CN104885943B - 一种文心兰化学消毒组培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种文心兰化学消毒组培方法。文心兰化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽。本发明的文心兰化学消毒组培方法，利用化学试剂达到灭菌或抑菌的目的，在配制培养基的过程中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了文心兰组培环节；并且操作简单，只要按不同的培养基配方配制即可；实用性强，推广性好，还可以有效降低文心兰的组培成本，一般可降低成本10％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种文心兰化学消毒组培方法，属生物技术领域。
背景技术
文心兰属兰科文心兰属(Oncidium),又名瘤唇兰属,全属有原生种400多个。它花小而繁多,颜色艳丽多彩,形态变化多样,花朵连续不断开放,可持续1～3个月,是上等的盆栽观赏和切花材料。文心兰传统的分株繁殖速度慢,一年仅分2～3个芽,繁殖系数低。通过组培技术,可加快繁殖速度,进行工厂化生产。实践表明,文心兰在生产上受病毒病危害,导致质量和产量下降,失去商品价值,造成品质退化,应用组织培养技术快速繁殖文心兰种苗,利于保持文心兰的优良特性,有效控制病毒危害,因此探索文心兰的组培快速繁殖方式具有重要意义。
文心兰组织培养，一方面可以扩大其繁殖系数，从而实现规模化繁殖；另一方面，可以在保存其原有的优良性状的基础上，实现文心兰的种质资源保存和转基因研究等。文心兰组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗材和人工成本。常规的文心兰组织培养方法要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。如果能通过化学消毒的方法来改造培养基，使培养基在不需要进行高温高压灭菌，就能够获得文心兰的正常生长。这样，一方面可以降低文心兰组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，缩减了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展文心兰组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对文心兰生长产生毒害或抑制，即不影响文心兰的正常生长，从根本上简化了文心兰组织培养。
发明内容
本发明的目的是提供一种文心兰化学消毒组培方法。
本发明的目的是通过以下方法实现的。
本发明的一种文心兰化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
1.培养容器消毒：将培养瓶瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
2.培养基配制：诱导培养基为MS+1～5mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+50～100mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：MS+1.0～3mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+50～100mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；壮苗培养基为MS+0.1～0.5mg/L 6-BA+0.5～1.0mg/L NAA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+50～100mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.5～1.5mg/L NAA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+50～100mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌吟；所述NAA，指〆-萘乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容、然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
3.诱导培养：从母株上切取叶片尚未展开的幼苗，除去外层叶片，用自来水冲洗30min，剥去最外面的一层叶鞘，在体积比为75％的酒精中浸2～3s，用体积比为0.1％的升汞溶液消毒10min，取出用无菌水冲洗3次后，然后在无菌条件下剥取顶芽或侧芽，切取0.5～1mm，的茎尖，接种于诱导培养基上，培养25d后形成大量原球茎；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
4.增殖培养：将生长健壮的原球茎转入增殖培养基中,30d后开始分化，逐步诱导出丛生芽并发育成不具根的幼芽；每30d转接一次，获得大量幼芽；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
5.壮苗培养：将增殖培养的幼芽接种到壮苗培养基上，30d成为高度为6～8cm丛生芽苗；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
6.生根培养：取高度为6～8cm丛生芽苗，切成单株，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照12h，光照强度为1500lx；
7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的水草中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。
本发明的应用效果：
由于本发明的化学消毒组培方法，是利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用，所以，配制的培养基是无需高温高压灭菌。因此，在文心兰诱导培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养各个阶段的影响，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。
1.诱导培养：通过实验证实，本发明的一种文心兰的化学消毒组培方法与常规的文心兰组培方法相比，结果如表1所示，在诱导培养阶段的外植体培养的成活率、污染率和死亡率都没有太大差异。
表1本发明的化学消毒组培方法对文心兰诱导培养的影响
| 组培方式 | 平均成活率(％) | 平均污染率(％) | 平均死亡率(％) |
| 常规组培方法 | 58 | 35 | 7 |
| 化学消毒组培方法 | 62 | 32 | 6 |
2.增殖培养：本发明的化学消毒组培方法与常规组培文心兰的增殖倍数和污染率的比较，结果如表2所示，增殖倍数和污染率二个指标都没有太大差异。在瓶苗的生长状况看，本发明的化学消毒组培方法的培养基由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，其文心兰组培苗更绿，更壮。
表2本发明的化学消毒组培方法对文心兰增殖倍数和污染率的影响
| 组培方式 | 平均增殖倍数 | 平均污染率(％) | 生长状况 |
| 常规组培方法 | 3.5 | 0 | 苗浅绿、弱 |
| 化学消毒组培方法 | 3.4 | 0 | 苗绿、壮 |
3.壮苗培养：壮苗培养的试验结果如表3所示，本发明的文心兰化学消毒组培方法的每瓶平均壮苗数明显高于常规的文心兰组培方法，瓶苗也更壮、更绿。在污染率方面没有差异。
表3本发明的化学消毒组培方法对文心兰壮苗数和污染率的影响
| 组培方式 | 平均壮苗数/瓶 | 平均污染率(％) | 生长状况 |
| 常规组培方法 | 15.2 | 0 | 苗浅绿、弱 |
| 化学消毒组培方法 | 20.5 | 0 | 苗绿、壮 |
*苗高大于2cm的瓶苗为壮苗
4本发明的化学消毒组培方法对文心兰生根率和污染率的影响：在生根过程中，本发明的化学消毒组培方法与常规的文心兰组培方法相比，结果如表4所示，生根率和污染率都没有太大差异；从瓶苗的生长状况看，用本发明的方法，文心兰组培苗茎更粗，叶片更大。
表4本发明的化学消毒组培方法的文心兰瓶苗生根情况
5.成本分析：本发明的化学消毒组培方法与常规组培的成本分析见表5。
本发明组培省去了高压灭菌环节,简化了组培程序,提高了工作效率。从可以直接计算出来的费用来算，每年可以节约5万元左右(以每天配制50L培养基计算)。另外，还有一些不容易计算的项目，如高压锅维修，安全，节约空间等。
表5本发明的文心兰简便组培方法培养与常规组培的成本分析表
本发明具有如下有益效果：
1.本发明的文心兰化学消毒组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了文心兰组培环节，降低了文心兰组培成本。
2.本发明的文心兰化学消毒组培方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配制后即可，实用性强，推广性好。
3.本发明的文心兰化学消毒组培方法与常规的文心兰组培方法对比，可以降低成本10％以上。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。
实施例一：一种文心兰化学消毒组培方法
一种文心兰化学消毒组培方法，包括以下步骤：
1.培养容器消毒：将培养瓶瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡10h，保存备用；
2.培养基配制：诱导培养基为MS+4mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+70mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；壮苗培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+1.0mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+8mg/L乳酸链球菌素+50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容、然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
3.诱导培养：从母株上切取叶片尚未展开的幼苗，除去外层叶片，用自来水冲洗30min，剥去最外面的一层叶鞘，在体积比为75％的酒精中浸2～3s,用体积比为0.1％的升汞溶液消毒10min，取出用无菌水冲洗3次后，在无菌条件下剥取顶芽或侧芽，切取0.5～1mm的茎尖接种于诱导培养基上，25d后可形成大量原球茎；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
4.增殖培养：取生长健壮的原球茎转入增殖培养基中,30d后开始分化，逐步诱导出丛生芽并发育成不具根的幼芽。每30d转接一次，可以达到大量增殖的效果；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
5.壮苗培养：将增殖培养的幼芽接种到壮苗培养基上，30d可以获得6～8cm高的丛生芽苗；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
6.生根培养：取壮苗培养获得的6～8cm高的丛生芽苗，切成单株，接种到生根培养基上，25d后形成完整植株；培养室温度为25℃，光照12h，光照强度为1500lx；
7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至透水性好的水草中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。
Claims (5)
1.一种文心兰化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在1ml/L 10％次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
(2)培养基配制：诱导培养基为MS+1～5mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+50～100mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：MS+1.0～3mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+50～100mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；壮苗培养基为MS+0.1～0.5mg/L 6-BA+0.5～1.0mg/L NAA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+50～100mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.5～1.5mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+50～100mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌呤；所述NAA，指〆-萘乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒后的培养容器中，封口，凝固后备用；
(3)诱导培养：从母株上切取叶片尚未展开的幼苗，除去外层叶片，用自来水冲洗30min，剥去最外面的一层叶鞘，在体积比为75％酒精中浸泡2～3s，用体积比为0.1％的升汞溶液消毒10min，取出用无菌水冲洗3次，然后在无菌条件下剥取顶芽或侧芽，切取0.5～1mm的茎尖接种于诱导培养基上，25d后形成大量原球茎；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
(4)增殖培养：取生长健壮的原球茎转入增殖培养基中，30d后开始分化，逐步诱导出丛生芽并发育成不具根的幼芽；每30d转接一次，培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
(5)壮苗培养：取增殖培养的幼芽接种到壮苗培养基上，30d可以达到6～8cm高芽苗；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400lx；
(6)生根培养：取壮苗培养后高度为6～8cm的芽苗切成单株，接种到生根培养基上，生根培养25d后形成完整植株；培养室温度为25℃，光照12h，光照强度为1500lx；
(7)瓶苗移栽：取生根培养后形成的完整植株，洗净根部的培养基，用800倍体积的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的水草中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。
2.根据权利要求1所述的一种文心兰化学消毒组培方法，其特征在于所述诱导培养基为：MS+4mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+70mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8。
3.根据权利要求1所述的一种文心兰化学消毒组培方法，其特征在于所述增殖培养基为：MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8。
4.根据权利要求1所述的一种文心兰化学消毒组培方法，其特征在于所述壮苗培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8。
5.根据权利要求1所述的一种文心兰化学消毒组培方法，其特征在于所述生根培养基为：1/2MS+1.0mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+8mg/L乳酸链球菌素+50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8。
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