CN104861085B - 板栗种仁α‑1,6‑葡聚糖及其制备方法以及在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种板栗种仁α‑1,6‑葡聚糖及其制备方法以及在抗肿瘤药物中的应用。所述板栗种仁α‑1,6‑葡聚糖的结构式为[→6)‑α‑Glcp(1→]_n，其重均分子量范围为1600~2400 kDa，平均分子量为2000 kDa，为均聚多糖，其体外对***细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF‑7和耐阿霉素乳腺癌细胞MCF‑7/ADR的增殖具有显著的抑制活性，且板栗作为药食两用的果中珍品，无严重的毒副作用；通过本发明提供的制备方法制得的板栗种仁α‑1,6‑葡聚糖，糖链的结构完整性好，有望开发为抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物。

Description

板栗种仁α-1,6-葡聚糖及其制备方法以及在抗肿瘤药物中的 应用

技术领域

本发明涉及一种植物多糖及其制备方法与应用，尤其是涉及一种板栗种仁α-1,6-葡聚糖及其制备方法以及在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

板栗为壳斗科栗属植物的果实，味甘，性温，无毒，有益气补脾、厚肠胃、补肾强筋、活血止血、清热解毒、止泻治咳等功效。临床上，板栗还可用于治疗反胃、泄泻、腰腿软弱、吐血、便血、金疮等症。多糖作为板栗种仁的重要组成物质，因其生物功能广泛、毒副作用小等诸多优势，受到各国研发人员的极大重视。

从镇安板栗中分离得到多糖组分CPS-a和CPS-b，具有抗氧化和抗疲劳作用(板栗多糖的分离纯化、结构分析及体外抗氧化研究，陕西师范大学，硕士论文，2011；板栗多糖的分离纯化、结构分析及抗疲劳作用的研究，食品与生物技术学报，2013，32，767-772)。罗田板栗中的多糖由葡萄糖、甘露糖、木糖和***糖组成，比例为0.58：1.00：0.33：0.18，平均分子量为164.0kDa，具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血和升高白细胞等活性，浓度为1mg/mL时，对人肝癌细胞HepG2和***细胞HeLa的抑制率分别为32.8％和12.1％(罗田板栗多糖的分离纯化及成分分析，中国药学杂志，37(1)，63-64，2002；板栗多糖的提取、成分分析及活性测定，武汉理工大学学报，32(11)，14-16，2010；板栗多糖的分离纯化、结构鉴定及其活性研究，江苏大学，硕士论文，2013)。燕龙板栗多糖对人肝癌细胞Bel-7402、肺癌细胞A-549和子宫癌细胞HCT-8的抑制作用较明显，多糖浓度为0.3mg/mL时，抑制率分别为69.5％、51.4％和55.3％(板栗不同品种(系)多糖结构和活性的初步研究，河北科技师范学院，硕士论文，2013)。Barbat等从欧洲板栗碱提取物中，分离得到木聚糖，结构为4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖和同木聚糖，其中4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖可抑制人表皮癌细胞A431的增生、迁移和侵袭的能力(Structural Characterization and Cytotoxic Properties of a 4-O-Methylglucuronoxylan from Castanea sativa.2.evidence of a structure-activityrelationship,Journal of Natural Product,71,1404–1409,2008)。

以上研究中提取得到的多糖均由多种单糖组成，为结构复杂的杂聚多糖，其仅显示出在抗氧化、抗疲劳和抗肿瘤活性上面的性能。

发明内容

本发明的目的就是提供一种板栗种仁α-1,6-葡聚糖。

本发明的另一目的是提供一种以迁西板栗种仁为原料制备板栗种仁α-1,6-葡聚糖的方法。

本发明的进一步的目的是提供板栗种仁α-1,6-葡聚糖在制备抗肿瘤药物上的应用。

本发明的更进一步的目的是提供一种以板栗种仁α-1,6-葡聚糖为有效成分的药物组合物。

本发明的目的是这样实现的：

一种板栗种仁α-1,6-葡聚糖，其结构式为[(1→6)-α-Glcp(1→]_n，其中n为正整数，其重均分子量范围为1600～2400kDa，平均分子量为2000kDa。

一种以迁西板栗种仁为原料制备所述板栗种仁α-1,6-葡聚糖的方法，包括以下步骤：

a.多糖提取：迁西板栗种仁干燥、粉碎，乙醇脱脂，水提，离心，上清液减压浓缩，醇沉，冷冻干燥，得板栗水提粗多糖；

b.多糖纯化：上述板栗水提粗多糖经Sevag法脱蛋白，离心，上清液先用截留分子量为3500的透析袋透析，再依次采用阴离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱分离纯化，得α-1,6-葡聚糖。

优选地，所述方法包括以下步骤：

a.多糖提取：将迁西板栗种仁干燥、粉碎，用95％乙醇脱脂，室温干燥，得板栗种仁粉末；取板栗种仁粉末，加水，二者的质量体积比为1g：10～30ml，室温静置2～4h后，冷水提取，提取液离心后沉淀重复提取2～4次，所得上清液合并后减压浓缩，加入2～5倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜，抽滤，所得沉淀冷冻干燥，得板栗水提粗多糖；

b.多糖纯化：板栗水提粗多糖配制成水溶液，加入等体积的氯仿/正丁醇混合液，室温剧烈搅拌1～3h，静置分液，上层水相重复上述操作1～3次，合并上层水相并浓缩，浓缩后的上层水相用截留分子量为3500的透析袋对蒸馏水透析3～5d，对透析袋内的液体浓缩，采用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱进行分离，以水进行洗脱，收集水洗脱组分，浓缩后，溶于0.2mol/L的碳酸氢铵溶液中，离心后经Sephacryl S-300凝胶渗透色谱柱分离纯化，得α-1,6-葡聚糖。

优选地，所述步骤a中板栗种仁粉末与水的质量体积比为1g：20ml。

优选地，所述步骤a的醇沉操作中95％乙醇的加入量为浓缩后上清液体积的3倍。

另一方面，本发明提供所述板栗种仁α-1,6-葡聚糖在制备抗肿瘤药物方面的应用，具体地说，所述肿瘤为***、乳腺癌或耐药乳腺癌，尤其是耐阿霉素乳腺癌。

再一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明所述的板栗种仁α-1,6-葡聚糖作为有效成份，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

本发明提供的药物组合物，含有板栗种仁α-1,6-葡聚糖、制药学上许可的载体或以板栗种仁α-1,6-葡聚糖作为活性成分的混以药用赋形剂或稀释剂的组合。

所述的药物组合物的制药学上许可的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如水等，赋形剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶等，润湿剂如甘油等，崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙等，吸收剂如季铵化合物等，表面活性剂如十六烷醇等，吸附载体如高岭土等，润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明提供的药物组合物可以通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酊剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等，优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。

本发明提供的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明提供的板栗种仁α-1,6-葡聚糖为均聚多糖，通过本发明提供的制备方法制得的板栗种仁α-1,6-葡聚糖，糖链的结构完整性好。其除体外对***细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制活性，还对耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR的增殖具有更优良的抑制活性。

附图说明

图1是α-1,6-葡聚糖的纯度鉴定图。

图2是α-1,6-葡聚糖的¹³C NMR(DEPT)谱图。

具体实施方式

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂未标明来源、规格的均为市售分析纯或化学纯。

实施例1

将迁西板栗种仁(产地为河北省迁西县)干燥、粉碎，所得粉末用95％乙醇脱脂2天，室温干燥后，取100g的板栗种仁粉末加入2000mL的水，室温静置2h后，冷水搅拌提取2h，离心，残渣以相同条件再重复提取2次，合并上清液，减压浓缩至150mL，在搅拌下加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜，抽滤，无水乙醇脱水，所得沉淀冷冻干燥，得板栗水提粗多糖9.6g。

取板栗水提粗多糖1g配制成1％的水溶液(W/V，质量体积浓度)，采用Sevag法脱蛋白，加入等体积的氯仿/正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4:1；V/V，体积比)，室温剧烈搅拌2h，静置分液，上层水相重复脱蛋白步骤2次，合并上层水相并浓缩。浓缩后的上层水相用截留分子量为3500的透析袋对蒸馏水透析3d，对透析袋内的液体浓缩，采用Q-Sepharose FastFlow阴离子交换色谱柱对多糖进行分离，以去离子水洗脱，硫酸-苯酚检测，收集去离子水洗脱多糖组分，浓缩冷冻干燥后得多糖CP0。将多糖CP0溶于0.2mol/L碳酸氢铵溶液，离心后经Sephacryl S-300凝胶色谱柱分离，流速为0.35mL/min，硫酸苯酚法检测，收集多糖组分，得多糖CP 0.45g。

多糖结构解析：

采用高效凝胶色谱法(HPGPC)测定产物的相对分子质量和纯度，纯度鉴定结果如图1所示，为单一对称洗脱峰，说明所得多糖为结构均一的多糖，产物的相对重均分子量为2000kDa。所用仪器为Agilent 1260高效液相色谱仪，流动相为0.1mol/L硫酸钠，色谱柱为Shodex Ohpak SB-804，流速为0.5ml/min，柱温为35℃。

单糖组成分析表明多糖CP由葡萄糖组成。

经旋光仪测定产物的比旋光度为[α]²⁰ _D＝+203°(c 1.0H₂O)，其中测试条件为：温度20℃，浓度为0.1g/100mL，水为溶剂。

甲基化分析多糖CP的连接方式，结果表明多糖CP为1,6-连接的葡萄糖。

图2所示为多糖CP的¹³C NMR(DEPT)谱图，图中位于δ98.5ppm的碳信号为α-葡聚糖的C-1信号，其他碳信号依次为C-2(δ72.2ppm)，C-3(δ74.2ppm)，C-4(δ70.3ppm)，C-5(δ71.0ppm)和C-6(δ66.4ppm)。

以上结果表明多糖CP的结构为：

[→6)-α-Glcp(1→]_n

其中n为正整数。

实施例2

抑制癌细胞增殖实验

1.试验材料

受试样品：实施例1中制备的α-1,6-葡聚糖。

阴性对照品：生理盐水。

空白对照品：PBS。

细胞株：人***细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7、耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR(均购自中国科学院细胞库)。

试剂和仪器：0.25％胰蛋白酶(Invitrogen公司)、MTT(5mg/mL,Sigma公司)；酶标仪(Bio-Rad 3550,美国)。

2.试验方法

2.1药物处理计量及配制方法

将实施例1中制备的α-1,6-葡聚糖溶于PBS中，配制成浓度分别为250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL，2000μg/mL，4000μg/mL的系列溶液。

2.2细胞培养

人***细胞HeLa用含10％胎牛血清的DMEM培养基于5％CO₂培养箱37℃培养，2-3天换液1次。细胞贴壁长满后，用0.25％胰蛋白酶消化后，以2×10⁴个/mL细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积90μL，37℃培养使细胞贴壁。

乳腺癌细胞MCF-7和耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR分别用含10％胎牛血清的1640培养基于5％CO₂培养箱37℃培养，2-3天换液1次。细胞贴壁长满后，用0.25％胰蛋白酶消化后，以2×10⁴个/mL细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积90μL，37℃培养使细胞贴壁。

2.3α-1,6-葡聚糖对癌细胞生长的抑制作用

向细胞培养板中分别加入系列浓度(250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL，2000μg/mL，4000μg/mL)的α-1,6-葡聚糖溶液10μL使其终浓度分别为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，空白对照组为等体积的PBS，阴性对照为等体积的生理盐水。加样组和对照组均设3个复板，板上均设3个复孔，细胞在温度37℃，5％CO₂的培养箱中，加样组和对照组的复板分别在孵育24h、48h和72h之后测定OD值，以计算不同浓度的受试样品在不同时间对三种癌细胞的抑制率。测定方法为：加入MTT，10μL/孔，继续培养4h后，加入DMSO 100μL/孔，放置过夜后，分别用酶标仪在570nm波长下测定各孔的OD值。

数据处理：细胞存活率(％)＝[OD_加药组-OD_空白]/[OD_{阴性对照组}-OD_空白]；

细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)；

试验结果如表1、表2所示。

表1 α-1,6-葡聚糖对人***细胞HeLa增殖抑制率

表2 α-1,6-葡聚糖对人乳腺癌细胞MCF-7和耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADR增殖抑制率

Claims (9)

1.一种板栗种仁α-1,6-葡聚糖，其结构式为：

[(1→6)-α-Glcp(1→]_n，

其中n为正整数，其重均分子量范围为1600~2400 kDa，平均分子量为2000 kDa。

2.一种以迁西板栗种仁为原料制备如权利要求1所述的板栗种仁α-1,6-葡聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 多糖提取：迁西板栗种仁干燥、粉碎，乙醇脱脂，冷水提取，离心，上清液减压浓缩，醇沉，冷冻干燥，得板栗水提粗多糖；

b. 多糖纯化：上述板栗水提粗多糖经Sevag法脱蛋白，离心，上清液先用截留分子量为3500的透析袋透析，再依次采用阴离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱分离纯化，得α-1,6-葡聚糖。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 多糖提取：将迁西板栗种仁干燥、粉碎，用95%乙醇脱脂，室温干燥，得板栗种仁粉末；取板栗种仁粉末，加水，二者的质量体积比为1g：10~30ml，室温静置2~4h后，冷水提取，提取液离心后沉淀重复提取2~4次，所得上清液合并后减压浓缩，加入2~5倍体积的95%乙醇，4^oC静置过夜，抽滤，所得沉淀冷冻干燥，得板栗水提粗多糖；

b. 多糖纯化：板栗水提粗多糖配制成水溶液，加入等体积的氯仿/正丁醇混合液，室温剧烈搅拌1~3h，静置分液，上层水相重复上述操作1~3次，合并上层水相并浓缩，用截留分子量为3500的透析袋对蒸馏水透析3~5 d，对透析袋内的液体浓缩，采用Q-Sepharose FastFlow阴离子交换色谱柱进行分离，以水进行洗脱，收集水洗脱组分，浓缩后，溶于0.2 mol/L的碳酸氢铵溶液中，离心后经Sephacryl S-300凝胶渗透色谱柱分离纯化，得α-1,6-葡聚糖。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中板栗种仁粉末与水的质量体积比为1g：20ml。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a的醇沉操作中95%乙醇的加入量为浓缩后上清液体积的3倍。

6.权利要求1所述的板栗种仁α-1,6-葡聚糖在制备抗肿瘤药物方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为***、乳腺癌或耐药乳腺癌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤耐阿霉素乳腺癌。

9.药物组合物，其特征在于，其中含权利要求1所述的板栗种仁α-1,6-葡聚糖作为有效成份，以及一种或多种药学上可接受的辅料。