CN104849364A - 参枝苓口服液指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、高效液相色谱仪测定及对数据和图谱的处理，以及由该方法制备得到的参枝苓口服液指纹图谱。本发明还提供了利用指纹图谱进行参枝苓口服液质量控制的方法。本发明的指纹图谱构建方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大，采用指纹图谱作为参枝苓口服液的质量控制手段，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，通过对多个批次的样品进行***分析，能更加全面、科学评价参枝苓口服液的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。

Description

参枝苓口服液指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与应用

技术领域

本发明涉及中药指纹图谱分析方法，特别是参枝苓口服液HPLC指纹图谱的建立方法以及由此方法得到的参枝苓口服液的指纹图谱。

背景技术

参枝苓口服液是由党参、桂枝、白芍、甘草(蜜炙)、茯苓、干姜、远志(制、炒)、石菖蒲、龙骨和牡蛎十种药材经精工制作而成的中药复方制剂，现已证明其含有多种生物活性物质，具有良好的益气温阳、化痰安神的疗效，用于治疗轻中度阿兹海默病所显现的心气不足证，主要表现为健忘、心悸、头晕、失眠、少气烦言、舌质淡、表情淡漠、神疲乏力、脉虚无力等症。参枝苓口服液中党参的作用为安神明，补心气；远志、菖蒲、茯苓等则起通心窍、振心阳、化浊痰的作用。用于临床能够有效改善阿兹海默症患者记忆力、智力及生活能力和认知功能。经药理学研究表明，参枝苓口服液能够十分有效地改善老年痴呆症所有的部分病理性变化，能够改善阿尔兹海默证模型大鼠的空间学习记忆能力，改善其皮质神经纤维增厚和增多的现象，而且能治疗其海马椎体细胞脱落的症状。

参枝苓口服液作为一种中药复方制剂，处方药材较多(由10味药材组成)，成分非常复杂多样。在“参枝苓口服液标准”(国家食品药品监督管理局标准)中采用液相色谱法建立了芍药苷及肉桂酸两个成分的含量测定方法。但参枝苓口服液为复方制剂，单纯通过检测一、二种指标成分定量来控制其药品质量显然是不全面的，也不能体现中药复方制剂的整体性特征。因此，开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能尽可能多地反映复方制剂所含多成分的指纹图谱检测方法对于参枝苓口服液的质量控制和评价非常必要。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种参枝苓口服液指纹图谱构建方法及其指纹图谱。本发明通过对参枝苓口服液指纹图谱的研究，提供了一种操作简便、稳定、精密度高和重现性好，可用于参枝苓口服液的质量检测和评价的方法，弥补了现有质量控制方法的不足，使参枝苓口服液的质量控制技术更为完善、科学。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种参枝苓口服液指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取参枝苓口服液，加入甲醇，超声提取，冷藏放置0.5-1小时，恢复至室温，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的肉桂酸、芍药苷、甘草苷、芍药内酯苷、甘草酸铵对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；

(4)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得参枝苓口服液指纹图谱；

步骤(3)中，测定的液相色谱条件为：色谱柱为phenomenex synergi Hydro-RP色谱柱(4μ，250×4.6mm；即填料粒径为4μm，柱长为250mm，柱内径为4.6mm)；流动相A为0.3％磷酸水溶液(体积分数)，流动相B为乙腈；梯度洗脱；流动相流速为0.8ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm。

步骤(3)中，梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-5min，流动相A95％-95％，流动相B 5％-5％；5-10min，流动相A95％-92％,流动相B 5％-8％；10-20min，流动相A92％-80％,流动相B 8％-20％；20-25min，流动相A80％-77.5％,流动相B 20％-22.5％；25-40min，流动相A77.5％-67％,流动相B22.5％-33％；40-50min，流动相A 67％-60％,流动相B 33％-40％；50-60min，流动相A60％-50％,流动相B 40％-50％；60-80min，流动相A50％-15％,流动相B 50％-85％；80-90min，流动相A15％-5％,流动相B 85％-95％；90-100min，流动相A5％-95％,流动相B 95％-5％。(均为体积百分含量)。

具体的，步骤(1)中，供试品溶液的制备方法为：精密量取1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取5min，于4℃冰箱中放置0.5小时，恢复至室温，经0.22μm有机系滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

步骤(2)中，对照品溶液的制备方法为：

精密称取肉桂酸标准品0.0103g，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到肉桂酸溶液，浓度为0.103mg/mL；

精密称取芍药苷标准品0.0302g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到芍药苷溶液，浓度为3.02mg/mL；

精密称取甘草苷标准品0.0204g，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到甘草苷溶液，浓度为0.816mg/mL；

精密称取芍药内酯苷标准品0.0101g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到芍药内酯苷溶液，浓度为1.01mg/mL；

精密称取甘草酸铵标准品0.0198g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到甘草酸铵溶液，浓度为1.98mg/mL。

步骤(3)中，分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。

需要说明的是，本发明的指纹图谱的构建方法是经过科学实验而筛选得到的，并非是本领域的常规选择，本发明主要对供试品溶液的制备方法，色谱条件，检测波长和分析时间等条件进行了优选。

其中：1)供试品溶液配制方法的考察：试验比较了提取溶剂稀释倍数对样品溶液检测效果的影响，如稀释40倍，20倍和10倍，结果以甲醇作为提取溶剂稀释20倍的检测效果为佳。

2)色谱条件的选择及优化：考察了流动相中不同磷酸缓冲液配比(0.1％、0.2％和0.3％)对色谱分离效果的影响。试验结果表明：流动相A中磷酸缓冲溶液配比为0.3％时色谱分离效果较好，基线平稳，峰形对称，分离度较好，因此流动相确定为：A相(0.3％磷酸水)—B相(乙腈)。调整流动相不同时间洗脱比例之后，各色谱峰的保留时间适中，且基线平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于色谱指纹图谱的检测和分析。

3)检测波长的选择：采用光电二极管阵列检测器(PDAD)在190～400nm扫描的各波长下的色谱图进行比较分析，并设定8个波长进行同时检测(包括220nm,230nm,235nm,237nm,240nm,245nm,254nm和290nm)，检测结果表明：230nm处检测的色谱图不仅基线平稳，色谱峰较多，信息量大，各色谱峰的分离效果较好，峰面积也较大。因此，选230nm作为检测波长。同时按照试行标准的要求考察了其他波长下的色谱图，其结果显示参枝苓口服液在不同波长下的色谱指纹图谱具有较好的相似度。

4)分析时间的选择：在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了2h的色谱图。结果表明85min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择100min作为分析时间。

5)柱温的选择：试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对指纹图谱检测结果的影响。结果显示柱温为30℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为30℃。

6)流速的选择：试验了四个流速(0.7ml/min,0.8ml/min,0.9ml/min和1.0ml/min)对指纹图谱检测结果的影响。结果表明：流速为0.8ml/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.8ml/min。

如前所述参枝苓口服液指纹图谱构建方法得到的参枝苓口服液指纹图谱，该指纹图谱中的共有峰为11个。

本发明还提供了一种参枝苓口服液质量控制的方法，包括以下步骤：

(1)待测参枝苓口服液指纹图谱的构建：取待测的参枝苓口服液，按上述方法构建待测的参枝苓口服液的指纹图谱；

(2)将待测参枝苓口服液的指纹图谱与参考样品指纹图谱进行相似性比较，以评价待测参枝苓口服液的质量，计算方法为相关系数法，相似度不低于0.900的口服液质量合格。若相似度小于0.900，表明批次样品质量差异较大。

步骤(2)中，所述参考样品指纹图谱的构建方法为：首先计算每个样品与其它样品的相似度，然后选择与其它样品相似度之和最大的样品为参考样品，其指纹图谱为参考样品指纹图谱。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用磷酸水溶液-乙腈***，采用梯度洗脱的方法建立了参枝苓口服液的指纹图谱，该方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大。

(2)由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息，因此，本发明选择在230nm波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息更为完全，各个峰吸收值良好，基线平稳。

(3)本发明采用参枝苓口服液的指纹图谱作为参枝苓口服液的质量控制手段，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，通过对多个批次的样品进行***分析，能更加全面、科学评价参枝苓口服液的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。

(4)本发明采用参考样品指纹图谱来进行指纹图谱的比较，避免各批次样品对对照指纹图谱的影响，对不同批次样品的质量区分能力增强，性能优于对照指纹图谱，判断结果更符合实际情况。

附图说明

图1为各批次参枝苓口服液HPLC指纹图谱及对照指纹图谱；

图2为参枝苓口服液对照品混合液指纹图谱；

图3为每个批次样品与其它批次样品的相似度之和(相关系数法)；

图4为各批次样品与参考样品指纹图谱的相似度(相关系数法)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：参枝苓口服液指纹图谱的构建及方法学验证

具体步骤为：

(1)供试品溶液的制备：精密量取1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取5min，于4℃冰箱中放置0.5小时，恢复至室温，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得稀释20倍的供试品溶液，即得。

(2)对照品溶液的制备：

精密称取肉桂酸标准品(批号：110786-200503)0.0103g，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到肉桂酸溶液，浓度为0.103mg/mL。

精密称取芍药苷标准品(批号：MUST-13030401)0.0302g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到芍药苷溶液，浓度为3.02mg/mL。

精密称取甘草苷标准品(批号：111610-200604)0.0204g，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到甘草苷溶液，浓度为0.816mg/mL。

精密称取芍药内酯苷标准品(批号：MUST-14031214)0.0101g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到芍药内酯苷溶液，浓度为1.01mg/mL。

精密称取甘草酸铵标准品(批号：G07-110317)0.0198g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到甘草酸铵溶液，浓度为1.98mg/mL。

(3)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图，并进行方法学考察。

色谱条件为：色谱柱为phenomenex synergi 4μ，Hydro-RP色谱柱(4μ，250×4.6mm)；流动相：0.3％磷酸水-乙腈，流动相A为0.3％磷酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱方式：梯度洗脱；检测波长230nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，进样量10μl，理论塔板数按芍药苷色谱峰计算不低于5000，与其它主要色谱峰的分离度均大于1.0，所有组分均在100min内被检测完。其中，流动相线性梯度如表1所示：

表1  色谱流动相梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	95	5
5	95	5
			10	92	8
20	80	20
			25	77.5	22.5
40	67	33

50	60	40
			60	50	50
80	15	85
			90	5	95
100	95	5

方法学考察主要包括稳定性、重现性和精密度考察，考察方法和结果如下：

①稳定性实验取同一批次参枝苓口服液样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，分别于0h，2h，4h，8h，12h，16h和24h进样分析，记录色谱图，结果见表2。由表2可见，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.050％～0.31％和2.0％～4.3％，说明供试品溶液的成分在24h内是稳定的。

②精密度实验取同一批次参枝苓口服液样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，连续测定6次，记录色谱图，结果见表2。可见，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.01％～0.25％和1.7％～4.6％，RSD＜5.0％，说明仪器的精密度良好。

③重复性实验取5份同一批次的参枝苓口服液样品，经预处理后，在优化的色谱条件下，分别进样分析，记录色谱图，结果见表2。各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.01％～1.2％和0.8％～4.6％，RSD＜5.0％，说明该实验方法的重复性较好。

表2  参枝苓口服液指纹图谱方法学验证结果

(4)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得参枝苓口服液指纹图谱。其中，不同批次的参枝苓口服液样品和对照品的指纹图谱如图1所示，对照品的指纹图谱如图2所示。

与图1参枝苓口服液指纹图谱比对可见，需要鉴定和定量的5种成分分离良好，色谱峰峰形对称，基线平稳。芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、肉桂酸和甘草酸铵的保留时间分别为：25.2，26.2，30.4，47.2和55.7min。

实施例2：利用指纹图谱进行参枝苓口服液的质量控制

利用指纹图谱进行参枝苓口服液的质量控制，具体方法包括以下步骤：

(1)待测参枝苓口服液指纹图谱的构建：取11批次待测的参枝苓口服液样品，按实施例1的方法构建待测的参枝苓口服液的指纹图谱；

(2)采用“中药色谱指纹图谱相似度评价***”软件对11批参枝苓口服液样品的HPLC指纹图谱色谱峰进行匹配。选择S1(编号为1的样品)作为参照图谱，生成的对照指纹图谱为R。各批次样品的指纹图谱与对照指纹图谱以及各样品之间指纹图谱的相似度结果见表3。

表3  11个批次参枝苓口服液指纹图谱的相似度值(相关系数法)

	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	S11	R
													S1	1.000	0.985	0.980	0.986	0.991	0.994	0.991	0.991	0.887	0.901	0.893	0.991
S2	0.985	1.000	0.993	0.979	0.991	0.994	0.993	0.993	0.871	0.883	0.889	0.989
													S3	0.980	0.993	1.000	0.988	0.989	0.988	0.987	0.987	0.876	0.888	0.893	0.989
S4	0.986	0.979	0.988	1.000	0.985	0.981	0.980	0.980	0.889	0.901	0.892	0.987
													S5	0.991	0.991	0.989	0.985	1.000	0.993	0.991	0.991	0.881	0.893	0.890	0.991
S6	0.994	0.994	0.988	0.981	0.993	1.000	0.999	0.999	0.881	0.893	0.890	0.992
													S7	0.991	0.993	0.987	0.980	0.991	0.999	1.000	0.999	0.881	0.893	0.885	0.991
S8	0.991	0.993	0.987	0.980	0.991	0.999	0.999	1.000	0.882	0.895	0.885	0.991
													S9	0.887	0.871	0.876	0.889	0.881	0.881	0.881	0.882	1.000	0.999	0.847	0.923
S10	0.901	0.883	0.888	0.901	0.893	0.893	0.893	0.895	0.999	1.000	0.858	0.934
													S11	0.893	0.889	0.893	0.892	0.890	0.890	0.885	0.885	0.847	0.858	1.000	0.919
R	0.991	0.989	0.989	0.987	0.991	0.992	0.991	0.991	0.923	0.934	0.919	1.000

由表3中可以看出，各批次样品与R的相似度均在0.900以上，说明参枝苓口服液各批次样品的化学组成总体上较为相近。但编号为1～8的样品与R的相似度较大，在0.987以上，而9-11的样品相似度值较小(0.919～0.934)。从相似度的初步分析结果可见，1～8批样品可以分为一类，而9～11批次样品为另一类。根据各批次样品的信息可知，1～8批次样品为2013年～2014年生产的批次样品，而9，10批次为2010年的样品，11批次为2012年的样品。9～11批次样品与R的相似度相对较低可能是这些批次样品出厂时间较长导致口服液中某些成分或含量发生变化所致。由于对照指纹图谱是采用11个批次样品指纹图谱的平均图谱来表示，因此各批次样品指纹图谱对最终生成的R都有一定的影响。可见，R对不同批次样品的质量区分能力较弱。

为了避免各批次样品对对照指纹图谱的影响，本发明提出基于参考样品指纹图谱来进行指纹图谱的比较。参考样品指纹图谱的构建方法是：首先计算每个样品与其它样品的相似度，然后选择与其它样品相似度之和最大的样品为参考样品。根据计算结果，第6批次样品与其他批次样品的相似度之和最大(见图3)，因此选择第6批次样品的指纹图谱作为参考样品指纹图谱。基于该样品对各批次样品进行相似度评价，结果见图4。

由图4可见，1～8批次样品与参考样品指纹图谱的相似度均在0.981以上，而9～11批次样品的相似度为0.881～0.893，小于0.900。说明这些批次样品的质量较低，一致性不好。与对照指纹图谱相比(见表3数据)，参考样品指纹图谱对不同批次样品的质量区分能力得到增强，性能优于对照指纹图谱，判断结果更符合实际情况。由于该样品指纹图谱为真实测定指纹图谱，不受各批次样品指纹图谱的影响，而且与其它各批次样品指纹图谱相似度之和最大，因此具有较好的代表性。

Claims (10)

1.一种参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取参枝苓口服液，加入甲醇，超声提取，冷藏放置0.5-1小时，恢复至室温，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的肉桂酸、芍药苷、甘草苷、芍药内酯苷、甘草酸铵对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；

(4)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得参枝苓口服液指纹图谱；

步骤(3)中，测定的液相色谱条件为：色谱柱为phenomenex synergi Hydro-RP色谱柱；流动相A为0.3％磷酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱；流动相流速为0.8ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm。

2.如权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-5min，流动相A95％-95％，流动相B 5％-5％；5-10min，流动相A95％-92％,流动相B 5％-8％；10-20min，流动相A92％-80％,流动相B 8％-20％；20-25min，流动相A80％-77.5％,流动相B 20％-22.5％；25-40min，流动相A77.5％-67％,流动相B 22.5％-33％；40-50min，流动相A 67％-60％,流动相B 33％-40％；50-60min，流动相A60％-50％,流动相B 40％-50％；60-80min，流动相A50％-15％,流动相B 50％-85％；80-90min，流动相A15％-5％,流动相B 85％-95％；90-100min，流动相A5％-95％,流动相B 95％-5％。

3.如权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，冷藏放置的时间为0.5-1小时。

4.如权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，供试品溶液的制备方法为：精密量取1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取5min，于4℃放置0.5小时，恢复至室温，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。

5.如权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，对照品溶液的制备方法为：

精密称取肉桂酸标准品0.0103g，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到肉桂酸溶液，浓度为0.103mg/mL；

精密称取芍药苷标准品0.0302g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到芍药苷溶液，浓度为3.02mg/mL；

精密称取甘草苷标准品0.0204g，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到甘草苷溶液，浓度为0.816mg/mL；

精密称取芍药内酯苷标准品0.0101g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到芍药内酯苷溶液，浓度为1.01mg/mL；

精密称取甘草酸铵标准品0.0198g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到甘草酸铵溶液，浓度为1.98mg/mL。

6.如权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述色谱柱的填料粒径为4μm，柱长为250mm，柱内径为4.6mm。

7.如权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。

8.权利要求1所述的方法构建得到的参枝苓口服液指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱中的共有峰为11个。

9.一种参枝苓口服液的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待测参枝苓口服液指纹图谱的构建：取待测的参枝苓口服液，按权利要求1所述的方法构建待测的参枝苓口服液的指纹图谱；

(2)将待测参枝苓口服液的指纹图谱与参考样品指纹图谱进行相似性比较，以评价待测参枝苓口服液的质量，计算方法为相关系数法，相似度不低于0.900的口服液质量合格。

10.如权利要求9所述的参枝苓口服液的质量控制方法，其特征在于，步骤(2)中，所述参考样品指纹图谱的构建方法为：首先计算每个样品与其它样品的相似度，然后选择与其它样品相似度之和最大的样品为参考样品，其指纹图谱为参考样品指纹图谱。