CN104849249A - 一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法。通过分别利用pH8.0的1×TE缓冲溶液、10%Tween80和10mM的焦磷酸钠等试剂对土壤中腐植酸处理从而制备出土壤悬浮液，并采取了对样品不同倍数的稀释，然后进行样品的染色和制片，在荧光显微镜下观察制片效果，利用荧光显微镜测定样品核酸荧光强度及土壤中的噬菌体丰度准确分析，结果表明用10%Tween80和10mM的焦磷酸钠同时处理样品并对样品稀释10倍时制片效果最好，测得的噬菌体丰度较高。本发明的方法制样简单，准确性高，重复性好，操作简便快速，为噬菌体丰度的快速测定提供了方法依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法，特别是利用不同的试剂及处理方法去除土壤中腐植酸，从而优化荧光显微镜制片效果，测定土壤中噬菌体丰度的方法，属生物技术领域，专用于土壤中噬菌体丰度的快速鉴定。
背景技术
众所周知，病毒在自然界中数量巨大，利用超离心和透射电镜技术研究发现病毒丰度为105~107个/mL，远远超过细菌数量。病毒在微食物环、生源要素的循环及对宿主细胞的裂解以及控制宿主多样性方面都具有重要作用。噬菌体是病毒类群中的一大类，噬菌体感染宿主菌的同时，潜在着将新的遗传信息导入宿主菌。噬菌体在调节微生物种群的结构与多样性、促进微生物间遗传物质的传递与协同进化、参与微食物环的形成等方面发挥重要角色。随着对微生物研究的不断深入，发现病毒对传统意义上微生物食物环中的主要角色都有不同程度的影响，它的介入使得微生物食物环中的物质流向更加复杂化，由此可知病毒的丰度在微生物食物环中有着重要的生态学意义。
在水生环境中存在着大量的浮游病毒，海洋中可高达1030个/ml，其中大多数都是噬菌体。环境中的叶绿素a含量，C、N等化学元素，pH等多种因素都会引起噬菌体丰度的变化。基于这些关联，噬菌体丰度的变化也可以对环境的变化进行指示。
病毒体积微小，多数病毒直径在20~200 nm之间。对于可培养的噬菌体，主要采用单层或双层平板法观察噬菌斑估算噬菌体效价，但是环境中多数是不可培养得噬菌体。对于不可培养的噬菌体可采用透射电镜、荧光显微镜及流式细胞仪来估算噬菌体丰度。传统的方法一般是将土样制备成悬浮液后，通过超速离心将病毒直接收集到电镜铜网上或者通过浓缩后转移到铜网上，在透射电镜下观察病毒样颗粒和细菌形态，按形态分类统计后计算噬菌体丰度。由于透射电镜计数要求颗粒达到的最低浓度是105个/mL，因而在贫营养环境下该技术受到限制，另外由于染色和在铜网上的不均匀分布，导致计数病毒丰度存在较大误差，同时，样品的准备和分析也耗时繁琐。
20世纪90年代出现了荧光显微镜技术，根据有关文献得知该技术测定微生物丰度的原理利用是核酸染料和核酸高效共价结合，从而对细菌或病毒进行染色，利用氧化铝膜将病毒截留在膜上放在荧光显微镜下观察，根据染色亮点的大小进行辨别和计数。该技术在病毒计数方面有着更高的准确度和精确度而被广泛应用，最初使用的染料是DAPI和Yo-Pro-1，但是这种染料猝灭较快，不宜计数和拍照，后来出现了SYBR Gold和SYBR Green I，具有染色效果好、猝灭较慢、易于拍照的优点，所以逐渐代替了前者。样品的前处理对病毒丰度的计数也尤为重要，由于土壤中存在大量腐植酸成分较为复杂，如果不能对腐植酸去除，对制片影响很大，用荧光显微镜观察时会遮盖噬菌体，从而使计数减少，所以探索和摸索较优的处理和制备条件，探索出更优的样品前处理和制片方法对准确测定病毒丰度有重大意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：现有处理土样的方法只是用无菌水进行溶解离心和过膜的简单处理，存在较大误差与不稳定性。
本发明的目的在于提供一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法，按如下步骤进行：
（1）样品前处理试剂的制备
pH 7.0~9.0经过0.22~0.45um滤膜过滤的TE缓冲溶液的配制：取1mol/L Tris-HCl、取121.1g Tris，加浓盐酸约42ml，高温高压灭菌后冷却至室温后调节pH 7.0~9.0；
10~15%的Tween80溶液的配制：按体积比用蒸馏水稀释Tween80，用容量瓶定容即可，贮藏于4℃保存；
5~10mmol/L的焦磷酸钠溶液的配制：取2.23~4.46 g焦磷酸钠溶于蒸馏水中，定容至1 L。
所述1L EDTA（pH 8.0，终浓度0.5M）的配制：取186.1g Na2EDTA·2H2O，用NaOH（约20 g）调节pH 8.0，用过滤的ddH2O混合至1L，高温高压灭菌后室温保存；
所述1 L10×TE 缓冲溶液（pH 8.0）的配制：取10 ml Tris-HCl（pH 8.0，终浓度1M）取，0.5M EDTA（pH 8.0）取20ml，用过滤ddH2O混合至1L，高温高压灭菌后，室温保存；1×TE 缓冲溶液是将10×TE 缓冲溶液稀释10倍；
用0.22μm膜滤过的pH 8.0的TE 缓冲溶液将SYBR Gold 10000×和SYBR Green I 10000×稀释到10×，分装成20 ul/管，-20℃避光保存，将抗猝灭剂1加入30~40℃水浴温育过的抗猝灭剂2中，充分溶解后分装，-20℃保存，有效期3个月；1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。
（2）土壤悬浮液的制备：按10~50g/100ml的比例将土壤加入到pH 7.0~9.0经过0.22~0.45 um滤膜过滤的TE 缓冲溶液中，涡旋震荡1~10min后，按150~250μL/100ml的比例加入体积百分比10~15%的Tween80、按10~30ml/100ml的比例加入5~10mmol/L的焦磷酸钠，然后充分震荡混匀后超声30~45s，停止30~60s，重复3~5次，3000~8000r/min离心5~10min，上清液经滤纸过滤后收集滤液，将滤液4~10℃静置8~10h，8000~10000r/min离心分离1~3min后取上清液，按DNAse I（脱氧核糖核酸酶I）和RNAse A（核糖核酸酶A）最终浓度均为0.5~2μg/ml的比例向上清液中加入DNAse I和RNAse A，在25~37℃或室温中消化20~40min后，在分装有样品的冻存管中按最终体积浓度为0.2~1%的比例加入质量百分比浓度为15~30%的戊二醛，4~10℃避光固定15~20 min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃左右的超低温冰箱保存；
（2）用0.22~0.45um滤膜滤过的pH 7.0~9.0的1×TE 缓冲溶液将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到10~50×SYBR Gold、10~50×SYBR Green I，将步骤（1）得到的样品取出后，置于25~37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻，样品一经融化立即取出，将样品稀释5~20倍后进行制片；
（3）将0.22~0.45μm硝酸纤维膜置于过滤器上作为衬膜，真空滤器≤13kPa，用蒸馏水完全湿润滤膜，将Al2O3膜放置在湿衬膜上，打开抽滤泵，按照1~10ul/cm2的比例将步骤（2）得到的品滴加到Al2O3膜上，将滤干后的Al2O3膜在真空状态下移走，避光的空气中干燥；用pH 7.0~9.0的TE 缓冲溶液 将10×染液稀释10~50倍，将干燥的Al2O3膜正面朝上置于含有染液的平皿中，使染液与Al2O3膜充分接触，暗处避光染10~30min，在湿衬滤器上去除多余染液，保持真空状态下移走Al2O3膜避光放置于滤纸上干燥直到完全不透明；滴10~15 μl抗猝灭剂到玻片上，将晾干的Al2O3膜在玻片上面，然后再加15~30μl抗猝灭剂并加盖玻片得到样品；
（3）将制备好的玻片在荧光显微镜下观察，选择清晰视野，对每个视野进行拍照和计数，具体为将玻片放在在荧光显微镜1000×视野下，目镜10×，物镜100×，用油镜观察；可以观察到许多明亮的针尖大小的亮点，即染色的噬菌体；选择若干清晰视野，对每个视野进行拍照和计数。
本发明所述染液、抗猝灭剂为荧光显微镜专用，其中染液为市售的SYBR Green I或SYBR Gold，抗淬灭剂为市售的抗荧光淬灭试剂。
本发明针对传统计数方法中存在的不足，探索出更优的样品前处理和制片方法准确计数病毒丰度，从而更好的揭示环境微生物中生物群落结构关系；本发明重点在于优化土壤样品前处理方法，能更有效的去除土壤中的腐植酸，从而使得荧光显微镜对噬菌体丰度的测定更加准确，更加真实的反应环境中噬菌体的丰度，为进一步了解病毒在微生物食物环乃至整个海洋生态***中的地位及其在生物地球化学循环中的作用提供了基础数据。
本发明利用荧光显微镜技术测定土壤噬菌体丰度，通过添加不同的试剂优化了土壤样品的前处理方法，为后续用荧光显微镜清晰地观察噬菌体和拍照计数奠定基础，建立了土壤噬菌体量监测分析的体系。
与现有技术相比，有益效果是：
（1）克服了可培养方法成本高、时间长、数据有限的缺点；
（2）重点对土壤中腐植酸去除和处理进行了优化，土壤样品经Tween80和焦磷酸钠处理并稀释10倍后测得的噬菌体丰度明显高于其他处理方法。
（3）比传统方法更加准确，更加快速，平均减少时间2h。
因此，本发明的方法有效改善了土壤噬菌体计数困难和计数不准确的现状，而且操作简单，节省时间，为后续噬菌体的丰度测定奠定了基础。
附图说明
图1是经TE 缓冲溶液（pH 8.0）处理的纳帕海采集的湿地土壤样品的荧光图。
图2是经TE 缓冲溶液（pH 8.0）、Tween80和焦磷酸钠处理并稀释15倍的纳帕海采集的湿地土壤样品的荧光图。
图3是经TE 缓冲溶液（pH 8.0）、Tween80和焦磷酸钠处理并稀释10倍的纳帕海采集的湿地土壤样品的荧光图。
图4是经TE 缓冲溶液（pH 8.0）、Tween80和焦磷酸钠处理并稀释10倍的纳帕海采集的淤泥土壤样品的荧光图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1
本实施例为采用现有技术即TE buffer（pH 8.0）处理的纳帕海采集的湿地土壤样品的噬菌体丰度，包括以下步骤：
（1）样品前处理试剂的制备：
土壤样品采自于纳帕海湿地（E99°38′16″，N27°51′08″，海拔3272m）。
样品前处理试剂是pH 8.0的1×TE Buffer。所述pH 8.0的1×TE buffer配制：1M Tris-HCl：取121.1g Tris，加浓盐酸约42ml高温高盐灭菌后，冷却到室温后调pH为8.0；0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA·2H2O，用NaOH调pH至8.0约20g,高温高压灭菌，室温保存；10×TE Buffer（pH8.0）（1L）的配制：1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml，高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。用0.22μm膜滤过的pH 8.0的TE buffer将SYBR Gold 10000×和SYBR Green I 10000×稀释到10×，分装成20 ul/管，-20℃避光保存，将抗猝灭剂1加入30~40℃水浴温育过的抗猝灭剂2中，充分溶解后，分装，-20℃保存，有效期3个月。1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。
（2）土壤样品悬浮液的制备：
称取5g土样，加入20ml 经过0.22 um滤膜过滤的pH=8.0的TE buffer，最大涡旋震荡3min，在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，5000r/min离心10min，上清经过滤纸过滤，收集滤液。在4℃冰箱静置8h，然后在8000r/min离心3min，取上清液。按1 ug/ml终浓度加入DNAse I（脱氧核糖核酸酶I）和RNAse A（核糖核酸酶A），在37℃或室温中消化30 min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛，4℃避光固定15~20 min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存。
（3）上样样品玻片的制备：
样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻。制片过程如下：将0.45 μm硝酸纤维膜置于滤器上作为衬膜，用水完全湿润滤膜，将Al2O3膜放置在湿衬膜上，打开抽滤泵，取1 ml样品滴加到Al2O3膜上，液体不能溢出Al2O3膜塑料衬托。加样品的Al2O3膜抽滤干后，在真空状态下移走Al2O3膜，避光的空气中干燥（约1 min）。玻璃平皿中，按染液终浓度为0.25×用TE buffer 将10×染液稀释40倍（每张滤膜约需80 μl 0.25×染液）。将干燥的Al2O3膜正面朝上置于含有染液的平皿中，使染液与Al2O3膜充分接触，暗处避光染15 min。在湿衬滤器上去除多余染液，保持真空状态下移走Al2O3。膜避光放置于滤纸上干燥直到完全不透明（约5 min）。滴12 μl抗猝灭剂到玻片上，晾干的Al2O3膜在上面，再加20 μl抗猝灭剂并加盖玻片，避免气泡。载波片上标记样品名。1 ml 0.02 μm滤过的TE buffer与样品制片同样操作，作为空白对照。玻片可以立即计数或在-20℃冻存4个月。
（4）对土壤中的噬菌体丰度进行分析
将玻片放在在荧光显微镜1000×视野下，目镜10×，物镜100×，油镜观察。可以观察到许多明亮的针尖大小的亮点，即噬菌体。选择若干清晰视野，对每个视野进行拍照和计数，但由于样品腐植酸太多，造成制片时腐植酸覆盖Al2O3膜，从荧光显微镜上计数结果不精确，约为1.2×106/mL，如图1所示。
实施例2
本实施例用荧光显微镜测定经Tween80和焦磷酸钠处理并稀释15倍的纳帕海采集的湿地土壤样品的噬菌体丰度，包括以下步骤：
（1）样品前处理试剂的制备：
土壤样品采自于纳帕海的湿地（E99°38′16″，N27°51′08″，海拔3272m）。
样品前处理试剂由pH=8.0的1×TE 缓冲溶液、10%Tween80和10mM的焦磷酸钠组成。所述10%Tween80配制：用蒸馏水按体积比稀释Tween80，用容量瓶定容即可，贮藏于4℃保存；所述10mM的焦磷酸钠配制：取4.46g焦磷酸钠溶于蒸馏水中，定容至1L；所述pH=8.0的1×TE 缓冲溶液配制：1M Tris-HCl：取121.1g Tris，加浓盐酸约42ml高温高盐灭菌后，冷却到室温后调pH=8.0；0.5M EDTA（pH 8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA·2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存；10×TE 缓冲溶液（pH 8.0）（1L）配制：1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH 8.0）取20ml，高温高压灭菌，室温保存。1×TE 缓冲溶液（pH 8.0）是将10×TE 缓冲溶液（pH 8.0）用无菌ddH2O稀释10倍即可。用0.22μm膜滤过的pH 8.0的TE 缓冲溶液将SYBR Gold 10000×和SYBR Green I 10000×稀释到10×，分装成20 ul/管，-20℃避光保存，将抗猝灭剂1加入30~40℃水浴温育过的抗猝灭剂2中，充分溶解后，分装，-20℃保存，有效期3个月。1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。
（2）土壤悬浮液的制备：
称取5g土样，加入20ml 经0.22um滤膜过滤的pH=8.0的TE 缓冲溶液，最大涡旋震荡3min，加入10%（v/v）的Tween 80 50ul，充分震荡混匀，加入10mM的焦磷酸钠6ml, 充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，5000r/min离心10min，上清经普通滤纸过滤，收集滤液，将滤液在4℃静置8h，8000r/min离心3min，取上清液。按1ug/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存。制玻片的样品在使用前用ddH2O稀释15倍后制片。
（3）样品玻片的制备：
样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻。解冻后将样品稀释100倍制片。过程如下：取出1mL样品稀释15倍，轻轻摇晃均匀。将0.45 μm硝酸纤维膜置于滤器上作为衬膜，用水完全湿润滤膜，将Al2O3膜放置在湿衬膜上，打开抽滤泵，取1 ml稀释样品滴加到Al2O3膜上，液体不能溢出Al2O3膜塑料衬托。加样品的Al2O3膜抽滤干后，在真空状态下移走Al2O3膜，避光的空气中干燥（约1 min）。玻璃平皿中，按染液终浓度为0.25×用TE 缓冲溶液 将10×染液稀释40倍（每张滤膜约需80 μl 0.25×染液）。将干燥的Al2O3膜正面朝上置于含有染液的平皿中，使染液与Al2O3膜充分接触，暗处避光染15 min。在湿衬滤器上去除多余染液，保持真空状态下移走Al2O3。膜避光放置于滤纸上干燥直到完全不透明（约5 min）。滴12 μl抗猝灭剂到玻片上，晾干的Al2O3膜在上面，再加20 μl抗猝灭剂并加盖玻片，避免气泡。载波片上标记样品名。1 ml 0.22 μm滤过的TE 缓冲溶液与样品制片同样操作，作为空白对照。玻片可以立即计数或在-20℃冻存4个月。
（4）土壤中的噬菌体丰度分析
将玻片放在在荧光显微镜1000×视野下，目镜10×，物镜100×，油镜观察。可以观察到许多明亮的针尖大小的亮点，即噬菌体。选择若干清晰视野，对每个视野进行拍照和计数，测得噬菌体丰度为3.89×106/mL，高于实施例1中采用现有技术计数的噬菌体丰度，如图2所示。
实施例3
本实施例用荧光显微镜测定经Tween80和焦磷酸钠处理并稀释10倍的纳帕海采集的湿地土壤样品的噬菌体丰度，包括以下步骤：
（1）样品前处理试剂的制备：
土壤样品采自于纳帕海的湿地（E99°38′16″，N27°51′08″，海拔3272m）。
样品前处理试剂由pH 8.0的1×TE 缓冲溶液、10%Tween80和10mM的焦磷酸钠组成。所述10%Tween80配制：用蒸馏水按体积比稀释Tween80，用容量瓶定容即可，贮藏于4℃保存；所述10mM的焦磷酸钠配制：取4.46g焦磷酸钠溶于蒸馏水中，定容至1L；所述pH 8.0的1×TE 缓冲溶液配制：1M Tris-HCl：取121.1g Tris，加浓盐酸约42ml高温高盐灭菌后，冷却到室温后调pH=8.0；0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA·2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存；10×TE 缓冲溶液（pH 8.0）（1L）配制：1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH 8.0）取20ml，高温高压灭菌，室温保存。1×TE 缓冲溶液（pH 8.0）是将10×TE 缓冲溶液（pH 8.0）用无菌ddH2O稀释10倍即可。用0.22μm膜滤过的pH 8.0的TE 缓冲溶液将SYBR Gold 10000×和SYBR Green I 10000×稀释到10×，分装成20 ul/管，-20℃避光保存，将抗猝灭剂1加入30~40℃水浴温育过的抗猝灭剂2中，充分溶解后，分装，-20℃保存，有效期3个月。1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。
（2）土壤悬浮液的制备：
称取5g土样，加入20ml 经过0.02um滤膜过滤的pH=8.0的1×TE 缓冲溶液，最大涡旋震荡3min，加入10%（v/v）的Tween80 50ul，充分震荡混匀，加入10mM的焦磷酸钠6ml, 充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，5000r/min离心10min，上清经过普通滤纸过滤，收集滤液，将滤液在4℃静置8h，8000r/min离心3min，取上清液。按1ug/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存。制玻片的样品在使用前用ddH2O稀释10倍后制片。
（3）样品玻片的制备：
样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻。解冻后将样品稀释10倍制片。过程如下：取出1mL样品稀释10倍，轻轻摇晃均匀。将0.45 μm硝酸纤维膜置于滤器上作为衬膜，用水完全湿润滤膜，将Al2O3膜放置在湿衬膜上，打开抽滤泵，取1 ml 稀释样品滴加到Al2O3膜上，液体不能溢出Al2O3膜塑料衬托。加样品的Al2O3膜抽滤干后，在真空状态下移走Al2O3膜，避光的空气中干燥（约1 min）。玻璃平皿中，按染液终浓度为0.25×用TE 缓冲溶液 将10×染液稀释40倍（每张滤膜约需80μl 0.25×染液）。将干燥的Al2O3膜正面朝上置于含有染液的平皿中，使染液与Al2O3膜充分接触，暗处避光染15 min。在湿衬滤器上去除多余染液，保持真空状态下移走Al2O3。膜避光放置于滤纸上干燥直到完全不透明（约5 min）。滴12 μl抗猝灭剂到玻片上，晾干的Al2O3膜在上面，再加20 μl抗猝灭剂并加盖玻片，避免气泡。载波片上标记样品名。1 ml 0.22 μm滤过的pH 8.0的1×TE 缓冲溶液与样品制片同样操作，作为空白对照。玻片可以立即计数或在-20℃冻存4个月。
（4）土壤中的噬菌体丰度分析
将玻片放在在荧光显微镜1000×视野下，目镜10×，物镜100×，油镜观察。可以观察到许多明亮的针尖大小的亮点，即噬菌体。选择若干清晰视野，对每个视野进行拍照和计数，荧光显微镜拍照清晰，计数较准确，测得噬菌体丰度为4.16×106/mL，说明稀释倍数为10倍时效果最佳，高于采用现有技术进行荧光显微镜计数的结果，如图3所示。
实施例4
荧光显微镜测定经Tween80和焦磷酸钠处理并稀释10倍的纳帕海采集的淤泥土壤样品的噬菌体丰度，包括以下步骤：
（1）样品前处理试剂的制备：
样品采集自纳帕海的淤泥（E99°38′16″，N27°51′08″，海拔3272m）。
样品前处理试剂由pH 8.0的1×TE 缓冲溶液、10% Tween 80和10mM的焦磷酸钠组成；所述10%Tween80配制：用蒸馏水按体积比稀释Tween80，用容量瓶定容即可，贮藏于4℃保存；所述10mM的焦磷酸钠配制：取4.46g焦磷酸钠溶于蒸馏水中，定容至1L；所述pH=8.0的1×TE 缓冲溶液配制：1M Tris-HCl：取121.1g Tris，加浓盐酸约42ml高温高盐灭菌后，冷却到室温后调pH 8.0；0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA·2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存；10×TE 缓冲溶液（pH=8.0）（1L）的配制：1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH 8.0）取20ml，高温高压灭菌，室温保存。1×TE 缓冲溶液（pH 8.0）的配制是将10×TE 缓冲溶液用无菌ddH2O稀释10倍即可。用0.22μm膜滤过的pH 8.0的1×TE 缓冲溶液将SYBR Gold 10000×和SYBR Green I 10000×稀释到10×，分装成20 ul/管，-20℃避光保存，将抗猝灭剂1加入30~40℃水浴温育过的抗猝灭剂2中，充分溶解后，分装，-20℃保存，有效期3个月。1周内用完，使用前检查是否沉淀或析出。
（2）土壤悬浮液的制备：
称取5g土样，加入20ml 经过0.22um滤膜过滤的pH=8.0的1×TE 缓冲溶液，最大涡旋震荡3min，加入10%（v/v）的Tween80 50ul，充分震荡混匀，加入10mM/L的焦磷酸钠6ml, 充分震荡混匀，15min后在59Hz超声 45s，停30s，重复3次，离心前充分震荡，5000r/min离心10min，上清经过普通滤纸过滤，收集滤液。将滤液放在4℃静置8h，8000r/min离心3min，取上清液。按1ug/ml终浓度加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30min后，在分装有样品的冻存管中按终浓度为0.5%（v/v）加入25%戊二醛， 4℃避光固定15min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃超低温冰箱中长期保存。制玻片的样品在使用前用无菌ddH2O稀释10倍后制片。
（3）样品玻片的制备：
样品从-80℃冰箱中取出后，置于37℃水浴，轻晃冻存管加速解冻。解冻后将样品稀释10倍制片。过程如下：将1 ml 样品稀释至10倍，轻轻摇晃均匀。将0.45μm硝酸纤维膜置于滤器上作为衬膜，用水完全湿润滤膜，将Al2O3膜放置在湿衬膜上，打开抽滤泵，取出1mL稀释样品滴加到Al2O3膜上，液体不能溢出Al2O3膜塑料衬托。加样品的Al2O3膜抽滤干后，在真空状态下移走Al2O3膜，避光的空气中干燥（约1 min）。玻璃平皿中，按染液终浓度为0.25×用TE 缓冲溶液 将10×染液稀释40倍（每张滤膜约需80μl 0.25×染液）。将干燥的Al2O3膜正面朝上置于含有染液的平皿中，使染液与Al2O3膜充分接触，暗处避光染15 min。在湿衬滤器上去除多余染液，保持真空状态下移走Al2O3。膜避光放置于滤纸上干燥直到完全不透明（约5min）。滴12μl抗猝灭剂到玻片上，晾干的Al2O3膜在上面，再加20μl抗猝灭剂并加盖玻片，避免气泡。载波片上标记样品名。1 ml 0.22 μm滤过的pH 8.0的1×TE 缓冲溶液与样品制片同样操作，作为空白对照。玻片可以立即计数或在-20℃冻存4个月。
（4）土壤中的噬菌体丰度分析
将玻片放在在荧光显微镜1000×视野下，目镜10×，物镜100×，油镜观察。可以观察到许多明亮的针尖大小的亮点，即噬菌体。选择若干清晰视野，对每个视野进行拍照和计数，测得噬菌体丰度为4.76×106/mL，说明采用同样处理方法和稀释倍数，淤泥样的计数也较前述方法准确，拍照清晰，高于采用现有技术进行荧光显微镜计数的结果，如图4所示。
因此，利用Tween80和焦磷酸钠处理并稀释10倍的优化方案不论是分析纳帕海湿地土壤还是淤泥土样样品，荧光显微镜计数效果均优于现有技术；该优化方案同样适用于其他土壤样品的前处理及制片过程，为噬菌体丰度的快速测定提供了方法依据。
Claims (1)
1.一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法，其特征在于，按如下步骤进行：
（1）按10~50 g/100ml的比例将土壤加入到pH 7.0~9.0经过0.22~0.45 um滤膜过滤的TE 缓冲溶液中，涡旋震荡1~10min后，按150~250μL/100ml的比例加入体积百分比10~15%的Tween80、按10~30ml/100ml的比例加入5~10mmol/L的焦磷酸钠，然后充分震荡混匀后超声30~45s，停止30~60s，重复3~5次，3000~8000r/min离心5~10min，上清液经滤纸过滤后收集滤液，将滤液4~10℃静置8~10h，8000~10000r/min离心分离1~3min后取上清液，按DNAse I和RNAse A最终浓度均为0.5~2μg/ml的比例向上清液中加入DNAse I和RNAse A，在25~37℃或室温中消化20~40 min后，在分装有样品的冻存管中按最终体积浓度为0.2~1%的比例加入质量百分比浓度为15~30%的戊二醛，4~10℃避光固定15~20 min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80℃左右的超低温冰箱保存；
（2）用0.22~0.45um滤膜滤过的pH 7.0~9.0的1×TE 缓冲溶液将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到10~50×SYBR Gold、10~50×SYBR Green I，将步骤（1）得到的样品取出后，置于25~40℃水浴，轻晃冻存管加速解冻，样品一经融化立即取出，将样品稀释5~20倍后进行制片；
（3）将0.22~0.45μm硝酸纤维膜置于过滤器上作为衬膜，真空滤器≤13kPa，用蒸馏水完全湿润滤膜，将Al2O3膜放置在湿衬膜上，打开抽滤泵，按照1~10ul/cm2的比例将步骤（2）得到的样品滴加到Al2O3膜上，将滤干后的Al2O3膜在真空状态下移走，避光的空气中干燥；用pH 7.0~9.0的TE缓冲溶液 将10×染液稀释10~50倍，将干燥的Al2O3膜正面朝上置于含有染液的平皿中，使染液与Al2O3膜充分接触，暗处避光染10~30min，在湿衬滤器上去除多余染液，保持真空状态下移走Al2O3膜避光放置于滤纸上干燥直到完全不透明；滴10~15μl抗猝灭剂到玻片上，将晾干的Al2O3膜在玻片上面，然后再加15~30μl抗猝灭剂并加盖玻片得到样品；
（4）将制备好的玻片在荧光显微镜下观察，选择清晰视野，对每个视野进行拍照和计数。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150819 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |