CN104874362B - 一种活化壳聚糖微球的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机高分子材料改性技术领域，具体公开了一种活化壳聚糖微球的方法。本发明的活化方法主要是通过烯基直接与蛋白质的氨基发生反应而固定蛋白质，因此其活化方式和现有技术的不同，而且，本发明活化得到的壳聚糖微球具有的活性基团希基，能够很好的与蛋白质氨基酸中的氨基相结合，且每克壳聚糖微球（湿重）能够结合2~5mg蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及有机高分子材料改性技术领域，具体涉及一种活化壳聚糖微球的方法。
背景技术
壳聚糖是由自然界广泛存在的甲壳素在碱性条件下水解并脱去部分乙酰基后生成的衍生物，结构为聚-(１→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，来源丰富，无毒。自1859年，法国人Rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。
天然状态的壳聚糖大部分为粉末状，作为吸附载体，使载体和吸附物都难以回收，从而限制其应用。在特定的条件下，壳聚糖能发生水解、烷基化、酰基化、羧甲基化、磺化、硝化、卤化、氧化、还原、缩合和络合等化学反应，可生成各种具有不同性能的壳聚糖衍生物，从而扩大了壳聚糖的应用范围。
壳聚糖在蛋白相互作用、抗原抗体反应、相关疾病的诊断等方面都会应用到，具体为把蛋白固定到微球上，然后进行相关分析或者检测。目前，市场上多采用环氧或-CN基团作为活化基团。因为不同活化方式的用途不一样，所以，开发多种不同的活化方式才能满足科研的实际需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的活化壳聚糖微球的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的。
一种活化壳聚糖微球的方法，包括如下步骤：
S1.向戊二醛交联好的壳聚糖微球中加入PBS溶液和硼氢化钠，常温搅拌反应12~24h；
S2.反应结束后清洗壳聚糖微球，向清洗后的壳聚糖微球中加入5倍体积的PBS溶液，调节pH为14，然后加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚，其占总体积百分比为0.5~3%，30~80℃加热48~72h，反应结束后，弃上清；
S3.重复S2步骤2~4次，回收壳聚糖微球，向微球中加入2~15倍体积的PBS溶液，然后加入烯丙基缩水甘油醚，其占总体积的百分比为2~5%，30~80℃加热48~72h，反应结束后，弃上清；
S4.重复S3步骤2~4次，将壳聚糖微球用乙醇清洗后再用PBS溶液清洗，即得活化的壳聚糖微球。
本发明的活化方法主要是通过烯基直接与蛋白质的氨基发生反应而固定蛋白质，因此其活化方式和现有技术的不同。
本发明所用的硼氢化钠的作用是还原醛基，不能用其它同类物质替代，因为其它同类物质的效果不好；1，4-丁二醇二缩水甘油醚的作用是对羟基进行交联，不能用其它同类物质替代，因为其它同类物质的效果不好；烯丙基缩水甘油醚的作用是与羟基反应的同时保留烯基，不能用其它同类物质替代，因为其它同类物质的效果不好。
优选地，所述1，4-丁二醇二缩水甘油醚的加入量占总体积百分比为1~1.5%。
优选地，S2和S3所述的加热温度为45~80℃。
优选地，S1所述PBS溶液按10倍壳聚糖微球体积的加入量加入，所述硼氢化钠占的质量百分比为0.1~4%。更优选地，所述硼氢化钠占的质量百分比为0.5~1.5%。
优选地，S1所述搅拌的速度为100~500rpm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明活化得到的壳聚糖微球具有活性基团希基，能够很好的与蛋白质氨基酸中的氨基相结合，且每克壳聚糖微球（湿重）能够结合2~5mg蛋白质。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细阐述本发明。但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
一种活化壳聚糖微球的方法，包括以下步骤：
S1.向戊二醛交联好的壳聚糖微球（直径25~45微米）加入10倍体积的PBS溶液得混合液，向混合液中加入硼氢化钠，硼氢化钠占混合液的质量百分比为1%，常温反应12h，反应过程中进行搅拌，搅拌的速度为300rpm；
S2.反应结束后，倒入500目的不锈钢筛网中，用纯水清洗30min；然后把壳聚糖微球放入烧杯中，加入5倍体积的PBS溶液，使用0.5M NaOH溶液调节pH为14，然后加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚，其占总体积的百分比为1%，50℃水浴加热反应72h；反应结束后，弃上清；
S3.重复S2步骤2~4次，使用500目的不锈钢筛网回收壳聚糖微球，并放入烧杯中，同时加入5倍体积的PBS溶液和烯丙基缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚占总体积的百分比为1%，60℃水浴加热反应48h，反应结束后，弃上清；
S4.重复S3步骤3次；使用50%乙醇洗涤壳聚糖微球3次，之后使用PBS溶液清洗，去除乙醇即得活化的壳聚糖微球。
称取活化后的壳聚糖微球，其湿重为20g，放入100ml的蛋白质溶液中，浓度2mg/ml。加入过硫酸铵溶液，过硫酸铵的浓度为1%；常温反应，反应时间为50 min。使用微量检测上清溶液中的蛋白质含量，计算壳聚糖微球上结合蛋白的量，结果见表1。
实施例2
一种活化壳聚糖微球的方法，包括以下步骤：
S1.向戊二醛交联好的壳聚糖微球（其直径25~45微米）加入10倍体积的PBS溶液和入硼氢化钠，硼氢化钠占的质量百分比为1%，常温反应12h，反应过程中进行搅拌，搅拌的速度为400rpm；
S2.反应结束后，倒入500目的不锈钢筛网中，然后用纯水清洗30min，然后把壳聚糖微球放入烧杯中，加入8倍体积的PBS溶液，使用0.5M NaOH溶液调节pH为14，然后加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚，1，4-丁二醇二缩水甘油醚占总体积百分比为2%，50℃水浴加热反应72h，反应结束后，弃上清；
S3.重复S2步骤2~4次，使用500目的不锈钢筛网回收壳聚糖微球，并放入烧杯中，同时加入5倍体积的PBS溶液和烯丙基缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚占总体积的百分比为2.5%，60℃水浴加热反应48h，反应结束后，弃上清；
S4.重复S3步骤3次，使用50%乙醇洗涤壳聚糖微球3次，之后使用PBS溶液清洗，去除乙醇即得活化的壳聚糖微球。
称取壳聚糖微球，其湿重为20g，放入100ml的蛋白质溶液中，浓度2mg/ml。加入过硫酸铵溶液，过硫酸铵的浓度为1%；常温反应，反应时间为50 min。使用微量检测上清溶液中的蛋白质含量，计算壳聚糖微球上结合蛋白的量，结果见表2。
实施例3
一种活化壳聚糖微球的方法，包括以下步骤：
S1.向戊二醛交联好的壳聚糖微球（其直径25~45微米）加入10倍体积的PBS溶液和入硼氢化钠，硼氢化钠占的质量百分比为0.5%，常温反应24h，反应过程中进行搅拌，搅拌的速度为250rpm；
S2.反应结束后，倒入500目的不锈钢筛网中，然后用纯水清洗30min，然后把壳聚糖微球放入烧杯中，加入10倍体积的PBS溶液，使用0.5M NaOH溶液调节pH为14，然后加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚，1，4-丁二醇二缩水甘油醚占总体积百分比为3%，35℃水浴加热反应72h，反应结束后，弃上清；
S3.重复S2步骤2~4次，使用500目的不锈钢筛网回收壳聚糖微球，并放入烧杯中，同时加入5倍体积的PBS溶液和烯丙基缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚占总体积的百分比为2.5%，60℃水浴加热反应48h，反应结束后，弃上清；
S4.重复S3步骤3次，使用50%乙醇洗涤壳聚糖微球3次，之后使用PBS溶液清洗，去除乙醇即得活化的壳聚糖微球。
实施例4
一种活化壳聚糖微球的方法，包括以下步骤：
S1.向戊二醛交联好的壳聚糖微球（其直径25~45微米）加入10倍体积的PBS溶液和入硼氢化钠，硼氢化钠占的质量百分比为3.5%，常温反应18h，反应过程中进行搅拌，搅拌的速度为500rpm；
S2.反应结束后，倒入500目的不锈钢筛网中，然后用纯水清洗30min，然后把壳聚糖微球放入烧杯中，加入6倍体积的PBS溶液，使用0.5M NaOH溶液调节pH为14，然后加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚，1，4-丁二醇二缩水甘油醚占总体积百分比为0.5%，50℃水浴加热反应72h，反应结束后，弃上清；
S3.重复S2步骤2~4次，使用500目的不锈钢筛网回收壳聚糖微球，并放入烧杯中，同时加入5倍体积的PBS溶液和烯丙基缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚占总体积的百分比为2.5%，60℃水浴加热反应48h，反应结束后，弃上清；
S4.重复S3步骤3次，使用50%乙醇洗涤壳聚糖微球3次，之后使用PBS溶液清洗，去除乙醇即得活化的壳聚糖微球。
Claims (6)
1.一种活化壳聚糖微球的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.向戊二醛交联好的壳聚糖微球中加入PBS溶液和硼氢化钠，常温搅拌反应12~24h；
S2.反应结束后清洗壳聚糖微球，向清洗后的壳聚糖微球中加入5~10倍体积的PBS溶液，调节pH为14，然后加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚，其占总体积百分比为0.5~3%，30~80℃加热48~72h，反应结束后，弃上清；
S3.重复S2步骤2~4次，回收壳聚糖微球，向微球中加入2~15倍体积的PBS溶液，然后加入烯丙基缩水甘油醚，其占总体积的百分比为2~5%，30~80℃加热48~72h，反应结束后，弃上清；
S4.重复S3步骤2~4次，将壳聚糖微球用乙醇清洗后再用PBS溶液清洗，即得活化的壳聚糖微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，1，4-丁二醇二缩水甘油醚的加入量占总体积百分比为1~1.5%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2和S3所述的加热温度为45~80℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述PBS溶液按10倍壳聚糖微球体积的加入量加入，所述硼氢化钠占壳聚糖微球和PBS溶液混合所得混合液的质量百分比为0.1~4%。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述硼氢化钠占壳聚糖微球和PBS溶液混合所得混合液的质量百分比为0.5~1.5%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述搅拌的速度为100~500rpm。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |