CN104911213A - 以固体形式发酵生产非挥发性微生物代谢物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过基于糖的微生物发酵以固体形式生产至少一种非挥发性微生物代谢物的方法。此外,本发明还涉及通过本发明的方法可得到的非挥发性微生物代谢物的固体制剂;以及此类固体制剂作为人类或动物食物的添加剂或增补剂的用途或者用于处理纺织品、皮革、纤维素、纸张或表面的用途。
Description
本申请为2006年9月6日提交的、发明名称为“以固体形式发酵生产非挥发性微生物代谢物”的PCT申请PCT/EP2006/066057的分案申请,所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2008年5月6日,申请号为200680041349.3。
发明领域
本发明涉及通过研磨、液化和糖化选自谷粒的淀粉源并通过使用产生的含糖液体培养基用于发酵来发酵生产固体形式的非挥发性微生物代谢物。
背景技术
通过微生物发酵生产非挥发性微生物代谢物例如氨基酸、维生素和类胡萝卜素的方法通常是已知的。依赖于不同的方法条件,不同的碳源被用于此目的。它们从纯蔗糖到甜菜和甘蔗的糖蜜、到所谓的高级糖蜜(high-testmolasses)(甘蔗转化糖蜜)、到来自淀粉水解产物的葡萄糖。此外,乙酸和乙醇被提及作为能够用于工业规模生物技术生产L-赖氨酸的辅助底物(Pfefferle等,Biotechnological Manufacture of Lysine.Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Vol.79(2003),59-112)。
基于上述碳源,建立了各种基于糖来发酵生产非挥发性微生物代谢物的方法和程序。以L-赖氨酸为例,例如Pfefferle等(上述引文)就菌株开发、工艺开发和工业生产对此进行了描述。
对于微生物介导的非挥发性微生物代谢物的发酵生产,一种重要碳源是淀粉。淀粉在可以作为碳源用于发酵之前必须首先在前面的反应步骤中被液化和糖化。为此,淀粉通常以预纯化形式从天然淀粉源(如马铃薯、木薯、谷物如小麦、玉米(maize,corn)、大麦、黑麦、黑小麦或稻)获得,并随后被酶法液化和糖化,然后在实际发酵中用于生产期望的代谢物。
除了使用此类预纯化淀粉源之外,使用未预处理的淀粉源制备用于发酵生产非挥发性微生物代谢物的碳源,也已有描述。典型地,淀粉源最初通过研磨粉碎。然后对经研磨物进行液化和糖化。因为除淀粉以外,此经研磨物还天然含有一系列可以不利地影响发酵的非淀粉成分,故通常在发酵之前去除这些成分。去除可以直接地在研磨之后(WO 02/277252;JP 2001-072701;JP 56-169594;CN 1218111)、在液化之后(WO 02/277252;CN 1173541)或在糖化之后(CN 1266102;Beukema等:Production offermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes;potatosaccharification to give culture medium(会议摘要),Symp.Biotechnol.Res.Neth.(1983),6;NL8302229)进行。然而,所有变体方案均涉及在发酵中使用基本上纯的淀粉水解产物。
更近些的技术特别涉及改良的方法,这些方法旨在使发酵前纯化例如液化和糖化的淀粉溶液(JP 57159500)和从可再生资源纯化发酵培养基(EP 1205557)成为可能。
相反地,未经处理的淀粉源已知可以应用在生物乙醇的大规模发酵生产中。大规模工业化建立了干燥研磨、液化和糖化淀粉源的方法,被称为“干磨”。适宜的程序的描述可以参见例如“The Alcohol Textbook-Areference for the beverage,fuel and industrial alcohol industries”,Jaques等编,Nottingham Univ.Press 1995,ISBN 1-8977676-735,和McAloon等“Determining the cost of producing ethanol from corn starch和lignocellulosic feedstocks”(NREL/TP-580-28893,National RenewableEnergy Laboratory,October 2000。
在干磨方法中,第一步将完整的谷粒磨细,优选玉米、小麦、大麦、高粱和粟(millet)。与称之为“湿磨”的方法不同,不添加额外液体。研磨成细碎组分具有使谷物中的淀粉易于在随后的液化和糖化中为水和酶所作用的目的。
因为在生物乙醇的发酵生产中通过蒸馏获得有价值的产品,故使用来自干磨法的非预纯化形式的淀粉源不构成特别的问题。然而,当将干磨法用于生产非挥发性微生物代谢物时,经由糖溶液引入发酵中的固体流即构成问题,因为它不只可能对发酵产生不利影响,而且可能在相当大程度上使后续的后处理变得复杂化。
因此,对所用微生物的氧供应是许多发酵中的限制因素,特别是当微生物具有苛刻的氧需求时更是如此。一般,几乎不了解高固体浓度对于氧气从气相向液相的转换以及由此对于氧传质速率(oxygen transfer rate)的影响。另一方面,已知随递增的固体浓度而增加的粘性会导致氧传质速率的下降。此外,如果将表面活性物质和固体一起引入发酵培养基,它们会影响气泡聚集的趋势。产生的气泡大小反过来对于氧传质有显著影响(Mersmann,A.等:Selection和Design of Aerobic Bioreactors,Chem.Eng.Technol.13(1990),357-370)。
作为引入固体的结果,早在制备含淀粉悬液的期间就会达到所用培养基的临界粘度值,因为,例如,在水中具有大于30%重量的研磨后玉米的悬液不再能混合均匀(Industrial Enzymology,第2版,T.Godfrey,S.West,1996)。这限制了常规方法中的葡萄糖浓度。通常,由于工艺的经济原因,使用较低浓度的溶液是不利的,因为这会导致发酵液的不相称的稀释。这使得能得到的目标产物终浓度下降,从而在从发酵培养基中分离目标产物时导致额外的成本,并引起时空产率降低,假定相同的生产量,这导致更高的体积需求,即,更高的投资费用。
由于这些困难,干磨法的现有技术变体方案不适于提供用于发酵生产非挥发性微生物代谢物的淀粉源,因此不具有特别的经济价值。至今,在工业规模生产非挥发性微生物代谢物的过程中尝试利用干磨的概念以及原则上与该方法相关联存在的优势,仅仅在使用木薯作为淀粉源时进行过描述。
因此,当JP 2001/275693描述利用在干燥状态下磨碎的去皮木薯块茎作为淀粉源发酵生产氨基酸的方法时,为实施该方法必须调整经研磨物的颗粒大小到小于等于150微米。在用于此目的的过滤步骤中大于10%重量的所用经研磨物(包括非含淀粉成分)被除去,之后所包含的淀粉被液化/糖化然后发酵。类似的方法见述于用于生产含氨基酸的饲料添加剂的JP 2001/309751。
然而,与其它淀粉源,特别是谷物或谷粒相比,就干磨法而言,木薯应该是相对不具有问题的。尽管淀粉典型地占干木薯根的至少80%重量(Menezes等,Fungal celluloses as an aid for the saccharification ofCassava,Biotechnology and Bioengineering,Vol.20(4),1978,John Wiley和Sons,Inc.,表1,第558页),但谷物中的淀粉含量(干物质)相对低得多,通常少于70%重量;例如在玉米中它总计大约68%重量,而在小麦中大约是65%重量(Jaques等,The Alcohol Textbook,同上)。因此,当使用干燥研磨的木薯时,液化和糖化之后获得的葡萄糖溶液包含较少的污染物,特别是较少的固体。当使用谷粒作为淀粉源时,这些污染物,特别是非淀粉性固体,由于与木薯中相比在这些淀粉源中占有显著更大的比例,被证实是成问题的。这是因为增加的污染物量实质性地增加反应混合物的粘度。
然而木薯淀粉应该相对容易加工。尽管与玉米淀粉相比它在溶胀温度下有更高的粘度,但是相反地,木薯与例如玉米淀粉相比,粘度在递增的温度下下降更快(Menezes,T.J.B.de,Saccharification of Cassava for ethylalcohol production,Process Biochemistry,1978,第24页,右栏)。此外,木薯淀粉的溶胀和糊化温度比来自谷物如玉米的淀粉的溶胀和糊化温度低,这就是为什么它相对于谷物淀粉更容易被细菌α淀粉酶作用的原因(Menezes,T.J.B.de,上述引文)。
木薯相对于谷物淀粉源的其它优势是它的低纤维素含量和它的低植酸含量。纤维素和半纤维素能转化为糠醛,特别是在酸性糖化条件下(Jaques等,The Alcohol Textbook,同上;Menezes,T.J.B.de,同上),糠醛反过来可能对于发酵中所用的微生物有抑制效应。同样地植酸可以抑制发酵所用的微生物。
因此,尽管从技术角度讲,可以在相当于干磨法的方法中将木薯加工为淀粉源,但是这种基于木薯的方法仍然是复杂的、未经优化的,因而不能被广泛地应用。至今,有关在相当于干磨法的方法中使用谷物作为淀粉源来生产精细化学品如非挥发性微生物代谢物,一直未有报道。
WO 2005/116228第一个描述了用于微生物生产精细化学品的、基于糖的发酵方法,其中使用的淀粉源是未经发酵前去除非淀粉性成分的、谷粒或其它干燥颗粒或种子的经研磨物。未叙述从发酵液中实质性去除挥发性成分以产生含有发酵产物的固体。
发明内容
本发明的一个目的是提供基于糖的发酵生产非挥发性微生物代谢物的有效方法,其允许使用谷物,包括玉米,作为淀粉源。该方法使得可以对发酵混合物进行简单的后处理(workup)(特别是通过干燥方法)。此外,其还具有易于操作所用培养基的特征,并且特别是避免了发酵前复杂的预纯化或主要纯化步骤,例如固体非淀粉性成分的去除。
与本申请人公司执行的工作相关,令人惊讶的是,已经发现此方法可以通过在至少一种淀粉液化酶的存在下在水性液体中液化获自谷粒的经研磨物并之后使用至少一种糖化酶糖化该混合物而制备含糖液体培养基来有效地(尽管固体含量固有地增加)进行,在该方法中,为了液化目的,在液化过程中将至少一部分经研磨物连续地或分批地加入到所述水性液体中。
因此本发明涉及通过基于糖的微生物发酵以固体形式生产至少一种非挥发性微生物代谢物的方法,在该方法中生产期望的代谢物的微生物菌株用含糖液体培养基培养,并且随后将发酵液的挥发性成分大部分地去除,其中所述含糖液体培养基具有按重量计占液体培养基总重的20%以上的单糖含量,所述含糖液体培养基通过以下方式制备:
a1)通过研磨选自谷粒的淀粉源,产生经研磨物,和
a2)在至少一种淀粉液化酶的存在下在水性液体中液化经研磨物,然后用至少一种糖化酶进行糖化,
其中,为液化目的,在液化过程中将至少一部分经研磨物连续地或分批地加至所述水性液体中。
合适作为淀粉源的主要是其中在干燥状态下淀粉占至少40%重量,优选至少50%重量的干谷粒或种子。它们在许多当前大规模种植的谷物植物中可找到,例如玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、黑小麦、稻和多种高粱及粟物种如甜高粱和买罗高粱。淀粉源优选选自玉米、黑麦、黑小麦和小麦仁(kernel)。原则上,本发明方法还可以使用类似的淀粉源,例如多种含淀粉的类似谷粒或种子的混合物来进行。
在依照本发明产生的含糖液体培养基中存在的糖类基本上是单糖,例如己糖和戊糖,例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、***糖和核糖,特别是葡萄糖。除葡萄糖之外的其它单糖的量可以根据所用的淀粉源和其中存在的非淀粉性成分而变化,而且可能为反应的进行所影响,例如通过添加纤维素酶可以使纤维素成分分解。含糖液体培养基中的单糖有利地包含,基于含糖液体培养基中存在的糖类的总量,至少60%重量,优选至少70%重量,且特别优选至少80%重量的葡萄糖量。通常,基于含糖液体培养基中存在的糖类的总量,葡萄糖为75%到99%重量,特别是80%到97%重量,且特别是85%到95%重量。
在依照本发明制备的液体培养基中,单糖的浓度,特别是葡萄糖的浓度,常为按重量计液体培养基总重量的至少25%,优选至少30%,特别优选至少35%,尤其是至少40%,例如25%到55%,特别是30%到52%,特别优选35%到50%并特别是40%到48%。
依照本发明,相应于提取率(extraction rate),用于培养生产期望代谢物的微生物的含糖液体培养基包含至少一部分(优选至少20%重量,特别至少50%重量,尤其至少90%重量并非常特别地至少99%重量)的存在于磨碎的谷粒中的非淀粉性固体成分。基于经研磨物的淀粉性成分(以及由此含糖液体培养基中的单糖的量),含糖液体培养基中的非淀粉性固体成分优选为至少10%重量,并特别为至少25%重量,例如25%到75%重量并特别为30%到60%重量。
为制备含糖液体培养基,在添加或不添加液体如水(优选不添加液体)的情况下,将所讨论的淀粉源在步骤a1)中进行研磨。也可以将干磨与随后的湿磨步骤相结合。一般用于干磨的设备是锤片式粉碎机(hammer mill)、高速旋转式粉碎机(rotor mill)或辊式粉碎机(roller mill);适用于湿磨的设备为浆叶式混合机(paddle mixer)、搅拌式球磨机(agitated ball mill)、循环式粉碎机(circulation mill)、圆盘式粉碎机(disk mill)、环形粉碎机(annualmill)、振动式粉碎机(oscillatory mill)或行星式粉碎机(planetary mill)。原则上,其它粉碎机也是适宜的。湿磨所需的液体量可以由本领域技术人员在例行试验中确定。通常进行调整以便干物质含量在10%到20%重量的范围。
研磨产生适于随后加工步骤的颗粒大小。在本上下文中,已证实,当在步骤a1)的研磨步骤,特别是干磨步骤中获得的经研磨物具有按重量计30%到100%、优选按重量计40%到95%并特别优选按重量计50%到90%量的面粉颗粒(即,具有100到630微米颗粒大小的微粒成分)时是有利的。优选地,获得的经研磨物含有50%重量的具有大于100微米的颗粒大小的面粉颗粒。通常,获得的面粉颗粒的至少95%重量具有小于2毫米的颗粒大小。在此上下文中,颗粒大小通过使用振动分析器经筛选分析来测定。原则上,小颗粒尺寸对于得到高产率是有利的。然而,过度小的颗粒尺寸可能导致问题,特别是在液化或加工过程中,例如在发酵步骤后干燥固体期间,经研磨物形成浆状物时由于团块形成/结块作用所导致的问题。
通常,面粉以提取率或面粉等级来表征,提取率和面粉等级之间的关联是这样的:面粉等级特性随着提取率的增加而增加。提取率相应于基于100份重量的所用经研磨物获得的面粉量(按重量计)。尽管在研磨过程中最初得到纯的超细的面粉(例如从谷仁的内部),但在进一步研磨过程中,即随着提取率增加,面粉中粗纤维的量及谷壳含量将增加,而淀粉的比例降低。因此,提取率也可以反映在所谓的面粉等级上,面粉等级是用于划分面粉,特别是谷物面粉的值,其基于面粉的含灰量(称作灰分比(ashscale))。面粉等级或型号(type number)指示在燃烧100克面粉固体后留下的毫克灰(矿物质)量。在谷物面粉的情况下,型号越高意味着提取率越高,因为谷仁核心含有大约0.4%重量的灰,而壳含有约5%重量的灰。因此,在较低提取率的情况下,谷物面粉主要由粉碎的胚乳,即谷仁的淀粉成分,组成;在较高提取率的情况下,谷物面粉还含有粉碎的含蛋白质的谷粒糊粉层;在粗磨的情况下,它们还含有含蛋白质和含脂肪的胚的成分和种壳的成分,其包含粗纤维和灰。为本发明目的,原则上优选具有高提取率或高型号的面粉。如果使用谷物作为淀粉源,优选将完整的谷仁与其壳一起进行研磨和加工,如果适当的话,在预先地机械除去胚芽和壳之后进行。
为液化经研磨物中的淀粉,在液化步骤过程中,但优选在糖化步骤前,将至少一部分经研磨物(优选至少40%重量,特别至少50%重量,且非常特别优选至少55%重量)在步骤a2)中引入反应器。通常,基于所使用的经研磨物的总量,该加入的经研磨物的量不超过90%重量、特别是85%重量并特别优选80%重量。典型地,在液化过程中加入的该部分经研磨物在液化步骤期间盛行的条件下供给反应器。添加可以分批地,即,分部分地,以几个部分实现,所述部分在每一情况下均优选不大于按重量计待液化的经研磨物总量的20%,特别优选不大于10%(例如1%到20%重量,特别是2%到10%重量),或者所述添加可以连续地进行。对于本发明,重要的是在液化过程开始时反应器中只有一些经研磨物(优选不超过60%重量,特别不超过50%重量并特别优选不超过45%重量的经研磨物),并且在液化步骤期间加入剩余的经研磨物。
经研磨物可以以粉末(即不加水)的形式加入,或者以水性液体(例如淡水、来自例如发酵或后处理的循环工艺水)中的悬液形式加入。
还可以连续地,例如在多步骤反应级联中,进行液化。
依照本发明,步骤a2)中的液化在至少一种淀粉液化酶存在时进行,该酶优选选自α淀粉酶。同样可使用在反应条件下有活性并稳定的并且能液化稳定性淀粉的其它酶。
下面涉及α淀粉酶的使用;然而,它一般也适用于所有淀粉液化酶。
α淀粉酶(或使用的淀粉液化酶)可以先被引入到反应容器中或在步骤a2)过程中加入。优选的是步骤a2)中所需的α淀粉酶的一部分在步骤a2)开始时加入或先被放进反应器中。基于所用淀粉源的总量,α淀粉酶的总量通常在0.002%到3.0%重量的范围内,优选为0.01%到1.5%重量并特别优选0.02%到0.5%重量。
可以在高于或低于糊化温度的温度下进行液化。优选的是,步骤a2)的液化至少部分地在高于所用淀粉的糊化温度的温度下进行(称作蒸煮过程)。通常,选择70到165℃的温度,优选80到125℃,并特别优选85到115℃,优选温度为高于糊化温度至少5℃并特别优选至少10℃。
为达到最佳的α淀粉酶活性,步骤a2)优选至少部分地在弱酸性pH下进行,优选4.0至7.0,特别优选5.0至6.5,通常在步骤a2)之前或开始时调节pH;优选的是,在液化期间检查此pH,并且酌情重新调节。优选使用稀的矿物酸例如H2SO4或H3PO4,或稀的碱金属类氢氧化物溶液例如氢氧化钠水溶液(NaOH)或氢氧化钾水溶液(KOH)或使用碱土金属类氢氧化物溶液例如氢氧化钙水溶液来调节pH。
在优选的实施方案中,依照本发明的方法的步骤a2)以这样的方式进行:首先将基于经研磨物总量计不超过60%重量、优选不超过50%重量、并特别优选不超过45%重量(例如10%到60%重量、特别是15%到50%重量、并特别优选20%到45%重量)的部分经研磨物悬浮在水性液体(例如淡水、如来自发酵或处理阶段的循环工艺水)或这些液体的混合物中,并且随后进行液化。可以将用于产生经研磨物的悬液的液体预热到适度增加的温度(例如40到60℃)。优选的是,用于产生经研磨物的悬液的液体不超过30℃并特别是具有室温,即,15到28℃。
接着,加入至少一种淀粉液化酶,优选α淀粉酶到此悬液中。如果使用α淀粉酶,有利的是只加入部分α淀粉酶,例如,基于步骤a2)中所用的所有α淀粉酶,10%到70%重量、特别是20%到65%重量。在此时间点加入的α淀粉酶的量依赖于该所用α-淀粉酶在反应条件下对于所用淀粉源的活性,并且通常基于所用淀粉源的总量在从0.0004%到2.0%重量的范围内,优选0.001%到1.0%重量,特别优选0.02%到0.3%重量。作为可选的方法,此部分α-淀粉酶可以在制备悬液前和所用的液体混合。
在此上下文中,该部分α-淀粉酶优选在开始加热至液化所使用的温度之前加入到悬液中,特别是在室温时或在只有适度增加的温度(例如20到30℃)时。
有利的是,选择α淀粉酶和经研磨物的量使糖化过程,特别是糊化过程中的粘度充分降低以便可以通过例如搅拌的方式有效地混合悬液。优选,在糊化期间反应混合物的粘度不超过20帕,特别优选不超过10帕,并且非常特别优选不超过5帕。通常,使用带有M5测量***和MVDIN设备的Roto Visko RV20型Haake粘度计在50℃和200s-1剪切速率下测量粘度。
这样制得的悬液接着优选在高于所用淀粉的糊化温度的温度加热。通常选择70到165℃的温度,优选80到125℃,并且特别优选85到115℃,温度优选高于糊化温度至少5℃并特别优选至少10℃。监测粘度的同时,将其余部分的经研磨物,例如,分部分地,以每部分基于所用的所有经研磨物计为2%到20%重量、特别是5%到10%重量的量,逐渐加入到经研磨物的悬液中。优选将待在液化步骤过程中加入的该部分经研磨物分至少两份、优选至少4份并特别优选至少6份加入到反应混合物中。可选的是,尚未用于制备悬液的该部分经研磨物可以在液化步骤期间连续加入。在添加过程中,温度应有利地保持高于淀粉的糊化温度。优选以这样的方式加入经研磨物:在加入的过程中或在液化过程中反应混合物的粘度不超过20帕,特别优选不超过10帕并非常特别优选不超过5帕。
在加入所有经研磨物之后,通常在设定在淀粉糊化温度以上的温度下保持反应混合物一段时间,例如30到60分钟或如必要更长时间,其中经研磨物的淀粉成分被蒸煮。然后,在加入另一部分的α淀粉酶(优选主要部分)之前,通常将反应混合物冷却到微低些的高于糊化温度的温度,例如75到90℃。依据所用α淀粉酶在反应条件下的活性,在此时间点加入的α淀粉酶的量基于所用淀粉源的总量优选为0.002%到2.0%重量,特别优选0.01%到1.0%重量,并非常特别优选0.02%到0.4%重量。
在这些温度下,淀粉的颗粒结构被破坏(糊化)使得淀粉的酶降解(液化)成为可能。为了充分降解淀粉成糊精,保持反应混合物在设定的温度下或者酌情进一步加热,直至通过碘,或者,如果适当的话,用于检测淀粉的另一种试验检测淀粉为阴性,或至少基本上为阴性。如适当的话,一个或多个另外的α-淀粉酶部分(例如,基于所用淀粉源的总量,从0.001%到0.5%重量的范围,并优选从0.002%到0.2%重量)可以现在被加入到反应混合物中。
在淀粉液化结束后,液体培养基中存在的糊精或者连续地或者分批地(优选连续地)被糖化,即降解成为葡萄糖。在供给发酵步骤b)之前,该液化后的培养基可以在特定的糖化罐中完全糖化。然而,已经证明在发酵前只进行部分糖化是有利的。例如,可以实施这样一个程序,其中存在于液体培养基中的部分糊精(如,基于糊精或最初淀粉的总重量,在10%到90%重量的范围,并特别在20%到80%重量的范围)被糖化,并且产生的含糖液体培养基被用于发酵。然后可以在发酵培养基中原位进行进一步糖化。此外,可以直接在发酵罐内(原位)进行糖化,无需单独的糖化罐。
原位糖化,即部分或完全地发生在发酵罐内的糖化,的优势首先是降低了费用;第二,葡萄糖的延迟释放,如果适当的话,将允许在该批次中提供更高的葡萄糖浓度,而不会观察到所用微生物被抑制或发生代谢改变。例如,在大肠杆菌的情况下,过度高的葡萄糖浓度导致有机酸(乙酸)的形成,而在此状况下酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)例如会转换成酵解,即使在通气的发酵罐中存在足够量的氧气时(Crabtree效应)。可以通过控制葡糖淀粉酶浓度来调节延迟的葡萄糖释放。这使得上述效应被抑制,并且可以在最初引入更多底物以便可以降低由添加的进料流导致的稀释。
在分开糖化的情况下,例如在糖化罐中糖化,通常液化的淀粉溶液被冷却或升温到糖化酶的最适温度或稍低,例如50到70℃,优选60到65℃,并随后以葡糖淀粉酶处理。
如果在发酵罐中进行糖化,通常液化的淀粉溶液在被加入到发酵罐前被冷却到发酵温度即32到37℃。在此情况下,用于液化的葡糖淀粉酶(或所述至少一种糖化酶)被直接加入到发酵液中。依照步骤a2)的液化淀粉的糖化现在和微生物对该糖的代谢平行地发生。
在添加葡糖淀粉酶之前,有利的是将液体培养基的pH调节到处于所用葡糖淀粉酶的最佳活性范围内的数值,优选3.5到6.0,特别优选4.0到5.5,并且非常特别优选4.0到5.0。然而,特别是直接在发酵罐中进行糖化时,也可以调节pH到上述范围之外,例如6.0到8.0。尽管在此pH范围内标准葡糖淀粉酶的活性受到限制,但是这在例如生产赖氨酸、泛酸和维生素B2中可能是总体有利的,或者作为调节发酵条件的结果,这可能是必需的。
在一个优选的实施方案中,在特定的糖化罐内进行糖化。为此,液化的淀粉溶液被带到并保持在最适于该酶的温度或稍低的温度,并以上述方式调节pH到最适于该酶的数值。
通常,以基于所用淀粉源的总量计0.001%到5.0%重量,优选0.005%到3.0%重量,并特别优选0.01%到1.0%重量的量,将葡糖淀粉酶添加到含糊精的液体培养基中。在加入葡糖淀粉酶之后,优选在设定温度下保持含糊精悬液一段时间(例如2到72小时,或需要的话更长时间,特别是5到48小时),其中糊精被糖化产生单糖。糖化过程的进行可以使用本领域技术人员已知的方法如HPLC、酶学试验或葡萄糖测试试纸来监控。当单糖浓度基本上不再上升或实际上下降时,糖化完成。
在一个优选的实施方案中,在步骤a2)中在至少一种α-淀粉酶和至少一种葡糖淀粉酶存在下,以使液体培养基的粘度不超过20帕,优选不超过10帕并特别优选不超过5帕的方式,添加经研磨物。为帮助控制粘度,已经证明有利的是,在高于经研磨物中存在的淀粉的糊化温度的温度下加入所加经研磨物的总量的至少25%重量、优选至少35%重量并特别优选至少50%重量。此外,可以通过分部分地加入至少一种淀粉液化酶(优选α-淀粉酶)和/或至少一种糖化酶(优选葡糖淀粉酶)进一步影响对粘度的控制。
通过实践步骤a1)和a2),可以生成含糖液体培养基,具有的单糖含量特别是葡萄糖含量为优选大于25%重量(例如大于30%重量或大于35%重量),并特别优选大于40%重量,例如大于25%到55%重量,特别是大于30%到52%重量,特别优选大于35%到50%重量并特别是大于40%到48%重量(基于液体培养基总重量)。在此情况下,在液体培养基中的总固体含量典型地为30%到70%重量,常常为35%到65%重量,特别是40%到60%重量。单糖或葡萄糖的浓度和固体含量以本身已知的方式取决于液化中所用经研磨物和液体量的比例以及取决于经研磨物中的淀粉含量。
原则上,可以用于液化经研磨物中的淀粉部分的酶是所有α淀粉酶(酶类EC 3.2.1.1),特别是获得自地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)或芽孢杆菌staerothermophilus(Bacillus staerothermophilus)的α淀粉酶,及特别地与生产生物乙醇相关用于液化通过干磨法得到的材料的那些酶。适用于液化的α淀粉酶也是可商业获得的,例如来自Novozymes的命名为Termamyl 120L(L型)的酶、或来自Genencor的命名为Spezyme的酶。不同α淀粉酶的组合也可以用于液化。
原则上,可以用于糖化液化的淀粉溶液中的糊精(即寡糖)的酶是所有适用于糖化糊精的酶,典型地是葡糖淀粉酶(酶类EC 3.2.1.3)。特别是得自曲霉属(Aspergilus)的葡糖淀粉酶和特别地那些与生产生物乙醇相关用于糖化通过干磨法得到的材料的酶,是适宜的。适用于糖化的酶也是可商业获得的,例如来自Novozymes的名为Dextrozyme GA的酶或来自Genencor名为Optidex的酶。也可以使用不同糖化酶,例如不同葡糖淀粉酶的组合。
为稳定所用的酶,如果适当,可以使用例如CaCl2或Ca(OH)2调节钙离子的浓度到特异于酶的最适值。技术人员可以通过常规试验确定合适的浓度值。例如,如果使用Termamyl作为α淀粉酶,调节液体培养基中的钙浓度到例如50到100ppm(优选60到80ppm,并且特别优选大约70ppm)是有利的。
因为完整的淀粉源即完整的谷仁被研磨来生产a1)的含糖液体培养基,故也存在淀粉源的非淀粉性固体成分。这经常会导致从谷粒引入一定量的植酸,该量是不能被忽视的。为避免由此造成的抑制效应,在步骤a2)中在将含糖液体培养基用于发酵步骤前,加入至少一种植酸酶到液体培养基中是有利的。
可以在液化或糖化之前、之间或之后加入植酸酶,条件是其在相应的高温下足够稳定。
可以使用任何植酸酶,只要它们的活性在每种情况下于反应条件下至多受到轻微的影响即可。优选使用的植酸酶具有大于50℃并特别优选大于60℃的热稳定性(T50)。
通常植酸酶的量是每千克淀粉源为1到10 000单位,并特别是每千克淀粉源10到2000单位。
为增加总糖产率,或为了得到游离的氨基酸,在生产含糖液体培养基期间,可以另外添加其它的酶,例如支链淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖苷酶或蛋白酶到反应混合物中。加入这些酶可以对粘度产生正面效应,即降低粘度(例如通过切割较长链的葡聚糖和/或***木聚糖),并导致可代谢的糖苷的释放和(残余)淀粉的释放。使用蛋白酶有类似的正面效应,它还可以释放充当发酵中的生长因子的氨基酸。
在依照本发明的方法中含糖液体培养基用于发酵生产非挥发性微生物代谢物。为此,对步骤a1)和a2)中产生的含糖液体培养基进行发酵。在发酵中由微生物生产非挥发性微生物代谢物。
通常可以用技术人员熟悉的一般已知方式实施该发酵过程。流加的含糖液体培养基和最初引入的含有微生物的液体培养基之间的体积比一般在从大约1∶10到10∶1的范围内,优选在从大约1∶2到2∶1的范围内,例如大约1∶2或大约2∶1,并特别为约1∶1。发酵液中的糖含量可以特别通过含糖液体培养基的进料速率来控制。通常可以调节该进料速率,以便发酵液中的单糖含量在从大于等于0%重量到约5%重量的范围内;然而,也可以在发酵液中具有实质上更高的单糖含量,例如约5%到20%重量,并特别是10%到20%重量下,进行发酵。
如果分开进行糖化和发酵,在步骤a)中得到的含糖液体培养基可以酌情在发酵前灭菌,在该步骤中可能存在的及已经(例如和经研磨物一起)引入的任何干扰微生物(污染物)通过合适的方法(一般通过热灭菌法)被破坏。在热灭菌法中,液体通常被加热到80℃以上的温度。细胞的破坏或裂解可以在临发酵前发生。为此,对全部含糖液体培养基进行此裂解或破坏。然而,为本发明的目的,已经证明在发酵前进行在此描述的灭菌步骤并不是必需的;相反地,已经证明不进行这样的灭菌步骤是有利的。因此,本发明的一个优选实施方案涉及这样的方法,其中在步骤a)(或分别地,步骤a1)和a2))中得到的液体培养基被直接供给发酵(即,不经事先灭菌)或进行至少部分原位糖化。
发酵导致的液体培养基,除了含有期望的非挥发性微生物代谢物和水以外,本质上还含有不可溶的固体,如发酵期间产生的生物质、糖化的淀粉溶液中的未代谢成分,特别是淀粉源的非淀粉性固体成分例如纤维,和以溶解形式存在于发酵液中的成分(可溶性成分),如未利用的缓冲液和营养盐及未反应的单糖(即未利用的糖)。这种液体培养基在下面也称作发酵液,术语发酵液也包括其中仅发生了存在的糖类的部分或不完全的发酵转化,即,单糖的部分或不完全的微生物代谢,的(含糖)液体培养基。
依照本发明,至少发酵培养基的挥发性成分被去除。以此方式,可得到含有目的非挥发性产物及发酵液的不溶性成分和,适当的话,以溶解形式存在于发酵液中的成分的固体。
为本发明目的,非挥发性微生物代谢物理解为有意义的化合物,其通常不能从发酵液中通过蒸馏不经降解而去除。
通常,在常压下这些化合物具有高于水沸点,常常高于150℃且特别是高于200℃的沸点。通常在标准条件(298K,101.3kPa)下它们表现为固体状态的化合物形式。然而,也可以使用本发明的方法制备在大气压下具有低于水沸点的熔点和/或油的稠度(consistency)的非挥发性微生物代谢物。在此情况下,通常必须控制加工过程,特别是干燥过程的最高温度。这些化合物也可以方便地通过将它们在吸附剂上配制成假固态而制备。
适用于此目的的吸附剂是,例如活性炭、氧化铝、硅胶、硅石、粘土、炭黑、沸石、无机碱金属和碱土金属盐(如钠、钾、镁和钙的氢氧化物、碳酸盐、硅酸盐、硫酸盐和磷酸盐,特别是镁盐和钙盐,例如Mg(OH)2、MgCO3、MgSiO4、CaSO4、CaCO3)、碱土金属氧化物例如MgO和CaO、其它无机磷酸盐和硫酸盐例如ZnSO4、有机酸的盐,特别是其碱金属和碱土金属盐(特别是其钠盐和钾盐,例如钠和钾的乙酸盐、甲酸盐、氢甲酸盐(hydrogen formate)和柠檬酸盐)及高分子量的有机支持物例如碳水化合物(例如糖类,任选地修饰的淀粉、纤维素、木质素)和一般地在下面产品制剂的上下文中提及的支持物。通常上面提及的支持物不包含或只包含少量(特别是只有痕量)的卤素(如氯离子)和硝酸盐。
可以通过本发明方法以此方式方便制备的化合物的例子是γ-亚麻酸、二同型γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,还有丙酸、乳酸、丙二醇、丁醇、丙酮。再一次,为本发明目的,这些假固态制剂形式的化合物应理解为固体形式的有意义的非挥发性微生物代谢物。
在下文,术语非挥发性微生物代谢物包括特别是有机单、二和三羧酸(其优选具有3到10个碳原子,并且适当的话具有一个或多个,例如1、2、3或4个羟基连接于其上),例如酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羟基丙酸、富马酸、马来酸、2,5-呋喃二甲酸、戊二酸、乙酰丙酸、葡糖酸、乌头酸和二氨基庚二酸、柠檬酸;蛋白质的(proteinogenic)和非蛋白质的(non-proteinogenic)氨基酸,例如赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸;嘌呤和嘧啶碱基;核苷及核苷酸,例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和腺苷5’-单磷酸(AMP);脂质;具有优选10到22个碳原子的饱和和不饱和脂肪酸,例如γ-亚麻酸、二同型-γ亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸;具有优选3到8个碳原子的二醇,例如丙二醇和丁二醇;具有3或3个以上,例如3、4、5或6个OH基团的高官能度醇,例如甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇和***糖醇;具有至少4个碳原子,例如4到22个碳原子的长链醇,如丁醇;碳水化合物例如透明质酸和海藻糖;芳香化合物例如芳香胺、香草醛和靛蓝,维生素和维生素原,例如抗坏血酸、维生素B6、维生素B12和核黄素、辅因子及所谓的营养药(nutraceutical);蛋白质例如酶类如淀粉酶、果胶酶、酸性、杂交或中性纤维素酶、酯酶如脂肪酶、胰酶(pancreases)、蛋白酶、木聚糖酶和氧化还原酶如漆酶、过氧化氢酶和过氧化物酶、葡聚糖酶、植酸酶;类胡萝卜素如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄质和角黄素;具有优选3到10个碳原子及适当的话1或多个羟基基团的酮类,例如丙酮和3-羟基丁酮;内酯类例如γ-丁内酯、环糊精;生物聚合物,例如聚羟基乙酸,聚酯类如聚乳酸、多糖类、类聚异戊二烯(polyisoprenoides)、聚酰胺类;以及上面提及的化合物的前体和衍生物。其它适用作非挥发性微生物代谢物的化合物见Gutcho在Chemicals by Fermentation(Noyes DataCorporation(1973),ISBN:0818805086)中所述。
术语“辅因子”包括对于正常酶活性的出现所必需的非蛋白质性化合物。这些化合物可以是有机的或无机的;优选本发明的辅因子分子是有机的。此类分子的例子是NAD和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP);这些辅因子的前体是烟酸。
术语“营养药”包括促进植物和动物,特别是人类的健康的食物添加剂。此类分子的例子是维生素、抗氧化剂和某些脂质例如多不饱和脂肪酸。
制备的代谢物选自特别是酶类、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个碳原子的脂族单-和二羧酸、具有3到10个碳原子的脂族羟基羧酸、具有3到10个碳原子的酮类、具有4到10个碳原子的链烷醇类、具有3到10个并特别是3到8个碳原子的链烷二醇类。
本领域技术人员将意识到依照本发明发酵生产的化合物(在存在不同对映体的情况下)在每一情况下均以所用微生物产生的对映体形式获得。因此,例如在氨基酸的情况下一般获得相应的L对映体。
在发酵中所用的微生物以本身已知的方式取决于所讨论的微生物代谢物,如下文详细说明。它们可以是天然来源的或遗传改造的。下面表A中给出了适宜的微生物和发酵方法的例子。
表A:
依照本发明的方法的优选实施方案涉及生产酶类如植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶;氨基酸如赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸;维生素如泛酸和核黄素;及其前体和衍生物;还涉及生产上面提及的一-、二-和三羧酸,特别是具有3到10个碳原子的脂族一-和二羧酸,如丙酸、富马酸和琥珀酸,具有3到10个碳原子的脂族羟基羧酸,如乳酸;上面提及的长链链烷醇类(特别是具有4到10个碳原子的链烷醇如丁醇);上面提及的二醇类(特别是具有3到10个并特别为3到8个碳原子的链烷二醇类如丙二醇);上面提及的酮类(特别是具有3到10个碳原子的酮类如丙酮);以及上面提及的碳水化合物(特别是二糖如海藻糖)。
在一个优选的实施方案中,发酵中所用的微生物因而选自生产至少一种以下代谢物的天然或重组的微生物:酶类如植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶;氨基酸如赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸;维生素如泛酸和核黄素;其前体和/或衍生物;二糖如海藻糖;具有3到10个碳原子的脂族一-和二羧酸如丙酸、富马酸和琥珀酸;具有3到10个碳原子的脂族羟基羧酸如乳酸;具有3到10个碳原子的酮类如丙酮;具有4到10个碳原子的链烷醇如丁醇;以及具有3到8个碳原子的链烷二醇如丙二醇。
特别地,该微生物选自棒状杆菌属、芽孢杆菌属、阿舒囊霉属(Ashbya)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、曲霉属、产碱杆菌属(Alcaligenes)、放线杆菌属、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、乳杆菌属、丙酸杆菌属、根霉属和梭菌属,特别是选自谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、棉阿舒囊霉、大肠杆菌、黑曲霉或Alcaligenes latus、产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌、德氏乳杆菌、莱氏乳杆菌、***糖丙酸杆菌、谢氏丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌、丙酸梭菌、Clostridium formicoaceticum、丙酮丁醇梭菌、少根根霉和米根霉(Rhizopus oryzae)的菌株。
在一个特别的优选实施方案中,发酵中微生物产生的代谢物是赖氨酸。为进行该发酵,可以使用针对其它碳源已经描述过的,例如Pfefferle等的上述引文和US 3,708,395中所叙述的类似条件和过程。原则上,连续的和批量的(分批或补料分批)操作模式均是适宜的,而优选的是补料分批方式。
在另一特别优选实施方案中,发酵中微生物产生的代谢物是甲硫氨酸。为进行该发酵,可以使用针对其它碳源已经描述过的,例如在WO 03/087386和WO 03/100072中所叙述的类似条件和过程。
在另一特别优选实施方案中,发酵中微生物产生的代谢物是泛酸。为进行该发酵,可以使用针对其它碳源已经描述过的,例如在WO 01/021772中所叙述的类似条件和过程。
在另一特别优选的实施方案中,发酵中微生物产生的代谢物是核黄素。为进行该发酵,可以使用针对其它碳源已经描述过的,例如在WO 01/011052、DE 19840709、WO 98/29539、EP 1186664和Fujioka,K:New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of thisriboflavin.Fragrance Journal(2003),31(3),44-48中所叙述的类似条件和过程。
在另一特别优选的实施方案中,发酵中微生物产生的代谢物是富马酸。为进行该发酵,可以使用针对其它碳源已经描述过的,例如在Rhodes等,Production of Fumaric Acid in 20-L Fermentors,Applied Microbiology,1962,10(1),9-15中所叙述的类似条件和过程。
在另一特别优选实施方案中,发酵中微生物产生的代谢物是植酸酶。为进行该发酵,可以使用针对其它碳源已经描述过的,例如在WO 98/55599中所叙述的类似条件和过程。
在发酵液被用于进一步加工前,优选进行灭菌步骤。灭菌步骤可以以热、化学或机械方式或以这些方式的组合来进行。热灭菌可以以上述方式进行。对于化学灭菌,通常用酸或碱处理发酵液以破坏微生物。机械灭菌通常是通过引入剪切力来进行。这些方法为技术人员所已知。
依照本发明的方法有利地包括下面三个相继的工艺步骤a)、b)和c):
a)如步骤a1)和a2)中所述制备具有大于20%重量的单糖含量的含糖液体培养基,其中该含糖液体培养基还包含淀粉源的非淀粉性固体成分,
b)在发酵中使用含糖液体培养基来生产非挥发性代谢物,和
c)通过去除发酵液中的至少一些挥发性成分,从发酵液中得到固体形式的非挥发性代谢物以及淀粉源的至少部分非淀粉性固体成分。
取决于提取率,在步骤a)中获得的含糖液体培养基(用于在步骤b)中培养生产期望代谢物的微生物菌株)含有至少部分或全部(但通常为至少90%重量并特别是大约100%重量)的存在于磨碎的谷仁中的非挥发性固体成分。基于经研磨物的淀粉性成分,含糖液体培养基中的非淀粉性固体成分的量优选至少10%重量并特别为至少25%重量(例如从25%到75%重量并特别是从30%到60%重量)。这些非淀粉性固体成分与含糖液体培养基一起提供给如步骤b)所述的发酵,并因此也存在于产生的含代谢物的发酵液中。
如果需要,可以从发酵液中分离一部分(例如5%到80%重量,并特别为30%到70%重量)非淀粉性固体,即不溶性成分。此分离典型地通过通常的固-液分离法,例如通过离心或过滤的方式来进行。适当的话,进行此预先分离来去除不包含或只包含小量的非挥发性微生物代谢物的较粗大的固体颗粒。可以使用为技术人员已知的常规方法来进行此初级过滤,例如用粗筛、网、多孔片或类似物。适当的话,还可以在离心力分离器中分离粗固体颗粒。在此使用的设备,如滗析器、离心机、双锥筒体离心机(SEDICANTER)和分离器也是为技术人员所知的。然而,优选在挥发性成分去除前去除发酵液中不超过30%重量、特别是不超过5%重量的不溶性成分。
优选,不经预先分离出固体成分而基本上与所有固体成分整个一起从发酵液中获得至少一种固体形式的非挥发性代谢物。
依照本发明,在发酵以后实质性地去除发酵液的挥发性成分(适当的话在预先已分离出一部分固体非淀粉性成分之后)。实质性意味着在挥发性成分去除后留下固体或至少半固体残留物(适当的话,能通过加入固体物质转化成固体产物)。通常,这意味着去除挥发性成分至残余含水量不超过20%重量,经常为不超过15%重量并特别不超过10%重量。通常,从发酵液中去除发酵液的挥发性成分至残留含水量基于干燥后确定的固体成分总重量有利地在0.2%到20%重量的范围内,优选1%到15%重量,特别优选2%到10%重量并非常特别优选5%到10%重量。残留含水量可以通过为技术人员已知的常规方法来确定,例如通过热重量分析法(Hemminger等.,Methoden der thermischen Analyse,Springer Verlag,Berlin,Heidelberg,1989)。
为了去除发酵液中的挥发性成分,依照第一个实施方案,可以以基本上只有发酵液的挥发性成分被去除的方式(例如通过蒸发)来进行。
依照第二个实施方案,发酵液的液体成分(其除了包含挥发性成分,还通常包含溶解的非挥发性成分)从未溶解的成分(即,期望的代谢物和生物质及淀粉源的非淀粉性固体成分)中被去除。该液体成分以通常的固-液分离方法如过滤、离心及类似方法去除。
还可以联合使用第一和第二个实施方案的方法。例如,开始可以将一些或大部分的发酵液液体成分与未溶解的成分分离,并可以通过蒸发从该分离的发酵液的未溶解成分中去除残留的挥发性成分。另外,可以通过蒸发从该分离的发酵液的液体成分中去除大多数或全部的挥发性成分,并对其进行加工。还可以将分离液体成分后得到的固体与通过蒸发挥发性成分从该分离的液体成分中得到的残留物合并,从工艺学角度来看这可能特别有利。
在步骤c)中从发酵液中获得固体形式的非挥发性代谢物可以通过一步、两步或多个步骤来实现,特别是以一步或两步法,适当的话在之前的初步分离之后。通常,至少一个用于得到固体形式代谢物的步骤(特别是最终步骤)包括干燥步骤。
在一步法的情况下,去除发酵液的挥发性成分(适当的话在上述的初步分离之后)直至达到想要的残留含水量。
在两步或多步法情况下,发酵液先通过例如(微-,超-)过滤或热法通过蒸发一些挥发性成分的方式而浓缩(适当的话在上述初步分离之后)。在这个步骤中去除的挥发性成分的量基于发酵液的挥发性成分的总重量通常为10%到80%重量,且特别是自20%到70%重量。在一个或多个后面的步骤中去除发酵液里的残留挥发性成分直到达到想要的残留含水量。
依照本发明,可以基本上去除液体培养基的挥发性成分,而不会预先耗尽或实际上分离有价值的产物。因而,当去除发酵液的挥发性成分时,非挥发性代谢物基本上不和液体培养基的挥发性成分一起被去除,而是和来自发酵液的至少一些(通常为大多数、且特别是所有)剩余固体成分一起保留在由此获得的残留物中。然而,依照本发明,一些(优选小量,通常不超过20%重量,例如从0.1%到20%重量,优选不超过10%,特别是不超过5%重量,特别优选不超过2.5%重量且非常特别优选不超过1%重量,基于代谢物的总干重计)期望的非挥发性微生物代谢物可以在发酵液的挥发性成分被去除时和它们一起被去除。在一个非常特别优选的实施方案中,在去除挥发性成分后,至少90%重量特别是至少95%重量、特别是99%重量,且非常特别大约100%重量的期望的非挥发性微生物代谢物(在每一情况下均基于代谢物的总干重计)作为固体和发酵培养基的部分或全部固体成分混合在一起留下来。
这给出了一个固体或半固体例如浆糊状残留物,其包含非挥发性代谢物和非挥发性的,通常为固体的、淀粉源的非淀粉性成分或其至少大部分,经常是至少90%重量或全部的固体非淀粉性成分。
和发酵的固体成分一起存在的干代谢物的特性可以具体地就各种参数如活性物质含量、颗粒大小、颗粒形状、成灰趋向、吸湿度、稳定性,特别是储存稳定性、颜色、气味、流动行为、成团趋向、静电荷、光敏感性、高温敏感性、机械稳定性和可再分散性,以本身已知的方式,通过添加制剂辅料(如载体、包衣料、粘合剂及其它添加剂)来配制。
常规使用的制剂辅料包括例如粘合剂、载体、成粉/流动助剂,还有色素、生物杀灭剂、分散剂、消泡剂、粘度调节剂、酸、碱、抗氧化剂、酶稳定剂、酶抑制剂、吸附剂、脂肪、脂肪酸、油或这些的混合物。特别在使用配制和干燥方法如喷雾干燥、流化床干燥和冷冻干燥时,此类制剂辅料有利地作为干燥助剂使用。
粘合剂的例子是碳水化合物,特别是糖类如单糖、二糖、寡糖和多糖,例如糊精、海藻糖、葡萄糖、葡萄糖浆、麦芽糖、蔗糖、果糖和乳糖;胶状物质如动物蛋白(例如明胶、酪蛋白,特别是酪蛋白钠),植物蛋白(如大豆蛋白、豌豆蛋白、菜豆蛋白、羽扇豆、玉米醇溶蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白和稻蛋白),合成聚合物(例如聚乙二醇、聚乙烯醇和特别是BASF的Kollidon),任选修饰的生物聚合物(例如木质素、几丁质、壳聚糖、聚丙交酯和改性淀粉,例如辛烯基琥珀酸酐(OSA));树胶例如***树胶;纤维素衍生物(例如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素(CMC));粗面粉(meal)(例如研碎的玉米、小米、黑麦、大麦和稻)。
载体的例子是碳水化合物,特别是上述作为粘合剂的糖类和例如来自玉米、稻、马铃薯、小麦和木薯的淀粉;改性淀粉,例如辛烯基琥珀酸酐;纤维素和微晶纤维素;无机矿物质或壤土,例如粘土、煤、硅藻土、硅石、动物脂和高岭土;粗面粉例如粗小麦粉、糠例如麦麸、上述作为粘合剂的粗面粉;盐类如金属盐,特别是碱金属和碱土金属的有机酸盐,例如柠檬酸镁、醋酸镁、甲酸镁、氢甲酸(hydrogen formate)镁、柠檬酸钙、醋酸钙、甲酸钙、氢甲酸钙、柠檬酸锌、醋酸锌、甲酸锌、氢甲酸锌、柠檬酸钠、醋酸钠、甲酸钠、氢甲酸钠、柠檬酸钾、醋酸钾、甲酸钾、氢甲酸钾,无机盐例如硫酸镁、碳酸镁、硅酸镁或磷酸镁、硫酸钙、碳酸钙、硅酸钙或磷酸钙、硫酸锌、碳酸锌、硅酸锌或磷酸锌、硫酸钠、碳酸钠、硅酸钠或磷酸钠、硫酸钾、碳酸钾、硅酸钾或磷酸钾,碱土金属氧化物如CaO和MgO;无机缓冲剂如碱金属磷酸氢盐,特别是磷酸氢钠和钾,例如K2HPO4、KH2PO4和Na2HPO4;及一般地就依照本发明制备具有低熔点或油的稠度的代谢物时提及的吸附剂。
成粉助剂或流动助剂的例子是硅藻土、硅石例如Degussa的商品Sipernat;粘土、煤、动物脂和高岭土;淀粉、改性淀粉、无机盐、有机酸盐和上面作为载体提及的缓冲剂;纤维素和微晶纤维素。
至于其它添加剂,下面的可以作为例子提及:色素如TiO2、类胡萝卜素和它们的衍生物、维生素B2、辣椒红、叶黄素、隐黄质、角黄素、虾青素、酒石黄、晚霞黄FCF、靛青、木炭、胭脂树橙、氧化铁;生物杀灭剂如安息香酸钠、山梨酸、碱金属山梨酸盐和碱土金属山梨酸盐(如山梨酸钠、山梨酸钾和山梨酸钙)、4-羟基苯甲酸乙基酯、碱金属亚硫酸氢盐如亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、甲酸、甲酸盐和特别是碱金属甲酸盐如甲酸钠、甲醛、亚硝酸钠、乙酸盐和特别是碱/碱土金属乙酸盐(如乙酸钠和乙酸钾),乙酸,乳酸,丙酸;分散剂和粘度调节剂,如藻酸盐、卵磷脂、1,2-丙二醇、琼脂、角叉菜胶、***树胶、瓜尔豆胶、黄原胶、吉兰糖胶、肉桂胶、山梨醇、聚乙二醇、甘油、果胶、改性淀粉、改性纤维素(例如甲基纤维素、HPMC、乙基纤维素、羧甲基纤维素),微晶纤维素,单和二甘油酯,蔗糖酯;消泡剂如乙烯基官能化硅油(例如来自Wacker Chemie的SC 155)和脂肪醇烷氧基化物(例如来自BASF AG的);无机酸,如磷酸、硝酸、盐酸、硫酸;有机酸如饱和和不饱和单和二羧酸,例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、棕榈酸、硬脂酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、马来酸和富马酸;碱如碱金属氢氧化物,例如NaOH和KOH;抗氧化剂如维生素C、3-叔丁基-4-羟基茴香醚(BHA)、3,5-二-叔-4-羟基甲苯(BHT)、6-乙氧基-1,2-二羟基-2,2,4-三甲基喹啉(乙氧喹啉(ethoxyquin));酶稳定剂如钙盐、锌盐如硫酸锌、镁盐如硫酸镁、氨基酸;酶抑制剂如抑胃酶肽A或盐酸胍;吸附剂如硅石、氧化硅、糖类或盐类;脂肪如甘油酯,例如单-、双和三甘油酯;脂肪酸如硬脂酸;油如向日葵油、玉米油、大豆油和棕榈油。
上面提及的添加剂及适当的话另外的添加剂如包衣材料的量可以变化很大,这取决于所讨论的代谢物的具体需要及所用添加剂的特性,且可以是例如从0.1%到80%重量的范围内并特别为从1%到30%重量的范围内,在每种情况下均基于在最终的配制形式中产物或物质混合物的总重量计算。
添加制剂辅料可以在发酵液的后处理(workup)(也称作产品配制或固体设计)之前、之间或之后(特别是在干燥期间)实施。在对发酵液或代谢物进行后处理之前添加制剂辅料可能尤其对于改善待后处理的物质或产物的可加工性是有利的。制剂辅料可以或者加入到以固体形式获得的代谢物中,或者加入到含有代谢物的溶液或悬液中(例如在发酵已经完成后直接加入到发酵液中,或加入到在后处理期间和在最终干燥步骤前得到的溶液或悬液中)。
因此,例如,辅料可以和微生物代谢物悬液混合;这样的悬液还可以通过喷雾或混合而加至载体材料上。当例如喷雾含有代谢物的溶液或悬液时,在干燥期间加入制剂辅料可能是重要的。当例如施加包衣料/包衣层到干燥的颗粒上时,尤其可以在干燥后添加制剂辅料。其它辅助剂既可以在干燥后也可以在可选的包衣步骤后加到产物中。
从发酵液中去除挥发性成分可以通过用于从液相中分离固相的惯常方法,包括过滤方法和蒸发液相的挥发性成分的方法,以本身已知的方式实施。此类方法(也可以包括用于粗略地纯化有价值产物的步骤和配制步骤)在例如Belter,P.A,Bioseparations:Downstream Processing forBiotechnology,John Wiley&Sons(1988)和Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry,第五版(在CD-ROM上)Wiley-VCH中有所叙述。本领域技术人员已知的、可在发酵结束后的产物配制或后处理中使用的方法、设备、辅料和一般的或具体的实施方案在EP 1038 527、EP 0648 076、EP 835613、EP 0219 276、EP 0394 022、EP 0547 422、EP 1088 486、WO98/55599、EP 0758 018和WO92/12645中有进一步描述。
在从有价值产物和发酵液的非淀粉性固体成分中分离挥发性成分的第一个优选实施方案中,非挥发性微生物代谢物,如果以溶解的形式存在于液相中,则通过例如结晶或沉淀从液相转化至固相。之后,通过固液分离的惯常方法,例如通过离心、滗析或过滤,可从液体成分中分离包括代谢物的非挥发性固体成分。通过加入吸附剂例如硅石、硅胶、壤土、粘土和活性炭,将油性发酵产物转化成固体形式,也可以以类似的方式将油性代谢物分离开来。
微生物代谢物的沉淀可以以常规方式进行(J.W.Mullin:Crystallization,第3版,Butterworth-Heinemann,Oxford 1993)。沉淀可以通过例如加入其它的溶剂、加入盐或变化温度来起始。产生的沉淀物可以通过在此叙述的用来分离固体的常规方法,和其它固体成分一起从液体中分离出来。
微生物代谢物的结晶同样地可以以惯常的方式完成。惯常的结晶方法见述于例如Janeic,S.J.,Grootscholten,P.A.,Industrial Crystallization,New York,Academic,1984;A.W.Bamforth:Industrial Crystallization,Leonard Hill,London 1965;G.Matz:Kristallisation,第2版,SpringerVerlag,Berlin 1969;J.Industrial Crystallization-State of the Art.VCH Verlagsges.,Weinheim 1982;S.J.Jancic′,P.A.M.Grootscholten:Industrial Crystallization,Reidel,Dordecht 1984;O.J.Garside:Precipitation,Butterworth-Heinemann,Oxford,1992;A.S.Myerson编,Handbook of Industrial Crystallization,Butterworth-Heineman,Boston1993;J.W.Mullin:Crystallization,第3版,Butterworth-Heinemann,Oxford 1993;A.Mersmann编:Crystallization Technology Handbook,Marcel Dekker,New York 1995。结晶可以通过例如冷却、蒸发、真空结晶(绝热冷却)、反应结晶或盐析来起始。结晶可以在例如搅拌和不搅拌的容器中,通过直接接触法,在蒸发式结晶器中(R.K.Multer,Chem Eng.(N.Y.)89(1982)March,87-89)、在真空结晶器中,分批或者连续地,例如在强制循环结晶器中(Swenson强制循环结晶器)或流化床结晶器(Oslo型)中(A.D.Randolph,M.A.Larson:Theory of Particulate Processes,第2版,Academic Press,New York 1988;J.Robinson,J.E.Roberts,Can.J.Chem.Eng.35(1957)105-112;J.Design of Crystallizers,CRC Press,Boca Raton,1992)进行。也可以分级结晶(L.Gordon,M.L.Salutsky,H.H.Willard:Precipitation from Homogeneous Solution,Wiley-Interscience,New York 1959)。同样地,可以分离对映结构体和外消旋物(J.Jacques,A.Collet,S.H.Willen:Enantiomers,Racemates and Resolutions,Wiley,New York 1981;R.A.Sheldon:Chirotechnology,Marcel Dekker,NewYork 1993;A.N.Collins,G.N.Sheldrake,J.Crosby编:Chirality inIndustry,Wiley,New York 1985)。
惯常的过滤方法有例如滤饼过滤和深层过滤(例如在A.Rushton,A.S.Ward,R.G.Holdich:Solid-Liquid Filtration and Separation Technology,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim 1996,pp.177ff.,K.J.Ives,在A.Rushton编:Mathematical Models and Design Methods in Solid-LiquidSeparation,NATO ASI series E Nr.88,Martinus Nijhoff,Dordrecht 1985,pp.90ff.中所述)及交叉流过滤,特别是用于去除大于0.1微米的固体的微过滤(例如在J.Altmann,S.Ripperger,J.Membrane Sci.124(1997)119-128中所述)。
在微过滤和超过滤的情况下,可以使用例如微孔的(A.S.Michaels:″Ultrafiltration,″在E.S.Perry编:Progress in Separation andPurification中,第1卷,Interscience Publ.,New York 1968.)、均质的(J.Crank,G.S.Park编:Diffusion in Polymers,Academic Press,New York1968;S.A.Stern:″The Separation of Gases by Selective Permeation,″在P.Meares编:Membrane Separation Processes中,Elsevier,Amsterdam1976.)、不对称的(R.E.Kesting:Synthetic Polymeric Membranes,AStructural Perspective,Wiley-Interscience,New York 1985.)和带电的(F.Helfferich:Ion-Exchange,McGraw-Hill,London 1962.)膜,这些膜可以通过多种方法制得(R.Zsigmondy,US 1 421 341,1922;D.B.Pall,US 4 340479,1982;S.Loeb,S.Sourirajan,US 3 133 132,1964)。典型的材料是纤维素酯类、尼龙、聚氯乙烯、丙烯腈、聚丙烯、聚碳酸酯和陶瓷。可以以盘状模块(R.F.Madsen,Hyperfiltration and Ultrafiltration inPlate-and-Frame Systems,Elsevier,Amsterdam 1977)、螺旋模块(US 3 417870,1968(D.T.Bray))、管束或中空-纤维模块(H.Strathmann:″SyntheticMembranes and their Preparation,″in M.C.Porter编:Handbook ofIndustrial Membrane Technology,Noyes Publication,Park Ridge,NJ 1990,1-60页)的形式实现这些膜的使用。此外,可以使用液体膜(N.N.Li:″Permeation Through Liquid Surfactant Membranes,″AIChE J.17(1971)459;S.G.Kimura,S.L.Matson,W.J.Ward III:″Industrial Applicationsof Facilitated Transport,″in N.N.Li编:Recent Developments inSeparation Science,卷V,CRC Press,Boca Raton,Florida,1979,11-25页)。期望的物质可以或者在进料侧上浓缩并经由滞留物流卸料,或者在进料侧上耗尽并经由滤液/渗透液流卸料。
惯常的离心方法见述于例如G.Hultsch,H.Wilkesmann,″FilteringCentrifuges,″in D.B.Purchas,Solid-Liquid Separation,Upland Press,Croydon 1977,493-559页;和H.Trawinski,Dievon Zentrifugen,Chem.Ztg.83(1959)606-612。可以使用多种设计如管式离心机、篮式离心机和特别是活塞推料离心机、滑动式-过滤离心机(slip-filter centrifage)和盘式分离器。
在依照此第一个实施方案的方法中,从液相中分离固相可以适当的话接以用惯常方式进行的干燥步骤。传统的干燥方法见述于例如O.Krischer,W.Kast:Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik[干燥技术的科学基础],第3版,Springer,Berlin-Heidelberg-New York 1978;R.B.Keey:Drying:Principles and Practice,Pergamon Press,Oxford 1972;K.Trockner und Trocknungsverfahren[干燥器和干燥方法],第2版,Springer,Berlin-Heidelberg-New York 1978;Williams-Gardener,A.:Industrial Drying,Houston,Gulf,1977;K.W.Kast:Trocknen undTrockner in der Produktion[生产中的干燥和干燥器],Springer,Berlin-Heidelberg-New York 1989)。干燥方法的例子包括对流干燥法(例如在干燥炉、隧道式干燥器、带式干燥器、圆盘式干燥器、喷射干燥器、流化床干燥器、鼓风和转鼓式干燥器、喷雾干燥器、气流式对流干燥器、旋风干燥器、搅拌式干燥器、磨浆机干燥器(paste-grinder dryer)、粉碎干燥器、环形干燥器、塔式干燥器、旋转式干燥器、转盘式干燥器中)。其它方法使用通过接触的干燥,例如桨叶式干燥真空或冷冻干燥、锥形干燥器、吸式干燥器、盘式干燥器、薄膜接触式干燥器、滚筒式干燥器、粘性相干燥器(viscons-phase dryer)、板式干燥器、旋转线圈干燥器(rotarycoil dryer)、双锥干燥器;或用于干燥目的的热辐射(红外线,例如红外线回转干燥器)或电介质能量(微波)。用于热干燥法的干燥装置在多数情况下通过蒸气、油、气体或电来加热,并且能够部分地真空操作(依赖于它们的设计)。
已被分离出的液相可以以工艺水的形式再循环。不再循环到该工艺中的液相的量可以在多步蒸发过程中被浓缩,至产生糖浆。如果在滗析前想要的代谢物还没被从液相转化为固相,则产生的糖浆中也包含代谢物。通常,糖浆的干物质含量在从10%到90%重量的范围内,优选20%到80%重量,并特别优选25%到65%重量。可以将该糖浆与滗析后分离出的固体相混合,然后进行干燥。干燥可以通过例如转筒式干燥器、喷雾干燥器或桨叶式干燥器进行,优选使用转筒式干燥器。干燥优选以这样的方式进行,即获得的固体具有的残留含水量不超过30%重量,优选不超过20%重量,特别优选不超过10%重量,并非常特别优选不超过5%重量(基于得到的固体的总干重)。
在从有价值产物和来自发酵液的非淀粉性固体成分中分离挥发性成分的第二个优选实施方案中,该挥发性成分,如适当的话在前述固体成分的预分离步骤之后,通过蒸发而去除。蒸发可以以本身已知的方式完成。蒸发挥发性成分的适宜方法的例子有喷雾干燥、流化床干燥或流化床团聚作用、冷冻干燥、气流式对流干燥器和接触式干燥器、挤压干燥。也可以将上述方法和赋予形状的方法(如挤压、粒化或造粒)相结合。在这些最后提及的方法的情况下,优选使用部分地或大部分地预干燥的含代谢物的物质混合物。
在一个特别优选的实施方案中,发酵液的挥发性成分的去除包括喷雾干燥法或流化床干燥法(包括流化床造粒)。为此,适当的话在初步分离去除粗固体颗粒之后(该粗固体颗粒只含有(即使有)小量非挥发性微生物代谢物),发酵液被送入一个或多个喷雾干燥或流化床干燥设备。通过惯常的用于运输含固体的液体的设备例如泵(如偏心单转子螺杆泵(例如来自Delasco PCM)或高压泵(例如来自LEWA Herbert Ott GmbH),可以方便地进行载有固体的发酵液的运输或流加。
可以使用的喷雾干燥设备是所有为本领域已知的传统喷雾干燥设备,例如那些在上述文献中叙述的设备,特别是喷口塔(特别是装备有加压喷口的那些)及盘状塔;在下面描述的使用流化床干燥的实施方案中优选使用与流化床结合的喷雾干燥器和流化床喷雾制粒机。
适于利用喷雾干燥进行干燥的***特别是那些在其中载有固体的发酵液被顺流或逆流干燥、优选逆流干燥的***。这里,发酵液在直立式喷雾塔的顶端通过喷口或经由转盘进入所说的喷雾塔并同时被雾化,而用于干燥的气流(例如空气或氮气)在上部或下部区域进入喷雾塔。发酵液的挥发性成分经由喷雾塔的下部出口或经由顶端被放出,而非挥发性或固体成分(包括想要的微生物代谢物)可以以基本上干燥的粉末形式从喷雾塔底部排出或取出并从这一步起进一步加工。
然而,不必早在这一个干燥步骤中就得到产物的想要的残留含水量,而是可以在随后的进一步干燥步骤中对其进行调节。为此,例如,可以在喷雾干燥步骤之后跟随流化床干燥步骤。喷雾塔和/或流化床的废气有利地通过旋风分离器和/或过滤器从输送的颗粒或尘中释放出来并被收集用于进一步加工;然后可以在例如浓缩装置中收集挥发性成分并且如适当的话以例如循环工艺水形式再利用。
在设计和操作所用设备时,技术人员将考虑发酵液中的固体量,该量可能是相当可观的。因此,特别是,必须选择所用喷嘴的内部直径和/或排放口以便消排除或尽量保持低的阻塞或堵塞的倾向。通常,排放口或内部直径的合适大小为大约至少0.4毫米、优选至少1毫米,并且通常取决于发酵液和其中存在的物质、压力和期望的生产量的特性,在从0.6到5毫米的范围内。
用于干燥步骤的气流通常在期望的压力下具有高于水性发酵液的沸点的温度,例如在从110到300℃的范围内,特别是从120到250℃,并特别从130到220℃。为了支持干燥过程,还可以将水性发酵培养基温至低于其沸点的温度,例如在从25到85℃的范围内,并特别为从30到70℃。同样可以过度加热水性发酵培养基超过优选100℃,其中加热液体培养基到这样的温度点,在该点培养基在期望的压力下于喷嘴之前不会沸腾,但在喷嘴释放压力之后将发生自发蒸发。
此外发酵液可以与气流(例如空气或氮气)混合,该气流可以例如在从30到90℃范围的温度下已预加热。如果使用双物质喷嘴而非单物质喷嘴,可以在马上进入喷雾塔的实际干燥空间之前完成这个混合步骤。
在任何情况下,在选择温度时,要考虑到想要的微生物代谢物的热稳定性或沸点。通常,有利的是调节用于干燥的气流的温度到低于目的非挥发性微生物代谢物的沸点或分解点至少20℃,优选至少50℃的温度。这里必须考虑到:只要不是所有挥发性成分都已经被蒸发,在某些情况下正在干燥的物质的温度可以明显地低于加入的气流的温度。在此方面,通过设定停留时间也可以影响到待干燥的物质的温度。因此干燥过程可以在待干燥代谢物的沸点或更高的进口气流温度下进行至少一段时间。适宜的温度条件可以由技术人员通过常规试验来确定。
在一特别优选的实施方案中,干燥过程在顺流或逆流,优选逆流操作的直立设计的喷雾塔中进行。在喷雾塔的顶部经由一个或多个(例如1、2、3或4,特别是1或2个)喷嘴加入含固体的已经被冷却到室温或仍在发酵温度或低于发酵温度(例如从18℃到37℃)的发酵液。提供用于干燥过程的热气(优选空气)流进入喷雾塔的顶端或底端区域。得到的粉末从喷雾塔的底部或顶部取出。如果想要,可以在此之后进行流化床干燥。
得到的粉末的平均颗粒大小主要由含固体发酵液进入喷雾塔时获得的雾化程度决定。雾化程度部分依赖于在喷嘴处使用的压力或转盘的速度。在喷嘴处应用的压力通常在高于标准压5到200巴(例如大约10到100巴,并特别为大约20到60巴)的范围内。转盘的速度通常是从5000到30 000rpm的范围内。用于干燥目的的进入气流的通过速率极大地依赖于液体培养基的流动速率。如果液体培养基的流动速率低(例如在10到1000l/h的范围内),则其通常在100到10 000m3/h的范围内,在更高的流速下(例如1000到50 000l/h)通常在10 000到10 000 000m3/h的范围内。
适当的话,伴随喷雾干燥过程可以使用本领域已知的惯用的辅助剂。这些辅助剂降低或防止喷雾塔内形成的初始粉末粒子的成团以使得可以以目标方式(例如关于颗粒大小、就干燥程度的提高、流动性的改善和/或在溶剂如水中的更好再分散性而言)影响从喷雾塔释放的粉末的特性。常规的喷雾辅助剂的例子是上面提及的制剂辅助剂。它们以常规的用量来使用,例如在从0.1%到50%重量的范围内,特别是0.1%到30%重量并特别为0.1%到10%重量(基于发酵液的非挥发性固体成分的总干重)。
在每种情况下对于所讨论的设备,能够有利地被选择以应用的设计(特别是所用喷嘴的直径和合适的操作参数)可以由技术人员通过常规试验来确定。
在此第二个优选实施方案的另一形式中,发酵液的挥发性成分用流化床干燥方法去除。在此也可类似地应用上面针对喷雾干燥法的使用进行的描述,例如关于含固体发酵液的运输、关于设备的设计及关于操作参数(特别是操作温度)的选择。能使用的合适的流化床干燥设备是本领域已知的所有常规流化床干燥器,特别是与流化床结合的喷雾干燥器及流化床喷雾制粒机(例如来自Allgaier、DMR、Glatt、Heinen、Hüttlin、Niro和Waldner)。
可以连续或分批式操作流化床干燥器。在连续操作的情况下,在干燥器内的停留时间从几分钟直到几小时。因此该设备也适用于长停留时间的干燥(例如大约1小时到15小时的时间)。如果想要窄的停留时间分布,流化床可以用隔离片(separate sheet)分隔成多级,或者产物流可以通过具有曲折设计的折流板而接近理想的活塞流。较大的干燥器特别可以被分割成数个干燥带(例如2到10个,并且特别为2到5个干燥带),这些干燥带在不同的气流速度和温度下运作。然后最后一个带可以用作冷却带;在此情况下,通常设定入口气流的温度为从10到40℃的范围内。
在湿材料的进料区,通常要小心避免结块。这个可以通过不同方式实现,例如通过局部更高的气流速率或通过使用搅拌机制。在较小的***的情况下,或者为改善清洗***的容易程度,可以把用来清洁废气的滤器整合到流化床干燥器中。
在分批操作的流化床干燥器内,停留时间同样地是在几分钟到数小时。再一次,这些设备适用于长停留时间的干燥。
可以用振动模式操作流化床干燥器,振动支持产物以低气流速度(即低于最小流化速度)和低床高度进行传送并且能防止成团。除振动外,还可以使用脉冲式供气来降低干燥气体的消耗。湿材料与向上的热气流中的湍流混合、并由此在高热和高传质系数下干燥。所需气流速度基本上依赖于颗粒大小和密度。例如对于具有几百微米直径的颗粒,表观速度在从1到10m/s的范围内可能是必需的。带孔的底部(多孔板、conidur板、编织的或烧结的金属制成的底部)防止固体落入热气空间。热可以只通过干燥气体提供,或者还可以将热交换器(管束或盘)引入流化床(K.Masters:Spray Drying Handbook,Longman Scientific&Technical 1991;Arun S.Mujumdar,Handbook of Industrial Drying,Marcel Dekker,Inc.1995)。
至于其它方面,针对喷雾干燥进行的描述可类似地应用于流化床干燥,例如关于干燥辅助剂的添加和以此方式影响产物特性的可能性。
在油性代谢物的情况下,通过使用流化床设备或混合器进行干燥可以例如以这样的方式进行:引入吸附剂至流化床设备或混合器中并彻底混合或流化。当这样做时,带有油性代谢物的发酵液被喷至吸附剂上。然后发酵液的挥发性成分可以通过向混合器供能而被蒸发掉或者在流化床中通过加热的气流而被蒸发掉。
在另一优选实施方案中,发酵液的挥发性成分使用冷冻干燥法去除。这里,含固体的发酵液被完全冷冻,并且冷冻的挥发性成分从固相被蒸发,即升华(Georg-Wilhelm Oetjen,Gefriertrocknen[冷冻干燥],VCH 1997)。能使用的冷冻干燥装置是本领域已知的所有常规的冷冻干燥器,例如来自Klein Vakuumtechnik和Christ。
在另一优选实施方案中,使用气流式对流干燥器去除发酵液的挥发性成分。这里,含固体的发酵液被加至垂直干燥管的下部。干燥气体以10到20m/s的表观速度驱动产生的粒子向上运动。使用螺杆、旋转盘或通过气动方式进行含固体发酵液的进料。通过旋风分离器颗粒沉淀在干燥管的顶部,并且如果还未达到想要的干燥度,它们可以再循环至干燥管中或者进入放置在下游的流化床中(K.Masters:Spray Drying Handbook,LongmanScientific&Technical 1991;Arun S.Mujumdar,Handbook of IndustrialDrying,Marcel Dekker,Inc.1995)。能使用的装置是本领域已知的所有传统的气流式对流干燥器,例如来自Nara和Orth的那些。
在另一优选实施方案中,使用接触式干燥器去除发酵液的挥发性成分。这类干燥器特别适用于干燥糊状培养基。然而,使用接触式干燥器对于其中固体已以颗粒形式存在的那些培养基也是有利的。将含固体的发酵液施加至干燥器的沸腾器(经由其供能)。发酵液的挥发性成分蒸发(K.Masters:Spray Drying Handbook,Longman Scientific&Technical 1991;Arun S.Mujumdar,Handbook of Industrial Drying,Marcel Dekker,Inc.1995)。存在并且可以使用多种不同设计的接触式干燥器,在此上下文中,见上面提及的实例。它们为技术人员所知,特别是作为:薄膜接触式干燥器(例如来自BUSS-SMS)、转鼓干燥器(例如来自Gouda)、桨叶式干燥器(例如来自BTC-Technology和Drais)、接触带式干燥器(例如来自Kunz和Merk)和回转管束干燥器(例如来自Vetter)。
在依照本发明的方法的另一实施方案中,其中在干燥步骤之前使用制剂辅助剂,这时可以例如在搅拌式容器中或在静态混合之前将例如稳定剂或粘合剂(如聚乙烯醇和明胶)混入微生物代谢物悬液中。这样的悬液还可以在混合器或流化床中通过例如喷雾或混合而施加于载体材料上。
另一特别的实施方案(其中在干燥步骤期间加入制剂辅助剂)涉及到含有代谢物的湿滴的成粉化(在本文中见EP 0648 076和EP 835613),其中含代谢物的悬液被喷雾,并且液滴用成粉剂(powdering agent)(例如硅石、淀粉或上面提及的成粉剂或流动助剂之一)粉末化以便稳定化,并接下来同样地在例如流化床中干燥。
在另一特别的实施方案(其中在干燥步骤之后加入制剂辅助剂)中,涉及到例如施加包衣料/包衣层到干燥颗粒上。特别是既可以在干燥之后也可以在包衣步骤之后向产物添加用于改善流动特性的流动助剂(例如硅石、淀粉或其它上述流动助剂)。
为得到油性代谢物或具有低于水沸点的熔点的那些代谢物,所讨论的产物可以有利地被吸附到吸附剂(见在上文中的例子)上。通常,实施该工艺,以便在发酵液发酵终止时或其后加入相关吸附剂。适当的话,可以在预先已经浓缩发酵液之后加入吸附剂。既可以使用疏水吸附剂也可以使用亲水吸附剂。在第一种情况下,吸附剂与吸附的代谢物一起与发酵液的挥发性成分相分离,分离方式同固体成分与代谢物一起分离的方式。在后一种情况下,必须注意溶解或悬浮形式的吸附剂通过该操作步骤不与吸附的产物一起被排出。当使用过滤时,这可以通过例如选择合适的小孔径滤器来实现。优选的疏水性或亲水性吸附剂是已经在上文中就制备假固体形式的非挥发性微生物代谢物而提及的吸附剂,特别是硅藻土、硅石、糖类和上述无机及有机碱和碱土金属盐。
产品配制的另一可能方案是通过机械方法(例如通过挤压、粒化或所谓的造粒)成形。在此,代谢物或含有代谢物的物质混合物(其优选已经干燥、预干燥和/或用制剂助剂处理)通常被推挤过模具或筛子。通常产物通过一个或多个螺杆、磨轮(edge runner)或其它机械部件(例如旋转或纵向移动部件)被递送给模具。在物质挤过模具或筛子后得到的挤出物可以(例如使用刀片)以机械方式移走,或适当的话或多或少地靠自己崩解成更小的颗粒。不用模具的成型产物配制方法是例如在混合器中压制和制粒(例如被称为高剪切制粒)。
如果作为蒸发含代谢物悬液的结果和/或通过向这样的悬液中加入制剂助剂(例如载体如淀粉和胶粘剂如木质素或聚乙烯醇)能够得到高粘性、糊状物质或能被颗粒化并因而能被直接用于这些方法之一的物质,可有利地使用提到的成形方法。如果不能,还可以在挤压、粒化、压制、制粒(例如高剪切制粒)或造粒过程进行之前,用上述干燥法(优选用喷雾干燥)通过干燥或预干燥含代谢物的悬液例如发酵液来得到所需的高粘性或糊状稠度。适当的话,以此方式得到的产物和技术人员已知的用于此目的的常规配制助剂相混合并被挤压、粒化、压制、制粒或造粒。还可以用这样的方式操作这些方法:使含代谢物的物质混合物中的至少一种成分在成形步骤前融化并在成形之后再次固化。通常,这样的实施方案需要添加为技术人员已知的用于此目的的惯常助剂。在此得到的产物典型地具有颗粒大小在从500微米到0.05米的范围内。如果想要的话,粉碎方法如研磨(适当的话与筛分方法联合)可以用于获得比此更小的颗粒尺寸。
通过所述的成形配制方法得到的颗粒可以使用上述干燥法被干燥至想要的残留含水量。
以上述方式之一以固体形式得到的所有代谢物或含有它们的物质混合物(例如颗粒、细粒和挤出物)可以涂以包衣料,即具有至少一个另外的物质层。包衣在例如混合器或流化床中实现,其中对待包衣的颗粒进行流化,而后喷以包衣料。包衣料可以是干燥形态(例如作为粉末),或是于溶剂(例如水、有机溶剂和这些的混合物,特别是水)中的溶液、分散体、乳液或悬液的形式。如果存在溶剂,通过在喷涂颗粒期间或之后蒸发来去除溶剂。此外,还可以以熔化物的形式应用如脂肪这样的包衣材料。
可以以水性分散体或悬液的形式喷涂的包衣料在例如WO 03/059087中有述。这些包括(特别是)聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯蜡、蜡、盐类如碱金属或碱土金属硫酸盐、碱金属或碱土金属氯化物和碱金属或碱土金属碳酸盐(例如硫酸钠、硫酸镁、硫酸钙、氯化钠、氯化镁、氯化钙、碳酸钠、碳酸镁和碳酸钙);acronal,例如丙烯酸丁酯/丙烯酸甲酯共聚物、例如基于苯乙烯和丁二烯的来自BASF的商标Styrofan,和如WO 03/059086中所述的疏水性物质。当应用这样的材料时,包衣料的固体含量典型地在从0.1%到30%重量的范围内,特别是在从0.2%到15%重量的范围内并特别是从0.4%到5%重量的范围内(在每一情况下基于配制的最终产物的总重量计)。
可以以溶液的形式喷涂的包衣料是例如聚乙二醇、纤维素衍生物如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和乙基纤维素、聚乙烯醇、蛋白质如明胶、盐类如碱或碱土金属硫酸盐、碱或碱土金属氯化物和碱或碱土金属碳酸盐(例如硫酸钠、硫酸镁、硫酸钙、氯化钠、氯化镁、氯化钙、碳酸钠、碳酸镁和碳酸钙);碳水化合物如糖类(例如葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖和海藻糖);淀粉及改性淀粉。当应用这些材料时,包衣料的固体含量典型地在从0.1%到30%重量的范围内,特别是在从0.2%到15%重量的范围内并特别是从0.4%到10%重量的范围内(在每一情况下基于配制的最终产物的总重量)。
可以以熔化形式喷涂的包衣料在例如DE 199 29 257和WO 92/12645中有述。这些包括(特别是)聚乙二醇、合成的脂肪和蜡(例如来自BASF的Polygen)、天然脂肪如动物脂肪(例如蜂蜡)和植物脂肪(例如小烛树蜡)、脂肪酸,例如动物蜡、动物脂肪酸、棕榈酸、硬脂酸、甘油三酯、Edenor产品、Vegeole产品、褐煤酸酯蜡(montan ester waxes)(例如来自BASF的Luwax)。当应用此类材料时,包衣料的固体含量典型地在从1%到30%重量的范围内,特别是在从2%到25%重量的范围内并特别是从3%到20%重量的范围内(在每一情况下基于配制的最终产物的总重量)。
可以以粉末形式用在干燥包衣过程中的包衣料是例如聚乙二醇、纤维素和纤维素衍生物如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和乙基纤维素、聚乙烯醇、蛋白质如明胶、盐类如碱和碱土金属硫酸盐、碱和碱土金属氯化物和碱或碱土金属碳酸盐(例如硫酸钠、硫酸镁、硫酸钙、氯化钠、氯化镁、氯化钙、碳酸钠、碳酸镁和碳酸钙);碳水化合物如糖类(例如葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖和海藻糖)、淀粉及改性淀粉、脂肪、脂肪酸、动物脂、面粉(例如玉米粉、小麦粉、黑麦粉、大麦粉或稻粉)、粘土、灰和高岭土。在待用作包衣的粉末和待包衣的产物间的粘附可以用能够以溶液或熔化形式喷涂上的物质来实现。喷涂这些溶液或熔化物可以与引入粉末交替地或平行地进行。优选地,待包衣的产物在流化床或混合器中进行流化,然后为了实现包衣(优选连续地)传送粉末至流化床或混合器内。在一特别优选的实施方案中,当加入粉末时将该溶液或熔化物送入此工艺空间。溶液可以通过例如连接部件传送,或优选地经由喷嘴(例如单物质或双物质喷嘴)喷入该工艺空间。特别优选的是粉末的进料位置和喷嘴的位置在该工艺空间中在空间上是彼此分隔的,以便溶液或熔化物主要地与待包衣的产物而不是与应用的粉末相接触。
还可以应用不同包衣料的混合物,特别是可以相继地应用多个相同或不同的包衣层。
在可选的实施方案中,想要的非挥发性微生物代谢物可以和发酵液的固体成分一起从残留的发酵液中获得,类似于在生产生物乙醇中得到副产品(其中它被称为“含有可溶固形物的干酒糟(DDGS)”并就此市售)。在此情况下,可能发酵液的液体成分基本上全部或只有一些可从固体中被去除。以此方式得到的蛋白质性副产品可以在进一步的加工或操作步骤之前或者在之后,用作饲料或饲料添加剂用于饲养动物,优选农畜(特别优选牛、猪和家禽,非常特别优选牛)。
为此,通常在一步或通常多步蒸发程序里,浓缩(蒸发)所有发酵液(即包括非挥发性微生物代谢物和其它不可溶或固体的成分)到某种程度,并且接下来(例如用滗析器)将包含的固体从残留液体(液相)中移出。在依照本发明的方法中,首先(例如通过结晶或沉淀)将想要的代谢物从液相转换成固态,以便于其可以和其它固体一起获得。在此移出的固体通常具有的干物质含量为10%到80%重量,优选15%到60%重量并特别优选20%到50%重量,并且适当的话能够使用常规干燥法(例如在上文中所述的那些方法)进一步干燥。通过进一步加工或处理得到的最终制剂有利地具有至少约90%的干物质含量,因而降低了储存时变质的风险。
分离开的液相能够作为工艺水再循环。不再循环进入此工艺中的液相部分可以在多步蒸发操作中浓缩以给出糖浆。如果在滗析步骤前想要的代谢物尚未从液相转换为固相,那么该产生的糖浆也会包括代谢物。通常,糖浆中的干物质含量在从10%到90%重量的范围内,优选20%到80%重量,并特别优选25%到65%重量。此糖浆可以和经过滗析已分离出的固体混合并随后干燥。可以通过例如转鼓式干燥器、喷雾干燥器或桨叶式干燥器的方式实现干燥,优选使用转鼓式干燥器。优选以这样的方式进行干燥,即,得到的固体具有的残留含水量不超过30%重量,优选不超过20%重量,特别优选不超过10%重量,并非常特别优选不超过5%重量(基于获得的固体的总干重计)。
不仅在此可选的实施方案中分离出的液相可以作为工艺水再循环,而且在另外的上述实施方案中收集的挥发性成分在浓缩之后也可以。这些再循环的液体或挥发相部分可以有利地例如完全或部分地用于生产步骤a)的含糖液体或用于制作在发酵中使用的缓冲液或营养盐溶液。当在步骤a)中混合再循环工艺水时,必须考虑到作为过高供应某些矿物质和离子(例如钠离子和乳酸根离子)的后果,过度高的百分率可能对于发酵有反作用。因而优选在配制用于淀粉液化的悬液时,依照本发明限制再循环工艺水的百分率到不超过75%重量,优选不超过60%重量,并特别优选不超过50%重量。在步骤a2)的该优选实施方案中,配制悬液时工艺水的百分率在从5%到60%重量的范围内并优选10%到50%重量为有利的。
作为在此所述的干燥和调制方法的结果,得到的固体的平均颗粒大小可以在一个相当大范围内变化,例如从相对小的颗粒(范围是从大约1到100微米)到中等颗粒大小(范围在从100至几百微米)直到相对大的颗粒(大约至少500微米或大约1毫米)及更大(至几毫米,例如直到10毫米)。制备粉末时,平均颗粒大小通常在从50到1000微米的范围内。制备其它固体形式的产物时,例如通过例如流化床喷雾干燥器和喷雾制粒机制备的挤出物、压制物及特别是颗粒,通常设定较大的尺寸,平均颗粒大小常常在从200到5000微米的范围内。这里的术语“平均颗粒大小”意指在非球形颗粒的情况下单颗粒的最大颗粒长度的平均值,或者是球形或近球形颗粒的直径的平均值。必须考虑的是作为初级颗粒团聚的后果在喷雾干燥过程中会形成较大的二级颗粒。执行依照本发明的方法给出在喷雾干燥中惯常得到的颗粒大小分布。
本发明还涉及上述的方法,其中:
(i)从步骤a2)中得到的含糖液体培养基(其包含选自谷仁的淀粉源的非淀粉性固体成分)中移出不超过50%重量的部分,并且剩余物用于实施发酵以生产固体形式的第一非挥发性代谢物(A);及
(ii)从所述部分中去除全部或一些的淀粉源的非淀粉性固体成分,并将该部分用于进行发酵来生产固体形式的第二非挥发性代谢物(B),该代谢物(B)同于或不同于代谢物(A)。
在一个优选的实施方案里,分离出(ii)的非淀粉性固体成分,以便于含糖液体培养基的剩余部分的固体含量优选不超过50%重量,优选不超过30%重量,特别优选不超过10%重量并非常特别优选不超过5%重量。
该方法使得可以在(ii)的单独发酵中利用必须要满足一些最低需求(例如关于氧传质速率)的微生物。在(ii)的单独发酵中使用的合适微生物为例如芽孢杆菌属种,优选枯草芽孢杆菌。此种微生物在单独发酵中生产的化合物特别可以选自维生素、辅因子和营养药、嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸、脂质、饱和及不饱和脂肪酸、芳香化合物、蛋白质、类胡萝卜素,特别是选自维生素、辅因子和营养药、蛋白质和类胡萝卜素,并且非常特别选自核黄素和泛酸钙。
此方法的一个优选实施方案涉及在两个单独发酵中平行生产相同的代谢物(A)和(B)。特别是在同样代谢物的不同应用具有不同的纯度要求的情况下,这个是有利的。因此,第一代谢物(A),例如用作食物添加剂的氨基酸(如赖氨酸),使用含固体的发酵液生产,并且相同的第二代谢物(B),例如用作食物添加剂的相同氨基酸(在本情况下如赖氨酸),使用已经依照(ii)减少了固体的发酵液来生产。由于完全地或部分地去除了非淀粉性固体成分,当对应用领域具有较高纯度需求(例如作为食物添加剂)的代谢物进行后处理时,能够降低纯化的复杂度。
在此方法的另一优选实施方案中,微生物在发酵中生产的代谢物B是核黄素。为进行此发酵,可以使用已经在例如WO 01/011052、DE 19840709、WO 98/29539、EP 1186664和Fujioka,K.:Newbiotechnology for Riboflavin(vitamin B2)and character of this Riboflavin.Fragrance Journal(2003),31(3),44-48中针对其它碳源描述过的类似条件和过程。
为了进行本发明方法的该变体方案,可以使用例如下面的程序。依照本发明的方法,例如使用优选方法步骤a)到c),进行优选的大体积发酵来生产代谢物A(例如氨基酸如赖氨酸)。依照(i),步骤a)中得到的含糖液体培养基的一些被移出并依照(ii)通过惯常方法(如离心或过滤)完全或部分地去除固体。自此得到的含糖液体培养基(其基本上完全或部分地去除了固体)依照(ii)供给发酵来生产代谢物B(例如核黄素)。依照(ii)分离的固体流有利地返回到大体积发酵的含糖液体培养基流中。
依照(ii)由此生成的含核黄素的发酵液可以通过利用在例如DE 4037441、EP 464582、EP 438767和DE 3819745中针对其它碳源描述过的类似条件和步骤来后处理。在细胞团裂解之后,优选通过滗析分离以晶体形式存在的核黄素。其它分离固体的方式如过滤也是可以的。其后优选通过喷雾干燥器和流化床干燥器干燥核黄素。作为备选,依照(ii)生产的含核黄素发酵混合物可以在例如EP 1048668和EP 730034中所述的类似条件下并使用类似步骤进行加工。在巴斯德灭菌之后,离心发酵液并以矿物酸处理剩余的含固体级分。通过过滤从水性酸性培养基中移出形成的核黄素,适当的话洗涤,并随后干燥。
在此方法的另一优选实施方案中,微生物在发酵中生产的代谢物B是泛酸。为进行此发酵,可以使用在例如WO 01/021772中已述的用于其它碳源的类似条件和步骤。
为了进行此方法变体,可以遵循例如上述用于核黄素的步骤。已经依照(ii)经过预先纯化并且优选已经基本没有固体的含糖液体培养基依照(ii)供给发酵,用来生产泛酸。这里,相比较于含固体的液体培养基,事实上的粘度降低是特别有利的。优选将分离的固体流返回到大体积发酵的含糖液体培养基流中。
依照(ii)生产的含泛酸的发酵液可以在例如EP 1050 219和WO 01/83799中所述用于其它碳源的类似条件下并使用类似步骤来后处理。在全部发酵液已经过巴斯德灭菌后,通过例如离心或过滤分离残留的固体。在此固体分离步骤中得到的清澈的流出物被部分蒸发掉,适当的话以氯化钙处理并干燥(特别是喷雾干燥)。
在平行大体积发酵过程中同时获得已经分开的固体和相应的想要的非挥发性微生物代谢物(A)。
在干燥和/或配制步骤后,整个或磨碎的谷仁,优选玉米、小麦、大麦、粟/高粱、黑小麦和/或黑麦,可以被添加到产物制剂中。
本发明还涉及可以通过此处描述的方法得到的非挥发性代谢物的固体制剂。除了发酵的至少一种非挥发性代谢物(成分A)以外,制剂通常还包含来自发酵的生物质(成分B)和淀粉源的一些或全部非淀粉性固体成分(成分C)。此外,依照本发明的物质混合物还包括(适当的话)上述制剂助剂如粘合剂、载体、成粉/流动助剂、薄膜或色素、生物杀灭剂、分散剂、消泡剂、粘度调节剂、酸、碱、抗氧化剂、酶稳定剂、酶抑制剂、吸附剂、脂肪、脂肪酸、油等。
代谢物典型地基于成分A、B和C的总量为超过10%重量,例如大于10%到80%重量,特别是20%到60%重量。基于制剂的总重量,代谢物一般为0.5%到80%重量,特别为1%到60%重量。
来自生产非挥发性代谢物的发酵的生物质一般基于成分A、B和C的总量为1%到50%重量,特别是10%到40%重量,或是基于制剂的总重量为0.5%到50%重量,特别是2%到40%重量。
通常,来自发酵液的淀粉源的非淀粉性固体成分基于成分A、B和C的总量为至少1%重量并且特别为5%到50%重量,或是基于制剂的总重量为至少0.5%重量特别是至少2%重量(例如自2%到50%重量的范围内,特别是5%到40%重量)。
通常,制剂助剂基于成分A、B和C的总重量不超过400%重量,常常在从0到100%重量的范围内,或是基于制剂的总重量在从0到80%的范围内,特别是1%到30%重量。
依照本发明的制剂是固体形式,典型地是粉末、颗粒、丸剂、挤出物、压制物或团块的形式。
依照本发明的制剂一般含有膳食纤维,其首先自淀粉源的固体成分中产生并进一步在依照本发明的制剂的制备中用作增量剂/载体。至于为了本发明目的归入术语“膳食纤维”下的成分的定义,可参考美国谷物化学家协会(AACC)在谷物食品世界(CFW)中的报告(46(3),“The Definition ofDietary Fiber”,2001,112-129页,特别是第112、113和118页)。通常膳食纤维为至少1%重量,特别为至少是5%重量,特别是至少10%重量并常在1%到60%重量的范围内,特别是5%到50%重量并特别在10%到40%重量的范围内(在每种情况下均基于制剂的总重量计)。通常通过AACC标准方法(American Association of Cereal Chemists.2000.Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists,第10版,方法32-25,按中性糖残留物、糖醛酸残留物和硫酸木素确定总膳食纤维(Uppsala法),The Association,St.Paul,MN)确定膳食纤维的含量。
依照本发明的物质混合物具有基本上相应于生物质B的高蛋白质含量。另外的蛋白质含量部分也可以来源于使用的淀粉源。蛋白质含量一般按重量计为制剂总重的20%到70%。
固有的蛋白质含量(特别是成分B)和膳食纤维含量(特别是成分C)对于多种配制方法是有利的,例如在油性代谢物的情况下,特别是就在本上下文中使用的干燥步骤而言是有利的。
依照本发明的制剂有利地包含一种或多种基本氨基酸,特别是至少一种选自赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和色氨酸的氨基酸。基本氨基酸(特别是提及的那些),如果有的话,通常每一种的存在量都超过(特别是增加至少1.5倍)在发酵生产生物乙醇中产生的传统DDGS副产品。如果所讨论的氨基酸在制剂中存在,通常制剂具有至少1%重量的赖氨酸含量(特别是在1%到10%重量的范围内并特别是自1%到5%重量的范围内),至少0.8%重量的甲硫氨酸含量(特别是在0.8%到10%重量的范围内并特别是自0.8%到5%重量的范围内),至少1.5%重量的苏氨酸含量(特别是自1.5%到10%重量的范围内并特别是自1.5%到5%重量的范围内)和/或至少0.4%重量的色氨酸含量(特别是自0.4%到10%重量的范围内并特别是自0.4%到5%重量的范围内),在每种情况下均基于制剂的总干物质计算。
依照本发明的制剂习惯上还包含少量水,经常在0到25%重量的范围内,特别是自0.5%到15%重量的范围内,特别在从1%到10%重量的范围内,并且非常特别在从1%到5%重量的范围内(在每一情况下基于制剂的总重量计)。
依照本发明的制剂适用于动物或人类营养,例如就此使用或作为添加剂或增补剂,也可以以预混合物的形式。适用于此用途的,特别是包含氨基酸(如赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸或色氨酸)、维生素(如维生素B2(核黄素)、维生素B6或维生素B12)、类胡萝卜素(如虾青素或角黄菌素)、糖类(如海藻糖)或有机酸(如富马酸)的制剂。
依照本发明的制剂还适用于用在纺织、皮革、纤维素和造纸工业中。用于纺织业的制剂尤其是包含作为代谢物的酶类如淀粉酶、果胶酶和/或酸性、杂交或中性纤维素酶的那些;用于皮革业的特别是包含酶类如脂肪酶、胰酶或蛋白酶的那些;用于纤维素和造纸工业中的特别是包含酶类如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶、氧化还原酶(如漆酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)的那些。
下面的实施例意在举例说明本发明的各方面,而决不能理解为构成限制。
实施例
I.研磨淀粉源
按下述生产在下文使用的经研磨物。使用高速旋转式粉碎机将整个玉米仁完全磨碎。用不同的搅拌器、磨轨(miling path)或筛件,得到三种不同程度的细度。通过实验室振动筛(振动分析仪:Retsch Vibrotronictype VE1;筛析时间5分钟,振幅1.5毫米)的方式进行经研磨物的颗粒分析,给出表1所列的结果。
表1
实验编号 | T 70/03 | T 71/03 | T 72/03 |
<2毫米/%1) | 99.4 | 100 | 100 |
<0.8毫米/% | 66 | 100 | 99 |
<0.63毫米/% | 58.6 | 98.5 | 91 |
<0.315毫米/% | 48.8 | 89 | 65 |
<0.1毫米/% | 25 | 9.6 | |
<0.04毫米/% | 8 | 3.2 | |
经研磨物总计 | 20kg | 11.45kg | 13.75kg |
1)%基于经研磨物总量按重量计
II.酶法淀粉液化和淀粉糖化
II.1.在糖化步骤中没有植酸酶
II.1a)酶法淀粉液化
320克干磨的粗玉米粉(T71/03)悬浮于480克水中并通过持续搅拌和310毫克氯化钙混合。在整个实验期间连续搅拌。在用H2SO4使pH成为6.5并且混合物经加热至35℃之后,加入2.4克L型Termamyl 120L(NovozymesA/S)。在40分钟的过程中,反应混合物被加热到86.5℃的温度,适当的话用NaOH再调节pH到上面的值。30分钟内,再加入400克干磨粗玉米粉(T71/03),在该操作期间提高温度到91℃。反应混合物在此温度下保持大约100分钟。然后再加入2.4克Termamyl 120L并保持温度大约100分钟。在实验期间使用碘-淀粉反应监控液化进程。最终提高温度到100℃并另外煮沸反应混合物20分钟。在此时间点处,不再能检测到淀粉。冷却反应器到35℃。
II.1b)糖化
在持续搅拌下加热II.1a)得到的反应混合物到61℃。在整个实验期间连续搅拌。在用H2SO4使pH成为4.3之后,加入10.8克(9.15ml)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。保持温度大约3小时,在其间用葡萄糖检测试纸(S-Glucotest,Boehringer)监控反应进程。结果列于下面的表2。其后加热反应混合物至80℃然后冷却。这个给出了大约1180克的液体产物,有大约1.2kg/l的密度和通过红外线干燥器确定的计大约53.7%重量的干物质含量。在用水洗涤后,得到大约14%重量的干物质含量(没有水溶性成分)。以HPLC确定的反应混合物的葡萄糖含量为380g/l(见表2,样品7号)。
表2
样品号 | 分钟(从加入葡糖淀粉酶起) | 上清液中的葡萄糖浓度[g/l] |
1 | 5 | 135 |
2 | 45 | 303 |
3 | 115 | 331 |
4 | 135 | 334 |
5 | 165 | 340 |
6 | 195 | 359 |
7 | 225 | 380 |
II.2.糖化步骤中有植酸酶
II.2a)淀粉液化
如II.1a)所述液化干磨的粗玉米粉样品。
II.2b)糖化
连续搅拌下加热II.2a)中得到的反应混合物到61℃。在整个实验期间持续搅拌。在用H2SO4使pH成为4.3之后,加入10.8克(9.15ml)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)和70μl植酸酶(700单位植酸酶,来自BASF AG的Natuphyt Liquid 10 000L)。保持温度达大约3小时,在其间用葡萄糖检测试纸(S-Glucotest,Boehringer)监控反应进程。其后加热反应混合物至80℃然后冷却。得到的产物通过红外线干燥器干燥并用水洗涤。通过HPLC确定反应混合物的葡萄糖含量。
II.3用于酶法液化和糖化淀粉的另外的方案
II.3a)粗玉米粉
引入360克去离子水到反应容器中。加入1.54ml的CaCl2储存液(100克CaCl2x 2H2O/l)到浆液中至终浓度为大约70ppm Ca2+。连续搅拌下慢慢将240克粗玉米粉混入水中。用50%重量浓度的NaOH水溶液使pH至6.5后,加入4.0ml(等于2%重量的酶/干物质)的L型Termamyl 120L(Novozymes A/S)。然后快速加热浆液到85℃。在此过程中,必需不断监控并且适当的话调节pH。
在达到最终温度之后,开始添加其余的粗面粉,最初为50克粗面粉。此外,为了维持Ca2+浓度在70ppm,加入0.13ml的CaCl2储存液到浆液中。在添加期间,保持温度在恒定的85℃。为了保证在加入其它部分(50克粗粉和0.13毫升CaCl2储存液)之前反应完全,允许反应至少进行10分钟。在加入两部分后,加入1.67ml的Termamyl;其后,再加入另外两个部分(每部分均为50克粗粉和0.13ml的CaCl2储存液)。达到55%重量的干物质含量。添加之后,升温至100℃并煮沸浆液10分钟。
取出样品并冷却至室温。在以去离子水稀释样品(约1∶10)之后,加入一滴浓缩的Lugol氏溶液(每升5克的I和10克的KI的混合物)。深蓝色显示存在着残留的淀粉;当所有淀粉已被水解可观察到棕色。当测试显示存在部分残留淀粉时,再次降低温度到85℃并保持恒定。再加入1.67ml的Termamyl直至碘-淀粉反应为阴性。
为了随后的糖化反应,将淀粉测试呈阴性的混合物调到61℃。通过添加50%浓度的硫酸把pH调至4.3。在反应期间,维持pH在这个值。维持温度在61℃。为了转化液化的淀粉成葡萄糖,加入5.74ml(等于1.5%重量的酶/干物质)Dextrozym GA(Novozymes A/S)。允许反应进行1小时。为了使酶失活,85℃加热混合物。将热混合物装入灭菌的容器中,冷却然后贮藏在4℃。得到的最终葡萄糖浓度为420g/l。
II.3b)粗黑麦粉(包括以纤维素酶/半纤维素酶预处理)
引入360克去离子水到反应容器中。持续搅拌下慢慢将155克粗黑麦粉混入水中。维持温度在恒定50℃。在用50%重量浓度的NaOH水溶液将pH调至5.5之后,加入3.21ml(等于2.5%重量的酶/干物质)的Viscozyme L(Novozymes A/S)。30分钟后,开始添加其余的粗粉,最初加入55克粉。在再30分钟后,再加入另50克粉;30分钟后,再加入另40克粉,在最后一次添加之后30分钟,可以开始液化。
加入1.7ml的CaCl2储存液(100克CaCl2x 2H2O/l)。在用50%重量的NaOH水溶液将pH调至6.5之后,加入5.0ml(等于2%重量的酶/干物质)的L型Termamyl 120L(Novozymes A/S)。然后快速加热浆液至85℃。在此过程期间,持续监控并适当的话调节pH。
在达到最终温度后,开始加入其余的粗粉,最初是60克粉。此外,为了维持Ca2+浓度在70ppm,加入0.13ml的CaCl2储存液到浆液中。在添加期间,保持温度在恒定85℃。为了保证在加入其它部分(40克粉和0.1毫升CaCl2储存液)之前反应完全,至少经过10分钟。加入1.1ml Termamyl;其后,再加入另一部分(40克粉和0.1ml的CaCl2储存液)。达到55%重量的干物质含量。添加之后,升温至100℃并煮沸浆液10分钟。
取出样品并冷却至室温。在以去离子水稀释样品(约1∶10)之后,加入一滴浓缩Lugol氏溶液(每升5克的I和10克的KI的混合物)。深蓝色显示存在着残留的淀粉;当所有淀粉已被水解可观察到棕色。当测试显示存在部分残留淀粉时,再次降低温度到85℃并保持恒定。再加入另外1.1ml的Termamyl直至碘-淀粉反应为阴性。
为了随后的糖化反应,将淀粉测试呈阴性的混合物调到61℃。通过添加50%浓度的硫酸把pH调至4.3。在反应期间,维持pH在这个值。维持温度在61℃。为了转化液化的淀粉成葡萄糖,加入5.74ml(等于1.5%重量的酶/干物质)Dextrozym GA(Novozymes A/S)。允许反应进行1小时。为了使酶失活,85℃加热混合物。将热混合物装入灭菌的容器中,冷却然后贮藏在4℃。得到的最终葡萄糖浓度为370g/l。
II.3c)粗小麦粉(包括以木聚糖酶预处理)
引入360克去离子水到反应容器中,加热水到55℃,并用50%重量浓度的NaOH水溶液将pH调至6.0。在调整温度和pH后,加入3.21ml(等于2.5%重量的酶/干物质)的Shearzyme 500L(Novozymes A/S)。持续搅拌下慢慢将155克粗小麦粉混入溶液中。保持温度和pH不变。30分钟后,开始添加其余的粗粉,最初加入55克粉。在再30分钟后,再加入另50克粉。30分钟后,再加入另40克粉,在最后一次添加之后30分钟,可以开始液化。
如II.3b中所述进行液化和糖化。得到的最终葡萄糖浓度为400g/l。
III.菌株ATCC13032lysCfbr
在下面的一些实施例中,使用了改良的谷氨酸棒状杆菌菌株,在WO05/059144中以ATCC13032lysCfbr的名字已经对其有所描述。
实施例1
a)酶法淀粉液化和糖化
500克干磨的粗玉米粉悬浮于750ml水中并在搅拌混合器中再次细磨。悬浮液被分成四个样品,1到4号,并以大约3克热稳定的α-淀粉酶处理每一样品(1号和2号样品:Termamyl L;3号和4号样品:Spezyme)。然后用大约7g/l葡糖淀粉酶处理2号和4号样品(2号样品:Dextrozyme GA;4号样品:Optidex)。这给出了浅黄色的粘性样品,在每种情况下其固体内含物通过离心分离出来,一层疏水的固体漂浮在清澈的液相之上。
在忽视或考虑已经离心出的沉淀物的情况下,使用HPLC分析浓缩形式及10倍稀释后的以这种方式得到的每个样品的澄清上清液。当考虑到沉淀物时,假定沉淀的干物质含量为50%重量。基于原样品的结果列在下面的表3中。
表3
b)发酵
在用谷氨酸棒状杆菌的摇瓶实验中使用了依照实施例II.1得到的两个玉米粗粉水解物(4-9号摇瓶)。此外,平行使用了类似于实施例II.1制备的小麦粗粉水解物(1-3号摇瓶)。
b.1)制备接种物
细胞划线于灭菌的CM琼脂(组成:见表4;在121℃下20分钟)上,然后在30℃下孵育48小时。然后从平板上刮下细胞并重悬于盐水中。在每种情况下以如此制备的细胞悬液来接种在250ml Erlenmeyer摇瓶中的25ml培养基,其中所用细胞悬液量使光密度在600nm处达到OD600值为1。
表4:CM琼脂板的组成
浓度 | 成分 |
10.0g/l | D-葡萄糖 |
2.5g/l | NaCl |
2.0g/l | 尿素 |
10.0g/l | 细菌用蛋白胨(Difco) |
5.0g/l | 酵母提取物(Difco) |
5.0g/l | 牛肉膏(Difco) |
22.0g/l | 琼脂 |
b.2)制备发酵液
1到9号摇瓶培养基的组成列于表5。
表5:摇瓶培养基
*以稀NaOH水溶液调节
**水解物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中称入的水解物的量
接种之后,在30℃下在湿润摇床中(200rpm)振荡孵育摇瓶48小时。在发酵终止后,用HPLC确定糖和赖氨酸的含量。使用来自Agilent的1100系列LC***进行HPLC。柱前用邻苯二甲醛衍生化允许形成的氨基酸的定量测定,使用来自Agilent的Hypersil AA柱分离产物混合物。结果汇辑在表6中。
表6
在所有摇瓶中产生了类似量的赖氨酸,为大约30到40g/l的数量级,相应于使用葡萄糖营养溶液的标准发酵中得到的产量。
c)制备干粉
c.1)喷雾干燥
在室温下将具有大约20%重量的固体含量的250克含赖氨酸发酵液(得自如实施例1a和1b中所述的玉米粗粉悬液)加入玻璃烧杯,并以滚轮泵(型号:ISM444,Ismatec)运送到喷雾塔(Niro,Minor High Tec)的顺流操作的双物质喷嘴中。喷射压力是4巴。在喷雾过程中,大约2到3克的Sipernat S22分小份计量供给。入口温度为从95℃到100℃。调节泵流量以使产物温度基本上不低于50℃。
在进行喷雾干燥过程时,喷雾塔壁适度涂以赖氨酸。得到的干燥粉末看起来精细并且具有好的流动性。获得了23克干粉。
c.2)挤出
已经在80℃下加热60分钟的、具有大约20%重量固体含量的400克含赖氨酸发酵液(以类似于实施例1a和1b的方式获自玉米粗粉悬液)用通过溶解14克聚乙烯醇(PVA,分子量等于10 000到190 000g/mol)到75克水制得的PVA溶液处理。产生的悬液的pH大约是7。加入此悬液到开始已放入混合器内的大约950克玉米淀粉(来自Roquette)中,并在大约100-350rpm下混合。
从混合器中放出并且具有大约30℃的温度的粉状、潮湿、浆糊样的产物随后被供应给DOME挤压机(Fuji Paudal Co.Ltd.)并在低于30℃的温度被挤压。在低于60℃的产物温度下,在来自的流化床干燥器中干燥挤出物120分钟。这给出了600克颗粒。
c.3)在流化床中团聚
开始将500克Na2SO4加入流化床设备Aeromatic MP-1(NiroAeromatic;多孔底部的穿孔面积:12%(12%FF))的锥体内,并加热到温度为50℃。具有大约20%重量的固体含量的998克含赖氨酸发酵液(类似于实施例1a和1b从玉米粗粉悬液获得)以滚轮泵供给双物质喷嘴(d=1.2毫米),并经由位于顶部喷雾位置的这个喷嘴(即从上面)喷到已经引入锥体中的固体上。喷雾压力是1.5巴。在加入278克及再加入另320克含赖氨酸发酵液(基于流化床设备中的总固体计,分别相应于10%和20%重量的一部分喷上的发酵固体)之后,在每种情况下中断喷雾过程用于中间干燥和取样(每种情况下为50克)。入口气量调节至大约45到60m3/h的范围内并在干燥步骤间降低。在最终干燥步骤期间入口气温在大约46℃到80℃的范围内,在某些情况下更低些。调节泵流量以使产物温度在大约50℃并基本上不低于45℃。冷却后,释放出513克产物。所取的所有三个产物样品的团块大小在几百微米的范围内。
c.4)接触干燥
将具有大约20%重量固体含量的240克含赖氨酸发酵液体(类似于实施例1a和1b得自玉米粗粉悬液)加到500ml圆底摇瓶内,并随后在稍微降低的压力(880到920毫巴)下在旋转蒸发器上浓缩。水浴温度为140-145℃。在约40分钟后,机械粉碎在摇瓶壁上产生的覆盖层,继续干燥并在再40分钟后进行又一次粉碎步骤。然后继续干燥,并偶尔中断以再次粉碎残余物。总干燥时间为2.5小时。得到的颗粒是深棕色并易于流动。颗粒的残留水分是3%。只有小量颗粒黏附在摇瓶壁上。
实施例2
使用依照实施例II.1得到的玉米粗粉水解物,用WO 05/059144中所述的ATCC13032lysCfbr菌株进行类似实施例1b)的发酵。在30℃,在灭菌CM琼脂(组成见表4;121℃下20分钟)上孵育细胞48小时。然后从平板上刮下细胞并重悬于盐水中。在每种情况下,使用由此制备的、610nm处的光密度达到OD610值为1的细胞悬液接种250ml Erlenmeyer瓶中的25ml培养基1或2(见表5)。然后在湿润摇床(相对大气湿度为85%)中200rpm、30℃下孵育样品48小时。通过HPLC的方式确定培养基中的赖氨酸浓度。在所有情况下,生产出大概相等量的赖氨酸。
如实施例1c.2)所述加工产生的含赖氨酸的发酵液来产生挤出物。
实施例3
在用谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032lysCfbr)的摇瓶试验(摇瓶1+2)中使用依照实施例II.3a获得的玉米粗粉水解物。此外,平行使用了类似于实施例II.3制备的小麦粗粉水解物(摇瓶3+4)和黑麦粗粉水解物(摇瓶5+6)。
3.1)制备接种物
细胞划线于灭菌的CM+CaAc琼脂(组成:见表7;在121℃下20分钟),然后在30℃下孵育48小时。然后接种到新鲜平板上并在30℃孵育过夜。其后从平板上刮下细胞并重悬于盐水中。在每种情况下,以如此制备的、610nm处光密度值达到OD610值为0.5的细胞悬液接种在250mlErlenmeyer摇瓶中的23ml培养基(见表8)。
表7:CM+CaAc琼脂平板的组成
浓度 | 成分 |
10.0g/l | D-葡萄糖 |
2.5g/l | NaCl |
2.0g/l | 尿素 |
5.0g/l | 细菌用蛋白胨(Difco) |
5.0g/l | 酵母提取物(Difco) |
5.0g/l | 牛肉膏(Difco) |
20.0g/l | 水解酪蛋白氨基酸 |
20.0g/l | 琼脂 |
3.2)制备发酵液
摇瓶培养基1到6的组成列于表8。
在对照培养基中,使用相应量的葡萄糖溶液代替粗粉水解物。
表8:摇瓶培养基
*以稀NaOH水溶液调节
**水解物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中称入的水解物的量
接种之后,在30℃下在湿润摇床中(200rpm)振荡孵育摇瓶48小时。在发酵终止后,用HPLC确定糖和赖氨酸的含量。使用来自Agilent的1100系列LC***进行HPLC分析。确定形成的氨基酸需要用邻苯二甲醛作柱前衍生,使用来自Agilent的Zorbax Extend C18柱分离产物混合物。结果汇辑在表9中。
表9
在所有摇瓶中产生了可比量的赖氨酸,为大约10到12g/l的数量级,相应于使用葡萄糖营养液的标准发酵中得到的产量。
依照实施例1c.1)加工所产生的含赖氨酸发酵液以生产可流动的粉末。
实施例4
在摇瓶试验(摇瓶1-3)中使用依照实施例II.3a得到的玉米粗粉水解物。泛酸生产菌株是芽孢杆菌PA824(详细描述见WO 02/061108)。此外,平行使用类似于实施例II.3制备的小麦粗粉水解物(摇瓶4-6)和黑麦粗粉水解物(摇瓶7-9)。
4.1)制备接种物
在每种情况下以0.4ml冻存培养物接种在装备有两个挡板的250mlErlenmeyer摇瓶中的42ml预培养培养基(见表10),并在43℃在湿润摇床里以250rpm振荡孵育24小时。
表10:预培养培养基的组成
成分 | 浓度 |
麦芽糖 | 28.6g/l |
大豆粉 | 19.0g/l |
(NH4)2SO4 | 7.6g/l |
谷氨酸一钠 | 4.8g/l |
柠檬酸钠 | 0.95g/l |
FeSO4x 7H2O | 9.5mg/l |
MnCl2x 4H2O | 1.9mg/l |
ZnSO4x 7H2O | 1.4mg/l |
CoCl2x 6H2O | 1.9mg/l |
CuSO4x 5H2O | 0.2mg/l |
Na2MoO4x 2H2O | 0.7mg/l |
K2HPO4x 3H2O | 15.2g/l |
KH2PO4 | 3.9g/l |
MgCl2x 6H2O | 0.9g/l |
CaCl2x 2H2O | 0.09g/l |
MOPS | 59.8g/l |
pH* | 7.2 |
*以稀KOH水溶液调节
在每种情况下以1ml预培养物接种装备有两个挡板的250mlErlenmeyer摇瓶中的42ml主要培养基(见表11)。
4.2)制备发酵液
摇瓶培养基1到9的成分列于表11。
在对照培养基中,使用相应量的葡萄糖溶液代替面粉水解物。
表11:摇瓶培养基
*以稀NaOH水溶液调节
**水解物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中称入的水解物的量
接种之后,在43℃下在湿润摇床中(250rpm)振荡孵育摇瓶24小时。在发酵终止后,用HPLC确定糖和泛酸的含量。借助于来自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱进行葡萄糖的测定。通过在来自Phenomenex的AquaC18柱上分离以测定泛酸浓度。结果汇辑在表12中。
表12
摇瓶号 | 葡萄糖[g/l] | 泛酸[g/l] |
1 | 0.00 | 1.75 |
2 | 0.00 | 1.70 |
3 | 0.00 | 1.73 |
4 | 0.10 | 1.80 |
5 | 0.10 | 1.90 |
6 | 0.19 | 1.96 |
7 | 0.12 | 2.01 |
8 | 0.12 | 2.12 |
9 | 0.13 | 1.80 |
在所有摇瓶中产生了可比量的泛酸,为大约1.5到2g/l的数量级,其与使用葡萄糖营养液的标准发酵中达到的产量一致。
在某些情况下依照实施例1c.3)加工产生的含泛酸发酵液以生产团聚物或依照实施例1c.4)进一步加工以生产干燥的粗粉末。
实施例5
在使用黑曲霉的摇瓶试验(摇瓶1-3)中使用依照实施例II.3a得到的玉米粗粉水解物。此外,平行使用类似于实施例II.3制备的小麦粗粉水解物(摇瓶4-6)和黑麦粗粉水解物(摇瓶7-9)。
5.1)菌株
近似于在WO 98/46772中有详细描述的NP505-7的生成,产生有6个拷贝的无花果曲霉(ficuum phyA)基因置于glaA启动子控制之下的黑曲霉植酸酶生产菌株。使用的对照是具有3个改变的glaA扩增子(类似于ISO 505)但没有整合的phyA表达盒的菌株。
5.2)制备接种物
在每种情况下以100μl冻存培养物接种在带挡板的100ml Erlenmeyer摇瓶中的20ml预培养培养基(见表13),并在34℃在湿润摇床里以170rpm振荡孵育24小时。
表13:预培养培养基的成分
成分 | 浓度 |
葡萄糖 | 30.0g/l |
酪蛋白胨 | 10.0g/l |
酵母提取物 | 5.0g/l |
KH2PO4 | 1.0g/l |
MgSO4x 7H2O | 0.5g/l |
ZnCl2 | 30mg/l |
CaCl2 | 20mg/l |
MnSO4x 1H2O | 9mg/l |
FeSO4x 7H2O | 3mg/l |
吐温80 | 3.0g/l |
青霉素 | 50000IU/l |
链霉素 | 50mg/l |
pH* | 5.5 |
*以稀的硫酸调节
在每种情况下以5ml预培养物接种带有一个挡板的250ml Erlenmeyer摇瓶中的50ml主要培养基(见表14)。
5.3)制备发酵液
摇瓶培养基1到9的成分列于表14。
在对照培养基中,使用相应量的葡萄糖溶液代替粗粉水解物。
表14:摇瓶培养基
*以释硫磺酸调节
**水解物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中称入的水解物的量
接种之后,在34℃下在湿润摇床中(170rpm)振荡孵育摇瓶6天。在发酵终止后,借助于试验确定植酸酶的活性。发酵终止后,在250mM乙酸/乙酸钠/吐温20(0.1%重量)、pH 5.5缓冲液中以适宜的植酸酶活性水平(标准:0.6U/ml)以植酸为底物测定植酸酶活性。对该试验进行标准化以用于微量板(MTP)。混合10μl酶溶液和140μl的6.49mM在pH 5.5、250mM乙酸钠缓冲液中的植酸盐溶液(植酸盐:植酸的十二钠盐)。在37℃孵育1小时后,加入等体积(150μl)的三氯乙酸使反应淬灭。转移此混合物的一个等分试样(20μl)到280μl含有0.32N H2SO4、0.27%重量钼酸铵和1.08%重量抗坏血酸的溶液中,然后在50℃下孵育25分钟。在820nm处测定蓝色溶液的吸光度。结果汇辑于表15。
表15
_____ | 植酸酶活性[FTU/ml]* |
玉米 | 433 |
小麦 | 476 |
黑麦 | 564 |
对照 | 393 |
*)FTU=Formazine浊度单位
依照实施例1c.1)加工产生的含植酸酶发酵液以产生粉末,并依照实施例1c.3)来产生粒状团聚物。
实施例6
在使用棉阿舒囊霉的摇瓶试验(摇瓶1-4)中使用依照实施例II.3a获得的玉米粗粉水解物。此外,平行使用类似于实施例II.3制备的小麦粗粉水解物(摇瓶5-8)和黑麦粗粉水解物(摇瓶9-12)。
6.1)菌株
使用的核黄素生产菌株是棉阿舒囊霉ATCC 10895(s.a.Schmidt G,等.抑制纯化的异柠檬酸裂合酶鉴定衣康酸和草酸是核黄素过量生产者棉阿舒囊霉的潜在抗代谢物.Microbiology 142:411-417,1996)。
6.2)制备接种物
细胞划线在灭菌的YMG琼脂(组成:见表16;121℃下20分钟)上,然后在28℃下孵育72小时。
表16:YMG琼脂平板的成分
成分 | 浓度 |
D-葡萄糖 | 4.0g/l |
酵母提取物 | 4.0g/l |
麦芽汁 | 10.0g/l |
琼脂 | 30.0g/l |
pH | 7.2 |
其后,在每种情况下以一满环细胞接种带有两个挡板的250mlErlenmeyer摇瓶中的50ml预培养培养基(见表17),并在28℃在湿润摇床里以180rpm振荡孵育24小时。
表17:预培养培养基的成分
成分 | 浓度 |
细菌用蛋白胨 | 10.0g/l |
酵母提取物 | 1.0g/l |
肌醇 | 0.3g/l |
D-葡萄糖 | 10.0g/l |
pH* | 7.0 |
*以稀NaOH水溶液调节
在每种情况下以5ml预培养物接种带有两个挡板的250ml Erlenmeyer摇瓶中的50ml主要培养基(见表18)。
6.3)制备发酵液
摇瓶培养基1到12的成分列于表18。
在对照培养基中,使用相应量的葡萄糖溶液代替粗粉水解物。
表18:摇瓶培养基
*以稀NaOH水溶液调节
**水解物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中称入的水解物的量
接种之后,在28℃下在湿润摇床中(180rpm)振荡孵育摇瓶6天。在发酵终止后,用HPLC确定维生素B2含量。结果汇辑在表19。
表19
维生素B2 | |
玉米 | 2.73g/l |
小麦 | 2.15g/l |
黑麦 | 2.71g/l |
对照 | 0.12g/l |
依照实施例1c.1)加工产生的含维生素B2的发酵液以产生粉末,并依照实施例1c.3)来产生粒状团聚物。
实施例7
在使用谷氨酸棒状杆菌的摇瓶试验(摇瓶1-3)中使用依照实施例II.3a得到的玉米粗粉水解物。此外,平行使用类似于实施例II.3制备的小麦粗粉水解物(摇瓶4-6)和黑麦粗粉水解物(摇瓶7-9)。
7.1)菌株
生产甲硫氨酸的棒状杆菌菌株为技术人员所已知。此类菌株的生产在例如Kumar D.Gomes J.Biotechnology Advances,23(1):41-61,2005;Kumar D.等.,Process Biochemistry,38:1165-1171,2003;WO 04/024933和WO 02/18613中有述。
7.2)制备接种物
细胞划线于灭菌CM+Kan琼脂(成分:见表20;121℃下20分钟)然后在30℃下孵育24小时。其后,从平板上刮下细胞并重悬于盐水。在每种情况下以610nm处光密度达到0.5OD610值的所得细胞悬液接种在装备有两个挡板的250ml Erlenmeyer摇瓶中的25ml培养基(见表5)。
表20:CM+Kan琼脂平板的组成
浓度 | 成分 |
10.0g/l | D-葡萄糖 |
2.5g/l | NaCl |
2.0g/l | 尿素 |
10.0g/l | 细菌用蛋白胨(Difco) |
5.0g/l | 酵母提取物(Difco) |
5.0g/l | 牛肉膏(Difco) |
20μg/ml | 卡那霉素 |
25.0g/l | 琼脂 |
7.3)制备发酵液
摇瓶培养基1到9的成分列于表21。在对照培养基中,使用相应量的葡萄糖溶液代替粗粉水解物。
表21:摇瓶培养基
*以稀NaOH水溶液调节
**水解物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中称入的水解物的量
接种之后,在30℃下在湿润摇床中(200rpm)振荡孵育摇瓶直至所有葡萄糖均被消耗。在发酵终止后,用HPLC确定甲硫氨酸含量(柱:AgilentZORBAX Eclipse AAA;方法依照Eclipse AAA操作方案,Technical Note5980-1193)。结果汇辑在表22。
表22
依照实施例1c.4)加工产生的含甲硫氨酸发酵液以产生粗粉末。
实施例8
在使用细菌130Z的摇瓶实验中使用依照实施例II.3a获得的玉米粗粉水解物。
8.1)菌株
使用的琥珀酸盐生产菌株是细菌130Z(ATCC No.55618)。
8.2)制备发酵液
在每种情况下以1ml冻存培养物接种120ml血清瓶中的50ml主要培养基(见表23)。在密封血清瓶之前,注入CO2(0.7巴)。
培养基的成分列于表23(参见US 5,504,004)。在对照培养基中,使用相应量的葡萄糖溶液代替粗粉水解物(最终葡萄糖浓度:100g/l)。
表23:培养基*
成分 | 浓度 |
玉米381.4g/kg** | 262g/l*** |
NaCl | 0.1g/l |
K2HPO4 | 0.3g/l |
MgCl2x 6H2O | 20mg/l |
CaCl2x H2O | 20mg/l |
(NH4)2SO4 | 0.1g/l |
生物素 | 200μg/l |
CSL | 15.0g/l |
10%酵母提取物 | 15.0g/l |
MgCO3 | 80.0g/l |
*用气体处理并在CO2/N2气下分散
**水解物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中称入的水解物的量
接种之后,在37℃下在摇床中(160rpm)振荡孵育血清瓶46小时。在发酵终止后,用HPLC确定葡萄糖和琥珀酸盐含量。借助于来自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱进行测定。结果汇辑在表24。
表24
编号. | 葡萄糖[g/l] | 琥珀酸盐[g/l] |
1 | 30.93 | 42.501 |
2 | 29.273 | 44.114 |
对照 | 17.414 | 47.73 |
如实施例1c.1)中所述加工产生的含琥珀酸盐的发酵液以产生干粉。
实施例9
在使用大肠杆菌的摇瓶试验(摇瓶1-3)中使用依照实施例II.3a获得的玉米粗粉水解物。此外,平行使用类似于实施例II.3制备的小麦粗粉水解物(摇瓶4-6)和黑麦粗粉水解物(摇瓶7-9)。
9.1)菌株
生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株为技术人员所已知。在例如EP 1013765A1、EP 1016710A2、US 5,538,873中描述了此类菌株的生产。
9.2)制备接种物
细胞划线于灭菌LB琼脂上。如果在所讨论的菌株中存在作为标记的适宜抗性基因,则加入抗生素到LB琼脂中。可以用于此目的的物质有例如卡那霉素(40μg/ml)或氨苄青霉素(100mg/l)。在30℃下孵育菌株24小时。在将细胞划线于补加甲硫氨酸(50μg/ml)、卡那霉素(40μg/ml)和高丝氨酸(10μg/l)的灭菌M9葡萄糖极限培养基之后,在30℃下孵育24小时。其后,从平板上刮下细胞并重悬于盐水中。在每种情况下以如此制备的、610nm处光密度达到0.5OD610值的细胞悬液接种装备有两个挡板的250mlErlenmeyer瓶中的25ml培养基(见表25)。
9.3)制备发酵液
摇瓶培养基1到9的成分列于表25。在对照培养基中,使用相应量的葡萄糖溶液代替粗粉水解物。
表25:摇瓶培养基
*以稀NaOH水溶液调节
**水解物中的葡萄糖浓度
***每升培养基中称入的水解物的量
接种之后,在30℃下在湿润摇床中(200rpm)振荡孵育摇瓶直至所有葡萄糖均被消耗。在发酵终止后,如Lindroth等.(Analytical Chemistry51:1167-1174,1979)所述,可以通过反相HPLC确定L-苏氨酸含量。
依照实施例1c.1)到1c.3)进一步加工产生的含苏氨酸的发酵液以产生干粉、挤出物或团聚物。
实施例10
使用合适的菌株,其它的L-氨基酸,谷氨酸、组氨酸、脯氨酸和精氨酸可以类似于实施例9的方法来制备。所讨论的菌株在例如EP 1016710中有述。
依照实施例1c.1)到1c.3)能够进一步加工产生的含氨基酸的发酵液以产生干产品。
实施例11
在使用黑曲霉的摇瓶实验中使用部分糖化的玉米粗粉水解物。
11.1)液化与(部分)糖化
类似于实施例II.3a进行液化。在悬液已被冷却至61℃及pH调节到4.3后,加入5.38ml(等于1.5%重量的酶/干物质)Dextrozyme GA(NovozymesA/S)。在每种情况下,添加酶后10、15、20、30、45和60分钟,取出50克样品并悬于25ml灭菌冰冷的充分软化水中。放置样品于冰浴中并立即用于摇瓶试验中。没有发生酶的失活。
11.2)发酵
使用实施例5.1)中所用的菌株。如实施例5.2)所述制备接种物。
为制备发酵液,使用组成列于表29的摇瓶培养基。以每种样品制备两个摇瓶。
表29:摇瓶培养基
玉米 | 10g/l*** |
酪蛋白胨 | 25.0g/l |
酵母提取物 | 12.5g/l |
KH2PO4 | 1.0g/l |
K2SO4 | 2.0g/l |
MgSO4x 7H2O | 0.5g/l |
ZnCl2 | 30mg/l |
CaCl2 | 20mg/l |
MnSO4x 1H2O | 9mg/l |
FeSO4x 7H2O | 3mg/l |
青霉素 | 50000IU/l |
链霉素 | 50mg/l |
pH* | 5.6 |
*以稀硫酸调节
***在每升培养基中称入的部分糖化的水解物的量
接种之后,在34℃下在湿润摇床中(170rpm)振荡孵育摇瓶6天。在发酵终止后,借助于(实施例5.3中所述)试验确定植酸酶活性。结果汇辑于表30。
表30
依照实施例1c.2)和1c.3)加工产生的含植酸酶的发酵液来产生挤出物或团聚物。
实施例12
在使用谷氨酸棒状杆菌的摇瓶实验中使用部分糖化的玉米粗粉水解物。
12.1)液化与(部分)糖化
类似于实施例II.3a进行液化。在悬液已被冷却至61℃及pH调节到4.3后,加入5.38ml(等于1.5%重量的酶/干物质)Dextrozyme GA(NovozymesA/S)。在每种情况下,添加酶后10、15、20、30、45和60分钟,取出50克样品并悬于25ml灭菌冰冷的充分软化水中。放置样品于冰浴中并立即用于摇瓶试验中。没有发生酶的失活。
12.2)发酵
使用实施例3)中所用的菌株。如实施例3.1)所述制备接种物。
为制备发酵液,使用组成列于表29的摇瓶培养基。以每种样品制备两个摇瓶。
表31:摇瓶培养基
*以稀NaOH水溶液调节
***在每升培养基中称入的部分糖化的水解物的量
接种之后,在30℃下在湿润摇床中(200rpm)振荡孵育摇瓶48小时。在发酵终止后,通过HPLC确定葡萄糖和赖氨酸含量。用Agilent 1100系列LC***进行HPLC分析。借助于来自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱确定葡萄糖。通过在Agilent 1100系列LC***HPLC上的高压液相色谱,确定该氨基酸浓度。用邻苯二甲醛作柱前衍生以允许定量形成的氨基酸,使用Hypersil AA柱(Agilent)分离氨基酸混合物。结果汇辑在表32中。
表32
依照实施例1c.1)或1c.4)加工产生的含赖氨酸发酵液来给出粉末或颗粒。
Claims (17)
1.通过基于糖的微生物发酵以固体形式生产至少一种非挥发性微生物代谢物的方法,其中非挥发性代谢物选自酶、氨基酸、维生素和具有3到10个碳原子的脂族单-和二羧酸,在该方法中生产期望代谢物的选自棒状杆菌属、芽孢杆菌属、阿舒囊霉属、埃希氏杆菌属、曲霉属和放线杆菌属的微生物菌株使用含糖液体培养基培养,并且随后实质性地大量去除发酵液的挥发性成分,其中所述含糖液体培养基具有基于该液体培养基的总重量按重量计大于30%的单糖含量,该含糖液体培养基的生产包括:
a1)通过研磨选自谷粒的淀粉源生产经研磨物;及
a2)在水性液体中在至少一种淀粉液化酶存在的情况下液化该经研磨物,之后使用至少一种糖化酶进行糖化,以获得具有基于该液体培养基总重量按重量计大于30%的单糖含量的含糖液体培养基,其中含糖液体培养基中还包含存在于经研磨物中的按重量计至少50%量的非淀粉性固体成分,其中基于经研磨物的淀粉性成分,经研磨物中所包含的非淀粉性固体成分的量为按重量计从25%到75%,
其中,为了液化目的,将按重量计至少40%的经研磨物在液化过程中连续地或分批地加至所述水性液体中,
且其中,从该发酵液,以固体形式、与该发酵液的所有不溶性成分一起,获得所述的至少一种非挥发性代谢物,
并且其中所述方法还包含获得至少90%的一种固体非挥发性微生物代谢物,和发酵培养基的固体成分混合。
2.依照权利要求1的方法,包括:
a)如步骤a1)和a2)所述制备具有大于30%重量的单糖含量的含糖液体培养基,其中含糖液体培养基还包含基于经研磨物的淀粉性成分按重量计至少25%的淀粉源的非淀粉性固体成分;
b)在发酵中使用该含糖液体培养基以生产非挥发性代谢物;和
c)通过去除发酵液中的挥发性成分,与淀粉源的非淀粉性固体成分一起,从发酵液中获得固体形式的非挥发性代谢物。
3.依照前述权利要求任一项的方法,其中在至少一种α-淀粉酶存在的情况下在水性液体中液化经研磨物,并且随后使用至少一种葡糖淀粉酶糖化。
4.依照权利要求3的方法,其中将至少一种α-淀粉酶的一部分在步骤a2)的液化期间加入至水性液体中。
5.依照前述权利要求任一项的方法,其中谷物选自玉米、黑麦、黑小麦和小麦粒。
6.依照前述权利要求任一项的方法,其中,在步骤a1)中在研磨期间获得的经研磨物含有至少50%重量的具有大于100微米的颗粒大小的面粉颗粒。
7.依照前述权利要求任一项的方法,其中在步骤a2)中以使得所述液体培养基的粘度不超过20Pas的方式进行经研磨物的液化和糖化。
8.依照前述权利要求任一项的方法,其中在液化期间加入的经研磨物的总量中至少25%重量是在高于经研磨物中存在的淀粉的糊化温度的温度下加入的。
9.依照前述权利要求任一项的方法,其中在发酵步骤之前将至少一种植酸酶加入含糖液体培养基。
10.依照前述权利要求任一项的方法,其中微生物选自谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、棉阿舒囊霉、大肠杆菌、黑曲霉、和产琥珀酸放线杆菌的菌株。
11.依照前述权利要求任一项的方法,其中,从发酵液中去除发酵液的挥发性成分至基于固体成分的总干重0.2%到20%重量的残留含水量。
12.依照前述权利要求任一项的方法,其中发酵液被喷雾干燥、流化床干燥或冷冻干燥以去除挥发性成分。
13.依照权利要求12的方法,其中使用一种或多种干燥助剂。
14.通过依照权利要求1到13之任一项的方法得到的代谢物的固体制剂,其包含:
A)大于10%到80%重量的至少一种非挥发性代谢物;
B)1%到50%重量的来自生产该非挥发性代谢物的发酵中的生物质;
C)1%到50%重量的来自发酵液的淀粉源的非淀粉性固体成分;及
D)基于成分A、B和C的总重量,0到400%重量的常规制剂助剂;
所述A、B和C的重量份总计为100%重量份。
15.依照权利要求14的制剂,包含,基于制剂的总重量,至少5%重量的膳食纤维。
16.依照权利要求14或15的制剂用于人类或动物营养的用途。
17.依照权利要求14或15的制剂在处理纺织品、皮革、纤维素、纸张或表面中用途。
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