CN104911165A - 一种纤维素酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维素酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其产生的重组纤维素酶制剂。该具有内切葡聚糖活性的纤维素酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其基因的编码序列是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。通过构建重组载体并在大肠杆菌中表达表达产物具有1,4-β-D内切葡聚糖功能，本发明的纤维素酶可用于各种含纤维素纤维的处理。

Description

一种纤维素酶基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和酶工程领域，具体涉及一种纤维素酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。

背景技术

纤维素酶是指能够水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键，使得纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一类酶系的总称，根据对糖苷键不同的催化作用，可以分为外切葡聚糖苷酶（1,4-β-D-glucanase或exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91，来自真菌的简称CBH，来自细菌的简称Cex），内切葡聚糖苷酶（1,4-β-D-glueanase或endo-1,4-β-D-glueanase，EC 3.2.1.4，CMC酶，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Cen)和β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG)。其中内切葡聚糖苷酶作用于纤维素分子内部的无定型区，能随机水解β-1,4-糖苷键，将长的纤维素分子截短，产生大量不同长度的带非还原性末端的小分子纤维素。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种纤维素酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。

本发明采用的技术方案如下：

本发明旨在提供一种从芽孢杆菌Bacillus sp. 48-1中分离得到的纤维素酶基因，该基因核苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2互补的核苷酸序列，该基因序列长度为1086 bp（碱基）。

本发明的核苷酸序列是DNA形式的，包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，可以是单链的或是双链的。由于核苷酸序列的特殊性，任何与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有80%以上同源性且具有相同功能的多核苷酸变体，均在本发明的保护范围之内。所述多核苷酸变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列，可以使用本领域所熟知的取代、缺失或***变异来获得。

本发明中的纤维素酶基因编码的氨基酸序列是具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸残基序列的多肽或蛋白质。由于氨基酸序列的特殊性，只要是含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物与SEQ ID NO.1所示的氨基酸残基序列具有90%以上同源性且具有相同活性的蛋白质，均在本发明的保护范围之内。这些方法包括氨基酸序列中氨基酸残基的缺失、***、化学修饰或替换，所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白。

本发明的另一目的是提供一种含有纤维素酶基因的重组表达载体，是将SEQ ID NO.2所示基因直接与不同表达载体连接所构建的重组载体。

本发明中，编码纤维素酶的多核苷酸序列可以***到载体中，以构成含有本发明所述的重组载体。载体是指本领域所熟知的质粒、病毒或其他载体，建议优选pET载体系列及其他原核表达载体。可用本领域技术人员熟知的方法来构建含编码纤维素酶的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述编码纤维素酶的核苷酸序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40 启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中***增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录，如腺病毒增强子。

本发明中，编码纤维素酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可以用本领域的技术人员熟知的方法转化或者导入到宿主细胞中，该细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代，代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞或酵母；植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑色素瘤细胞等。

本发明还涉及所述编码基因在制备重组纤维素酶中的应用，通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可以构建表达或生产重组的纤维素酶。一般来说可以通过以下步骤实现：构建重组载体，转化入宿主细胞构建重组细胞，在合适的培养基中培养宿主细胞，从培养基或细胞中分析、纯化蛋白质。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明利用大肠杆菌表达***构建了纤维素酶的工程菌，可以用来快速、大量表达纤维素酶。所需培养基及培养条件简单，工艺简单，周期短，可以大大降低生产成本。在构建载体时在纤维素酶的C-末端加入了组氨酸(His)标签，可与镍柱特异性结合，便于纯化。该纤维素酶基因来源于烤烟表面微生物基因组，可以利用生产的纤维素酶作用于烤烟纯化过程，进而改变烤烟纯化进程，有利于改善烟叶品质。

附图说明

图1为本发明构建的大肠杆菌BL21(DE3)表达载体48-pET-30a；

图2为本发明中重组质粒的双酶切图谱，图中：M是marker；泳道1是重组质粒，泳道2是双酶切结果，泳道3是克隆产物。

图3是本发明SDS-PAGE检测纯化效果示意图，图中M是marker，泳道1是未加诱导剂对照；2是未纯化的诱导表达蛋白；3是纯化后的蛋白。

图4为本发明中用不同浓度咪唑洗脱蛋白后SDS-PAGE检测结果示意图，图中M是marker，泳道1~8分别为50,80,100,150,200,250,300,500mmol/l咪唑洗脱液。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）48-1中分离得到的纤维素酶基因的核苷酸序列。

采用CTAB法提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，取2μl为模板进行聚合酶链式反应（PCR），根据已发表的纤维素酶同源序列的保守区，结合所用载体设计引物（引物F和引物R），在此PCR反应过程中所用引物、组分和扩增条件如下：

引物F：5’-CGGGATCCATGGCAAAATTAGATGAAAC-3’（SEQ ID NO.3）

引物R：5’-GGAATTCTTATTGGTACGTAATTTCG-3’（SEQ ID NO.4）

PCR扩增体系组成如表1所示。

表1

扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性45S，55℃退火45S，72℃延伸90S，72℃补齐末端10min，变性、退火、延伸三步进行30个循环。PCR扩增结束后用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，得到了大小约1100bp的片段，用多功能DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）（北京百泰克生物技术有限公司）回收，把回收片段亚克隆到pMD-18T（TaKaRa公司产品）中，连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB固体平板上进行培养，挑取平板上生长的白色菌落，通过菌落PCR验证阳性克隆，将验证为阳性的克隆子接入到LB液体培养基（加入100μg/ml氨苄青霉素），37℃过夜培养，用高纯质粒小量提取试剂盒（离心柱型）（北京百泰克生物技术有限公司）提取质粒，经测序（北京奥科鼎盛生物科技有限公司），测序结果显示所得片段大小为1086bp。

实施例2：重组表达载体的构建

实施例1中扩增得到的片段，因其引物F的5’端分别含有BamH I酶切位点（第3个碱基到第8个碱基）和引物R的5’端分别含有EcoRⅠ酶切位点（第2个碱基到第7个碱基），所以使用这两个酶对片段进行双酶切，同时将PET30a用相同的酶进行双酶切，电泳回收酶切大片段，并用T4连接酶在16℃连接10h，构建成功的载体示意图如图1所示。连接产物用化学转化法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，在含卡那霉素（100μg/ml）的LB固体平板上进行培养，挑取平板上生长的白色菌落，通过菌落PCR和提取质粒双酶切（图2）筛选到阳性克隆并测序鉴定，成功构建含有纤维素酶基因的大肠杆菌宿主细胞。

实施例3：纤维素酶的制备

将实施例2中得到的重组工程菌按1%接种量接到100ml LB液体培养基（含1‰ 50mg/ml卡那霉素），37℃，150rpm培养到OD₆₀₀=0.6，加入1‰的1mmol/l IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），转到16℃，80rpm诱导10h后，离心收集菌体，将菌体用5ml 50mmol/l的咪唑缓冲液(pH8.2)悬浮，超声破碎。离心取上清，然后用5ml 50mmol/l的咪唑缓冲液(pH8.2)悬浮，分别取50μl进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），条带出现在离心后的沉淀中，说明得到的重组蛋白是包涵体。

实施例4：包涵体的变性复性以及酶活的测定

将工程菌按实施例3的方法诱导表达，收集菌体，超声破碎，离心后去掉上清，用5ml 8mol/l的尿素溶液(pH8.0)重悬沉淀，于37℃过夜使包涵体变性。将变性后的溶液装入到透析袋中，放入透析液(Tis Base12.14g/l，用盐酸调pH至8，然后每升加入200μlβ-巯基乙醇)中透析24h复性，其中换液两次。

酶活力单位的定义：1毫升液体酶（或1克固体酶粉），在40℃ pH﹦4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na），产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。

酶活的测定：采用CMC糖化力法。

实施例5：纤维素酶的纯化

将实施例4中变性又复性后的蛋白液上镍柱进行纯化，镍柱中的硫酸镍可以与有His（组氨酸）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。先将蛋白液以一定速度通过镍柱使蛋白质挂柱，然后用不同浓度的咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示，纯化的效果如图3所示。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定 。

本发明所述的纤维素酶的氨基酸序列、核苷酸序列及引物序列如下所示。

SEQ ID NO.1

MET Ala Lys Leu Asp Glu Thr Leu Thr MET Leu Lys Asp Leu Thr

1               5                   10                  15

Asp Ala Lys Gly Ile Pro Gly Asn Glu Arg Glu Val Arg Gln Val

16              20                  25                  30

MET Lys Ser Tyr Ile Glu Pro Phe Ala Asp Glu Val Thr Thr Asp

31              35                  40                  45

Arg Leu Gly Ser Leu Ile Ala Lys Lys Thr Gly Ala Glu Asn Gly

46              50                  55                  60 

Pro Lys Ile MET Ile Ala Gly His Leu Asp Glu Val Gly Phe MET

61              65                  70                  75

Val Thr Gln Ile Thr Asp Lys Gly Phe Ile Arg Phe Gln Thr Val

76              80                  85                  90

Gly Gly Trp Trp Ala Gln Val MET Leu Ala Gln Arg Val Thr Ile

91              95                  100                 105

Val Thr Lys Lys Gly Glu Ile Thr Gly Val Ile Gly Ser Lys Pro

106             110                 115                 120

Pro His Ile Leu Ser Pro Glu Ala Arg Lys Lys Ser Val Glu Ile

121             125                 130                 135

Lys Asp MET Phe Ile Asp Ile Gly Ala Ser Ser Arg Glu Glu Ala

136             140                 145                 150

Leu Glu Trp Gly Val Leu Pro Gly Asp MET Val Val Pro His Phe

151             155                 160                 165

Glu Phe Thr Val MET Asn Asn Glu Lys Phe Leu Leu Ala Lys Ala

166             170                 175                 180

Trp Asp Asn Arg Ile Gly Cys Ala Ile Ala Ile Asp Val Leu Arg

181             185                 190                 195

Asn Leu Gln Asn Thr Asp His Pro Asn Ile Val Tyr Gly Val Gly

196             200                 205                 210

Thr Val Gln Glu Glu Val Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Ala Ala

211             215                 220                 225

His Thr Ile Gln Pro Asp Ile Ala Phe Gly Val Asp Val Gly Ile

226             230                 235                 240

Ala Gly Asp Thr Pro Gly Ile Ser Glu Lys Glu Ala Gln Ser Lys

241             245                 250                 255

MET Gly Lys Gly Pro Gln Ile Ile Val Tyr Asp Ala Ser MET Val

256             260                 265                 270

Ser His Lys Gly Leu Arg Asp Ala Val Val Ala Thr Ala Glu Glu

271             275                 280                 285

Ala Gly Ile Pro Tyr Gln Phe Asp Ala Ile Ala Gly Gly Gly Thr

286             290                 295                 300

Asp Ser Gly Ala Ile His Leu Thr Ala Asn Gly Val Pro Ala Leu

301             305                 310                 315 

Ser Ile Thr Ile Ala Thr Arg Tyr Ile His Thr His Ala Ala MET

316             320                 325                 330

Leu His Arg Asp Asp Tyr Glu Asn Ala Val Lys Leu Ile Thr Glu

331             335                 340                 345

Val Ile Lys Lys Leu Asp Arg Lys Thr Val Asp Glu Ile Thr Tyr

346             350                 355                 360

Gln

361

SEQ ID NO.2

atggcaaaat tagatgaaac attgaccatg ctgaaagatt taacagatgc aaaaggcata       60

ccgggcaatg aaagagaagt aaggcaagtg atgaaatcat acatagaacc atttgctgat      120

gaggtgacaa cagatcgcct gggcagttta attgccaaaa aaactggtgc agaaaacggc      180

ccgaaaatta tgatcgccgg acatttggat gaagtcggct ttatggtgac acaaatcacc      240

gataaaggct ttatccgttt tcaaaccgtt ggcggctggt gggctcaggt tatgcttgcc      300

cagcgcgtca ccattgtcac aaaaaaagga gaaatcacag gggttatcgg atctaagccg      360

cctcatattt tgtctcctga agcaagaaaa aaatcagtgg aaataaaaga catgtttatt      420

gatattggag cttcaagccg ggaagaagcc ttggagtggg gtgtactccc gggagatatg      480

gtcgttccgc attttgagtt tacggtcatg aacaatgaaa aattcctact cgcaaaggcc      540

tgggacaacc gcatcggctg tgcgattgca attgatgtgt taagaaactt acaaaacaca      600

gaccatccaa atatagtgta tggcgtcgga accgtgcagg aggaagtcgg gctgagagga      660

gcgaaaacgg ctgcacacac cattcagcct gatattgcgt ttggtgttga tgtagggata      720

gcaggagaca cgcctggcat ttccgagaag gaagcgcaga gcaaaatggg caaaggcccg      780

cagattatcg tttatgatgc atctatggtc tctcacaaag gtttgcgcga tgcagttgtg      840

gcaactgcag aggaagccgg cattccgtac caatttgatg ccattgccgg cggcggaact      900

gattcgggtg ccatccattt gacggcaaat ggcgttcctg cgctgtccat taccattgca      960

acccgctaca ttcatacgca cgcggccatg ctgcatcgtg atgattatga aaacgcggta     1020

aagttaatta cagaagtcat taagaagtta gaccgaaaaa cggttgacga aattacgtac     1080

caataa                                                                1086

SEQ ID NO.3

cgggatccat ggcaaaatta gatgaaac                                          28

SEQ ID NO.4

ggaattctta ttggtacgta atttcg                                            26

Claims (6)

1.一种纤维素酶，其特征在于，所述的纤维素酶为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。

2.编码权利要求1所述纤维素酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的编码序列是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所示的基因的重组载体。

5.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.权利要求2或3所述的基因在制备重组纤维素酶中的应用。