CN104845943B - 一种链球菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株宽宿主谱强裂解性链球菌噬菌体(Streptococcus)，该链球菌噬菌体保藏编号为：CCTCC M 2014430，保藏日期为2014年9月19日。本发明提供的链球菌噬菌体具有裂解性强、亲水性好、宿主谱宽等特性，利用纯化后的噬菌体单独或者复配使用可以防治由链球菌引起的奶牛***炎。

Description

一种链球菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种链球菌噬菌体菌株及其应用，特别是一株宽宿主谱、强裂解性链球菌噬菌体及其在防治奶牛***炎中的应用。

背景技术

奶牛***炎是国际性的难题，也是成年奶牛最贵的一个疾病。国外资料报道，***炎的发病率约25-60％，我国调查发现，发病率20-70％。在美国，***炎每年造成的经济损失达20亿美元，在世界范围内，每年的牛奶生产损失约计380万吨。奶牛***炎不仅对奶牛养殖业的经济效益带来巨大损失，而且有些***炎病原菌易产生各种有害产物，引起乳及乳制品污染，对人类健康带来巨大危害。因此，如何防止***炎的发生成为奶牛生产的关键措施。

链球菌属是引起奶牛***炎的重要病原菌。引起奶牛***炎的链球菌属病原体主要为兰氏B群的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、C群停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)以及***链球菌(Streptococcus uberis)，其中无乳链球菌和停乳链球菌是接触传染性病原体，***链球菌是环境致病性病原体。由于致病菌的多样性，耐药菌株的不断产生，链球菌对常用抗生素的耐药性愈来愈强，给防治带来很大的困难。尽管目前抗生素仍然是控制奶牛***炎的主要手段，但单靠抗生素不能从根本上解决奶牛***炎问题，抗生素治疗无效***炎病例越来越多，所以，寻找新型抗菌、杀菌制剂迫在眉睫，探索寻求新的奶牛***炎的治疗方法已成为全世界面临的重要课题。

美国洛克菲勒大学Vincent教授率先开展了采用肺炎链球菌噬菌体及其裂解酶治疗肺炎的研究，这重新开启了细菌性疾病的噬菌体疗法的研究。噬菌体是一类感染细菌的病毒，在自然界中分布广泛，与细菌关系密切，不会引起体内菌群失调或导致目标菌群出现耐药性。在链球菌噬菌体方面，美国针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)噬菌体开展了广泛研究，并获得了多株裂解性噬菌体和部***解酶。Loeffler等在Science杂志上发表的研究表明：其获得的S.pneumoniae噬菌体Dp21的溶壁酶Pal可在30s内使15株S.pneumoniae的CFU降低1×10⁴/mL，其中3株对青霉素有强烈抗性。目前，国内尚未有链球菌噬菌体治疗奶牛***炎的相关报道。鉴于噬菌体对宿主细菌溶解破坏的特异性和噬菌体治疗的诸多优势，因此，噬菌体被认为是治疗奶牛***炎及环境消毒的一种有效手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种宽宿主谱、强裂解性链球菌噬菌体。

本发明还要解决的技术问题是,提供上述噬菌体在防治奶牛***炎中的应用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种链球菌噬菌体，该噬菌体属于肌尾噬菌体科，头部呈正多面体，头部直径约为78nm，尾长约为118nm。将该噬菌体命名为vB_StrM_L1，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址是：武汉市武昌珞珈山，邮编是430072，保藏号：CCTCC M 2014430，分类命名：链球菌噬菌体(Streptococcus phage)，保藏日期为2014年9月19日。

该噬菌体是2014年3月从南京市西岗奶牛场污水中采集得到的，采集人是包红朵，采集者的联系电话是025-84391627。

其中，该噬菌体对无乳链球菌、停乳链球菌、***链球菌和草绿色链球菌具有裂解作用。

上述的链球菌噬菌体在制备防治奶牛***炎试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种药物组合物，该药物组合物包含上述链球菌噬菌体。

其中，将所述的药物组合物制成喷施剂喷洒在牛舍中，控制链球菌的污染，包括将所述的药物组合物喷施在奶牛的体表、奶牛养殖器具、奶牛的养殖环境中。

其中，利用所述的药物组合物对感染链球菌的奶牛进行***药浴，防治奶牛***炎。

其中，利用所述的药物组合物对感染链球菌的奶牛进行***灌注，防治奶牛***炎。

有益效果：

(1)采用噬菌体特异性裂解奶牛***炎链球菌可以杀灭具有多重耐药性的链球菌。

(2)本发明提供的链球菌噬菌体对多种引起奶牛***炎的链球菌致病菌均具有较强的杀灭活性；

(3)本发明提供的噬菌体是一种新型的防治奶牛***炎链球菌致病菌的产品和手段；

(4)经小鼠试验，本发明提供的链球菌噬菌体毒副作用小，安全性高；

(5)链球菌噬菌体具有较好的亲水性，容易配制成喷洒液、药浴液或注射液，对环境或***内的链球菌进行杀灭。

附图说明

图1噬菌体的噬菌斑形态。

图2噬菌体的透射电镜照片。

图3温度对噬菌体活性的影响。

图4pH值对噬菌体活性的影响。

图5噬菌体在培养基中的杀菌效果。

图6噬菌体在奶牛料槽上的杀菌效果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：噬菌体分离及制备。

本发明试验用噬菌体的宿主菌为无乳链球菌标准菌株ATCC12403。

本发明样品采自江苏省南京市西岗奶牛场污水，取上清经双层滤纸过滤，10000rpm离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。取10ml过滤上清，加入0.5ml宿主菌过夜培养物，再加入无菌CaCl₂母液至终浓度1.25mM混匀后，加入20ml THB培养基，室温作用30min，再放置于37℃，待培养至6～8h后，取上述培养物以12000rpm，4℃，离心30min，取上清；再取此上清10ml，加入0.5mL宿主菌过夜培养物，加入无菌CaCl₂母液至终浓度1.25mM混匀后，加入20mLTHB培养基，按上述培养方法培养离心，获得富集的上清；按照以上的试验方法再富集一次，将富集三次的上清用0.22μm滤膜过滤，形成噬菌体原液。

将固体THB平板分为2个区域：吸取宿主菌液0.1ml滴于平板正中央，用涂棒将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取噬菌体原液10μl滴于其中一个区域；待自然晾干后，置于37℃培养箱培养10h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。

如果有空斑形成，证明有噬菌体存在。取噬菌体原液100μl，进行一系列的10倍稀释，取10^-2、10^-4和10^-6稀释液各0.1ml与过夜培养的宿主菌液0.1ml混匀，室温作用15min后，加入约4ml 0.6％LB培养基，混匀后迅速倾倒入THB培养基平板上层，摇匀平置10min，待其凝固，置于37℃温箱培养12h后观察，获得形成单个噬菌斑的双层平板。

实施例2：噬菌体扩增和纯化。

在形成噬菌斑的双层平板上，用移液器的枪头挑取直径较大的单个噬菌斑，接种于3～5mL THB液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液0.1mL，混匀，室温作用15min，37℃培养10～14h，12000rpm，4℃离心10min，取上清，加入0.3％氯仿。如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。

取1mL新鲜培养的宿主菌，加0.3mL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例)。37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mL THB液体培养基，再加入CaCl₂母液至终浓度1.25mM，37℃摇振培养12～16h，12000rpm，4℃离心10min，取上清，得到大量噬菌体裂解液。

在裂解液中加入RNase A、DNaseⅠ至终浓度为1μg/mL，37℃温育30min；加9.3g PEG8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000rpm 10min，去上清液；加2mL SM液，充分洗涤沉淀，室温作用1h；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃5000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化的噬菌体颗粒(图1)。

实施例3：噬菌体透射电镜检测。

取纯化的噬菌体颗粒做电镜观察，加10μl样本滴在铜网上，待其沉淀15min,用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸(PTA)染色1-2min，干燥后透射电镜(日立H-7650)观察。如图2所示，噬菌体属于肌尾噬菌体科，头部呈正多面体，头部直径约为78nm，尾长约为118nm。

实施例4：温度及pH对噬菌体的影响。

取0.1ml 1×10⁸pfu/ml纯化的噬菌体于30℃～90℃水浴分别作用60min，将样品冷却后测其效价；分别取pH3.0～12.0的蛋白胨水和1×10⁸pfu/ml纯化噬菌体等量混合，37℃水浴作用2h后测其效价。

结果如图3所示，噬菌体在30～70℃分别作用1h后，其活性无显著变化；80～90℃作用1h后，无噬菌体存活。

结果如图4所示，在pH为3时，检测不到噬菌体；pH为5.0～10.0时，其效价与初始效价无显著性差异；而当pH为11时，检测不到噬菌体。

实施例5：噬菌体的安全性实验。

6～8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，平均体重25±2g，共40只，购自扬州大学比较医学中心。将小鼠随机分为2组，每组20只；其中一组口服噬菌体vB_StrM_L110⁸pfu/0.25mL/只(实施例2提供)；对照组口服等体积PBS。连续口服14d后，每组脱颈致死5只小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况；每组剩余的15只继续饲喂，每天取其粪便检测噬菌体数量变化。

结果显示，此剂量噬菌体对小鼠健康及日常行为没有影响，解剖检查未见任何异常，且在口服噬菌体结束5天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。

实施例6：噬菌体宿主谱分析。

以实施例2的提供的噬菌体vB_StrM_L1做此实验，将其效价调整为1×10⁸pfu/mL备用。

试验选择3株无乳链球菌标准菌株和40株从患奶牛***炎病牛中分离的多重耐药性链球菌菌株(包括无乳链球菌、草绿色链球菌、停乳链球菌和***链球菌)，对噬菌体的宿主谱进行分析，具体操作如下：取链球菌的过夜培养物100μl，滴加在1.5％THB培养基平板中央，用涂棒将它们涂制成均匀的菌苔。然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域，取10μl噬菌体滴加在菌苔表面，另一个区域滴加10μl生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12～16h，观察结果。

结果如表1所示，该噬菌体对43株链球菌中的26株有裂解作用，裂解率60.46％。说明该噬菌体具有跨种裂解的特性，是一种宽宿主谱的噬菌体。

表1噬菌体的宿主谱分析

实施例7：噬菌体在培养基中的杀菌效果。

取过夜培养的链球菌菌液1.0mL，用LB将其OD_600nm值调整为1.0(约为1×10⁹pfu/mL)，加入噬菌体vB_StrM_L1(效价为1×10⁸pfu/mL)，最后用LB调整其OD_600nm约为0.5左右，于37℃静置培养，同时以不加噬菌体作为对照组。在培养的0、1、2、3、4、5、6、7h检测OD_600nm值的变化。

结果见图5，与细菌对照组相比，噬菌体vB_StrM_L1处理组，1h后，链球菌数量急剧下降，3-4h时链球菌的数量已被控制到较低值，而且，5-7h时OD_600nm接近于0，说明噬菌体vB_StrM_L1在培养基中杀菌迅速而且彻底。

实施例8：噬菌体控制奶牛场环境中的链球菌污染。

将浓度为10⁵cfu/ml的链球菌喷洒在奶牛料槽表面，然后以浓度为10⁸pfu/ml噬菌体vB_StrM_L1对料槽实施喷杀，2h后，开始检测链球菌。

检测结果如图6显示，2h后，料槽表面链球菌的数量降到1000CFU以下，5h后，料槽表面链球菌的数量降到10CFU以下，说明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境中的链球菌。

实施例9：噬菌体控制链球菌奶牛***炎试验。

该试验在南京市西岗奶牛场进行，选取场内12头患隐性奶牛***炎(主要由链球菌引起的)的泌乳期荷斯坦奶牛进行治疗试验。随机分为两组，噬菌体实验组和抗生素对照组，每组6头奶牛。实验组牛用实施例2提供的纯化的噬菌体稀释液(终效价为10⁸pfu/mL)，在每次挤奶前和挤奶后用噬菌体进行***药浴，***药浴每天3次，每次1min，持续使用30天。对照组的牛按照奶牛场常用的抗生素治疗方式进行治疗。治疗期结束后，应用北京***炎试剂(BMT)对受试奶牛的隐性***炎发病率进行统计。

结果如表2所示，试验前后，噬菌体药浴组奶牛隐性***炎的阳性乳区少了11个，发病头数减少了5头；抗生素对照组牛隐性***炎的阳性乳区减少了3个，发病头数减少了2头。实验结果表明，噬菌体对奶牛***炎具有一定的防治效果。

表2隐性***炎的检出率

实施例10：噬菌体控制奶牛饲料中链球菌污染。

将过夜培养的链球菌调整浓度为10⁵cfu/ml，用小型喷雾器(瓶)将1ml菌液均匀喷洒在摊开的100g青贮饲料表面，然后将纯化的噬菌体vB_StrM_L1以1ml 10⁸pfu/ml的浓度实施喷杀，2h后开始检测链球菌。

检测结果显示，在以10⁸pfu/ml浓度实施喷杀后4h，青贮饲料中宿主菌的数量降到1cfu/g以下，说明该噬菌体可以有效杀灭奶牛饲料中污染的链球菌。

Claims (4)

1.一种链球菌噬菌体，其特征在于，该链球菌噬菌体的保藏编号为：CCTCC M 2014430，保藏日期为2014年9月19日。

2.权利要求1所述的链球菌噬菌体在制备防治奶牛***炎药物中的应用。

3.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含权利要求1所述的链球菌噬菌体。

4.权利要求3所述的药物组合物在制备防治奶牛***炎药物中的应用。