CN104878006B - 糊粉层特异表达的、调节植物种子大小及淀粉品质的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了糊粉层特异表达的、调节植物种子大小及淀粉品质的基因及其应用。具体地，本发明首次发现OsNF‑YB1基因特异在植物胚乳的糊粉层表达，还与植物种子的直链淀粉含量和种子大小密切相关。因此，OsNF‑YB1的启动子可用于调控目的基因在植物糊粉层的特异表达，从而实现植物品种改良。此外，OsNF‑YB1基因可应用于植物的培育中，选育出具有特定淀粉品质性状的品种。

Description

糊粉层特异表达的、调节植物种子大小及淀粉品质的基因及 其应用

技术领域

本发明属于植物学和基因工程领域，更具体地，本发明涉及糊粉层特异表达的基因及其应用，调控植物种子直链淀粉及其种子大小的基因及其应用。

背景技术

胚乳是谷物的主要储藏器官，发现胚乳发育不同时期和各种组织中特异的启动子有助于改良品种。水稻胚乳表层形成糊粉层，在种子发育过程中，糊粉层将灌浆物质转运到胚和胚乳细胞内部；种子萌发时，糊粉层分泌水解酶水解胚乳细胞中贮藏的淀粉和蛋白从而发挥重要的功能。糊粉层细胞的特点使其成为研究热点。

目前，水稻中还没有糊粉层特异表达的基因报道。目前虽然发现了一些可在糊粉层中表达的基因，但这些基因也在其他组织或部位表达。例如，pRINO1(Yoshida,K.T.etal.,1999,Plant Phys iology 119,65-72.)和ABA诱导的三个基因Rab16A,REG2,OSBZ8(Miyoshi,K.Et al.,1999,Plant and Cell Physiology 40,443-447.)不仅在糊粉层表达，在胚中也有表达。一个谷蛋白编码基因GluD1在胚和胚乳中都有表达(Kawakatsu,T.Etal.,2008,Journal of Experimental Botany 59,4233-4245.)。

淀粉作为水稻胚乳的主要组成成分，由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉含量直接影响稻米的蒸煮食用品质，是国内外衡量稻米品质的一个主要指标。直链淀粉含量低，则米饭的粘性好、味道佳。因此，发现调控直链淀粉含量的基因对改良稻米品质有重要意义。

此外，为了对水稻等作物进行品种改良，迫切需要开发能够在种子等部位特异性表达的启动子，以便更有效和便捷地对作物进行改良。

综上所述，本领域迫切需要开发能够在糊粉层特异表达的和/或调节植物种子淀粉品质的基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种能在糊粉层特异表达、调节植物种子直链淀粉含量以及植物种子大小的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种启动子元件，所述启动子元件选自下组：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:4所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％、≥90％、≥95％或≥98％)，且具有在植物糊粉层特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO:4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-6个)核苷酸，且具有植物糊粉层特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的启动子元件是植物糊粉层特异性表达的启动子。

在另一优选例中，所述的启动子是水稻糊粉层特异性表达的启动子。

在本发明的第二方面，提供了一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件。

在本发明的第三方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：本发明第一方面所述的启动子元件、外源基因ORF序列和终止子。

在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的启动子元件、或本发明第四方面所述的表达盒。

在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体上整合有外源的本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述的细胞包括糊粉层细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种如本发明第一方面所述的启动子元件、本发明第二方面所述的构建物或本发明第三方面所述的表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在植物糊粉层的表达。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：禾本科植物、茄科植物、大戟科植物。较佳地，所述植物选自：水稻、小麦、玉米、马铃薯、木薯。

在本发明的第七方面，提供了一种在糊粉层特异性表达外源基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件；

(b)将步骤(a)得到的构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞；

(c)将步骤(b)中转化的植物细胞再生成植株，从而使所述外源基因在植物糊粉层特异性表达。

在另一优选例中，所述的植物包括水稻。

在本发明的第八方面，提供了一种制备转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一植物细胞，所述植物细胞含有本发明第四方面所述载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述启动子、或其染色体整合有本发明第三方面所述表达盒；

(b)将(a)的植物细胞再生为植株，从而获得转基因植物。

在另一优选例中，所述的植物包括水稻。

在另一优选例中，在步骤(a)中所述的植物细胞是如下制备的：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明第二方面所述的构建物(construct)；

(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞。

在本发明的第九方面，提供了一种植物愈伤组织或植物体细胞胚胎，所述植物愈伤组织或植物体细胞胚胎包下述植物细胞或由下述植物细胞构成：所述植物细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述的植物包括水稻。

在本发明的第十方面，提供了一种OsNF-YB1基因、OsNF-YB1蛋白或其活性片段、或OsNF-YB1的拮抗剂、或OsNF-YB1的激动剂的用途，它们被用于调控植物(尤其是种子)的淀粉品质及其种子大小。

在另一优选例中，所述调控植物的淀粉品质是指调控植物种子中的直链淀粉含量和/或调控植物种子中支链淀粉含量。

在另一优选例中，所述的直链淀粉含量为种子中直链淀粉占总淀粉的重量百分比。

在另一优选例中，所述的支链淀粉含量为种子中支链淀粉占总淀粉的重量百分比。

在另一优选例中，所述调控为降低植物中直链淀粉含量。

在另一优选例中，所述调控为调控植物种子的糊粉质淀粉品质。

在另一优选例中，使用OsNF-YB1的拮抗剂(如miRNA或其前体、或其表达载体)，从而降低植物种子的直链淀粉含量、千粒重、或其组合。

在另一优选例中，将干扰所述OsNF-YB1蛋白的编码序列表达的拮抗剂(如干扰分子)转入植物细胞、组织、器官或种子，从而下调植物中蛋白的表达。

在另一优选例中，使用OsNF-YB1的激动剂，从而提高植物种子的直链淀粉含量及其千粒重。

在另一优选例中，使用OsNF-YB1基因或蛋白，从而提高植物种子的直链淀粉含量及其千粒重。

在另一优选例中，降低OsNF-YB1蛋白的表达或活性，从而降低植物种子的直链淀粉含量、千粒重或其组合。

在另一优选例中，所述的OsNF-YB1基因包括OsNF-YB1的基因组序列(例如SEQ IDNO.:1)或cDNA序列(例如SEQ ID NO.:2)。

在另一优选例中，所述的OsNF-YB1蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地≥95％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述植物选自：禾本科植物、茄科植物、大戟科植物。

在另一优选例中，所述植物是禾本植物。

在另一优选例中，所述植物选自：水稻、小麦、玉米、马铃薯、木薯。

在另一优选例中，所述植物为水稻。

在另一优选例中，所述OsNF-YB1的拮抗剂包括(i)干扰所述OsNF-YB1蛋白的编码序列表达(或转录)的干扰分子(包括反义分子)、其前体、或其表达载体；(ii)抗OsNF-YB1蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的干扰分子的前体具有如SEQ ID NO.:15所述的序列。

在另一优选例中，所述的拮抗剂包括OsNF-YB1蛋白的抑制剂和/或下调剂。

在另一优选例中，所述OsNF-YB1的激动剂选自：促进OsNF-YB1表达的物质。

在本发明的第十一方面，提供了一种改良植物(如水稻作物)性状的方法，所述的改良包括调控植物淀粉品质，所述方法包括步骤：提高或降低水稻作物中OsNF-YB1或OsNF-YB1活性片段的表达或活性。

在另一优选例中，所述改良包括，降低植物种子的直链淀粉含量及其千粒重和/或提高植物种子的支链淀粉含量及其千粒重。

在另一优选例中，所述的降低水稻作物中OsNF-YB1或OsNF-YB1活性片段的表达或活性是通过以下方式实现：在所述作物中表达OsNF-YB1的拮抗剂(如反义核酸、iRNA等)。

在本发明的第十二方面，提供了一种OsNF-YB1蛋白或其编码基因用途，它们被用作鉴定植物种子中直链淀粉含量的分子标记，或用于制备检测植物种子中直链淀粉含量的检测试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括引物、探针、芯片等。

在另一优选例中，所述的植物包括水稻。

在另一优选例中，所述的检测包括检测待测植物中OsNF-YB1蛋白的表达水平或活性，并与标准值或标准曲线进行比较，从而得到所述待测植物中种子中直链淀粉含量的测量值(预测值)。

在另一优选例中，所述检测还包括对所述的植物种子中直链淀粉含量进行实际测量，并将实际测量值与所述预测值进行比较。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了OsNF-YB1基因在野生型不同组织中的表达。其中，YL为萌发10天幼苗的叶；YR为萌发10天幼苗的根；FL为开花当天的旗叶；H2B为开花前两天的颖壳；H2A为开花后两天的颖壳；ovary为子房；3d、6d、8d、10d、12d、16d分别代表开花后3、6、8、10、12、16天的颖果。(数据为3次生物学重复的平均值。)

图2显示了OsNF-YB1基因在野生型水稻开花后4、6、8、10天的颖果中精细表达的情况。其中，图2A从左至右分别为：开花后4、6、8、10天颖果的横切，下行为正义探针的负对照，比例尺为500μm；图2B从左至右分别为：开花后4、6、8、10天颖果的纵切，下行为正义探针的负对照，比例尺为1mm。

图3显示了OsNF-YB1基因启动子驱动GUS报告基因的表达模式。其中，图3A从左上到右下分别为：旗叶、茎、颖壳和幼苗(比例尺为1mm)；图3B自上而下分别为：开花后9天颖果的纵切和横切(比例尺为0.5mm)。

图4显示了质粒pUN301的结构示意图。

图5显示了本发明一种OsNF-YB1基因的RNAi前体的序列(SEQ ID NO.:15)。

图6显示了OsNF-YB1、OsNF-YB6和OsNF-YB8在野生型和4个RNAi转基因株系的表达量。其中，检测材料为受精后6天的颖果，数据为3个生物学重复和3个技术重复的平均值±标准误。

图7显示了利用DNA杂交确认4个RNAi株系的T-DNA***拷贝数。其中，30μg叶片DNA分别用如图所示的限制性内切酶酶切，地高辛标记的Hyg探针用于信号检测。

图8显示了RNAi转基因糙米的表型观察。其中，图-8从上到下分别为：野生型(WT)和OsNF-YB1的RNAi转基因糙米(i2、i4、i8、i12)的大小比较图(比例尺为1cm)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现水稻的OsNF-YB1基因不仅特异地在植物胚乳的糊粉层表达，还与植物种子的直链淀粉含量以及种子千粒重密切相关。具体地，OsNF-YB1的启动子可用于调控目的基因(或外源基因)在植物糊粉层的特异表达，从而实现植物品种改良，而OsNF-YB1基因可应用调控植物种子中的直链淀粉含量以及种子千粒重，从而用于在植物培育中选育出具有特定淀粉品质性状的品种。在此基础上完成本发明。

术语

如本文所用，术语“OsNF-YB1”与“HAP3K”可互换使用。中国专利申请201410073383.5中的“HAP3K基因”和“HAP3K启动子”在本文中称为“OsNF-YB1基因”和“OsNF-YB1启动子”。

如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。比如，所述的“植物”包括但不限于：水稻、小麦、大麦、玉米、马铃薯、木薯等。较佳的，所述的植物是禾本科植物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。组织或器官特异型启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。

如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，“目的基因”或“外源基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于：β-葡萄糖苷酶(GUS)基因、改善植物品质或性状或表型相关的基因(如人乳铁蛋白基因、赖氨酸合成酶基因、beta胡萝卜素合成基因、蔗糖转运蛋白、细胞壁转化酶基因等)、以及种子中激素合成相关基因等。

如本文所用，术语“特异性表达”或“特异表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。“组织特异性”又称“器官特异性”，在一些调控元件的调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出其相关的发育调节的特性。本发明中，所述的“组织特异性表达”是指在植物胚乳的糊粉层中特异表达。通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍水平被表达，则认为相关基因的表达是组织或器官特异性的。

如本文所用，所述的“植物”是具有胚、胚乳结构的植物。本领域人员熟知，植物胚或胚乳的组成成分是相似的，具有胚或胚乳结构的植物具有共同的特性，其基因组中存在许多保守的调控基因转录、表达的基因或调节元件，例如一系列调控植物形成胚或胚乳的元件。因此可以确定：可以调控目的基因在禾本科植物的糊粉层中特异性表达的启动子也可以调控目的基因在禾本科植物以外其它具有胚或胚乳结构的植物产生同样的表达特性。作为本发明的优选方式，所述的植物是被子植物；较佳地，所述的植物是单子叶植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。

如本文所用，术语“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

OsNF-YB1基因

本发明还提供了OsNF-YB1(又被称为“HAP3K基因”)在调节植物种子中直链淀粉含量及其种子大小的应用。具体地，本发明人首次发现，OsNF-YB1蛋白与植物种子中直链淀粉占总淀粉的含量(或重量百分比)及其种子千粒重相关。因此，通过施用或使用OsNF-YB1基因、OsNF-YB1蛋白或其活性片段、或OsNF-YB1的拮抗剂、或OsNF-YB1的激动剂等物质，可以调控(包括降低和升高)种子中直链淀粉占总淀粉的含量以及种子千粒重，从而改良植物(如水稻)。

在本发明中，OsNF-YB1基因包括来自禾本科等各种不同物种的OsNF-YB1基因，尤其是来自水稻、小麦等农作物的OsNF-YB1基因。

在本发明中，一种优选的OsNF-YB1是水稻OsNF-YB1。水稻的OsNF-YB1野生型氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，基因组序列如SEQ ID NO:1所示，编码区序列如SEQ ID NO:2所示。

启动子及其应用

如本文所用，术语“本发明启动子”、“糊粉层特异表达的启动子”、或“OsNF-YB1启动子”可互换使用，均表示源于水稻OsNF-YB1基因的启动子元件。一种优选的OsNF-YB1启动子序列如SEQ ID NO.:4所示。该术语还可来自其他植物(尤其是禾本科植物)的同源启动子。例如，获自其它植物的、与水稻OsNF-YB1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明启动子特别适合驱动外源基因在水稻糊粉层特异性表达，而在水稻的其它组织中不表达。

本发明的启动子是一种组织特异性启动子，它能够高效、专一地在水稻胚乳糊粉层中特异性表达，而在其它组织中不表达。因此，本发明的启动子特别适用于特异性改善水稻种子的性状，避免外源基因对水稻的其它组织产生影响。

本发明的启动子还是一种时间特异性启动子，它仅在开花后的一段特定时期(尤其是开花后3-20天)表达。

在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过***或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员应理解，尽管本发明的实施例中提供的OsNF-YB1启动子序列如SEQ ID NO:4所示，但本发明还应包括与本发明的启动子序列(SEQ ID NO:4)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，只要所述核酸也具有在水稻胚乳(特别是糊粉层)中特异性表达的功能。

在本发明中，“水稻糊粉层中特异性的表达”是指在本发明的启动子调控下，目的基因高度特异性和专一性地在水稻糊粉层中表达。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所***的细胞或生物体来说也是“外源的”。

如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。

本发明的启动子可以可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子可以是外源(异源)的。本文所述的外源基因(或目的基因)没有特别限制，可以是RNAi基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或植物或水稻改良上有重要特性或功能的蛋白。合适的目的基因包括但不限于：改良植物品质、性状或代谢相关的基因。

在本发明中，所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。

代表性的抗性基因包括(但并不限于)：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。

代表性的筛选标记基因包括(但并不限于)：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。

代表性的抗原蛋白基因及生物制剂基因包括(但并不限于)：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB–pins)、或生物制剂(如α2b干扰素，***等)。

代表性的植物品质相关基因包括(但并不限于)：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或雄性不育相关基因。

含本发明启动子的转基因植物(如水稻)可以特异性地改善水稻的农艺性状，有效避免外源基因导入对水稻其它组织的影响，还能在胚乳的糊粉层中特异性表达外源基因，从而获得各种相关产物。由于水稻胚乳是供食用稻米的主要组成部分，若将优良的外源基因在该启动子的控制下导入水稻胚乳中，可以显著提高稻米品质，实现水稻的遗传改良。

此外，本发明启动子还可用于标记糊粉层，引导特定的功能基因特定的在糊粉层表达，以及应用于糊粉层的生长发育研究和针对性改良。

此外，本发明的启动子序列可以设计成下调特定基因。一般，这是通过将启动子序列连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组构建物(重组载体)中。

OsNF-YB1蛋白及其编码序列

如本文所用，“分离的OsNF-YB1蛋白”或“分离的OsNF-YB1多肽”是指OsNF-YB1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OsNF-YB1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括OsNF-YB1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的OsNF-YB1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种OsNF-YB1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，OsNF-YB1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的OsNF-YB1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长OsNF-YB1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长OsNF-YB1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“OsNF-YB1蛋白”指具有OsNF-YB1蛋白活性的SEQ IDNO:3序列的多肽。该术语还包括具有与OsNF-YB1蛋白相同功能的、SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括OsNF-YB1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与OsNF-YB1蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗OsNF-YB1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含OsNF-YB1蛋白或其片段的融合蛋白。

任何与所述的OsNF-YB1蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:3所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有OsNF-YB1蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

发明还提供OsNF-YB1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然OsNF-YB1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“OsNF-YB1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu

Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还涉及编码本发明OsNF-YB1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码OsNF-YB1蛋白的多聚核苷酸。

本发明的OsNF-YB1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

重组载体、宿主细胞和转基因植物

本发明还提供了基于本发明启动子和OsNF-YB1蛋白(或编码序列)的构建物、表达盒和载体等。

在本发明中，一种代表性的基因表达盒从5’-3’依次具有下列元件：本发明的启动子、外源基因ORF序列和终止子。

本发明还提供了一种重组载体，其包含本发明的启动子和/或基因表达盒。在优选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。

在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5’到3’方向上包括：启动子，目的基因和终止子。

如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。

在本发明中，转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

在优选的实施方式中，一种制备转基因植物的方法包括：将携带可操作连接的启动子和目的基因的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。优选的转基因受体植物包括(但并不限于)：水稻、小麦、大麦和玉米。

在本发明的一个实例中，所述的重组载体是带有GUS报告基因的双元载体(如pBI101.1、pUN301)，将本发明的启动子构建到该载体中GUS基因的上游，转化植株，启动子将激活GUS基因的表达，所述启动受到启动子区顺式作用元件的调控，可以有效模拟基因在体内被激活转录的状况。

β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。

在本发明的具体实施例中，在本发明启动子的启动下，GUS基因可以特异地在水稻胚乳(特别是糊粉层)中表达，而在其它组织中不表达。因此该启动子可以用于特异性改善水稻种子的性状，而不使得外源基因对其它组织造成影响。

本发明的启动子、构建物、或表达盒等可用于在水稻胚乳(特别是糊粉层)中特异表达外源基因，从而改善水稻种子的品质。本发明也可用于在水稻胚乳(特别是糊粉层)中特异性地生产蛋白产物(如抗原蛋白及生物制剂)，或用于研究外源基因在糊粉层或胚乳中的特定功能。

在本发明的另一方面，提供了含有OsNF-YB1编码序列或干扰OsNF-YB1表达的载体以及用所述的载体转化的宿主细胞。其中，干扰OsNF-YB1表达的载体包括基于RNA干扰技术的载体。

本发明中，OsNF-YB1多核苷酸序列或特异性干扰OsNF-YB1的干扰RNA序列(或其前体序列)可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得因OsNF-YB1表达或活性上升或下降而淀粉合成代谢性状发生改变的植物。

OsNF-YB1的激动剂或拮抗剂

本发明还涉及OsNF-YB1的激动剂或拮抗剂及其用途。由于OsNF-YB1的激动剂或拮抗剂可调节OsNF-YB1的表达和/或调节OsNF-YB1的活性等，因此，所述的OsNF-YB1的激动剂或拮抗剂也可通过对OsNF-YB1的影响来调控植物直链淀粉含量及其种子千粒重，从而达到改良植物的目的。

任何可提高OsNF-YB1蛋白的活性、提高OsNF-YB1蛋白的稳定性、促进OsNF-YB1蛋白的表达、延长OsNF-YB1蛋白有效作用时间、或促进OsNF-YB1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调控植物直链淀粉含量。任何可降低OsNF-YB1蛋白的活性、降低OsNF-YB1蛋白的稳定性、抑制OsNF-YB1蛋白的表达、减少OsNF-YB1蛋白有效作用时间、或降低OsNF-YB1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为OsNF-YB1的下调剂、拮抗剂或抑制剂(即：下调OsNF-YB1蛋白表达的物质)，如抗所述OsNF-YB1蛋白的抗体，干扰所述OsNF-YB1蛋白的编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于调控植物直链淀粉含量及其种子千粒重。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

基于OsNF-YB1改良植物种子淀粉品质

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中OsNF-YB1蛋白的表达，从而改良植物种子淀粉品质。

本发明还提供了一种降低直链淀粉含量的方法，所述的方法包括：降低所述植物中OsNF-YB1蛋白的表达(包括使OsNF-YB1蛋白不表达或低表达)。通常，这可通过常规的RNAi干扰技术来实现。

在一优选例中，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的OsNF-YB1蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带OsNF-YB1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的OsNF-YB1蛋白。

在另一优选例中，可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低OsNF-YB1蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义OsNF-YB1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达OsNF-YB1蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将编码OsNF-YB1蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述OsNF-YB1蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达OsNF-YB1蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达OsNF-YB1蛋白的植物。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源基因(包括OsNF-YB1蛋白的编码基因或干扰OsNF-YB1表达的干扰RNA的前体序列)转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入OsNF-YB1蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述外源基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有外源基因(包括OsNF-YB1蛋白的编码基因或干扰OsNF-YB1表达的干扰RNA的前体序列)；

(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述外源基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入外源基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

其它增加OsNF-YB1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强OsNF-YB1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该OsNF-YB1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

在本发明中，一种优选的降低植物中OsNF-YB1蛋白的表达的方法包括：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)含有反方向启动的OsNF-YB1蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；

(b)含有可在植物体内形成特异性干扰OsNF-YB1蛋白的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；

(ii)将植物的细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物细胞、组织或器官。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

其它抑制OsNF-YB1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了OsNF-YB1基因或其同源基因的转基因植物；或者OsNF-YB1蛋白表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。

OsNF-YB1的其他应用

本发明还涉及利用OsNF-YB1蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用OsNF-YB1蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中OsNF-YB1蛋白的表达情况，鉴定禾本科植物种子直链淀粉含量。还可利用OsNF-YB1基因相关的植物直链淀粉含量作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

此外，本发明还提供了筛选可调节植物种子直链淀粉含量的潜在物质的方法。在得知了所述的OsNF-YB1蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调控植物直链淀粉含量的潜在物质。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选调控植物直链淀粉含量的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达OsNF-YB1蛋白的体系接触，检测候选物质对OsNF-YB1蛋白的影响；若所述候选物质可提高或降低OsNF-YB1蛋白的表达，或促进或抑制OsNF-YB1蛋白的活性，则表明其是可用于调控植物直链淀粉含量。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调控植物直链淀粉含量有用的物质。

因此，本发明还包括通过所述的筛选方法获得的物质，所述的物质可用于调控植物直链淀粉含量。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的糊粉层特异性表达的启动子序列在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值，且尤其适用于水稻等作物；

(b)本发明技术可针对性地降低作物种子中的直链淀粉含量及其种子千粒重和提高支链淀粉的含量及其种子千粒重，从而达到对种子淀粉品质的改良和优化，在转基因作物的选育等方面有着广泛的应用前景；

(c)本发明的启动子序列及其相关技术特别适用于在遗传水平上对作物种子进行功能性的改造和选育，从而实现规模性生产或培育能特异性表达功能产物的作物和种子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

OsNF-YB1基因的特异表达

1.1芯片筛选

取材营养组织(根，叶，苗)，以及不同发育阶段的水稻胚和胚乳，制作Affymetrix芯片。利用所制作的芯片，筛选并分离出在水稻胚乳中特异表达的候选基因。

通过大量筛选，确定了一个候选基因为NF-Y家族的转录因子OsNF-YB1，又被称为OsHAP3K基因。

1.2实验验证

为了进一步确认OsNF-YB1基因在不同组织中的表达，进一步利用qRT-PCR的方法检测了OsNF-YB1基因在野生型水稻不同组织中的表达。

所用的材料包括：萌发10天幼苗的叶(YL)，萌发10天幼苗的根(YR)，开花当天的旗叶(FL)，开花前两天的颖壳(H2B)，开花后两天的颖壳(H2A)，子房(ovary)，以及开花后3、6、8、10、12、16天的颖果。

方法如下：提取了野生型(ZH11)的上述不同组织的RNA，进行反转录。然后采用OsNF-YB1基因上特异的两条引物P1(5’-GAA TAT AGC GGC TCA TCA CC-3’，SEQ ID NO.:5)和P2(5’-ACA CAC ACA TGC ATC AAG TT-3’，SEQ ID NO.:6)，进行常规PCR扩增。

实验结果

如图1所示。结果表明，OsNF-YB1基因仅在开花后的颖果中有表达，在其他组织不表达，在开花后3天的颖果中表达较低，6天的颖果中表达升高，8天的颖果达到最高，之后依次降低。

这表明，OsNF-YB1基因是一种组织特异性(仅表达于颖果的特定部位)和时间特异性(仅在开花期表达)的启动子，尤其在开花后3-20天(如6-16天)中表达量较高。

实施例2

OsNF-YB1基因在颖果中的精细定位

为了研究OsNF-YB1基因在颖果中的精细定位，在本实施例中，进一步利用原位杂交的方法，检测了OsNF-YB1基因在野生型(ZH11)水稻开花后4、6、8、10天的颖果中的表达位置。方法如下：

提取野生型(ZH11)水稻开花后6天颖果的RNA，以反转录后获得的cDNA作为模板，用引物P3(5’-ACG CCC GGT GGA CCG AC-3’，SEQ ID NO.:7)和P4(5’-ACG CAA ACA TCAAGC ATT-3’，SEQ ID NO.:8)，通过常规的PCR方法，扩增获得OsNF-YB1基因上385bp的特异片段(SEQ ID NO.:11)，并以Dig-UTP标记的方法制备RNA探针。

取开花后4、6、8、10天的颖果固定，石蜡包埋，分别做横纵切片，用如上制备的RNA探针进行杂交。

实验结果

如图2所示。结果表明，OsNF-YB1仅在胚乳的糊粉层表达。

实施例3

OsNF-YB1基因的启动子驱动报告基因在糊粉层特异表达

在本实施例中，构建了OsNF-YB1启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的双元载体并转化野生型水稻ZH11。其中，所述的OsNF-YB1的启动子序列如SEQ ID NO:4所示。

方法如下：以野生型(ZH11)水稻总DNA为模板，用引物P5a(5’-GCT CTA GA T AAGAAA TCG CTC TTC CTC-3’)(SEQ ID NO.:13)和P6a(5’-CGG GAT CCG CTC TCT CAA GTCTCA ATG A-3’)(SEQ ID NO.:14)，通过常规的PCR方法，扩增获得OsNF-YB1的启动子，XbaI/BamHI双酶切后连入同样酶切处理的双元载体pCAMBIA1300+pBI101.1(参见Liu,W.,Xu,Z.H.,Luo,D.,and Xue,H.W.Plant J 2003；36:189–202)中。

采用常规电击转化方法，将双元载体质粒导入常规的根癌农杆菌EHA105，并采用农杆菌介导法(参见Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Plant J 1994；6:271-282)，对野生型水稻Zhonghua11(获自上海市农业科学院)进行转化。

实验结果

对10个T1代转基因株系进行GUS染色分析。结果如图3所示。

检测表明，仅在种子胚乳的糊粉层细胞中检测到GUS信号。转基因植株的幼苗、旗叶、茎、腋芽等营养组织和开花前一天的颖壳中没有检测到GUS信号，胚中也没有GUS信号。

实施例4

OsNF-YB1基因的RNAi转基因株系的制作

为了进一步研究OsNF-YB1基因的生理功能，在本实施例中，通过RNA干扰技术来下调OsNF-YB1的表达，从而进行研究。

构建针对OsNF-YB1基因的RNAi载体，用于转化水稻。方法如下：提取野生型(ZH11)水稻开花后6天种子的RNA，以反转录后获得的cDNA作为模板，采用引物P6(5’-GGG GTA CCAAGC TTA AAG CGT GGT GGC AGG AAC-3’，SEQ ID NO.:9)和P7(5’-CGG GAT CCC TGC AGTGGG GTC GAC GTA GCG ATC-3’，SEQ ID NO.:10)(引物分别含有KpnI/HindI II和BamHI/PstI的酶切位点)，利用常规PCR的方法，扩增获得OsNF-YB1基因的311bp特异片段(SEQ IDNO.:12)。

对扩增产物分别用HindIII/PstI和BamHI/PstI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，依次反向连入到经同样酶切处理后的pMD18-T-intron载体(该载体是由Takara公司的pMD18-T改造而成，其中在EcoRV酶切位点处连入479bp的intron片段，构建方法见Chang,L.,Ma,H.,and Xue,H.W.Cell Research 2009；19:768-782)中，从而将上述PCR扩增产物分别***到所述内含子的上游和下游(该结构在植物细胞内转录并加工后，可形成特异性干扰OsNF-YB1的RNAi，该RNAi前体的序列如SEQ ID NO.:15所示)。经酶切鉴定，获得了正确***的载体,称为载体pMD18-T-intron-OsNF-YB1i。

从上述载体pMD18-T-intron-OsNF-YB1i中，用HindIII酶切获得含反义序列的酶切产物。对所述HindIII酶切产物补平后连入SmaI酶切的pUN301双元载体(参见Ge,L.,Chen,H.,Jiang,J.F.,Zhao,Y.,Xu,M.L.,Xu,Y.Y.,Tan,K.H.,Xu,Z.H.,and Chong,K.PlantPhysiol 2004；135:1502–1513)中。

其中，pUN301的结构示意图如图4所示。pUN301的构建过程如下：

首先用内切酶HindIII和BamHI将玉米泛素启动子(ubiquitin promoter:UbiPro)(约2.0kb)从KSP9质粒(中国专利申请201010233089.8)中切下，用同样的内切酶位点连接到pUC19质粒(购自New EnglandBiolabs公司)上，得到质粒pUC19+UbiPro；同时用Sac I和EcoRI将Noster poly A终止序列从pBI221质粒(Genbank Accession AF502128或参见中国专利申请201010233089.8)切下，装在pUC19+UbiPro质粒中，形成质粒pUC19+UbiPro+Noster。然后利用EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切从pUC19+UbiPro+Noster质粒切下2.3kb片段，利用EcoRI和HindIII位点连接到常规的pCAMBIA1301质粒(购自上海捷兰生物技术有限公司)中，将得到的pCAMBIA1301+UbiPro+Noster质粒命名为pUN1301。在该质粒中，在UbiPro和Noster之间存在4个内切酶位点，从前到后分别是BamHI,SmaI,KpnI和SacI。采用常规电击转化方法，将上述质粒pUN1301导入常规的根癌农杆菌EHA105(见美国专利申请13/847928)，并采用常规的农杆菌介导法(参见Hiei Y,Ohta S,Komari T,KumashiroT.Plant J 1994；6:271-282)，对野生型水稻Zhonghua11(获自上海市农业科学院)进行转化。

从获得的T0代转基因植株中，提取了RNA并进行反转录，并用OsNF-YB1基因特异的引物P1和P2对该基因的表达进行检测，获得了多个OsNF-YB1显著下降(降低幅度为60-95％)的多个转基因株系，从这些转基因株系中选出4个独立的OsNF-YB1基因表达降低(降低幅度≥90％))的转基因株系命名为OsNF-YB1i-2、4、8、12，并用于后续试验。

4个T0代植株收种后进行扩繁，并将T2代的种子分别单株收种，每个单株的种子取30粒，在含潮霉素(30mg/L)的水中进行萌发，全萌发的单株被鉴定为纯系。

大田种植T2代纯合转基因植株，取受精后6天颖果的RNA进行qRT-PCR检测。同时检测OsNF-YB1、OsNF-YB6(LOC_Os01g70890)和OsNF-YB8基因(LOC_Os03g29970)的表达变化。其中，OsNF-YB6(LOC_Os01g70890)和OsNF-YB8基因(LOC_Os03g29970)与OsNF-YB1的cDNA序列相似度较高。在4个转基因株系中，OsNF-YB1表达量下调显著，而OsNF-YB6和OsNF-YB8基因的表达没有显著变化，说明OsNF-YB1的表达被特异下调。结果如图6所示。

通过DNA杂交技术，对于来自多个转基因株系中4个转基因株系(名称为i2、i4、i8和i12)，进行了T-DNA拷贝数目的检测。

结果表明，植株i2、i4和i8含有至少2个拷贝，i12含有单拷贝，并且这4个株系的T-DNA***位置是不同的，表明是4个独立的转基因株系(图7)。对于

本实施例所得的4个转基因株系的纯系种子，用于后续的分析。

实施例5、OsNF-YB1基因的RNAi转基因株系种子中淀粉含量的检测

利用基因共表达的分析方法，发现有多个淀粉合成基因与OsNF-YB1基因共表达。由于相关的淀粉合成基因主要负责种子中淀粉的合成，因此本发明人首先检测了OsNF-YB1基因的RNAi转基因株系种子中淀粉的含量，方法如下：

将相应的种子去壳，磨成精米后，再用磨粉机将精米磨成米粉，过100目筛，所得米粉供之后的实验所用。

直链淀粉含量的测定方法：称取一定量的米粉，采用改进的碘蓝比色法检测直链淀粉含量(参见梅淑芳，贾莉萌，高君恺等，核农学报2007；21：246-248)

总淀粉含量的测定方法：采用硫酸-蒽酮法检测总淀粉含量(参见何照范，张迪清，保健食品化学及其检测技术。北京：中国轻工业出版社，1998；165-168)。

实验结果如表2所示。

表2

野生型(WT)和4个OsNF-YB1基因的RNAi转基因株系种子的表观直链淀粉含量(AAC)及总淀粉含量检测。数据为三次试验重复的平均值±标准差

与野生型对照相比，OsNF-YB1基因的RNAi转基因植株种子中表观直链淀粉含量(AAC)明显下调(t-test检测具有显著性差异，P<0.05)，而总淀粉含量并无明显变化。

由此可以得出，在OsNF-YB1基因的RNAi转基因植株中，随着OsNF-YB1蛋白的下调，种子中直链淀粉所占的比例被明显下调。此外，由于总淀粉含量保持不变，这提示支链淀粉的含量相应增加了。

实施例6、OsNF-YB1基因的RNAi转基因株系糙米千粒重的检测

发明人检测了OsNF-YB1基因的RNAi转基因株系糙米的千粒重。方法如下：

将植株种植于大田，在自然条件下生长，每个转基因株系收集30个单株的种子，将水稻种子去壳，得到糙米，用于拍照和统计。随机选取60粒糙米，游标卡尺统计糙米的长度、宽度和厚度。

实验结果如表3所示。

表3

RNAi转基因植株种子相关指标的统计。千粒重为10份独立的100粒种子的平均重量乘以10。其他数据为60粒种子的平均值±标准差。**代表T检验具有极显著差异，P<0.01。

与野生型相比，OsNF-YB1的RNAi转基因植株的糙米明显变小(图-8)，糙米千粒重显著降低。通过统计糙米的长度、宽度和厚度，表明糙米粒重降低是由于糙米宽度和厚度降低导致的。

实施例7 OsNF-YB1基因的过表达转基因株系种子中千粒重及淀粉含量的检测

为了研究OsNF-YB1表达量增加对籽粒灌浆的影响，分别构建了35S启动子和自身启动子驱动OsNF-YB1表达的载体并转化水稻，qRT-PCR鉴定获得OsNF-YB1表达量增加的株系。采用实施例5和6相同方法，分析大田种植的纯合转基因植株的糙米大小、千粒重及淀粉含量。

结果表明，与对照植株相比，OsNF-YB1表达量增加的转基因植株，糙米大小、千粒重及直链淀粉含量无显著差异。这提示，糙米大小、千粒重及直链淀粉含量是受多基因影响的植物性状，仅提高OsNF-YB1的表达量不足以显著增加糙米大小、千粒重和直链淀粉含量。

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Claims (2)

1.一种OsNF-YB1的拮抗剂的用途，其特征在于，所述OsNF-YB1的拮抗剂被用于调控植物的淀粉品质及其种子的大小，其中，所述调控包括降低植物种子的直链淀粉含量、千粒重、或其组合，所述植物为水稻，并且所述拮抗剂为干扰所述OsNF-YB1蛋白的编码序列表达的miRNA或其前体、或其表达载体；所述OsNF-YB1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种改良植物性状的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：降低植物中OsNF-YB1的表达或活性，其中，所述改良包括降低植物种子的直链淀粉含量及其千粒重，所述植物为水稻，所述OsNF-YB1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。