CN104897806B

CN104897806B - 判断菊花是否经过硫熏的hplc检测方法

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Publication number: CN104897806B
Application number: CN201510247076.9A
Authority: CN
Inventors: 王智民; 朱晶晶; 王珊; 李友连; 冯伟红; 陈两绵; 向世勰
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2015-05-15
Filing date: 2015-05-15
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2035-05-15
Also published as: CN104897806A

Abstract

本发明公开了判断菊花是否经过硫熏的HPLC检测方法。该方法包括：(1)利用水、醇或醇的水溶液提取待检测菊花，以便得到供试样品；(2)利用HPLC检测所述供试样品，色谱条件如下：色谱柱：C₁₈色谱柱；检测波长：350±5nm；流动相：A：乙腈或甲醇，B：含有0.05‑0.2体积％有机酸的溶液，梯度洗脱程序：0～10min，12～16％A；10～11min，16～20％A；11～25min，20～26％A；25～55min，26％～65％A。采用本发明的方法检测菊花是否经过硫熏，出峰时间早，仅20分钟左右就出峰，检测的运行时间短，仅需50分钟左右，并且能够同时表征出15个以上硫熏前后有差异的色谱峰，显著节省了试剂用量和人力，并且HPLC检测的基线稳定、目标物分离度良好，从而达到利用HPLC快速、准确判断菊花是否经过硫熏的目的。

Description

判断菊花是否经过硫熏的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及菊花是否经过硫熏的检测方法，具体地，涉及菊花是否经过硫熏的HPLC检测方法。

背景技术

菊花为菊科植物菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)的干燥头状花序，具疏风、清热、明目、解毒之功效。茶用、药用皆宜，茶用可去火、养肝明目，药用可抗菌、消炎、降压、防冠心病等，应用价值高。近年来各种以菊花为原料的保健茶饮品开发与上市，菊花原料需求量猛增。硫磺熏蒸具干燥、漂白、防虫及防霉变，延长储藏期等作用。由于硫熏具备以上“美容”作用，可以使药材外观颜色鲜亮，迎合大众审美需求。近年来，受药材等级的经济利益驱使，菊花也成为常用硫磺熏蒸加工的大宗品种之一。但硫磺熏蒸后的菊花药味会变酸，造成主要成分损失而影响临床疗效，同时残存二氧化硫，造成毒性叠加。研究发现，硫磺在熏蒸过程中会与氧结合，产生二氧化硫，二氧化硫是对人体有害的物质，长期接触可致粘膜细胞产生变异，对人体的呼吸道粘膜、消化道粘膜有严重的损害作用，对肝肾功能也有直接影响。药材加工过程中，过期药材反复熏蒸，甚至直接喷洒硫磺，严重影响了药材品质；“二氧化硫事件”一度热炒成了中草药界的“三聚氰胺”，成为威胁公众健康的焦点问题，引起社会广泛关注。韩国基于TBT(技术性贸易壁垒)的考虑，率先制定二氧化硫残留标准，致使近年来硫磺熏事件被高度关注。

目前，常用的HPLC检测菊花是否经过硫熏的方法，检测时程长，近100分钟，梯度洗脱基线漂移，造成积分困难，样品测定结果的重现性、准确性等差。

因此，本领域迫切需要提供一种运行时间短、基线稳定、分离度良好的HPLC检测方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种运行时间短、基线稳定、分离度良好的判断菊花是否经过硫熏的HPLC检测方法。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种判断菊花是否经过硫熏的HPLC检测方法。根据本发明的实施例，该包括：(1)利用水、醇或醇的水溶液提取待检测菊花，以便得到供试样品；(2)利用HPLC检测所述供试样品，色谱条件如下：色谱柱：C₁₈色谱柱；检测波长：350±5nm；流动相：A：乙腈或甲醇，B：含有0.05-0.2体积％有机酸的溶液，梯度洗脱程序：0～10min，12～16％A；10～11min，16～20％A；11～25min，20～26％A；25～55min，26％～65％A。

发明人惊奇的发现，采用本发明的方法检测菊花是否经过硫熏，出峰时间早，仅20分钟左右就出峰，检测的运行时间短，仅需50分钟左右，并且能够同时表征出15个以上硫熏前后有差异的色谱峰，显著节省了试剂用量和人力，并且HPLC检测的基线稳定、目标物分离度良好，从而达到利用HPLC快速、准确判断菊花是否经过硫熏的目的。

另外，根据本发明上述实施例的判断菊花是否经过硫熏的HPLC检测方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述流动相的流速为1.0mL·min^-1。由此，峰型较其它流速有改善，样品出峰速度加快。

根据本发明的实施例，所述醇或醇的水溶液为甲醇或甲醇的水溶液。由此，对菊花的成分的提取效果好。

根据本发明的实施例，所述有机酸选自甲酸、乙酸和磷酸的至少之一。由此，待测物与杂质峰的分离效果好。优选地，所述有机酸为甲酸。由此，待测物与杂质峰的分离效果更佳。

根据本发明的实施例，所述菊花为杭白菊和亳菊。由此，能够快速、准确的判断杭白菊和亳菊是否经过硫熏。

根据本发明的实施例，所述有机酸的浓度为0.1体积％。由此，峰型有显著改善，峰与峰之间的分离度提高。

根据本发明的实施例，所述色谱柱的柱温为25±5摄氏度。由此，峰拖尾现象改善，峰左右对称度提高。根据本发明的实施例，所述色谱柱的尺寸为4.6mm×250mm，5μm。由此，样品各峰之间分离度能满足定性鉴别的要求

根据本发明的实施例，所述甲醇水溶液的甲醇浓度为40-80体积％。由此，对菊花所含有的有机物的提取效果好。优选地，所述甲醇水溶液的甲醇浓度为60体积％。由此，对菊花所含有的有机物的提取效果更佳。

根据本发明的实施例，步骤(1)中，所述提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉。由此，能够充分的提取菊花所含的有机物。

根据本发明的实施例，步骤(2)中，进一步包括：选取绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、香叶木素和金合欢素标准品的至少之一作为对照品。由此，通过对菊花中的上述有效成分出峰时间和相对含量的检测，可以准确的判断菊花是否经过硫熏。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的硫熏与未熏杭白菊样品HPLC镜像图，其中，A为杭白菊经硫熏样品，B为杭白菊未经硫熏热风干燥样品；

图2显示了根据本发明一个实施例的混标对照品的HPLC色谱图，其中a-h色谱峰对应的化合物分别为：a:绿原酸、b：木犀草苷、c：异绿原酸A、d：蒙花苷、e：木犀草素、f：芹菜素、g：香叶木素和h：金合欢素；

图3显示了根据本发明一个实施例的5批不同产地热风干燥杭白菊样品HPLC色谱图；

图4显示了根据本发明一个实施例的5批杭菊硫熏样品HPLC色谱图；

图5显示了根据本发明一个实施例的硫熏与未熏亳菊样品HPLC镜像图，其中，A为亳菊经硫熏样品，B为亳菊未经硫熏热风干燥样品；

图6显示了根据本发明一个实施例的5批不同产地热风干燥亳菊样品HPLC色谱图；以及

图7显示了根据本发明一个实施例的5批不同产地硫熏加工亳菊样品HPLC色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种判断菊花是否经过硫熏的HPLC检测方法。根据本发明的实施例，该包括：(1)利用水、醇或醇的水溶液提取待检测菊花，以便得到供试样品；(2)利用HPLC检测所述供试样品，色谱条件如下：色谱柱：C₁₈色谱柱；检测波长：350±5nm；流动相：A：乙腈，B：含有0.05-0.2体积％有机酸的溶液，梯度洗脱程序：0～10min，12～16％A；10～11min，16～20％A；11～25min，20～26％A；25～55min，26％～65％A。

发明人惊奇的发现，采用本发明的方法检测菊花是否经过硫熏，出峰时间早，仅20分钟左右就出峰，检测的运行时间短，仅需50分钟左右，显著节省了试剂用量和人力，并且HPLC检测的基线稳定、目标物分离度良好，从而达到利用HPLC快速、准确判断菊花是否经过硫熏的目的。

根据本发明的实施例，所述流动相的流速为1.0mL·min^-1。由此，峰型较其它流速有改善，样品出峰速度加快。根据本发明的实施例，所述有机酸的种类不受特别的限制，只要能用于分离菊花的目标峰和杂质峰即可。优选地，所述有机酸选自甲酸、乙酸和磷酸的至少之一。由此，待测物与杂质峰的分离效果好。进一步优选地，所述有机酸为甲酸。由此，待测物与杂质峰的分离效果更佳。

根据本发明的实施例，所述有机酸的浓度为0.1体积％。由此，峰型明显改善，峰与峰之间的分离度提高。根据本发明的实施例，所述色谱柱的柱温为25±5摄氏度。由此，峰拖尾现象改善，峰左右对称度提高。

根据本发明的实施例，所述色谱柱的尺寸为4.6mm×250mm，5μm。由此，峰拖尾现象改善，峰左右对称度提高。根据本发明的实施例，所述甲醇水溶液的甲醇浓度为40-80体积％。由此，对菊花所含有的有机物的提取效果好。优选地，所述甲醇水溶液的甲醇浓度为为60体积％。由此，对菊花所含有的有机物的提取效果更佳。

根据本发明的实施例，步骤(2)中，进一步包括：选取绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、香叶木素和金合欢素标准品的至少之一作为对照品。由此，通过对上述有机物含量的检测，可以准确的判断菊花是否经过硫熏。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

采用本发明的方法，对从各道地产区直接收集的多种硫熏与未熏的杭白菊和和亳菊进行检测，判断菊花是否经过硫熏，具体如下：

1材料

1.1实验仪器

Agilent 1260高效液相色谱***，色谱柱Diamonsil C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)。

1.2试剂及药材

绿原酸(CA)、木犀草素(L)(均购于中国食品药品检定研究院，批号分别为：110753-200413和111520-200504)；木犀草苷(L-7G)、异绿原酸A(3,5-diCQA)、蒙花苷(Li)、芹菜素(A)、香叶木素(D)及金合欢素(Ac)(均购于上海盛中医药化工有限公司)；乙腈(Fisher)；娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

菊花样品均2012和2014年从道地产区直接收集，其中杭白菊的收集产地为浙江桐乡，江苏滨海、射阳等，亳菊的收集产地为安徽亳州十九里镇，菊花的产地及批次信息详见表1。

表1不同批次菊花的产地及采集时间

2方法

2.1供试品溶液的制备

分别称取表1中各种亳菊硫熏样品、未熏样品，杭菊硫熏样品、未熏样品(过40目筛)各0.5g，精密加入60％甲醇20ml，超声处理30min(功率100W，温度25℃)，过0.22μm微孔滤膜，即得各供试样品。

2.2对照品溶液的制备分别精密称取绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、香叶木素、金合欢素对照品适量，用甲醇溶解并定容，制成0.1mg mL^-1的含混合标准品的对照品溶液，置4℃备用。

2.3HPLC色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)

流动相：A：乙腈，B：0.1％甲酸水溶液进行梯度洗脱，0～10min，12～16％A；10～11min，16～20％A；11～25min，20～26％A；25～55min，26％～65％A

流速：1.0mL·min^-1

进样量：10μL

柱温：25℃

检测波长：350nm

3结果与讨论

3.1硫熏和非熏杭白菊样品的HPLC图谱比较

按2.1项下方法制备供试品溶液，并按照2.3项下色谱条件进行测定。HPLC对杭白菊的检测结果如下：

(1)硫熏和无硫杭白菊成分变化检测

分别检测硫熏和无硫杭白菊样品，以及2.2项配置的对照品，硫熏和非硫熏杭白菊的结果如图1的镜像HPLC色谱图所示，上部为硫熏杭白菊样品，下部为非硫熏的杭白菊样品，即非硫熏杭白菊，(样品编号分别为：杭菊HJ-有S12，杭菊HJ-无S7)，从图1可以清晰的看出，硫磺熏蒸法对杭白菊的化学组成影响较大，经硫磺熏蒸后菊花中的大极性成分(保留时间0-34分钟之间的成分，图1中线1左侧成分)及含量降低，而小极性成分(保留时间34-55分钟之间的成分，图1中线1右侧成分)及含量有所升高。通过与图2所示的标准品的HPLC图谱进行比对，对上述含量发生变化的色谱峰的成分进行确认，经比对发现，硫熏后杭白菊中的木犀草苷和蒙花苷等含量明显降低，而木犀草素的含量显著增高，同时，芹菜素、香叶木素及金合欢素3种化合物在在硫熏样品中都有检出，且含量较高，而在非硫熏的杭白菊中并未被检测到。

(2)非硫熏杭白菊检测

分别检测不同产地的5批非硫熏杭白菊样品，即非硫熏杭白菊(样品编号分别为表1中的HJ-无S1、HJ-无S3、HJ-无S4、HJ-无S5、HJ-无S7；)，结果如图3所述，，样品虽收集自不同产地，不同年份，但5批样品的色谱图重现性良好，由此表明，本发明所建立的HPLC检测方法可以用于表征无硫杭白菊化学成分指纹图谱轮廓。

(3)硫熏杭白菊检测

分别检测不同产地的5批硫熏杭白菊样品(样品编号分别为表1中的HJ-有S12，HJ-有S13，HJ-有S13，HJ-有S14，HJ-有S19)，HPLC检测的结果如图4所示，样品虽收集自不同产地，不同年份，但5批样品色谱图重现性良好，由此表明，硫熏导致杭白菊化学成分转化是一种不可逆的化学反应，且不同批次间重现性良好，本文所建立的HPLC色谱鉴定方法，能够用于表征硫熏后杭白菊化学成分指纹图谱。

3.2硫熏和非熏亳菊样品的HPLC图谱比较

按2.1项下方法制备供试品溶液，并按照2.3项下色谱条件进行测定。HPLC对亳菊的检测结果如下：

(1)硫熏和无硫亳菊样品的检测

分别检测硫熏和无硫亳菊样品(样品如表1中的BJ-无S3，BJ-无S4，BJ-无S5，BJ-无S8，BJ-无S9，BJ-有S1，BJ-有S2，BJ-有S3，BJ-有S6，BJ-有S9)，以及2.2项配置的对照品，其中，硫熏和无硫亳菊样品结果如图5所示，上部为硫熏亳菊样品，下部为无硫亳菊样品。从图5可以清晰的看出，硫磺熏蒸法对亳菊的化学组成影响较大。经硫磺熏蒸后亳菊中的大极性成分(保留时间0-34分钟之间的成分，图5中线1左侧成分)及含量降低，而小极性成分(保留时间34-55分钟之间的成分，图5中线2右侧成分)及含量有所升高。通过与图2所示的标准品的HPLC图谱进行比对，对上述含量发生变化的色谱峰的成分进行确认，经比对发现，硫熏后亳菊中的木犀草苷和蒙花苷等含量明显降低，而木犀草素、芹菜素、香叶木素及金合欢素4种黄酮苷元的含量均显著增高。

(2)非硫熏亳菊检测

分别检测不同产地的5批无硫亳菊样品(样品编号分别为表1中的BJ-无S3，BJ-无S4，BJ-无S5，BJ-无S8，BJ-无S9，)，即无硫亳菊，HPLC检测结果如图6所示，样品虽收集自不同产地，不同年份，但各批样品色谱图重现性良好，由此表明，本文所建立的方法可以用于表征亳菊化学成分指纹图谱轮廓。

(3)硫熏亳菊检测

分别检测不同产地的5批硫熏亳菊样品(样品编号分别为表1中的BJ-有S1，BJ-有S2，BJ-有S3，BJ-有S6，BJ-有S9)，HPLC检测结果如图7所示，样品虽收集自不同产地，不同年份，但5批样品色谱图重现性良好，由此表明，硫熏导致亳菊化学成分转化是一种不可逆的化学反应，且不同批次间重现性良好，本文所建立的HPLC色谱鉴定方法，能够用于表征硫熏后亳菊化学成分指纹图谱。

综上所述，利用本发明的方法，可以快速、准确的判断菊花是否经过硫熏，并且菊花的HPLC色谱图重现性良好，可以用于表征菊花化学成分指纹图谱轮廓。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种判断菊花是否经过硫熏的HPLC检测方法，其特征在于，所述菊花为杭白菊和亳菊，所述方法包括：

(1)利用60体积％甲醇溶液提取待检测菊花，以便得到供试样品，其中，所述提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉；

(2)利用HPLC检测所述供试样品，色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈色谱柱；柱温为25±5摄氏度；尺寸为4.6mm×250mm，5μm

检测波长：350±5nm

流动相：A：乙腈或甲醇，B：含有0.1体积％甲酸的溶液，梯度洗脱程序：0～10min，12～16％A；10～11min，16～20％A；11～25min，20～26％A；25～55min，26％～65％A，

所述流动相的流速为1.0mL·min^-1，

选取绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、香叶木素和金合欢素标准品的至少之一作为对照品。