CN104846094A - 草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用，该方法为用病原真菌通用、特异性引物对病原菌DNA进行PCR反应，当PCR产物呈现大约500bp单一条带，对PCR产物测序，测序结果在NCBI数据库进行比对，即可明确病样组织中含有引起草莓根腐病不同病原菌。该方法操作简单，耗时少，通量大。通过该方法对草莓苗圃种苗根部病样等进行定性检测，可以有效避免草莓根腐病的传播与发生，保障我国草莓无病种苗生产基地的建设、安全生产。

Description

草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用
技术领域
本发明属于果树病害防治及植物检疫技术领域，涉及草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用。
背景技术
草莓根腐病是由土传病原真菌共同引起的一大类病害总称。世界范围内草莓主产区已报道的根腐病病原物达20余种，是一种较难防治的土传病害。常见的病原菌有：引起草莓黑根腐病的主要有镰刀菌(Fusarium spp.)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、腐霉菌(Pythium sp.)、拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis sp.)；引起草莓红中柱根腐病的病原菌为疫霉菌(Phytophthorafragariae C.J.Hickman)。草莓根腐病典型症状是切开病根或剥下根外表皮可看到暗红色病组织，与健康部位形成鲜明对照；地下部发病迅速，地上部分突然凋萎，全株青枯死亡。根腐病发病率为20％～30％，个别地区达到50～80％，发病植株死亡率100％。近年来草莓黑根腐及红中柱根腐在草莓病害中的危害最重、影响最大，严重影响草莓的产量和效益，成为草莓种植发展的瓶颈问题。
引起草莓根腐病的病原真菌具有明显的潜伏侵染的特征。在草莓上根腐病菌的潜伏侵染是很普遍的现象，当环境条件适合发病时，就会发生草莓根腐病。草莓生产中一般使用无性种苗繁殖，各地区间种苗的流动性也很频繁。如果移栽的种苗上有根腐病原菌的潜伏侵染，往往会引起病原菌的跨地区长距离传播，造成根腐病区域性暴发，给草莓生产带来巨大经济损失。因此，用无根腐病发生的育苗基地繁殖的无菌种苗可以从根源上避免草莓根腐病的发生。但随着种植面积扩大，加上病害传播范围越来越广泛，这种方法难度很大。因此建立有效的种苗检测技术是非常重要的，可以有效避免草莓根腐病的传播与发生。但是由于带菌种苗不显症，而且目前发展的一些检验方法因为繁琐耗时不容易推广实施，还是给当前根腐病菌检验带来了极大难度。草莓根腐病的病因复杂，化学防治方法合理使用前提就是要搞清楚本地区草莓根腐病的病原微生物种类，对症下药才能起到事半功倍效果。同时，化学防治带来的残留问题和对生态环境的破坏已经不容忽视。传统的病原菌分离培养鉴定的方法又依赖于专业人员丰富的经验和***的病原菌分类的理论知识，这样就会贻误最佳的防治时机。目前，防治草莓根腐病还没有行之有效的方法。主要是采取以农业防治为主，化学防治为辅的综合治理措施。因此，对草莓根腐病应以预防为主，着重加强对该病害的检疫检测。为防止草莓根腐病从疫区传入非疫区，确保国内草莓的安全生产，建立一套稳定、简便、快速、灵敏的分子检测方法对草莓种苗进行检疫检测是非常必要的。PCR检测方法具有灵敏度高、精度高、取样量微小、检测时间短等优点。通过该技术对草莓种苗等定性检测，为确保我国草莓无病种苗生产基地的建设、安全生产，同时堵截国外危险性带病草莓种苗传入我国具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的存在的缺陷，提供一种草莓根腐病害病原菌分子快速检测方法。该方法操作简便易行，直接应用于生产实践，用于带菌植物组织的高灵敏度快速检测，确保为生产提供健康无菌种苗、对病原菌分子预警具有十分重要的意义。
本发明的另一目的在于提供所述草莓根腐病病原菌分子快速检测方法的应用。
其具体技术方案为：
草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法，包括以下步骤：
步骤1.病原菌的分离
采用组织分离法对草莓根部的病原菌进行分离，切取病健交界处的病组织4-5mm的小块，置于75％乙醇中浸泡5s，接着将病组织移入0.1％升汞溶液中浸泡3-5min，再将病组织转移到无菌水中漂洗3遍，最后将组织移到PDA培养基上，将培养皿放置25℃培养箱中培养3-5d，菌落直径1cm即进行DNA提取实验；
步骤2.病原菌DNA少量提取
1)用灭菌牙签刮取PDA平板上的少量病原菌菌丝，装入2.0ml的离心管中；
2)加入500μl Lysis buffer，1颗破碎珠，多样品组织研磨机研磨60-90s；
3)室温静置10min；
4)13200rpm，室温离心10min，取上清液400μl转入新离心管中；
5)加入800μl无水乙醇，颠倒混匀；-20℃静置10min沉淀DNA；
6)13200rpm，4℃离心5min；
7)沉淀用75％乙醇洗涤，空气中干燥后用50μl ddH2O溶解，上清即为提取的DNA溶液，用于下游PCR模板；
步骤3.设计病原真菌通用引物
上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
步骤4.PCR扩增
PCR反应体系为25μL，反应液为：10×buffer2.5μL，dNTP1μL，引物ITS1和ITS4各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板3μL，ddH2O16μL，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃总延伸10min；在1％的琼脂凝胶上检测PCR结果，当PCR产物呈现大约500bp条带，即样本中含有草莓根腐病病原菌，将随机挑选样品CY2、JN3、JM2、LW2PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序；
步骤5.序列分析
测序结果与NCBI数据库
http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome序列比对，得到明确的草莓根腐病病原菌种类。
本发明所述草莓根腐病害病原菌分子快速检测方法，在草莓种苗检疫、田间草莓根腐病的早期诊断以及病菌的监测和鉴定过程中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明根据引起草莓根腐病病原菌的基因组序列，设计通用特异性引物。通过该技术对草莓种苗等定性检测，从而实现我国草莓无病种苗生产基地的建设、安全生产，同时堵截国外危险性带病草莓传入的目的。该方法操作简单，耗时少，通量大。通过该方法对草莓苗圃种苗根部病样等进行定性检测，可以有效避免草莓根腐病的传播与发生，保障我国草莓无病种苗生产基地的建设、安全生产。
附图说明
图1为同地区草莓根部病样组织PCR电泳图，其中，泳道M为DNA Marker 2000；泳道1-9为下表中对应不同地区采集草莓根部组织DNA为模板PCR产物；泳道ck-为阴性对照水为模板PCR产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1.病原菌的分离
采用组织分离法对草莓根部的病原菌进行分离。切取病健交界处的病组织4-5mm的小块，置于75％乙醇中浸泡5s，接着将病组织移入0.1％升汞溶液中浸泡3-5min，再将病组织转移到无菌水中漂洗3遍，最后将组织移到PDA培养基上，将培养皿放置25℃培养箱中培养3-5d，菌落直径1cm即可进行DNA提取实验。
2.病原菌DNA少量提取
1)用灭菌牙签刮取PDA平板上的少量病原菌菌丝，装入2.0ml的离心管中；
2)加入500μl Lysis buffer，1颗破碎珠，多样品组织研磨机研磨60-90s；
3)室温静置10min；
4)13200rpm，室温离心10min，取上清液400μl转入新离心管中；
5)加入800μl无水乙醇，颠倒混匀；-20℃静置10min沉淀DNA。
6)13200rpm，4℃离心5min；
7)沉淀用75％乙醇洗涤，空气中干燥后用50μl ddH2O溶解，上清即为提取的DNA溶液，可用于下游PCR模板。
3.设计病原真菌通用引物
上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(步骤3可以跟步骤1、2同步进行)。
4.PCR扩增
PCR反应体系为25μL，反应液为：10×buffer2.5μL，dNTP1μL，引物(ITS1和ITS4)各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板3μL，ddH2O16μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃总延伸10min。在1％的琼脂凝胶上检测PCR结果，当PCR产物呈现大约500bp条带，即样本中含有草莓根腐病病原菌。将随机挑选样品CY2、JN3、JM2、LW2PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
5.序列分析
测序结果与NCBI数据库
(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)序列比对，得到明确的草莓根腐病病原菌种类。
实验结果如图1和表1所示。
表1：不同地区采集草莓样品信息表
注：+代表阳性结果，4号样品出现假阳性结果。
CY2：与拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis sp)(FJ175373.1)同源一致性99％，如SEQ ID NO：1所示。
JN3：与链格孢菌(Alternaria alternata)(JF796073.1)同源一致性99％，如SEQ ID NO：2所示。
JM2：与胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)(KM357285.1)同源一致性99％，如SEQ ID NO：3所示。
LW2：与镰刀菌(Fusarium solani)(JN786598.1)同源一致性99％，如SEQ ID NO：4所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法，包括以下步骤：
步骤1.病原菌的分离
采用组织分离法对草莓根部的病原菌进行分离，切取病健交界处的病组织4-5mm的小块，置于75％乙醇中浸泡5s，接着将病组织移入0.1％升汞溶液中浸泡3-5min，再将病组织转移到无菌水中漂洗3遍，最后将组织移到PDA培养基上，将培养皿放置25℃培养箱中培养3-5d，菌落直径1cm即进行DNA提取实验；
步骤2.病原菌DNA少量提取
1)用灭菌牙签刮取PDA平板上的少量病原菌菌丝，装入2.0ml的离心管中；
2)加入500μl Lysis buffer，1颗破碎珠，多样品组织研磨机研磨60-90s；
3)室温静置10min；
4)13200rpm，室温离心10min，取上清液400μl转入新离心管中；
5)加入800μl无水乙醇，颠倒混匀；-20℃静置10min沉淀DNA；
6)13200rpm，4℃离心5min；
7)沉淀用75％乙醇洗涤，空气中干燥后用50μl ddH2O溶解，上清即为提取的DNA溶液，用于下游PCR模板；
步骤3.设计病原真菌通用引物
上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
步骤4.PCR扩增
PCR反应体系为25μL，反应液为：10×buffer2.5μL，dNTP1μL，引物ITS1和ITS4各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板3μL，ddH2O 16μL，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃总延伸10min；在1％的琼脂凝胶上检测PCR结果，当PCR产物呈现500bp条带，即样本中含有草莓根腐病病原菌，将随机挑选样品CY2、JN3、JM2、LW2PCR产物送往生工生物工程上海股份有限公司测序；
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