CN104906076B - 程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***及其制备方法和应用，属于生物医学材料领域。本发明以两亲性树状大分子组装体作为载体的药物递送***，通过响应肿瘤微环境实现程序化多重靶向，从而攻克药物载体在体内转运过程中遇到的主要生物学障碍并最终把药物传递到目的地。通过多种端基功能化作用使所得的自组装体具有程序化多重靶向效果。一方面利用树状形分子作为药物载体所具备的好的稳定性、高的机械强度、多价的末端基团、高支化结构和仿病毒的胞内递送等优势；另一方面利用多元协同自组装策略整合树状大分子自组装基元上各功能基团的优势便于实现组装体的多功能化和高效的药物***递送。尤其适用于抗肿瘤药物的递送。

Description

程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***及其制备 方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种程序化多重靶向药物载体。

技术背景

目前，恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和发展，是全人类面临的共同难题之一。化疗作为最常用的治疗手段之一，实现了对肿瘤一定程度上的抑制；但是，目前化疗药物面临的水溶性差、体内代谢和分布不理想、毒副作用大等问题都亟待解决。纳米递送***在增加药物溶解度、改善药物代谢和降低毒副作用中具有显著优势，经过近几年的研发，一些纳米药物递送***已经成功应用于临床治疗（如，装载阿霉素的纳米脂质体Doxil^®，包载紫杉醇的纳米胶束Genexol-PM^®等）。在临床治疗中，纳米递送***仍有诸多问题没有得到妥善的解决，特别是如何通过对肿瘤组织及细胞的特异性识别以降低化疗过程中毒副作用问题亟待解决。

化学、材料科学与纳米技术的发展成为了孕育新型纳米载体***的摇篮；一方面不断创造新型的载体***，另一方面逐步地完善载体的功能。研究者们先后开发如脂质体、树状大分子、胶束、聚合物囊泡等一系列的纳米载体用于抗肿瘤药物的传递。2010年著名化学科学家Virgil Percec教授在Science上率先报道了双亲性树状大分子自组装体的构建策略（Science, 2010, 328, 1009），美国著名生物材料学家Robert Langer认为这种组装体是新近的一代纳米载体***（Nano letters, 2010, 10, 3223）。树状大分子组装体相较于其它纳米递送***具有高的稳定性和机械强度、丰富的表面官能团、结构生物仿生等特征。我们研究组长期致力于完善树状大分子组装体的功能性，开发了新型高效的药物和基因递送***；为了进一步解决药物毒副作用的问题，我们希望能够通过合理的靶向策略提高纳米递送***对肿瘤组织的识别，以提高药物利用度和治疗效果并降低毒副作用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种以两亲性树状大分子组装体作为载体的药物递送***，通过响应肿瘤微环境实现程序化多重靶向，从而攻克药物载体在体内转运过程中遇到的主要生物学障碍并最终把药物传递到目的地。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***，所述药物递送***由外层到内层依次包括：抗蛋白吸附的遮蔽层，正电荷层和/或主动靶向功能层，解组装功能层；所述抗蛋白吸附的遮蔽层与正电荷层和/或主动靶向功能层之间通过环境敏感键连接，使所述抗蛋白吸附的遮蔽层包裹在所述正电荷层和/或主动靶向功能层***，所述环境敏感键能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂从而使所述正电荷层和/或主动靶向功能层暴露，所述解组装功能层能够在细胞内发生断裂使树状大分子组装体解组装。

作为可选方式，所述抗蛋白吸附的遮蔽层包括PEG、肝素钠、透明质酸、带负电荷的亲水性基团及寡糖分子等具有抗蛋白吸附功能的基团中的至少一种，其作用是遮蔽在药物递送***的***，有效抵抗血液中蛋白成份吸附和清除作用，增加药物递送***在体内的循环时间，使其能顺利的达到目标部位。

作为可选方式，所述正电荷层包括赖氨酸、组氨酸、精氨酸等碱性氨基酸中的至少一种。进一步的，所述树状大分子以赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的至少一种作为支化单元，其最外层的支化单元直接可构成自组装体中的正电荷层，无需再额外的接枝带正电荷的基团进行改性。

作为可选方式，所述主动靶向功能层包含但不限于叶酸、生物素或RGD肽等能主动靶向肿瘤细胞的修饰。进一步的，所述主动靶向功能层可以被包裹在所述抗蛋白吸附的遮蔽层的内部，也可以与上述抗蛋白吸附的遮蔽层一起裸露在药物递送***的***或镶嵌在所述抗蛋白吸附的遮蔽层中。

作为可选方式，所述环境敏感键是指能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂从而使抗蛋白吸附的遮蔽层脱落的连接方式。可以是酸敏感基团（马来酸酐、2-甲基马来酸酐、2，3-二甲基马来酸酐、1，2-二羧基环己烯或2，2，3，3-四甲基马来酸酐等）或酶敏感底物肽（如MMP-2、MMP-7或MMP-9等）或温度敏感基团（如D-A加成键）或还原敏感基团（如二硫键、二硒键等）中的一种或几种。进一步的，当采用马来酸酐、2-甲基马来酸酐、2，3-二甲基马来酸酐、1，2-二羧基环己烯或2，2，3，3-四甲基马来酸酐等或MMP-2、MMP-7或MMP-9等时可以将这些基团既作为抗蛋白吸附功能基团又作为连接分子，可以不用再接枝其他抗蛋白吸附的功能基团。

作为可选方式，所述解组装功能层包括腙键、酯键、羟醛缩合等易水解键，使得自组装体的主体结构在胞内容易发生断裂而实现解组装，释放出药物有效成分。进一步的，所述自组装体的自组装基元的亲水端与疏水端之间通过所述易水解键连接。

作为可选方式，在上述药物递送***中，药物有效成分可以被包裹在自组装体内部，也可以将药物作为树状大分子自组装基元的组成部分，如将疏水性药物通过易水解键连接到树状大分子中作为自组装基元的疏水端。

作为可选方式，所述药物递送***的粒径在100纳米到200纳米范围内，能够通过EPR效应被动靶向到肿瘤部位实现富集。

作为可选方式，构成所述药物递送***的树状大分子自组装基元的主体结构为肽类树状大分子。

作为可选方式，所述药物递送***由多种带有不同功能基团的树状大分子自组装基元混合自组装而成。

本发明还提供了一种树状大分子自组装基元，所述自组装基元为两亲性的树状大分子，包括亲水端和疏水端，所述亲水端包括两层，其内层含有丰富的正电荷基团，用于构成组装体的正电荷层，其外层修饰有抗蛋白吸附功能分子，所述抗蛋白吸附功能分子通过环境敏感键连接在所述亲水端的***，所述环境敏感键能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂，所述自组装基元中还包括能够在细胞内发生断裂连接件，用于构成组装体的解组装功能层。

作为可选方式，在上述自组装基元中，所述亲水端还修饰有主动靶向分子或基团，如叶酸、生物素或RGD肽中的至少一种，所述主动靶向分子或基团能够与肿瘤细胞膜表面高表达受体特异性结合促进组装体选择性入胞。

通过采用端基功能化的树状大分子作为自组装基元，自组装基元之间通过亲疏水作用自组装形成组装体，通过自组装基元之间比例的调节来发挥最佳效果。通过所述端基功能化在所述树状大分子的亲水端进行主动靶向分子或者刺激（pH，酶等）响应性基团的修饰，通过多种端基功能化作用使所得的自组装体具有程序化多重靶向效果。所述程序化多重靶向是指（1）功能化的树状大分子自组装体表面带负电荷或抗蛋白吸附基团，有效抵抗血液中蛋白成份吸附增加体内循环时间，且尺寸在EPR效应范围内能被动靶向到肿瘤部位实现富集；（2）肿瘤细胞外环境靶向促使树状大分子组装体***敏感集团断裂离去露出正电荷层，与细胞膜表面产生静电作用促进其入胞；（3）***修饰的主动靶向分子或基团与肿瘤细胞膜表面高表达受体特异性结合进一步促进组装体选择性入胞；（4）***酸缓冲基团暴露的组装体可靶向溶酶体并有效缓冲其低的pH环境，实现溶酶体逃逸并在胞内发生解组装释放出药物有效成分，最终传递药物分子到细胞核发挥治疗作用。

作为可选，可以在同一个自组装基元上进行多种端基功能化，也可以将不同端基功能化的多种自组装基元进行混合自组装，通过两亲性树状大分子多元协同自组装策略可整合各个自组装基元自身的特性便于实现组装体的多功能化。

作为可选方式，在上述自组装基元中，所述两亲性树状大分子是以氨基酸为重复单元的一代、二代、三代或四代含肽类树状大分子。

作为可选方式，构成上述程序化多重靶向的两亲性树状大分子组装体的自组装基元的种类可以是1种或1种以上，分别命名为自组装基元1、自组装基元2、自组装基元3……自组装基元n (n ≥1)。作为可选方式，所述自组装基元中至少有一种自组装基元是以赖氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种或几种作为支化单元。

作为可选方式，所述两亲性树状大分子的疏水端为烷基链、疏水肽、胆固醇、脂肪族和芳香族氨基酸重复单元、阿霉素、紫杉醇或喜树碱中的一种或几种。

作为可选方式，所述两亲性树状大分子的主动靶向修饰是以包含但不限于叶酸、生物素或RGD肽等能主动靶向肿瘤细胞的分子或基团进行修饰。

作为可选方式，上述抗蛋白吸附功能分子修饰是通过环境敏感键将PEG、肝素钠、透明质酸、带负电荷的亲水性基团及寡糖分子等具有抗蛋白吸附功能的基团中的至少一种修饰到亲水端的***。所述环境敏感键是指能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂从而使抗蛋白吸附的遮蔽层脱落的连接方式。可以是酸敏感基团（马来酸酐、2-甲基马来酸酐、2，3-二甲基马来酸酐、1，2-二羧基环己烯或2，2，3，3-四甲基马来酸酐等）或酶敏感底物肽（如MMP-2、MMP-7或MMP-9等）或温度敏感基团（如D-A加成键）或还原敏感基团（如二硫键、二硒键等）中的一种或几种。进一步的，当采用马来酸酐、2-甲基马来酸酐、2，3-二甲基马来酸酐、1，2-二羧基环己烯或2，2，3，3-四甲基马来酸酐等或MMP-2、MMP-7或MMP-9等时可以将这些基团既作为抗蛋白吸附功能基团又作为连接分子，可以不用再接枝其他抗蛋白吸附的功能基团。

作为可选方式，上述自组装基元的主体结构中含有腙键、酯键、羟醛缩合等易水解键，使得其在胞内容易发生断裂而实现解组装，释放出药物有效成分。进一步的，所述自组装体的自组装基元的亲水端与疏水端之间通过所述易水解键连接。

作为可选方式，上述自组装基元的结构式如下：

其中，作为可选方式，A为碱性氨基酸（如赖氨酸、组氨酸、精氨酸）中的一种或几种；B为酸性氨基酸（如谷氨酸、天冬氨酸）中的一种或几种。R₁为两亲性树状大分子***功能化后的亲水端，为主动靶向分子（叶酸、生物素或RGD肽）、酸敏感基团（马来酸酐、2-甲基马来酸酐、2，3-二甲基马来酸酐、1，2-二羧基环己烯或2，2，3，3-四甲基马来酸酐）或酶敏感底物肽（MMP-2、MMP-7或MMP-9）或温度敏感基团或还原敏感基团中的一种或几种，R₂代表疏水端，为烷基链、疏水肽、胆固醇、脂肪族或芳香族氨基酸重复单元、阿霉素、紫杉醇或喜树碱中的一种或几种。

本发明还提供了一种超分子协同两亲性树状大分子自组装策略，通过亲疏水作用使各个自组装基元共同组装，整合各个自组装基元的特性协同实现组装体的多功能化。

作为可选方式，在上述两亲性树状大分子组装体中，所述协同自组装基元可以是1种或多种。

本发明还提供了一种上述程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***的制备方法，包括以下步骤如下：

1）制备端基功能化的两亲性树状大分子自组装基元；

2）将自组装基元按照一定比例溶解在共溶剂中，在超声条件下充分混合，并在超声的条件下将上述溶液缓慢地滴加入去离子水中，通过亲疏水作用实现共组装；

3）通过透析除去有机溶剂，再经过冷冻干燥，制得两亲性树状大分子自组装粒子；

4）将上述两亲性树状大分子自组装粒子及疏水性药物按照一定质量比溶解在共溶剂中，在超声条件下充分混合，并在超声的条件下将上述溶液缓慢地滴加入去离子水中，形成包裹药物的自组装体载药***。

作为可选方式，在上述的制备方法的步骤1）中，在同一自组装基元上进行多种端基功能化修饰制得一种自组装基元或者分别在不同的自组装基元上分别进行端基功能化修饰然后将制得的多种自组装基元混合用于步骤2）。

作为可选方式，步骤1）中所述端基功能化的两亲性树状大分子的制备可以采用发散法或收敛法或发散—收敛相结合的方法。

作为可选方式，步骤1）中所述端基功能化的两亲性树状大分子中以氨基酸为支化单元的肽类树状大分子的制备方法具体为：

a) 氨基酸的保护：根据制备树状大分子所选用的氨基酸支化单元的不同，对氨基酸的氨基、胍基和咪唑环进行不同保护基的保护。

b) 制备二代肽类树状大分子：按比例称取含甲酯保护的氨基酸、上述a中含保护基的氨基酸（3倍当量）、缩合剂（2.5倍当量）、催化剂（2.5倍当量）和有机碱（10倍当量），在冰浴和氮气保护条件下，加入溶剂进行脱水缩合反应；然后在室温下反应48 小时，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，以柱层析分离得到带有保护基团的二代肽类树状大分子；

c）脱保护：准确称取二代肽类树状大分子，加入重蒸二氯甲烷溶剂溶解，脱保护试剂三氟乙酸（40倍当量），在氮气保护下室温反应6 小时，脱除保护，减压浓缩，通过萃取或沉淀，获得脱去保护的二代肽类树状大分子；

d）制备三代肽类树状大分子：按比例称取二代肽类树状大分子、上述a中含保护基团的氨基酸（6倍当量）、缩合剂（5 当量）、催化剂（5 当量）和有机碱（20 当量），在冰浴和氮气保护条件下，加入溶剂进行脱水缩合反应；然后在室温下反应72小时，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，以柱层析分离得到带有保护基团的三代肽类树状大分子；重复以上脱保护和缩合反应步骤，可制备四代肽类树状大分子。

本发明还提供了一种上述程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***在制备抗癌药物中的应用。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1. 本发明所述的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***，一方面利用树状分子作为药物载体所具备的好的稳定性、高的机械强度、多价的末端基团、高支化结构和仿病毒的胞内递送等优势；另一方面利用多元协同自组装策略整合各个树状大分子自组装基元自身的优势便于实现组装体的多功能化和高效的药物***递送。

2. 本发明所述的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***，具有精确的分子结构、丰富的表面官能团，还具有良好的生物相容性和肿瘤治疗效果等生物学性质。

3. 本发明所述的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***，在生理pH条件下具有较高的表面负电荷，能有效抵抗血液中蛋白成份吸附，增大血液中循环时间。

4. 本发明所述的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***，能够组装成粒径在100纳米到200纳米范围内的药物载体，有效地通过肿瘤增强的渗透和滞留效应（EPR效应），实现对肿瘤部位的被动靶向。

5. 本发明所述的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***，在肿瘤微环境中特征生物学信号的响应刺激下（pH值、特定酶的浓度等），脱除递送***中阻碍入胞的成分（如聚乙二醇、负电基团等），并曝露出特定功能基团（如正电基团）促进与肿瘤组织及细胞相互作用，实现对肿瘤微环境靶向（肿瘤外基质靶向）。

6. 本发明所述的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***，主动靶向分子或基团的修饰使组装体与肿瘤细胞膜表面高表达受体特异性结合促进选择性识别入胞，实现对肿瘤细胞的进一步主动靶向。

7. 本发明所述的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***，利用组装体***修饰的敏感集团的响应性离去暴露出酸缓冲基团（如氨基、胍基和咪唑环），能有效缓冲溶酶体内低的pH环境，实现溶酶体逃逸并最终传递药物分子到细胞核发挥治疗作用。

8. 本发明所述的纳米载体***多元协同自组装策略为纳米载体多能化的实现提供了一个通用化的平台，一条简单易行的途径。

9. 本发明所述的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***的设计为纳米载体有效地实现药物的***递送呈现了一条通用化的策略。

附图说明：

图1为本发明实施例1中所述两亲性树状大分子自组装基元一的合成路线图。

图2为本发明实施例1中所述作为对照丁二酸酐修饰的两亲性树状大分子的合成路线图。

图3为本发明实施例2中所述两亲性树状大分子自组装基元二的合成路线图。

图4为本发明实施例1中所述两亲性树状大分子自组装基元一的中间产物和终产物的质谱和核磁。

图5为本发明实施例3中自组装基元一的临界聚集浓度测定。

图6为本发明实施例6中酸性可调组装体在不同pH条件下的氨基暴露实验。

图7 为本发明实施例9中通过流式细胞仪确定程序化多重靶向组装体的最佳成份比例。

图8为本发明实施例10中程序化多重靶向组装体酸缓冲能力的测定。

图9为本发明实施例12中程序化多重靶向载药纳米粒子的透射电子显微镜图片。

图10为本发明实施例14中程序化多重靶向载药纳米粒子的体外释放曲线。

图11为本发明实施例15中程序化多重靶向载药纳米粒子在pH 7.4和6.8下的细胞毒性测定。

图12为本发明实施例16中通过流式细胞仪实验定量测定程序化多重靶向载药纳米粒子的入胞效果。

图13为本发明实施例18中程序化多重靶向组装体在pH 7.4和6.8下的体外牛血清蛋白（BSA）吸附实验。

图14为本发明实施例19中程序化多重靶向药物递送***在BALB/c小鼠体内的药代动力学实验。

图15为本发明实施例21中程序化多重靶向药物递送***对建有4T1肿瘤的BALB/c小鼠的抗肿瘤效果。

图16为本发明实施例22中对经程序化多重靶向载药纳米粒子治疗过的小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织切片进行组织学的分析。

图17为本发明实施例22中对经程序化多重靶向载药纳米粒子治疗过的小鼠的肿瘤组织进行免疫组织化学的分析。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1：程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装基元一的制备（合成路线如图1）

二代赖氨酸树状分子（HO-Lys(G2)-Boc₄）的合成

称取4.0 g H-Lys-OMe·2HCl，14.8 g Boc-Lys(Boc)-OH，5.1 g HOBT和13.2 gEDC·HCl于100 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护，加入30 mL重蒸DCM，搅拌溶解，在冰浴下加入28.3 mL的DIEA反应0.5 h，然后在室温下反应48 h。水泵旋蒸除去溶剂，氯仿溶解，依次经1 M HCl、饱和NaHCO₃和NaCl洗涤后，用无水MgSO₄干燥过夜后，过滤、旋除溶剂，经200-300目硅胶柱层析（洗脱剂DCM/EA = 1:1）分离得到白色粉末MeO-Lys(G2)-Boc₄（化合物1）。

脱甲酯保护,准确称取4.0 g的MeO-Lys(G2)-Boc₄在冰浴条件下溶解在NaOH/MeOH（1 M，49.0 mL）溶液中，搅拌0.5 h后在室温下继续反应6 h，旋去甲醇后加入氯仿50 mL溶解残余物，用盐酸调节溶液pH在2到3之间，有机相在无水MgSO4中过夜干燥，过滤、旋除溶剂，得到白色粉末HO-Lys(G2)-Boc₄（化合物2）。产物无需提纯，直接用于下步反应。

油胺-谷氨酸（Oleylamine-Glu-H）疏水端的合成

称取5.0 g的Boc-Glu-OH，6.0 g的HOBT，15.5 g的EDC·HCl于100 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护，加入20 mL的油胺，入30 mL重蒸DCM，搅拌溶解，在冰浴下加入33.2 mL的DIEA反应0.5 h，然后在室温下反应24 h。水泵旋蒸除去溶剂，氯仿溶解，经饱和NaHCO₃和NaCl洗涤后，用无水MgSO₄干燥过夜后，过滤、旋除溶剂，经200-300目硅胶柱层析（洗脱剂DCM/EA = 4:1）分离得到白色固体Oleylamine-Glu-Boc（化合物3）。

脱叔丁氧羰基保护，准确称取3.5 g的Oleylamine-Glu-Boc于100 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护，加入1.2 mL的DCM使溶解，在冰浴下加入2.4 mL的TFA，反应0.5 h后在室温下继续反应6 h，旋去DCM后在油泵下除去TFA，加入***100 mL搅拌过夜，倾去上清液后旋干沉淀，得白色固体Oleylamine-Glu-H（化合物4）。产物无需提纯，直接用于下步反应。

树状大分子（Oleylamine-Glu-Lys(G2)-H₄）的合成

准确称取3.0 g的HO-Lys(G2)-Boc₄，2.4 g的Oleylamine-Glu-H，2.9 g的PyBop和0.6 g的HOBT于100 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护加入30 mL DMF，搅拌溶解，在冰浴下加入32.8 mL的DIEA反应0.5 h，然后在室温下反应48 h。油泵旋蒸除去溶剂，氯仿溶解，依次经1 M HCl、饱和NaHCO₃和NaCl洗涤后，用无水MgSO₄干燥过夜后，过滤、旋除溶剂，经200-300目硅胶柱层析（洗脱剂DCM/MeOH = 10:1）分离得到白色固体Oleylamine-Glu-Lys(G2)-Boc₄（化合物5）。

脱叔丁氧羰基保护，准确称取3.0 g的Oleylamine-Glu-Lys(G2)-Boc₄于100 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护，加入1.1 mL的DCM使溶解，在冰浴下加入2.2 mL的TFA，反应0.5 h后在室温下继续反应6 h，旋去DCM后在油泵下除去TFA，残留物溶解在去离子水中，用截留分子量500的透析袋用去离子水透析三天，冻干后得到白色粉末Oleylamine-Glu-Lys(G2)-H₄（化合物6）。产物无需提纯，直接用于下步反应。

端基功能化的两亲性树状大分子（Oleylamine-Glu-Lys(G2)-DMA）的合成

准确称取1.0 g的Oleylamine-Glu-Lys(G2)-H₄和2.2 g的2，3-二甲基马来酸酐于50 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护，加入1.0 mL的DMSO使溶解，冰浴下加入1.1 mL的吡啶和1.1 mL的三乙胺，在室温下反应24 h后加入含2.2 g 2，3-二甲基马来酸酐的吡啶（1.1 mL）和三乙胺的混合液（1.1 mL），溶液在室温下继续反应24 h，反应后的溶液逐滴加入冰的无水***中，沉淀溶解在甲醇中，在4℃条件下pH7.4的去离子水中透析三天，透析袋中液体冻干后得到白色固体Oleylamine-Glu-Lys(G2)-DMA（化合物7），即基元一。

作为对照，丁二酸酐修饰的两亲性树状大分子（Oleylamine-Glu-Lys(G2)-SA）的合成（合成路线如图2）

准确称取1.0 g的Oleylamine-Glu-Lys(G2)-H₄，2.0 g的丁二酸酐和0.6 g DMAP于250 mL的圆底烧瓶中，加入10 mL的DMF使溶解，在50℃加热回流下反应48 h。反应后的溶液逐滴加入冰的无水***中，沉淀溶解在去离子水中透析三天，透析液冻干后得到固体产物Oleylamine-Glu-Lys(G2)-SA（化合物8）。采用质谱分析和核磁图谱对本实施例中制备的化合物1-8进行验证分析，结果表明通过上述方法成功合成了化合物1-8（详见图4）

实施例2：程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装基元二的制备（合成路线如图3）

功能化亲水端（PEG₁₅₀₀-Biotin）的合成

准确称取1.0 g的生物素、1.6 g的EDC·HCl和0.6 g HOBT于250 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护，加入20 mL的DMSO使溶解。在生物素被活化2 h后，加入含12.2g PEG₁₅₀₀和3.4 mL DIEA的DCM溶液，继续在室温下反应24 h。油泵旋去溶剂后残余物溶解在氯仿中，经饱和NaHCO₃和NaCl洗涤后，用无水MgSO₄干燥过夜后，过滤、旋除溶剂，经200 -300目硅胶柱层析分离得到白色固体PEG₁₅₀₀-Biotin（化合物11）。

油酸-赖氨酸（Oleic acid-Lys-OH）疏水端的合成

准确称取5.0 g的H-Lys-OMe·2HCl，16.5 g的EDC·HCl和6.4 g的HOBT于250 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护，加入30 mL的DCM使溶解。随后加入15.7 mL的油酸，在冰浴下加入35.4 mL的DIEA反应0.5 h，然后在室温下反应24 h。油泵旋蒸除去溶剂，氯仿溶解，依次经1 M HCl、饱和NaHCO₃和NaCl洗涤后，用无水MgSO₄干燥过夜后，过滤、旋除溶剂，经200 - 300目硅胶柱层析（洗脱剂DCM/MeOH = 10:1）分离得到白色固体Oleicacid-Lys-OMe（化合物9）。

脱甲酯保护，准确称取1.5 g的Oleic acid-Lys-OMe在冰浴条件下溶解在NaOH/MeOH（1 M，22.0 mL）溶液中，搅拌0.5 h后在室温下继续反应6 h，旋去甲醇后加入氯仿60mL溶解残余物，用盐酸调节溶液pH在2到3之间，有机相在无水MgSO4中过夜干燥，过滤、旋除溶剂，得到白色固体Oleic acid-Lys-OH（化合物10）。产物无需提纯，直接用于下步反应。

靶向修饰的两亲性树状大分子（Oleic acid-Lys-PEG₁₅₀₀-Biotin）的合成

准确称取3.8 g的PEG₁₅₀₀-Biotin，1.5 g的Oleic acid-Lys-OH，0.5 g的EDC·HCl，0.3 g的HOBT和1.3 g的PyBop于250 mL带支管的圆底烧瓶中，抽真空，充氮气保护，加入25 mL的DMF使溶解。在冰浴下加入1.8 mL的DIEA反应0.5 h，然后在室温下反应24 h。油泵旋蒸除去溶剂，氯仿溶解，依次经1 M HCl、饱和NaHCO₃和NaCl洗涤后，用无水MgSO₄干燥过夜后，过滤、旋除溶剂，经200 - 300目硅胶柱层析（洗脱剂DCM/MeOH = 10:1）分离得到白色固体Oleic acid-Lys-PEG₁₅₀₀-Biotin（化合物12），即基元二。采用质谱分析和核磁图谱对本实施例中制备的化合物9-12进行验证分析，结果表明通过上述方法成功合成了化合物9-12。

实施例3：两亲性树状大分子自组装基元一临界聚集浓度的测定

首先制备浓度为6.02 × 10^-7 mol/L的芘水溶液，然后将实施例1中制备的端基功能化的两亲性树状大分子用上述制备的芘水稀释成1.0 mg/mL到 1.0 ×10^-7mg/mL不同浓度的溶液。固定发射波长为395 nm，用荧光分光光度计测定300 nm - 380 nm范围内的激发波长，记录338 nm和334 nm处的荧光值。以I₃₃₈/I₃₃₄的比值为纵坐标，以浓度为横坐标作图，结果如图5所示。测得临界聚集浓度为4.85 μg/mL，较小的临界聚集浓度值表明组装体具备较好的潜在稳定性，防止在体内递送过程中由于被血液大量稀释而解组装。

实施例4：作为对照，丁二酸酐修饰的两亲性树状大分子临界聚集浓度的测定测定方法与实施例3相同，测得其临界聚集浓度为6.89 μg/mL。

实施例5：两亲性树状大分子自组装基元一超分子组装体的制备

称取实施例1 中制备的两亲性树状大分子自组装基元一在良溶剂中充分溶解。在超声条件下将上述溶液溶缓慢的滴加入去离子水中，形成自组装体。在4℃条件下和截留分子量为500的透析袋中透析24 h，外相为pH 7.4的去离子水，每四小时更换一次。透析液冻干后得到白色粉末，制备出两亲性树状大分子自组装基元一超分子组装体。

利用动态光散射(DLS)测定实施例5制备出的自组装体，自组装体粒径约为145nm，且分布较窄，具有较负的表面电位约为-17 mV。

通过原子力显微镜观察实施例5制备出的自组装体三维形貌，自组装体为球形，粒径约为100 ~ 200nm，且分布较均一，与上述DLS结果保持一致。

实施例6: 实施例5制备的自组装体酸敏感行为的研究

荧光胺实验

精确称取59.6 mg的实施例5中冻干样溶解在1 mL的DMSO中，分别取20 μL加到2mL的pH 7.4和pH 6.8的PBS中，在37℃下孵育10 min。在设定的时间点，分别取100 μL加到1mL含2% 三乙胺的DMSO中。随后分别加入100 μL的浓度为5 mg/mL的荧光胺/DMF溶液，室温下孵育10 min。荧光胺与氨基特异性结合后产生的荧光用荧光分光光度计进行测定，测定时选取402 nm的激发波长和470 nm的发射波长。作为对照，***未功能化修饰的两亲性树状大分子作为阳性对照组，其***未修饰氨基可与荧光胺全部结合产生荧光作为百分之百；***丁二酸酐修饰的两亲性树状大分子作为阴性对照组，其***不含可与荧光胺结合的氨基。结果如图6所示，在pH 7.4条件下两亲性树状大分子自组装基元一稳定存在，具有较低的荧光强度；在pH 6.8下，在20 min内氨基暴露率达到约80%，表明***酰胺键发生较快的酸敏感断裂从而暴露出氨基。

电荷可调行为的研究

精确称量实施例5中冻干样并分别配成浓度为100 μg/mL的pH 7.4，6.8和5.0的PBS溶液，在设定的时间点，从中取出一小份用于粒径和电位的测定。结果显示：由于在pH6.8和5.0酸性条件下，***酰胺键的迅速水解暴露出氨基从而使组装体带上正电荷，而pH7.4模拟正常生理环境条件下自组装体在2 h内维持约-17.0 mV的负电荷。作为对照，丁二酸酐修饰的自组装体在不同pH条件下均维持负的表面电荷。

实施例7：程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装体的制备

分别将实施例1 和实施例2 制备的两亲性树状大分子自组装基元一和自组装基元二按照一定质量比例溶解在共溶剂中，在超声条件下使两组份充分混合。在超声的条件下将上述溶液溶缓慢的滴加入去离子水中，通过亲疏水作用实现协同自组装，形成自组装体。在4℃条件下和截留分子量为500的透析袋中透析24 h，外相为pH 7.4的去离子水，每四小时更换一次。透析液冻干后得到白色粉末，从而制备出一系列程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装体。

利用DLS测定实施例7制备出的一系列样品的粒径和电位。结果显示，在总质量浓度不变的情况下，自组装体的粒径随着自组装基元二比例的增加而略有增大，从145nm左右增加到165nm左右，这是由于PEG的水合作用增大了自组装体***的水化层；自组装体的电位随着自组装基元二比例的增加而增大，从大约-16 mV增加到了-8 mV，这是由于自组装基元一比例的相对减少。总的来说，制备出的一系列的自组装体粒径在有效的EPR效应范围内，表面有较好的表面负电荷。

实施例8：程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装载药***的制备

盐酸阿霉素与3倍量的三乙胺溶解在水中搅拌，离心冻干后产生红色疏水阿霉素粉末。取实施例7中自组装体（100.0 mg）和疏水阿霉素（25.0 mg）在超声条件下溶解在DMSO中。将此溶液在超声条件下逐滴滴加到pH 7.4的PBS中制备载药纳米粒子。在这个过程中两亲性树状大分子形成了核壳结构并将疏水药物包裹在疏水空腔中。随后，将此溶液在4℃条件下和截留分子量为1000的透析袋中透析24 h去除未包裹的药物和有机相，每四个小时更换外相（pH 7.4的去离子水）。透析液冻干后得红色载药纳米粒子粉末。所有操作在避光条件下进行。药物荧光强度用荧光分光光度计在480 nm的激发波长下测定，药物包裹量用提前测定的标准吸收曲线进行计算。包封率 = 包裹在自组装体疏水空腔的药物质量/加入的药物质量 × 100%；载药量 =包裹在自组装体疏水空腔的药物质量/载药纳米粒子的质量× 100%。计算的包封率约为44.7% (44.72 ± 0.47%, n = 3)；载药量约为10.3% (10.3± 0.25%, n = 3)。

实施例9：程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装基元最佳成分比的确定

通过流式细胞仪定量分析实施例8制备的一系列药物递送***的入胞效果，统一载药纳米粒子的药物含量为5 μg/mL，结果（详见图7）表明含10%自组装基元二的药物递送***具有最佳的入胞效果，为最优选择。具体操作步骤如下：3 × 10⁵个4T1细胞在六孔板中贴壁生长24 h后，弃去培养基，加入含一系列载药纳米粒子的RPMI 1640培养基，含阿霉素量统一为5 μg/mL。孵育2 h后，弃去培养基，用PBS洗3遍。胰酶消化培养基吹打后离心（1000 rpm，5min）,沉淀重新混悬在300 μL的PBS中。固定激发和发射波长分别为480 nm和590 nm，用流式细胞仪进行细胞摄取量的测定，结果用WinMDI 2.9软件来分析。以下实验均采用含10%自组装基元二的自组装体进行探究，为叙述方便起见以下所述程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装体默认为含10%自组装基元二的自组装体。

实施例 10: 序化多重靶向的两亲性树状大分子组装体酸缓冲能力的测定

精确称取实施例7制备的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装体冻干样，溶解在3 mL水中制备浓度为1 mg/mL的溶液。用NaOH将此溶液的pH值调节到10.0，然后用浓度为1 M的盐酸进行滴定。pH值用高精密pH计进行测定。每次稳定的示数出现时记录时间点。作为对照，自组装基元一和自组装基元二分别作为阳性和阴性对照组进行上述缓冲能力的测定。结果如图8所示，整合10%自组装基元二不影响程序化多重靶向组装体在pH 7.4到5.0的缓冲能力。

实施例 11: 利用DLS测定实施例8制备的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装载药纳米粒子，自组装体粒径约为170 nm，且分布较窄，表面电位约为-12 mV。表明自组装药物递送***粒径在EPR效应范围内，且具有较好的表面负电荷。

实施例 12: 通过透射电子显微镜观察实施实施例8制备出的自组装体尺寸及形态，如图9所示，自组装体为球形，粒径约为100 ~ 200nm，且分布较均一，与上述DLS结果保持一致。

实施例 13: 程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***电荷可调行为的研究

在超声条件下，精确称取实施例8制备的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装载药纳米粒子冻干样溶解在pH 7.4 PBS中制备浓度为100 μg/mL的溶液。每隔10 min从中取出一小份用于DLS测定。在1 h和2 h的时间点，溶液的pH值用盐酸被分别调节到6.8和5.0。电荷可调行为通过模拟体内酸性梯度的变化来进行探究。结果表明，程序化多重靶向组装体在生理pH 7.4条件下维持负电荷约为-12 mV，在肿瘤细胞外环境pH 6.8 条件下维持正电荷约为+8.0 mV和溶酶体酸性pH 5.0条件下维持较高正电荷约为+21.5 mV。值得注意的是，随着pH值的降低程序化多重靶向组装体的粒径在170 nm - 260 nm范围内变大。这些表明随着pH的降低，***马来酸酐修饰基团的离去，***氨基发生质子化，结构变的疏松，利于药物的释放。

实施例 14: 程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***体外释放行为的研究

精确称取实施例8制备的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装载药纳米粒子冻干样溶解在pH 7.4 、6.8和5.0的PBS中。分别将上述制备的溶液转移到截留分子量为1000的透析袋中，透析袋浸没于含对应pH值的25 mL PBS中，PBS剩放于50 mL的离心管中。样品置于摇床中并在37℃条件下孵育。在设定的时间点，取出1 mL透析液用于分析，并及时补充相应pH值的新鲜PBS液。释放的阿霉素用荧光分光光度计进行检测，激发和发射波长分别为480 nm和590 nm。结果如图10所示，程序化多重靶向自组装载药纳米粒子在pH 7.4和6.8条件下25小时释放在20%左右，但在pH 5.0酸性条件下2小时释放量超过50%。这说明载药纳米粒子在pH 7.4 和6.8下能稳定包裹疏水药物而在pH 5.0条件下则能加速药物的大量释放。

实施例15: 程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***细胞毒性的研究

4T1细胞培养在含10% 血清和1% 双抗的RPMI 1640培养基中，并在37℃条件下含5% CO₂的培养箱中贴壁生长。程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***在不同pH条件下对细胞的毒性用CCK-8实验进行测定。具体步骤如下：收集对数期生长的细胞用培养基稀释成8 ×10⁴ cell/mL，每孔100 μL接种到96孔板中并孵育24 h。吸弃培养基，加入含药浓度从10^-4 到10² μg/mL的pH7.4和6.8（盐酸调节）培养基，继续孵育24 h。吸弃培养基，每孔用PBS洗涤3次。紧接着每孔加入含10 μL CCK-8试剂的无血清双抗的100 μL的培养基，避光条件下在培养箱中孵育2 h。每孔的吸光值用酶标仪在450 nm处进行测定。程序化多重靶向的树状大分子自组装体在不同pH条件下对细胞的毒性根据上述的方法进行测定，浓度与上述材料浓度一一对应。相对细胞存活率根据以下公式来计算：细胞存活率 =（OD_实验组-OD_背景）/（OD_对照组-OD_背景）× 100%。细胞半数致死量（IC₅₀）用EXCEL软件来计算。结果如图11所示，首先，程序化多重靶向组装体在高浓度下对细胞明显无毒。通过比较程序化多重靶向自组装载药粒子和电荷可调组装体（无靶向）载药粒子在不同pH条件下的细胞毒性，发现低pH (6.8）明显增大细胞毒性。通过比较程序化多重靶向自组装载药粒子和电荷可调组装体（无靶向）载药粒子在相同pH条件下的细胞毒性，发现有靶向的纳米粒子具有较高的细胞毒性，同样的现象也发生在表面正电荷有靶向自组装体和表面正电荷无靶向组装体之间。这表明，pH的降低氨基的暴露使纳米载体表面带上正电荷有利于正负电荷介导入胞，以及靶向的修饰有利于受体介导的入胞。值得注意的是，程序化多重靶向自组装载药***在pH 6.8 条件下IC50值比阿霉素对照组小了十倍多，并且和盐酸阿霉素阳性对照组相当。

实施例16: 程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***入胞效果的探究

激光共聚焦定性分析：4T1细胞以1 × 10⁴ cells/well在薄底皿中贴壁生长24h，其中一个薄底皿的细胞在贴壁生长12 h后吸弃培养基，加入含PEG₁₅₀₀-biotin浓度为10μg/mL的新鲜培养基继续孵育12 h以饱和细胞膜表面生物素受体。吸弃培养基，换加含载药纳米粒子的pH 7.4和6.8（盐酸调节）新鲜培养基，其中阿霉素浓度统一为10 μg/mL。在37℃条件下孵育3 h后，小心地吸弃培养基，加入含Hoechst 33342的培养基继续孵育30 min。吸弃培养基，用PBS洗涤3遍后加入300 μL的PBS，在激光共聚焦显微镜下观察。激光共聚焦图片直观清楚的表明含有电荷可调组装体（自组装基元一）成分的载药纳米粒子在pH 6.8弱酸性条件下能转运较多的阿霉素到细胞内，而且程序化多重靶向载药纳米粒子在3小时内能把阿霉素转运到细胞核中（红色和蓝色荧光重叠）发挥抗肿瘤作用。这种现象在其它含有电荷可调组装体成分的组中都能观察到，基于我们小组以前的研究，赖氨酸富裕的超分子纳米载体能够逃逸溶酶体并传递药物到细胞核中。

流式细胞仪定量分析：4T1细胞以3 × 10⁵ cells/well在6孔板中贴壁生长24 h，其中一个孔板的3个孔的细胞在贴壁生长12 h后吸弃培养基，加入含PEG₁₅₀₀-biotin浓度为10 μg/mL的新鲜培养基继续孵育12 h以饱和细胞膜表面生物素受体。吸弃培养基，换加含载药纳米粒子的pH 7.4和6.8（盐酸调节）新鲜培养基，其中阿霉素浓度统一为10 μg/mL。在37℃条件下孵育3 h后，吸弃培养基，用PBS洗3遍。胰酶消化培养基吹打后离心（1000 rpm，5min）,沉淀重新混悬在300 μL的PBS中。固定激发和发射波长分别为480 nm和590 nm，用流式细胞仪进行细胞摄取量的测定，结果用WinMDI 2.9软件来分析。结果如图12所示，定量的流式细胞仪分析结果和定性的激光共聚焦结果一致。

实施例17: 程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***胞内递送的追踪

材料标记FITC：精确称取实施例7制备的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装体冻干样50.0 mg溶解在10 mL的pH 9.4去离子水中。精确称取5.0 mg的FITC加入上述溶液中，避光过夜搅拌。反应液在4℃条件下在截留分子量为1000的透析袋中透析3天。外相用新鲜的pH 7.4的去离子水每4小时更换一次，充分移除未反应的TITC。透析液冻干后得到黄色固体产物。

4T1细胞以1 × 10⁴ cells/well在薄底皿中贴壁生长24 h。吸弃培养基，加入含FITC标记的载药纳米粒子新鲜的pH 6.8（盐酸调节）的培养基，其中阿霉素浓度为5 μg/mL。分别在孵育1、3和6 h后，小心地吸弃培养基，加入含LysoTracker Blue DND-22的培养基。孵育30 min后，用PBS洗涤3遍，并最终加入300 μL的PBS覆盖薄底皿。在激光共聚焦显微镜下观察，经过一小时的孵育FITC标记的程序化多重靶向的载药纳米粒子主要黏附在细胞膜上。经过3小时的孵育，载药纳米粒子被截留在酸性细胞器（溶酶体和内涵体）中（绿色、红色和蓝色荧光的叠加）。幸运的是，经过6小时的孵育，阿霉素从溶酶体中逃逸出来进入细胞核中（红色、绿色和蓝色荧光分开）。这和实施例16所述现象一致，细胞内追踪实验进一步表明，氨基暴露的纳米粒子在酸性条件下具有较高的电位能缓冲溶酶体低的酸性，发生溶酶体逃逸。

实施例18: 程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装体抗蛋白吸附的研究

首先，精确称取实施例7制备的程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装体冻干样，分别溶解在pH 7.4和6.8（用盐酸调节）的水中，浓度为0.1 mg/mL。然后，精确称取牛血清蛋白BSA，将其溶解在pH 7.4和6.8（用盐酸调节）的水中制备浓度为0.1 mg/mL的溶液。将相同pH的样品溶液和BSA溶液等体积混合，在37℃下的摇床孵育。在设定的时间点(2min、30 min、1 h、6 h和12 h)，从中取出一小份在转速8000 g下离心15 min沉淀BSA结合物。上清液BSA量用紫外可见分光光度计在280 nm波长处测定吸收，而沉淀的BSA量用预先测定的标曲进行计算。作为对照，端基未功能化修饰的两亲性树状大分子组装体和丁二酸酐修饰的两亲性树状大分子组装体分别作为阳性和阴性对照用于蛋白吸附行为的研究。结果如图13所示，不管在pH 7.4还是6.8条件下，表面负电荷靶向组装体都具有很少的蛋白吸附，而表面正电荷靶向组装体具有明显的蛋白吸附。然而。程序化多重靶向组装体在pH 7.4有很少的蛋白吸附，在pH 6.8微酸性条件下蛋白吸附明显增大。这说明弱酸性pH 6.8条件会促使程序化多重靶向组装体表面电荷的快速反转，进而增大对牛血清蛋白的吸附作用。

实施例19: 程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***体内药代动力学行为的研究

动物的饲养：所有的动物在实验开始前一周提前购买使适应环境。所有的动物在25℃条件下在55%的湿度下和水源食物易得的条件下饲养。所有的动物操作符合四川大学有关动物饲养规范管理条例的规定。

将载药纳米粒子溶解在生理盐水中，通过小鼠尾静脉以10 mg阿霉素每公斤小鼠的剂量注射200 μL的上述载药纳米粒子溶液。每组为3只BALB/c小鼠。在给药后2 min, 30min, 1 h, 6 h 和 12 h的时间点，通过小鼠眼球取血将血液样品收集于含肝素钠的采血管中。将此血液样品在4℃条件下在3000 g的转速下离心10 min。从中取出100 μL的血浆并将其加入到50 μL 的5 M HCl中，在50℃条件下孵育1.5 h。待样品冷却到室温后，加入50 μL 1 M的NaOH。紧接着将此混合液用500 μL的氯仿/异丙醇混合溶剂（体积比4：1）涡旋混合90 s后萃取。在10000 g的转速下离心5 min后，收集有机相，过夜减压挥干有机相。将残渣溶于100 μL的乙腈中。在10000 g的转速下离心5 min后，上清液用于HPLC的分析。通过在血液样品（未治疗小鼠组眼球取血）中直接添加不同浓度的盐酸阿霉素，接着并按上述操作来制定阿霉素在血液中的标准吸收曲线。结果如图14所示，药动学曲线表明药物递送***能明显增加抗肿瘤药物阿霉素的半衰期，延长在血液中的滞留时间，而程序化多重靶向载药纳米粒子具有最大半衰期和最高的延长作用。这些结果表明表面负电荷的纳米粒子具备稳定的隐蔽层的确能增加血液中循环时间。

实施例20: 程序化多重靶向的两亲性树状大分子自组装药物递送***活体成像的研究

通过BALB/c裸鼠右腋窝皮下注射10⁶ 个4T1细胞建立外源性肿瘤模型。当接种的肿瘤体积长到100 mm³时，12只小鼠被随机的分成4组。通过小鼠尾静脉以5 mg阿霉素每公斤小鼠的剂量注射100 μL的载药纳米粒子的生理盐水溶液。在给药后1 h, 6 h和12 h的时间点，用水合氯醛将小鼠麻醉用于活体成像的研究。用体内活体成像***检测荧光信号，固定激发和发射波长分别为450 nm和605 nm。为了进一步评估药物的组织分布，小鼠在给药24 h后牺牲。剥离心肝脾肺肾和肿瘤，用生理盐水洗涤数次后用于药物组织分布的半定量的分析。通过比较定位于肿瘤部位的直观荧光强度表明纳米载体载药***具有明显高于游离药物的EPR效应，而程序化多重靶向药物递送***具有面积最大荧光最强的药物肿瘤定位，这一结果与前面的药动学实验结论相符合。

实施例21: 程序化多重靶向的树状大分子自组装药物递送***抗肿瘤效果的研究

通过BALB/c小鼠右翼皮下注射5 × 10⁵ 个4T1细胞建立外源性肿瘤模型。当接种的肿瘤体积长到100 mm³时，36只小鼠被随机的分成6组。通过小鼠尾静脉以5 mg阿霉素每公斤小鼠的剂量注射200 μL的载药纳米粒子的生理盐水溶液，每3天一次持续18天。在每次给药前用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积根据下面公式进行计算：肿瘤体积 = 长×宽²/2，相对肿瘤体积根据下面公式进行计算：相对肿瘤体积 = （每次测量的肿瘤体积-最开始测量的肿瘤体积）/最开始测量的肿瘤体积。小鼠相对体重根据下面公式进行计算：相对体重 = （每次测量的小鼠体重-最开始测量的小鼠体重）/最开始测量的小鼠体重。结果如图15所示，通过小鼠体重和肿瘤体积的测定表明，空白的程序化多重靶向组装体对小鼠无毒且程序化多重靶向药物递送***具有高于生理盐水组近10倍的抗肿瘤效果和高于游离药物3倍的效果。从小鼠体重变化曲线还表明，盐酸阿霉素对小鼠具有明显的毒副作用，小鼠体重明显降低。这说明程序化多重靶向组装体的使用不仅降低了药物的毒副作用，而且大幅度增大了药物的抗肿瘤效果。

实施例22: 组织学和免疫组化的分析

所有的动物在完成18天的治疗后牺牲，剥离出肿瘤和心肝脾肺肾，固定于体积比4%的***生理盐水中过夜。所有组织被切成5 μm后的切片嵌入到石蜡中。切片用H&E染色用于组织病理学的评估，用CD31、Ki-67和TUNEL染色用于免疫组化的分析，结果如图16和图17所示。其中CD31用于观察新生血管，Ki-67用于观察增值的细胞和TUNEL染色用于观察凋亡的细胞。染色后的组织切片用倒置显微镜成像。H&E分析表明程序化多重靶向药物递送***对心肝脾肾无毒且能有效抑制肿瘤的肺转移。且肿瘤切片分析表明经程序化多重靶向药物递送***治疗的小鼠肿瘤组织疏松多孔，不同于经生理盐水治疗的小鼠肿瘤组织切片致密坚实的结构。免疫组化的分析表明，经程序化多重靶向药物递送***治疗的小鼠肿瘤组织具有最少的新生血管生成、最少的增值细胞和最多的细胞凋亡。以上结果共同验证了程序化多重靶向药物递送***在血液中具备稳定的隐蔽层增加了血液中循环时间、合适的纳米尺寸通过EPR效应富集于肿瘤部位、肿瘤弱酸性微环境条件下纳米粒子电荷由负翻转为正增大了入胞和受体介导的入胞作用协同促进纳米粒子入胞、暴露的氨基缓冲溶酶体低pH发生溶酶体逃逸和传递药物到细胞核。

实施例23

参照上述实施例所述的方法制备树状大分子自组装基元，所述自组装基元为两亲性的树状大分子，包括亲水端和疏水端，所述亲水端包括两层，其内层含有丰富的正电荷基团，用于构成组装体的正电荷层，其外层修饰有抗蛋白吸附功能分子，所述抗蛋白吸附功能分子通过环境敏感键连接在所述亲水端的***，所述环境敏感键能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂，所述自组装基元中还包括能够在细胞内发生断裂连接件，用于构成组装体的解组装功能层。

作为可选方式，在上述自组装基元中，所述亲水端还修饰有主动靶向分子或基团，如叶酸、生物素或RGD肽中的至少一种，所述主动靶向分子或基团能够与肿瘤细胞膜表面高表达受体特异性结合促进组装体选择性入胞。

作为可选，可以在同一个自组装基元上进行多种端基功能化，也可以将不同端基功能化的多种自组装基元进行混合自组装，通过两亲性树状大分子多元协同自组装策略可整合各个自组装基元自身的特性便于实现组装体的多功能化。

作为可选方式，在上述自组装基元中，所述两亲性树状大分子是以氨基酸为重复单元的一代、二代、三代或四代含肽类树状大分子。

作为可选方式，构成上述程序化多重靶向的两亲性树状大分子组装体的，自组装基元的种类不少于2个，分别命名为自组装基元1、自组装基元2、自组装基元3……自组装基元n (n ≥ 2)。作为可选方式，所述自组装基元中至少有一种自组装基元是以赖氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种或几种作为支化单元。

作为可选方式，所述两亲性树状大分子的疏水端为烷基链、疏水肽、胆固醇、脂肪族和芳香族氨基酸重复单元、阿霉素、紫杉醇或喜树碱中的一种或几种。

作为可选方式，所述两亲性树状大分子的主动靶向修饰是以包含但不限于叶酸、生物素或RGD肽等能主动靶向肿瘤细胞的分子或基团进行修饰。

作为可选方式，上述抗蛋白吸附功能分子修饰是通过环境敏感键将PEG、肝素钠、透明质酸、带负电荷的亲水性基团及寡糖分子等具有抗蛋白吸附功能的基团中的至少一种修饰到亲水端的***。所述环境敏感键是指能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂从而使抗蛋白吸附的遮蔽层脱落的连接方式。可以是酸敏感基团（马来酸酐、2-甲基马来酸酐、2，3-二甲基马来酸酐、1，2-二羧基环己烯或2，2，3，3-四甲基马来酸酐等）或酶敏感底物肽（如MMP-2、MMP-7或MMP-9等）或温度敏感基团（如D-A加成键）或还原敏感基团（如二硫键、二硒键等）中的一种或几种。进一步的，当采用马来酸酐、2-甲基马来酸酐、2，3-二甲基马来酸酐、1，2-二羧基环己烯或2，2，3，3-四甲基马来酸酐等或MMP-2、MMP-7或MMP-9等时可以将这些基团既作为抗蛋白吸附功能基团又作为连接分子，可以不用再接枝其他抗蛋白吸附的功能基团。

作为可选方式，上述自组装基元的主体结构中含有腙键、酯键、羟醛缩合等易水解键，使得其在胞内容易发生断裂而实现解组装，释放出药物有效成分。进一步的，所述自组装体的自组装基元的亲水端与疏水端之间通过所述易水解键连接。

作为可选方式，上述自组装基元的结构式如下：

其中，作为可选方式，A为碱性氨基酸（如赖氨酸、组氨酸、精氨酸）中的一种或几种；B为酸性氨基酸（如谷氨酸、天冬氨酸）中的一种或几种。R₁为两亲性树状大分子***功能化后的亲水端，为主动靶向分子（叶酸、生物素或RGD肽）、酸敏感基团（马来酸酐、2-甲基马来酸酐、2，3-二甲基马来酸酐、1，2-二羧基环己烯或2，2，3，3-四甲基马来酸酐）或酶敏感底物肽（MMP-2、MMP-7或MMP-9）或温度敏感基团或还原敏感基团中的一种或几种，R₂代表疏水端，为烷基链、疏水肽、胆固醇、脂肪族或芳香族氨基酸重复单元、阿霉素、紫杉醇或喜树碱中的一种或几种。

采用上述自组装单元制备成程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***，所述药物递送***由外层到内层依次包括：抗蛋白吸附的遮蔽层，正电荷层和/或主动靶向功能层，解组装功能层；所述抗蛋白吸附的遮蔽层与正电荷层和/或主动靶向功能层之间通过环境敏感键连接，使所述抗蛋白吸附的遮蔽层包裹在所述正电荷层和/或主动靶向功能层***，所述环境敏感键能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂从而使所述正电荷层和/或主动靶向功能层暴露，所述解组装功能层能够在细胞内发生断裂使树状大分子组装体解组装。参照上述实施例中的评价方法对所得的药物递送***进行检测和评价分析，所得任意一种药物递送***的抗肿瘤效果均比现有技术中的药物递送***提高了1倍以上。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***，其特征在于，药物递送***由外层到内层依次包括：抗蛋白吸附的遮蔽层，正电荷层和/或主动靶向功能层，解组装功能层；所述抗蛋白吸附的遮蔽层与正电荷层和/或主动靶向功能层之间通过环境敏感键连接，使所述抗蛋白吸附的遮蔽层包裹在所述正电荷层和/或主动靶向功能层***，所述环境敏感键能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂从而使所述正电荷层和/或主动靶向功能层暴露，所述解组装功能层能够在细胞内发生断裂使树状大分子组装体解组装。

2.根据权利要求1所述的程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***，其特征在于，所述药物递送***的粒径在100纳米到200纳米范围内，能够通过EPR效应被动靶向到肿瘤部位实现富集。

3.根据权利要求1所述的程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***，其特征在于，所述药物递送***中的药物被包裹在树状大分子自组装基元自组装形成的包裹体中，或者将药物作为树状大分子自组装基元的组成部分。

4.根据权利要求1所述的程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***，其特征在于，所述药物递送***由多种带有不同功能基团的树状大分子自组装基元混合自组装而成。

5.一种树状大分子自组装基元，其特征在于，所述自组装基元为两亲性的树状大分子，包括亲水端和疏水端，所述亲水端包括两层，其内层含有丰富的正电荷基团，用于构成组装体的正电荷层，其外层修饰有抗蛋白吸附功能分子，所述抗蛋白吸附功能分子通过环境敏感键连接在所述亲水端的***，所述环境敏感键能够在肿瘤组织的微环境中发生断裂，所述自组装基元中还包括能够在细胞内发生断裂连接件，用于构成组装体的解组装功能层。

6.根据权利要求5所述的树状大分子自组装基元，其特征在于，所述亲水端还修饰有主动靶向分子或基团，所述主动靶向分子或基团能够与肿瘤细胞膜表面高表达受体特异性结合促进组装体选择性入胞。

7.根据权利要求5所述的树状大分子自组装基元，其特征在于，结构式如下：

其中，作为可选方式，A为碱性氨基酸中的一种或几种；B为酸性氨基酸中的一种或几种；R₁为两亲性树状大分子***功能化后的亲水端，为主动靶向分子、酸敏感基团或酶敏感底物肽或温度敏感基团或还原敏感基团中的一种或几种，R₂代表疏水端，为烷基链、疏水肽、胆固醇、脂肪族或芳香族氨基酸重复单元、阿霉素、紫杉醇或喜树碱中的一种或几种。

8.一种如权利要求1所述程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

1）制备端基功能化的两亲性树状大分子自组装基元；

2）将自组装基元按照一定比例溶解在共溶剂中，在超声条件下充分混合，并在超声的条件下将上述溶液缓慢地滴加入去离子水中，通过亲疏水作用实现共组装；

3）通过透析除去有机溶剂，再经过冷冻干燥，制得两亲性树状大分子自组装粒子；

4）将上述两亲性树状大分子自组装粒子及疏水性药物按照一定质量比溶解在共溶剂中，在超声条件下充分混合，并在超声的条件下将上述溶液缓慢地滴加入去离子水中，形成包裹药物的自组装体载药***。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，在同一自组装基元上进行多种端基功能化修饰制得一种自组装基元或分别在不同的自组装基元上分别进行端基功能化修饰然后将制得的多种自组装基元混合用于步骤2）。

10.权利要求1所述的程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送***在制备抗癌药物中的应用。