CN104877948A - 丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及丙烯酸及脂类废料处理技术领域，具体涉及丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研究方法。通过废水采用进行丙烯酸降解菌株的培育，然后研究丙烯酸降解菌株在不环境因素下的生长状况和降解效果，为丙烯酸废水处理提供了一种新的方法。

Description

丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研究方法

技术领域

    本发明涉及丙烯酸及脂类废料处理技术领域，具体涉及丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研究方法。

背景技术

    丙烯酸树脂是一种重要的化工原料，广泛应用于油漆、涂料、皮革、纺织、印刷等工业。目前，我国丙烯酸树脂的总产量约120万吨，按照每生产、1吨丙烯酸产生1.2吨废水计算，每年我国丙烯酸及其酷类废水总量在140万吨左右。丙烯酸废水组分复杂、污染物浓度高、降解难度大，环境危害性强，该类废水的有效治理对节能减排及可持续发展具有重要的意义。

    当前，丙烯酸及其酷类废水的主要处理方法是焚烧法，具有技术成熟，占地面积小、处理效率高、可以回收焚烧过程中产生的热量等优点，但是焚烧法不可避免的存在处理费用较高、具有二次污染等问题，因此人们开发并研究了一些新的方法。催化湿式氧化法处理丙烯酸树脂具有去除效率高、能耗低、二次污染小的优点，是较为清洁的处理技术。但是，存在运行成本高、控制难度大、重金属催化剂潜在的污染等问题；超临界水氧化法处理丙烯酸及其酷类废水具有反应时间短、污染物去除彻底、占地面积小、清洁环保等优势，但是高浓度溶解氧、高温高压带来的设备腐蚀和无机盐沉积是该技术面临的主要问题；纤维吸附法、离子交换纤维法；Fenton氧化法、光电子波分解法降解丙烯酸及其酷类废水。均具有反应条件温和、反应速度较快、去除效率较高的特点，但是由于目前深入研究较少，且处理成本较高，尚未能应用到实际工程处理领域。利用生物法处理丙烯酸及其酷类废水具有能耗低、反应条件温和且效率较高，厌氧过程还可以回收沼气，更加符合国家节能减排、可持续发展的战略路线。研究具有专属适应性微生物的筛选驯化培养，对于提高生物反应***的耐受性和稳定性，提高降解效率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研究方法，它采用定时转接逐步提高碳源的方法，筛选出的菌株对高浓度丙烯酸废水具有较好的降解能力，为丙烯酸废水处理提供新的方法。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它的培育筛选及其降解性能研究方法：

1.1菌种来源及培养基

菌种分离自某汽车喷涂车间排污口污泥

营养培养基：蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75 g、NaCl1.25 g、蒸馏水250 mL；

固体营养培养基：蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75g、NaC1 1.25g、蒸馏水250mL、

琼脂5g；

无机盐培养基：NaC10.5g、NH₄N0₃0.4g、KHZP0₄1.Og、KZHP0₄1.Og、酵母浸粉0.2g，微量元素液4mL，蒸馏水1000mL，调pH值为7.2；

微量元素液：MgS0₄2.Og， CuS0₄0.5g， MnS0₄0.5 g， FeS0₄·7H₂0 O.5g、

CaC1₂0.5g、蒸馏水5OOmL；

降解用无机盐培养基：NaCl O.5g、NH₄N0₃0.4g、KHZP0₄1.Og、KZHP0₄1.Og、酵母浸粉0.2g、微量元素液4mL、丙烯酸废水1000mL、调pH值为7.2；

1.2菌种培养

1.2.1丙烯酸高效降解菌的筛选

 (a)制备菌液:将汽车涂装废水排污口污泥加入无菌水中，汽车涂装废水排污口污泥的浓度为0.08g/mL，摇床避光培养24h，得到菌悬液；在灭菌后的无机盐培养基中接种菌悬液，菌悬液的接种量为无机盐培养基体积的5%，30℃，30r/min条件下摇床避光培养7d，得到菌液。

(b)制备丙烯酸树脂降解菌系：将葡萄糖加入制备的菌液中，按菌液体积的5%接种丙烯酸废水，摇床避光进行传代培养，得到丙烯酸树脂降解菌系培养液；每次传代培养时菌液中葡萄糖的量均比上一代减少1/5，丙烯酸废水的量均比上一代增加，每次增加量为菌液体积的5%，每次传代培养7d，传代培养妻五代，最后一代培养时培养基中不再添加葡萄糖。

 (c)选丙烯酸树脂降解菌系：往无机盐培养基中加入琼脂，灭菌后，待无机盐培养基凝固后加入经梯度稀释的丙烯酸树脂降解菌系培养液并涂布均匀，30℃培养7d，挑取周围有透明圈的菌落，重复进行接种培养并划线分离，得到纯化的丙烯酸树脂降解菌系。

1.2.2菌株的保藏

将筛选出来的丙烯酸高效降解菌株接种于固体营养培养基中，长出菌落后，制备成浓度为OD₆₀₀=1的菌液，并于4℃的冰箱中保存备用。由于微生物具有易突变的特点，因此对冰箱中保存的菌种每两个月转接一次，以减少菌株的突变性。

1.2.3生理生化指标测定

    对菌株进行系列生理生化特性实验，参照《简明第8版伯杰氏细菌鉴定

手册》进行鉴定。并采用紫外可见分光光度计在波长600nm处测定培养液的光密度值来表征细菌生长量。

1.2.4 16S rDNA鉴定

利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌DNA。用于16S rDNA PCR反应的引物为一对通用引物。

正向引物为7F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，

反向引物为1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR反应条件：94℃/4min、94℃/45sec，55℃/45 sec，72℃/lmin，循环30次；72℃/l0min，1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。高效降解菌株16S rDNA序列通过Blast程序与RDP II^[14]中核酸数据进行比对分析。

1.2.5菌株对丙烯酸树脂的降解能力的测定

将筛选得到的高效降解菌株接种到含丙烯酸树脂的无机盐培养基中培养7d变化设置3个平行及一个空白对照，培养结束后通过测定培养液COD的表征丙烯酸树脂的降解效率。

本发明的有益效果：它采用定时转接逐步提高碳源的方法筛选出的菌株对高浓度丙烯酸废水具有较好的降解能力，为丙烯酸废水处理提供新的方法。

附图说明

图1为R002菌株的生长曲线与菌液pH值的变化；

图2为不同温度下XR002菌株的生长和降解曲线；

图3为不同pH下XR002菌株的生长和降解曲线；

图4为不同浓度下XR002菌株的生长和降解曲线。

具体实施方式

本具体实施方式采用以下技术方案：它的培育筛选及其降解性能研究方法：

1.1菌种来源及培养基

菌种分离自某汽车喷涂车间排污口污泥

营养培养基：蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75 g、NaCl1.25 g、蒸馏水250 mL；

固体营养培养基：蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75g、NaC1 1.25g、蒸馏水250mL、

琼脂5g；

无机盐培养基：NaC10.5g、NH₄N0₃0.4g、KHZP0₄1.Og、KZHP0₄1.Og、酵母浸粉0.2g，微量元素液4mL，蒸馏水1000mL，调pH值为7.2；

微量元素液：MgS0₄2.Og， CuS0₄0.5g， MnS0₄0.5 g， FeS0₄·7H₂0 O.5g、

CaC1₂0.5g、蒸馏水5OOmL；

降解用无机盐培养基：NaCl O.5g、NH₄N0₃0.4g、KHZP0₄1.Og、KZHP0₄1.Og、酵母浸粉0.2g、微量元素液4mL、丙烯酸废水1000mL、调pH值为7.2；

1.2菌种培养

1.2.1丙烯酸高效降解菌的筛选

 (a)制备菌液:将汽车涂装废水排污口污泥加入无菌水中，汽车涂装废水排污口污泥的浓度为0.08g/mL，摇床避光培养24h，得到菌悬液；在灭菌后的无机盐培养基中接种菌悬液，菌悬液的接种量为无机盐培养基体积的5%，30℃，30r/min条件下摇床避光培养7d，得到菌液。

(b)制备丙烯酸树脂降解菌系：将葡萄糖加入制备的菌液中，按菌液体积的5%接种丙烯酸废水，摇床避光进行传代培养，得到丙烯酸树脂降解菌系培养液；每次传代培养时菌液中葡萄糖的量均比上一代减少1/5，丙烯酸废水的量均比上一代增加，每次增加量为菌液体积的5%，每次传代培养7d，传代培养妻五代，最后一代培养时培养基中不再添加葡萄糖。

 (c)选丙烯酸树脂降解菌系：往无机盐培养基中加入琼脂，灭菌后，待无机盐培养基凝固后加入经梯度稀释的丙烯酸树脂降解菌系培养液并涂布均匀，30℃培养7d，挑取周围有透明圈的菌落，重复进行接种培养并划线分离，得到纯化的丙烯酸树脂降解菌系。

1.2.2菌株的保藏

将筛选出来的丙烯酸高效降解菌株接种于固体营养培养基中，长出菌落后，制备成浓度为OD₆₀₀=1的菌液，并于4℃的冰箱中保存备用。由于微生物具有易突变的特点，因此对冰箱中保存的菌种每两个月转接一次，以减少菌株的突变性。

1.2.3生理生化指标测定

    对菌株进行系列生理生化特性实验，参照《简明第8版伯杰氏细菌鉴定

手册》进行鉴定。并采用紫外可见分光光度计在波长600nm处测定培养液的光密度值来表征细菌生长量。

1.2.4 16S rDNA鉴定

利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌DNA。用于16S rDNA PCR反应的引物为一对通用引物。

正向引物为7F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，

反向引物为1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR反应条件：94℃/4min、94℃/45sec，55℃/45 sec，72℃/lmin，循环30次；72℃/l0min，1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。高效降解菌株16S rDNA序列通过Blast程序与RDP II中核酸数据进行比对分析。

1.2.5菌株对丙烯酸树脂的降解能力的测定

将筛选得到的高效降解菌株接种到含丙烯酸树脂的无机盐培养基中培养7d变化设置3个平行及一个空白对照，培养结束后通过测定培养液COD的表征丙烯酸树脂的降解效率。

2高效降解菌株与环境因素的关系

2.1高效降解菌株在含丙烯酸树脂培养基上的生长曲线及pH变化

XR002菌株在降解用无机盐培养基中的生长曲线如图1。结果表明：该菌株从接种到第lOh生长缓慢，处于延滞期；从第lOh到24h，菌株开始加速生长，微生物数量开始有所增加；从24h到36h进入对数增长期，微生物数量急剧增加；第36h以后，OD₆₀₀值变化不大，细胞处于稳定期，说明XR002菌株在含有丙烯酸树脂的溶液中可以生长。在微生物生长的过程中，pH值有所降低，这是由于微生物在利用丙烯酸树脂进行新陈代谢的过程中，首先钻附在丙烯酸树脂的表面并产生一些水溶性的中间降解产物，同时微生物会分泌降解酶，通过水解和氧化等反应将丙烯酸大分子降解为低分子量的单体及碎片，这些低分子量的单体及碎片最终被降解为CO2、水、甲烷及腐殖质等物质，本研究中菌液初始pH为9.1，最低降到6.2。

2.2环境因子对丙烯酸树脂降解的影响

将丙烯酸废水加入到无菌无机盐培养基中至COD浓度为2000mg/L，调节pH为7.0，分别加入到7个灭菌的三角瓶中，每瓶100mL，并接种lOmLXR002高效降解菌液，置于10℃，20℃，25℃，30℃，3 5 ℃，40℃，50℃的摇床中150rpm培养7d，同时每个样品设置3个平行及一个空白对照，7d后测定降解液的OD₆₀₀和COD值。

如图2所示，温度对XR002菌株的生长和降解效率的影响都很明显。菌体生长量和降解曲线在30℃之前随着温度的升高而升高，30℃之后随着温度的升高而降低，可见XR002菌株的最适生长温度为30℃。在初始COD浓度为2000mg/L时，7d后的降解效率为63.1%。在10℃和50℃时菌体生长量和降解效率都明显下降，这与高温或者低温时微生物的生长受到抑制有关，可见，温度对于XR002菌株的生长和代谢产酶以及酶的催化都有很大的影响。

2.3pH对XR002菌株降解效率的影响

将丙烯酸废水加入到无菌无机盐培养基中至COD浓度为2000mg/L，分别加入到8个灭菌的三角瓶中，每瓶100mL，并接种lOmL XR002高效降解菌液，将pH调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在30℃，150rpm的条件下培养7d，同时每个样品设置3个平行及一个空白对照，7d后测定降解液的OD₆₀₀和COD值。

如图3所示，在pH7.0-9.0之间时XR002菌株均能生长良好，降解效率也高为9.0，随着pH升高或降低，降解效率和菌体量均随之降低，当初始pH COD浓度为2000mg/L时，7d后丙烯酸树脂的降解效率最高可以达到71.2%。而pH超过10.0或者低于7.0，则会抑制细菌的生长，说明XR002菌株在含丙烯酸的无机盐培养基中对高pH或者低pH都具有一定的忍耐性。

2.4丙烯酸浓度对XR002菌株降解效率的影响

将丙烯酸废水加入到无菌无机盐培养基中至COD浓度为500 mg/L，1000 mg/L、1500 mg/L、2000 mg/L、2500 mg/L、3000 mg/L、4000 mg/L、5000 mg/L，分别加入到8个灭菌的三角瓶中，每瓶100mL，并接种lOmL的XR002高效降解菌液，在pH为9.0，30℃，150rpm的条件下培养7d，同时每个样品设置3个平行及一个空白对照，7d后测定降解液的OD₆₀₀和COD值。

结果表明，当丙烯酸废水初始COD浓度为5OOmg/L时，7d后XR002菌株对丙烯酸树脂的去除率约为90%，但是随着丙烯酸初始浓度的不断增加残留丙烯酸树脂浓度也不断增加，菌体生长量也发生了变化。如图4所示，当丙烯酸废水初始COD浓度为3000mg/L时菌体生长明显受到了抑制，其OD₆₀₀值降低了近1倍，降解性能也受到了抑制。这是由于XR002菌株在降解高浓度丙烯酸废水的过程中积累了某些有害的中间产物，抑制了微生物的生长代谢。但是，微生物对丙烯酸的绝对降解量随着初始浓度的升高而升高在初始COD浓度为2000mg/L时，7d后丙烯酸树脂的降解率可以达到80%，这可能是由于代谢丙烯酸的酶随之升高而引起的。

Claims (1)

1.丙烯酸树脂降解菌的筛选鉴定及其降解性能研究方法，其特征在于：它的培育筛选及其降解性能研究方法：

1.1菌种来源及培养基

菌种分离自某汽车喷涂车间排污口污泥

营养培养基：蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75 g、NaCl1.25 g、蒸馏水250 mL；

固体营养培养基：蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75g、NaC1 1.25g、蒸馏水250mL、

琼脂5g；

无机盐培养基：NaC10.5g、NH₄N0₃0.4g、KHZP0₄1.Og、KZHP0₄1.Og、酵母浸粉0.2g，微量元素液4mL，蒸馏水1000mL，调pH值为7.2；

微量元素液：MgS0₄2.Og、CuS0₄0.5g、MnS0₄0.5 g、FeS0₄·7H₂0 O.5g、

CaC1₂0.5g、蒸馏水5OOmL；

降解用无机盐培养基：NaCl O.5g、NH₄N0₃0.4g、KHZP0₄1.Og、KZHP0₄1.Og、酵母浸粉0.2g、微量元素液4mL、丙烯酸废水1000mL、调pH值为7.2；

1.2菌种培养

1.2.1丙烯酸高效降解菌的筛选

 (a)制备菌液:将汽车涂装废水排污口污泥加入无菌水中，汽车涂装废水排污口污泥的浓度为0.08g/mL，摇床避光培养24h，得到菌悬液；在灭菌后的无机盐培养基中接种菌悬液，菌悬液的接种量为无机盐培养基体积的5%，30℃，30r/min条件下摇床避光培养7d，得到菌液；

(b)制备丙烯酸树脂降解菌系：将葡萄糖加入制备的菌液中，按菌液体积的5%接种丙烯酸废水，摇床避光进行传代培养，得到丙烯酸树脂降解菌系培养液；每次传代培养时菌液中葡萄糖的量均比上一代减少1/5，丙烯酸废水的量均比上一代增加，每次增加量为菌液体积的5%，每次传代培养7d，传代培养妻五代，最后一代培养时培养基中不再添加葡萄糖；

 (c)选丙烯酸树脂降解菌系：往无机盐培养基中加入琼脂，灭菌后，待无机盐培养基凝固后加入经梯度稀释的丙烯酸树脂降解菌系培养液并涂布均匀，30℃培养7d，挑取周围有透明圈的菌落，重复进行接种培养并划线分离，得到纯化的丙烯酸树脂降解菌系；

1.2.2菌株的保藏

将筛选出来的丙烯酸高效降解菌株接种于固体营养培养基中，长出菌落后，制备成浓度为OD₆₀₀=1的菌液，并于4℃的冰箱中保存备用；由于微生物具有易突变的特点，因此对冰箱中保存的菌种每两个月转接一次，以减少菌株的突变性；

1.2.3生理生化指标测定

    对菌株进行系列生理生化特性实验，参照《简明第8版伯杰氏细菌鉴定

手册》进行鉴定；并采用紫外可见分光光度计在波长600nm处测定培养液的光密度值来表征细菌生长量；

1.2.4 16S rDNA鉴定

利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌DNA；用于16S rDNA PCR反应的引物为一对通用引物；

正向引物为7F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；

反向引物为1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；

PCR反应条件：94℃/4min、94℃/45sec、55℃/45 sec、2℃/lmin，循环30次；72℃/l0min，1%琼脂糖凝胶电泳检测；PCR产物的测序由上海生工生物工程股份有限公司完成；高效降解菌株16S rDNA序列通过Blast程序与RDP II中核酸数据进行比对分析；

1.2.5菌株对丙烯酸树脂的降解能力的测定

将筛选得到的高效降解菌株接种到含丙烯酸树脂的无机盐培养基中培养7d变化设置3个平行及一个空白对照，培养结束后通过测定培养液COD的表征丙烯酸树脂的降解效率。