CN104894095A - 一种利用赤藓糖醇废弃菌泥生产赤藓糖醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用赤藓糖醇废弃菌泥生产赤藓糖醇的方法。该方法包括以下步骤：将经过常规斜面活化的菌种，接种至以蔗糖和/或葡萄糖及酵母粉为原料的培养基，经过一级种子培养、二级种子培养和发酵罐发酵，制得赤藓糖醇糖液和菌泥的混合物，分离后将菌泥收集，利用固定化载体对菌泥进行固定化制备固定化颗粒，将固定化颗粒加入葡萄糖及少量氮源的灭菌发酵液中进行发酵，得到赤藓糖醇糖液，赤藓糖醇糖液经脱色和离子交换纯化后，按常规方法浓缩，结晶，离心分离后制得赤藓糖醇晶体。本发明制备工艺简单，材料便宜易得，省时、转化率高等优点，且综合利用赤藓糖醇传统发酵废弃的菌体，变废为宝，提高赤藓糖醇生产效率，适合工业化生产。

Description

一种利用赤藓糖醇废弃菌泥生产赤藓糖醇的方法

技术领域

本发明涉及功能性糖的生产方法，尤其涉及一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法。

背景技术

赤藓糖醇是一种相对甜度为0.65的低热量四元醇，其化学名为1，2，3，4-丁四醇，其发热量极低，仅约为蔗糖发热量得十分之一。赤藓糖醇是一种新型的功能性多元醇类甜味剂，具有低热值、口感佳、吸湿性低、无龋齿性、对糖尿病人安全、对热和酸十分稳定等特点，同时还具有不发酵及不会引起肠胃不适等优点。近年来被广泛应用在低糖、保健等功能性食品中，此外，在医药、化工领域等也有广泛应用。其发展前景非常广阔，备受国内外的重视。

目前，赤藓糖醇的工业化生产主要是以葡萄糖、蔗糖、淀粉等为原料采用耐高渗酵母发酵转化而成，得到的发酵液首先进行菌体分离，发酵清液经膜过滤(超滤、纳滤)、脱色(活性炭、树脂)、离子交换等工序净化，去除发酵液中残留的培养基成分及菌体发酵过程中产生的副产物等。净化后的料液经减压浓缩、降温结晶、离心分离等工序得到赤藓糖醇结晶，重结晶后得到商品赤藓糖醇。近年来，很多科学家对赤藓糖醇的生产方法做了很多深入的研究，查到的相关文献如下：

中国专利CN 103290068B公开了一株耐高渗出芽短梗霉生产赤藓糖醇的方法。该方法包括以下步骤：经过斜面制备的出芽短梗霉转接种子培养基后逐级培养获得种子液；将种子液接入发酵培养基中发酵培养发酵生产赤鲜糖醇。所述发酵培养是在摇床或发酵罐中进行，其中发酵培养是以木糖为主要碳源，发酵罐的培养条件为接种量5-15%，发酵培养基装量30-70%，在溶氧为55-75%、温度为26-32℃、pH为5-8的条件下培养96-120h。耐高渗出芽短梗霉发酵赤藓糖醇产量和达到26-34g/L,转化率达到25-42%。

中国专利CN 102154383B公开了一种玉米粉生产赤藓糖醇的方法。该方法是以玉米粉为起始原料，与分离回收的酵母菌体混合配料，对物料进行液化、糖化、蛋白水解，接种解脂假丝酵母进行发酵，制得含有赤藓糖醇的发酵液；再经分离、浓缩、结晶，制得赤藓糖醇成品。所述赤藓糖醇发酵为将培养好的种子液接入经液化、糖化、蛋白质水解所得的物料—发酵培养基中，接种量为10-20%，温度控制28-35℃，pH调节至5.5-6.5，通风比控制1：0.5-1，搅拌转速100-800rpm,溶氧量控制20-30%，罐压0.5-1.0Mpa；流加补糖，补糖浓度50-65%，补糖速率在0.3-1.0%，发酵100-130h制得赤藓糖醇发酵液。

然而上述方法生产赤藓糖醇发酵结束后的菌体分离所得的菌泥约占整个发酵比重的5～10%，即每吨发酵液就会产生50-100kg的菌泥，因为缺乏有效的处理方法，生产企业现一般将生产菌泥作为垃圾处理，不仅浪费了资源，同时也增加了企业垃圾处理费用和环境污染负荷。随着赤藓糖醇产业的发展和生产规模的扩大，酵母菌泥的产量也将不断增加，如果不能得到有效妥善的处理，必将增加企业的经济和环境负担，阻碍企业的健康发展。因此，合理利用赤藓糖醇生产中的菌泥是当今社会的迫切需求。

发明内容

本发明目的在于解决当前生产赤藓糖醇存在的问题，通过将赤藓糖醇发酵结束后的废弃菌泥收集，利用海藻酸钠等材料对菌体进行固定化，并加入葡萄糖溶液及少量氮源进行发酵，获得赤藓糖醇糖液，得到的赤藓糖醇糖液采用常规的脱色和离子交换进行纯化后，经浓缩，结晶，离心分离而制得赤藓糖醇晶体。本发明综合利用赤藓糖醇传统微生物发酵的废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇，不仅将废弃菌泥变废为宝，减少了环境污染，还降低了赤藓糖醇的生产成本，同时也提高赤藓糖醇生产效率。

为实现以上目的，本发明是采用的技术方案是：

一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，该方法包括以下步骤：

（1）将经过常规斜面活化的赤藓糖醇菌种用接种环取1环接种至一级培养基中，在温度为25～30℃、pH为4.5～7.5、转速为100～225r/min的条件下，进行摇床培养24～36h获得一级种子液，再将一级种子液以5～10%(v/v)的接种量接入二级培养基，在温度25～30℃、pH为4.5～7.5、转速为100～225r/min的条件下，进行摇床培养12～18h获得二级种子液，将二级种子液以5～10%(v/v)的接种量接入至发酵培养基中，在温度为25～30℃、pH为4.5～7.5、溶氧量为10～80%、转速为100～400r/min的条件下进行发酵120～168h，制得赤藓糖醇糖液和菌泥的混合物；

（2）将步骤（1）所述混合物用离心机分离，制得赤藓糖醇糖液和菌泥，将菌泥加水稀释打匀成10～20%重量体积比的菌泥悬液；

（3）将步骤（2）所述菌泥悬液与1～5%重量体积比的固定化载体混合均匀，转移至固定化器皿中，滴入重量体积比为2-5%的氯化钙固定3～4h，其中菌泥∶固定化载体∶氯化钙各组分的重量比为10～20∶2～5∶1～2，以常规方法制备得到固定化细胞颗粒；

（4）上步骤（3）所述固定化细胞颗粒按10～20%的重量比，加入含有10～50%重量体积比的葡萄糖和0.5～2%重量体积比的氮源的灭菌发酵液中，其中葡萄糖和氮源的重量比为5～100∶1，在温度为25～32℃和pH＝4.5～7.5的条件下进行发酵，以发酵液中葡萄糖的残留小于0.1%的重量体积比则为转化中止的控制指标，得到赤藓糖醇糖液；

（5）将得到的赤藓糖醇糖液采用常规方法脱色和离子交换进行纯化后，经常规方法浓缩，结晶，离心分离后制得赤藓糖醇晶体。

以上所述赤藓糖醇菌种包括解假丝酵母（Candida lipolytica）、丛梗孢酵母（Moniliella pollinis）和类丝孢酵母（Trichosporonoides  megachiliensis）中的一种。

以上一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，所述步骤（4）所述发酵在发酵减弱后，更新的灭菌发酵液进行再次发酵。

以上一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，步骤（4）所述氮源为酵母粉和／或尿素。

以上一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，步骤（3）所述固定化载体为海藻酸钠、明胶和壳聚糖中的一种。

以上一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，步骤（1）所述一级培养基、二级培养基和发酵培养基的组份均包含：重量体积比为10～30%的蔗糖和/或葡萄糖，重量体积比为1～5%的酵母粉，其中蔗糖和/或葡萄糖和酵母粉的重量比为2～30∶1。

以上一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，步骤（4) 所述葡萄糖的残留量采用常规的高效液相色谱检测分析。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

（1）本发明综合利用赤藓糖醇传统微生物发酵的废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇，不仅将废弃菌泥变废为宝，减少了环境污染，还降低了赤藓糖醇的生产成本，同时也提高赤藓糖醇生产效率，具有较好的经济效益，生态效益。

（2）本发明利用固定化技术制备固定化菌体，固定化技术具有工艺简单，省时，材料便宜易得，固定化菌体颗粒强度高，不易破碎，产物分离容易等优点。

（3）本发明方法得到的赤藓糖醇浓度达到105g/L,葡萄糖转化成赤藓糖醇的转化率达到40%。

（4）采用葡萄糖为主要原料，产生的赤藓糖醇转化率高且不累积甘油、戊五醇和乙醇等副产物，同时可以避免从石油带来的不可食的污染成分。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

丛梗孢酵母（Moniliella pollinis）菌种购买于美国ACTT；

解假丝酵母（Candida lipolytica）菌种购买于美国ACTT；

类丝孢酵母（Trichosporonoides  megachiliensis）菌种购买于美国ACTT；

接种环为常州东谱科学仪器有限公司的产品，规格为5μL。

实施例1

一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，采用以下工艺步骤：

（1）将经过常规斜面活化的丛梗孢酵母（Moniliella pollinis）菌种，用接种环取1环菌种接种至一级培养基中，在温度为28～30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下，进行摇床培养24h获得一级种子液，再将一级种子液以5%(v/v)的接种量接入二级培养基，在温度28～30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下，进行摇床培养16h获得二级种子液；用30L的发酵罐装液量为20L，将二级种子液以8%(1.6L)的接种量接入至发酵培养基中，在温度为28～30℃、pH为5.5、溶氧量为10～80%，转速为300r/min的条件下进行发酵120h，制得赤藓糖醇糖液和菌泥的混合物；所述一级培养基、二级培养基和发酵培养基的组份均含有：30%重量体积比的蔗糖和1%重量体积比的酵母粉，其中蔗糖和酵母粉的重量分别为6kg和0.2kg。

（2）将步骤（1）所述混合物用管式离心机在转速为16000r/min的条件下离心20min，制得赤藓糖醇糖液和菌泥，收集到1.0kg的菌泥，将菌泥加水稀释打匀成悬液；

（3）将1.0kg菌泥加水稀释打匀成20%重量体积比的菌泥悬液，用0.15kg的海藻酸钠制成3%重量体积比的溶液再与菌泥悬液混合均匀，转移至固定化器皿中，滴入用0.1kg氯化钙制成重量体积比为2%的氯化钙溶液固定4h，以常规方法制备得到的固定化细胞颗粒；

（4）上步骤（3）得到的10kg固定化细胞颗粒按20 %的重量比，加到用2kg葡萄糖制成20％重量体积比的溶液和用0.05kg 酵母粉制成0.5%重量体积比的溶液的灭菌发酵液中，在温度为30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下进行发酵，取样用高效液相色谱法检测，以发酵液中葡萄糖的残留小于0.1 %的重量体积比则为转化中止的控制指标，得到赤藓糖醇糖液；

（5）将得到的赤藓糖醇糖液采用常规方法脱色和离子交换进行纯化后，经常规方法浓缩，结晶，离心分离后制得赤藓糖醇晶体。

发酵结束时赤藓糖醇浓度达到80g/L,葡萄糖转化成赤藓糖醇转化率达到40%。步骤（4）发酵减弱后，更新新的灭菌发酵液进入下一批发酵，发酵总批次为5批，转化时间为20天。

实施例2

一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，采用以下工艺步骤：

（1）将经过常规斜面活化的丛梗孢酵母（Moniliella pollinis）菌种用接种环取1环菌种接种至一级培养基中，在温度为28～30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下，进行摇床培养24h获得一级种子液；再将一级种子液以5 %(v/v)的接种量接入二级培养基，在温度28～30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下，进行摇床培养16h获得二级种子液；用30L的发酵罐装液量为20L，将二级种子液以8 %(1.6kg)的接种量接入至发酵培养基中，在温度为28～30℃、pH为5.5、溶氧量为10～80%、转速为300r/min的条件下进行发酵120h，制得赤藓糖醇糖液和菌泥的混合物。所述一级培养基、二级培养基和发酵培养基的组份均含有:30%重量体积比的蔗糖和1%重量体积比的酵母粉，其中蔗糖和酵母粉的重量分别为6 kg 和0.2kg。

（2）将步骤（1）所述混合物用管式离心机在转速为16000r/min的条件下离心20min，制得赤藓糖醇糖液和菌泥，收集到1.0kg的菌泥，将菌泥加水稀释打匀成菌泥悬液；

（3）将1.0kg菌泥加水稀释打匀成15％重量体积比的菌泥悬液，用0.15kg海藻酸钠制成3%重量体积比的溶液再与菌泥悬液混合均匀，转移至固定化器皿中，滴入用0.1kg氯化钙制成重量体积比为2%的氯化钙溶液固定4 h，以常规方法制备得到固定化细胞颗粒；

（4）上步骤（3）得到的10kg所述固定化细胞颗粒按20 %的重量比，加到用3kg葡萄糖制成30％重量体积比的溶液和用0.05kg 酵母粉制成0.5%重量体积比的溶液的灭菌发酵液中，在温度为30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下进行发酵，取样用高效液相色谱法检测，以发酵液中葡萄糖的残留小于0.1 %的重量体积比则为转化中止的控制指标，得到赤藓糖醇糖液；

（5）将得到的赤藓糖醇糖液采用常规方法脱色和离子交换进行纯化后，经常规方法浓缩，结晶，离心分离后制得赤藓糖醇晶体。

发酵结束时赤藓糖醇浓度达到105g/L,葡萄糖转化成赤藓糖醇转化率达到35%。步骤（4）发酵减弱后，更新新的灭菌发酵液进入下一批发酵，发酵总批次为6批，转化时间为30天。

实施例3

一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，采用以下工艺步骤：

（1）将经过常规斜面活化的解假丝酵母（Candida lipolytica）菌种用接种环取1环菌种接种至一级培养基中，在温度为28～30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下，进行摇床培养24h获得一级种子液，再将一级种子液以5 %(v/v)的接种量接入二级培养基，在温度28～30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下，进行摇床培养16h获得二级种子液；用30L的发酵罐装液量为20L，将二级种子液以8 %(1.6kg)的接种量接入至发酵培养基中，在温度为28～30℃、pH为5.5、溶氧量为10～80%、转速为300r/min的条件下进行发酵120h，制得赤藓糖醇糖液和菌泥的混合物；所述一级培养基、二级培养基和发酵培养基的组份均含有：30%重量体积比的蔗糖和1%重量体积比的酵母粉，其中蔗糖和酵母粉的重量比分别为6、0.2kg；

（2）将步骤（1）所述混合物用管式离心机在转速为16000r/min的条件下离心20min，制得赤藓糖醇糖液和菌泥，收集到1kg的菌泥；

（3）将1kg的菌泥加水稀释打匀成20％重量体积比的菌泥悬液，用0.15kg壳聚糖制成3%重量体积比的溶液再与菌泥悬液混合均匀，转移至固定化器皿中，滴入用0.1kg氯化钙制成重量体积比为2%的氯化钙溶液固定3 h，以常规方法制备得到固定化细胞颗粒；

（4）上步骤（3）得到的10kg固定化细胞颗粒按20 %的重量比，加到用3kg葡萄糖制成20％重量体积比的溶液和用0.05kg 酵母粉制成0.5%重量体积比的溶液的灭菌发酵液中,在温度为30℃，pH为5.5，转速为200r/min的条件下进行发酵，取样用高效液相色谱法检测，以发酵液中葡萄糖的残留小于0.1 %的重量体积比则为转化中止的控制指标，得到赤藓糖醇糖液；

（5）将得到的赤藓糖醇糖液采用常规方法脱色和离子交换进行纯化后，经常规方法浓缩，结晶，离心分离后制得赤藓糖醇晶体。

发酵结束时赤藓糖醇浓度达到60g/L,葡萄糖转化成赤藓糖醇转化率达到30%。步骤（4）发酵减弱后，更新新的灭菌发酵液进入下一批发酵，发酵总批次为5批，转化时间为25天。

实施例4

一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，采用以下工艺步骤：

（1）将经过常规斜面活化的类丝孢酵母（Trichosporonoides  megachiliensis）用接种环取1环菌种接种至一级培养基中，在温度为28 ℃，pH为5.5，，转速为200r/min的条件下，进行摇床培养24h获得一级种子液，再将一级种子液以5 %的接种量接入二级培养基，在温度28℃，pH为5.5，转速为200r/min的条件下，进行摇床培养16h获得二级种子液；用30L的发酵罐装液量为20L，将二级种子液以5%(1kg)的接种量接入至发酵培养基中，在温度为28℃，pH为5.5，溶氧量为10～80%，转速为300r/min的条件下进行发酵144h，制得赤藓糖醇糖液和菌泥的混合物；所述一级培养基、二级培养基和发酵培养基的组份均含有：30%重量体积比的葡萄糖和1%重量体积比的酵母粉，其中葡萄糖和酵母粉的重量分别为6kg和 0.2kg；

（2）将步骤（1）所述混合物用管式离心机在转速为16000r/min的条件下离心20min，制得赤藓糖醇糖液和菌泥，收集到1kg的菌泥，将菌泥加水稀释打匀成15％重量体积比的菌泥悬液；

（3）将步骤（2）所述菌泥加水稀释打匀成15％重量体积比的菌泥悬液，菌泥悬液再与3%重量体积比的明胶溶液(0.15 kg)混合均匀，转移至固定化器皿中，滴入重量体积比为5%的氯化钙(0.25kg)固定3h，以常规方法制备得到固定化细胞颗粒；

（4）上步骤（3）得到的10kg固定化细胞颗粒按20%的重量比，加到用2kg葡萄糖制成20％重量体积比的溶液和用0.05kg 酵母粉制成0.5%重量体积比的溶液的灭菌发酵液中，在温度为30℃、pH为5.5、转速为200r/min的条件下进行发酵，取样用高效液相色谱法检测，以发酵液中葡萄糖的残留小于0.1 %的重量体积比则为转化中止的控制指标，得到赤藓糖醇糖液；

（5）将得到的赤藓糖醇糖液采用常规方法脱色和离子交换进行纯化后，经常规方法浓缩，结晶，离心分离后制得赤藓糖醇晶体。

发酵结束时赤藓糖醇浓度达到62g/L,葡萄糖转化成赤藓糖醇转化率达到31%。步骤（4）发酵减弱后，更新新的灭菌发酵液进入下一批发酵，发酵总批次为5批，转化时间为25天。

Claims (7)

1.一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）将经过常规斜面活化的赤藓糖醇菌种用接种环取1环接种至一级培养基中，在温度为25～30℃、pH为4.5～7.5、转速为100～225r/min的条件下，进行摇床培养24～36h获得一级种子液，再将一级种子液以5～10%的接种量接入二级培养基，在温度25～30℃、pH为4.5～7.5、转速为100～225r/min的条件下，进行摇床培养12～18h获得二级种子液，将二级种子液以5～10%的接种量接入至发酵培养基中，在温度为25～30℃、pH为4.5～7.5、溶氧量为10～80%、转速为100～400r/min的条件下进行发酵120～168h，制得赤藓糖醇糖液和菌泥的混合物；

（2）将步骤（1）所述混合物用离心机分离，制得赤藓糖醇糖液和菌泥，将菌泥加水稀释打匀成10～20%重量体积比的菌泥悬液；

（3）将步骤（2）所述菌泥悬液与1～5%重量体积比的固定化载体混合均匀，转移至固定化器皿中，滴入重量体积比为2-5%的氯化钙固定3～4h，其中菌泥∶固定化载体∶氯化钙的重量比为10～20∶2～5∶1～2，以常规方法制备得到固定化细胞颗粒；

（4）上步骤（3）所述固定化细胞颗粒按10～20%的重量比，加入含有10～50%重量体积比的葡萄糖和0.5～2%重量体积比的氮源的灭菌发酵液中，其中葡萄糖和氮源的重量比为5～100∶1，在温度为25～32℃和pH＝4.5～7.5的条件下进行发酵，以发酵液中葡萄糖的残留小于0.1%的重量体积比则为转化中止的控制指标，得到赤藓糖醇糖液；

（5）将得到的赤藓糖醇糖液采用常规方法脱色和离子交换进行纯化后，经常规方法浓缩，结晶，离心分离后制得赤藓糖醇晶体。

2.根据权利要求1所述一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，其特征在于：所述赤藓糖醇菌种包括解假丝酵母（Candida lipolytica）、丛梗孢酵母（Moniliella pollinis）和类丝孢酵母（Trichosporonoides  megachiliensis）中的一种。

3.根据权利要求1所述一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，其特征在于：步骤（4）所述发酵在发酵减弱后，更新灭菌发酵液进行再次发酵。

4.根据权利要求1一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，其特征在于：步骤（4）所述氮源为酵母粉和／或尿素。

5.根据权利要求1所述一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，其特征在于：步骤（3）所述固定化载体为海藻酸钠、明胶和壳聚糖中的一种。

6.根据权利要求1所述一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，其特征在于：步骤（1）所述一级培养基、二级培养基和发酵培养基的组份均包含：重量体积比为10～30%的蔗糖和/或葡萄糖，重量体积比为1～5%的酵母粉，其中蔗糖和/或葡萄糖和酵母粉的重量比为2～30∶1。

7.根据权利要求6所述一种利用赤藓糖醇生产废弃菌泥制备固定化菌体生产赤藓糖醇的方法，其特征在于：步骤（4)所述葡萄糖的残留量采用常规的高效液相色谱检测分析。