测条件，分别以标准溶液、未加内标物的供试品溶液、加内标物的供试品溶液进样检测，进样量均为1μL，其中，如图1为37种脂肪酸甲酯混合标准溶液出峰顺序图，图1中，1.C4:0；2.C6:0；3.C8:0；4.C10:0；5.C11:0；6.C12:0；7.C13:0；8.C14:0；9.C14:1；10.C15:0；11.C15:1；12.C16:0；13.C16:1；14.C17:0；15.C17:1；16.C18:0；17.C18:1n9t；18.C18:1n9c；19.C18:2n6t；20.C18:2n6c；21.C20:0；22 .C18:3n6；23.C20:1；24.C18:3n3；25.C21:0；26.C20:2；27.C22:0；28.C20:3n6；29.C22:1n9；30.C20:3n3；31.C20:4 n6；32.C23:0；33.C22:2；34.C24:0；35.C20:5n3；36.C24:1；37.C22:6n3。图2为未加内标物供试品溶液的色谱图，图2中，2.C14:0；3.C14:1；4.C15:0；5.C16:0；6.C16:1；7.C17:0；8.C18:0；9.C18:1n9t；10.C18:1n9c；11.C20:0；12.C22:1n9；13.C20:3n3；14.C22:2；15.C20:5n3；16.C22:6n6；17.C22:6n3。图3为加内标物供试品溶液的色谱图，图3中，1.C13:0；2.C14:0；3.C14:1；4.C15:0；5.C16:0；6.C16:1；7.C17:0；8.C18:0；9.C18:1n9t；10.C18:1n9c；11.C20:0；12.C22:1n9；13.C20:3n3；14.C22:2；15.C20:5n3；16.C22:6n6；17.C22:6n3。
下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，当然，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1：
本实施例涉及的测定方法具有以下步骤：
A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入十三烷酸内标溶液和盐酸，混合后提取油脂；
B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在脂肪酸甲酯溶液中加入异辛烷和饱和NaCl溶液，经混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用；
C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：
色谱柱：石英毛细管柱，
柱温：60℃，
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250℃，
汽化室温度：240℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速0.8mL/min，空气流速300mL/min，氢气流速30mL/min，
分流比：5：1。
实施例2：
本实施例与实施例1的区别在于：在步骤A中，盐酸的浓度为4 mol/L，裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的质量比为0.2：4：4。
实施例3：
本实施例与实施例1的区别在于：在步骤A中，盐酸的浓度为4 mol/L，裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的质量比为0.8：6：6。
实施例4：
本实施例与实施例1的区别在于：在步骤A中，油脂的提取包括：
A.1：将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡（温度控制在50℃，振荡30min，振荡频率80次/min）、沸水浴加热（4min）和-10℃速冷降温后，制得样品溶液，其中，恒温振荡时；
A.2：在步骤A.1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的三氯甲烷—甲醇混合溶剂，混合均匀后进行离心操作（控制条件为：8次/min，4000r/min），取氯仿层备用；
A.3：在步骤A.2制得的氯仿层加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操作（控制条件为：8次/min，4000r/min），取氯仿层，蒸发后得到油脂。
实施例5：
本实施例与实施例4的区别在于：在本实施涉及的步A中，恒温振荡时的温度控制在70℃，振荡50min，振荡频率120次/min；沸水浴的加热时间为6min；使用--30℃的温度进行速冷降温。
步骤A.2中的离心操作控制在12次/min，转速控制在6000r/min；步骤A.3中的离心操作控制在12次/min，转速控制在6000r/min。
实施例6：
本实施例与实施例1的区别在于：在本实施例涉及的步骤B中，脂肪酸甲酯溶液的制备包括：
B.1：皂化，在步骤A提取的油脂中加入0.5 mol/L的氢氧化钾—甲醇，充N2，水浴加热并回流；
B.2：甲酯化：回流8～12min后，加入13%的三氟化硼-甲醇，水浴加热并回流15min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
实施例7：
本实施例与实施例6的区别在于：在本实施例涉及的步骤B中，异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和NaCl溶液，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为40：40：15。
实施例8：
本实施例与实施例6的区别在于：在本实施例涉及的步骤B中，异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和NaCl溶液，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为60：60：30。
实施例9：
本实施例与实施例1的区别在于：在本实施例涉及的步骤C中，气相色谱仪的测定条件中，色谱柱的温度变化为：初始温度为60 ℃，以4 ℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃。
实施例10：
本实施例与实施例9的区别在于：在本实施例中，气相色谱仪的测定条件满足：
色谱柱为Supelco SPTM-2560石英毛细管柱；
检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为260℃；
汽化室温度：250℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速1.0mL/min，空气流速350mL/min，氢气流速35mL/min；
柱流速：1.0 mL/min；
尾吹流速：40 mL/min；
分流比：10：1。
实施例11：
本实施例涉及的测定方法具有以下步骤：
A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入十三烷酸内标溶液和盐酸，并按一下步骤提取油脂：
A.1：将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡（温度控制在60℃，振荡40min，振荡频率100次/min）、沸水浴加热（5min）和-20℃速冷降温后，制得样品溶液，其中，恒温振荡时，；
A.2：在步骤A.1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的三氯甲烷—甲醇混合溶剂，混合均匀后进行离心操作（控制条件为：10次/min，5000r/min），取氯仿层备用；
A.3：在步骤A.2制得的氯仿层加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操作（控制条件为：10次/min，5000r/min），取氯仿层，蒸发后得到油脂。
B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂按以下步骤制备脂肪酸甲酯溶液：
B.1：皂化，在步骤A提取的油脂中加入0.5 mol/L的氢氧化钾—甲醇，充N2，水浴加热并回流；
B.2：甲酯化：回流10min后，加入15%的三氟化硼-甲醇，水浴加热并回流25min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
将异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和NaCl溶液，将上述溶液混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为50：55：22。
C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：
色谱柱：Supelco SPTM-2560石英毛细管柱，
柱温：初始温度为60 ℃，以4 ℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃；
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：270℃，
汽化室温度：260℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速1.0mL/min，空气流速350mL/min，氢气流速35mL/min，
分流比：20：1。
实施例12：
本实施例涉及的测定方法具有以下步骤：
A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入十三烷酸内标溶液和盐酸，并按一下步骤提取油脂：
A.1：将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡（温度控制在55℃，振荡45min，振荡频率110次/min）、沸水浴加热（5min）和-20℃速冷降温后，制得样品溶液，其中，恒温振荡时，；
A.2：在步骤A.1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的三氯甲烷—甲醇混合溶剂，混合均匀后进行离心操作（控制条件为：10次/min，4500r/min），取氯仿层备用；
A.3：在步骤A.2制得的氯仿层加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操作（控制条件为：10次/min，6000r/min），取氯仿层，蒸发后得到油脂。
B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂按以下步骤制备脂肪酸甲酯溶液：
B.1：皂化，在步骤A提取的油脂中加入0.5 mol/L的氢氧化钾—甲醇，充N2，水浴加热并回流；
B.2：甲酯化：回流12min后，加入14%的三氟化硼-甲醇，水浴加热并回流25min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
将异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和NaCl溶液，将上述溶液混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为55：40：20。
C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：
色谱柱：Supelco SPTM-2560石英毛细管柱，
柱温：初始温度为60 ℃，以4 ℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃；
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：260℃，
汽化室温度：250℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速1.2mL/min，空气流速400mL/min，氢气流速40mL/min，
分流比：15：1。
实施例13：
本实施例涉及的测定方法具有以下步骤：
A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入十三烷酸内标溶液和盐酸，并按一下步骤提取油脂：
A.1：将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡（温度控制在60℃，振荡35min，振荡频率95次/min）、沸水浴加热（4min）和-25℃速冷降温后，制得样品溶液，其中，恒温振荡时，；
A.2：在步骤A.1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的三氯甲烷—甲醇混合溶剂，混合均匀后进行离心操作（控制条件为：11次/min，6000r/min），取氯仿层备用；
A.3：在步骤A.2制得的氯仿层加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操作（控制条件为：11次/min，4000r/min），取氯仿层，蒸发后得到油脂。
B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂按以下步骤制备脂肪酸甲酯溶液：
B.1：皂化，在步骤A提取的油脂中加入0.5 mol/L的氢氧化钾—甲醇，充N2，水浴加热并回流；
B.2：甲酯化：回流10min后，加入14%的三氟化硼-甲醇，水浴加热并回流26min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
将异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和NaCl溶液，将上述溶液混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为44：55：22。
C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：
色谱柱：Supelco SPTM-2560石英毛细管柱，
柱温：初始温度为60 ℃，以4 ℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃；
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：265℃，
汽化室温度：255℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速0.9mL/min，空气流速330mL/min，氢气流速36mL/min，
分流比：18：1。
实施例14：
本实施例涉及的测定方法具有以下步骤：
备样：准确称取裂殖壶菌藻粉样品0.5g（精确至0.0001 g），置50 mL离心管中，准确加入10.0 mg/mL十三烷酸内标溶液0. 5 mL、4 mol/L盐酸6 mL，漩涡混匀1 min，置于60℃恒温振荡水槽，100次/mi n振荡30 min，沸水浴煮5 min，-20℃速冷后加入20 mL三氯甲烷-甲醇（1:1）混合溶剂，漩涡混匀2 min，5000 r/min离心10 min，取氯仿层，加等体积的0.1%氯化钠溶液，混匀，5 000 r/min离心10 min，取氯仿层移至干燥的250 mL三角瓶中，旋转蒸发除去氯仿，得到油脂。
制备供试品溶液：将所得油脂加入10 mL 0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇，充N2，连接冷凝器，置于水浴上回流10 min后立即加入7 mL 13~15%三氟化硼-甲醇于沸腾的溶液中，继续煮沸，回流20 min。加入50 mL异辛烷于沸腾的混合溶液中，停止加热，加入20 mL饱和NaCl溶液，在漩涡混合器上混合1 min，静置分层，移取4～5 mL上清液至10 mL具塞试管中，加入适量无水Na2SO4脱水，移取1 mL脱水试液作为供试液备用。
测定：分别移取等量的供试品溶液和Supelco 37种脂肪酸甲酯混合标准溶液（10mg/mL）1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：
色谱柱：Supelco SPTM-2560石英毛细管柱，
柱温：初始温度为60 ℃，以4 ℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃；
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：260℃，
汽化室温度：250℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速1.1mL/min，空气流速360mL/min，氢气流速36mL/min，
分流比：8：1。
实施例15：
本实施例与实施例14的区别在于：本实施例涉及的测定条件包括：
色谱柱：Supelco SPTM-2560石英毛细管柱，
柱温：初始温度为60 ℃，以4 ℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃；
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：255℃，
汽化室温度：250℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速0.8mL/min，空气流速400mL/min，氢气流速35mL/min，
分流比：12：1。
实施例16：
本实施例与实施例14的区别在于：本实施例涉及的测定条件包括：
色谱柱：Supelco SPTM-2560石英毛细管柱，
柱温：初始温度为60 ℃，以4 ℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃；
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：270℃，
汽化室温度：255℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速1.0mL/min，空气流速320mL/min，氢气流速40mL/min，
分流比：15：1。
上述实施例1～16中以等量的裂殖壶菌藻粉样品为检测对象，对其气相色谱检测结果进行分析和计算，以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，按内标法计算各脂肪酸的含量，计算各脂肪酸的校正因子，分别测定4批裂殖壶菌藻粉样品的各种脂肪酸含量，结果见表1。
表1 裂殖壶菌藻粉样品的测定结果表（mg/100g）
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，其特征在于：所述的测定方法包括以下步骤：
A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入内标物和盐酸，混合后提取油脂，所述的内标物为十三烷酸内标溶液；
B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在脂肪酸甲酯溶液中加入异辛烷和饱和NaCl溶液，经混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用；
C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：
色谱柱：石英毛细管柱，
柱温：初始温度为60 ℃，以4 ℃／min升至160 ℃后，再以2 ℃／min升至240 ℃，
检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250～270℃，
汽化室温度：240～260℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速0.8～1.2mL/min，空气流速300～400mL/min，氢气流速30～40mL/min，
分流比：（5～20）：1,
在所述的步骤A中，所述盐酸的浓度为4 mol/L，所述裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的质量比为（0.2～0.8）：（4～6）：（4～6），
在所述的步骤A中，油脂的提取包括：
A.1：将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡、沸水浴加热和速冷降温后，制得样品溶液；
A.2：在步骤A.1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的三氯甲烷—甲醇混合溶剂，混合均匀后进行离心操作，取氯仿层备用；
A.3：在步骤A.2制得的氯仿层加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操作，取氯仿层，蒸发后得到油脂。
2.根据权利要求1所述的一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，其特征在于：在所述的步骤A.1中，恒温振荡时，温度控制在50～70℃，振荡30～50min，振荡频率80～120次/min；沸水浴的加热时间为4～6min；使用-10～-30℃的温度进行速冷降温。
3.根据权利要求1所述的一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，其特征在于：在所述步骤A.2、A.3中，所述离心操作的时间控制在8～12次/min，转速控制在4000～6000r/min。
4.根据权利要求1所述的一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，其特征在于：在所述的步骤B中，脂肪酸甲酯溶液的制备包括：
B.1：皂化，在步骤A提取的油脂中加入0.5 mol/L的氢氧化钾—甲醇，充N2，水浴加热并回流；
B.2：甲酯化：回流8～12min后，加入13～15%的三氟化硼-甲醇，水浴加热并回流15～30min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
5.根据权利要求4所述的一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，其特征在于：在所述的步骤B中，异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和NaCl溶液，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为（40～60）：（40～60）：（15～30）。
6.根据权利要求1所述的一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，其特征在于：所述气相色谱仪的测定条件中：
色谱柱为Supelco SPTM-2560石英毛细管柱；
检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为260℃；
汽化室温度：250℃；
气体流量：载气为高纯氮，流速1.0mL/min，空气流速350mL/min，氢气流速35mL/min；
柱流速：1.0 mL/min；
尾吹流速：40 mL/min；
分流比：10：1。
CN201510364991.6A 2015-06-29 2015-06-29 一种裂殖壶菌藻粉中dha含量的测定方法 Active CN104914207B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510364991.6A CN104914207B (zh) 2015-06-29 2015-06-29 一种裂殖壶菌藻粉中dha含量的测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510364991.6A CN104914207B (zh) 2015-06-29 2015-06-29 一种裂殖壶菌藻粉中dha含量的测定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104914207A CN104914207A (zh) 2015-09-16
CN104914207B true CN104914207B (zh) 2017-03-15

Family

ID=54083455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510364991.6A Active CN104914207B (zh) 2015-06-29 2015-06-29 一种裂殖壶菌藻粉中dha含量的测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104914207B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107957454A (zh) * 2017-10-23 2018-04-24 广西壮族自治区食品药品检验所 一种乳酶生菌种中脂肪酸组分的检测方法及应用
CN110903897A (zh) * 2019-12-27 2020-03-24 沈兰兰 一种从衣藻提取油脂的方法
CN114689704B (zh) * 2020-12-26 2023-05-09 四川汇宇制药股份有限公司 1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001051598A1 (en) * 2000-01-11 2001-07-19 Monsanto Technology Llc Process for making an enriched mixture of polyunsaturated fatty acid esters
WO2002092540A1 (en) * 2001-05-14 2002-11-21 Martek Biosciences Corporation Production and use of a polar lipid-rich fraction containing omega-3 and/or omega-6 highly unsatruated fatty acids from microbes, genetically modified plant seeds and marine organisms
US20090197955A1 (en) * 2008-01-31 2009-08-06 Monsanto Company Methods of improving dha deposition and related function and/or development
CN103604891B (zh) * 2013-11-27 2015-12-30 青岛旭能生物工程有限责任公司 一种生物质材料油脂的提取方法及其应用
CN104498371A (zh) * 2014-12-31 2015-04-08 浙江工业大学 裂殖壶菌ylh70及其合成dha的应用
CN104593270B (zh) * 2015-01-24 2019-06-21 温州大学 一株裂殖壶菌及粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104914207A (zh) 2015-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dobarganes et al. High performance size exclusion chromatography of polar compounds in heated and non‐heated fats
CN101532991B (zh) 一种海洋微藻脂肪酸含量快速检测方法
Han et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis
CN104914207B (zh) 一种裂殖壶菌藻粉中dha含量的测定方法
Zheng et al. Purification of extracted fatty acids from the microalgae Spirulina
Suo et al. Extraction of Nitraria tangutorum seed lipid using different extraction methods and analysis of its fatty acids by HPLC fluorescence detection and on‐line MS identification
Zhao et al. Detection of adulterated vegetable oils containing waste cooking oils based on the contents and ratios of cholesterol, β-sitosterol, and campesterol by gas chromatography/mass spectrometry
CN105738513B (zh) 一种检测原料乳中脂肪酸相对含量的方法
CN103305332B (zh) 干法偶联溶剂法分提富集1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的方法
Zhang et al. Study on the fatty acids, aromatic compounds and shelf life of Paeonia ludlowii kernel oil
CN109001330A (zh) 一种基于指纹图谱的天然鱼肝油掺假鉴定方法
CN105241968B (zh) 一种快速检测全血红细胞脂肪酸的方法
Hamano et al. Quantification of Fatty Acids in Mammalian Tissues by Gas Chromatography–Hydrogen Flame Ionization Detection
CN106770277A (zh) 巴戟天定性定量中药饮片的质量标准与制造工艺
CN106645478A (zh) 油菜籽中挥发性风味成分的萃取检测方法
CN106442797A (zh) 一种食品中脂肪酸的检测方法
Putriasih et al. The Comparison Extraction Methods of Crude Fat Content and Fatty Acid Profile of Eels (Anguilla marmorata (Q.) Gaimard) from Lake Poso
CN106957726A (zh) 一种高效提取土壤中微生物磷脂脂肪酸的方法
CN110749684A (zh) 一种酵素中有机酸的快速检测方法
CN105158388B (zh) 一种快速检测全血红细胞二十四烷酸的方法
CN105241969B (zh) 一种快速检测全血红细胞二十二烷四烯酸的方法
Wang et al. Extraction of pollen lipids by SFE‐CO2 and determination of free fatty acids by HPLC
CN106198798A (zh) 一种胆固醇含量的检测方法
CN105158363B (zh) 一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法
Bitner et al. Alkali isomerization—Gas chromatography with the microreactor apparatus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20170322

Address after: 610000 Chengdu province high tech Zone Road, building No. 5, building 2, No.

Patentee after: SICHUAN WILLTEST TECHNOLOGY CO.,LTD.

Patentee after: TONGWEI Co.,Ltd.

Patentee after: HAINAN WEIER TESTING TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 610041 high tech Zone, Sichuan Province, the South Ring Road, No. two, No. four, No. 11

Patentee before: TONGWEI Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20231129

Address after: 610000 Chengdu hi tech Zone, Chengdu, Sichuan Province, No. 5 Building

Patentee after: SICHUAN WILLTEST TECHNOLOGY CO.,LTD.

Patentee after: Tongwei Agricultural Development Co.,Ltd.

Patentee after: HAINAN WEIER TESTING TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 610000 Chengdu hi tech Zone, Chengdu, Sichuan Province, No. 5 Building

Patentee before: SICHUAN WILLTEST TECHNOLOGY CO.,LTD.

Patentee before: TONGWEI Co.,Ltd.

Patentee before: HAINAN WEIER TESTING TECHNOLOGY Co.,Ltd.