CN104845610B - 一种荧光探针及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学领域，特别涉及一种荧光探针及其制备方法、应用。本发明通过三步合成了基于6‑羟基喹啉盐的β‑半乳糖苷酶荧光探针，通过两步合成了基于6‑羟基喹啉盐的脂肪酶荧光探针，极大的降低了其生产成本，同时具有较好的水溶性和荧光检测效果。
Description
技术领域
本发明涉及化学领域，特别涉及一种荧光探针及其制备方法、应用。
背景技术
β-半乳糖苷酶是能够催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖的酶，在肾近曲小管上皮细胞中含量较高。医学上，尿中β-半乳糖苷酶活性可反映肾实质，特别是肾小管的早期损伤。实验室研究中，β-半乳糖苷酶基因(lacZ)常作为报告基因，通过检测β-半乳糖苷酶的表达水平来监测目的基因的表达情况。因此，β-半乳糖苷酶的检测具有重要意义。
目前比较成熟的方法是通过光度法检测。其检测的显色底物包含对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(Biochemical，1960，209)、4-甲基扇形酮基-β-D-半乳糖苷(J Organ Chem，1962，27，1074)、氯酚红基-β-D-半乳糖苷等。光度法检测存在灵敏度低，操作流程复杂等缺点。科研工作者在实验室研究中对细胞中β-半乳糖苷酶检测灵敏度、操作便捷性、检测效果要求较高，常用的分光度法不能很好的满足这些要求。通过荧光检测探针能够很好的满足实验室研究的需求。
β-半乳糖苷酶荧光检测探针的基本原理主要是荧光发色团和半乳糖通过糖苷键结合，在β-半乳糖苷酶作用下将糖苷键切断，荧光发色团的结构发生变化从而产生荧光的变化。通过检测荧光的变化来定性和定量的检测β-半乳糖苷酶。Ralp将DDAO(7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one))荧光染料和半乳糖链接，发现在加入β-半乳糖苷酶后，最大发射波长红移了近50nm，加入荧光探针后，在表达lacZ基因的细胞里和阴性对照细胞有明显的荧光变化(CANCER RESEARCH，2004，64，1579–1583)。Helen合成了基于萤火虫荧光素的荧光探针，在lacZ基因和萤火虫荧光素基因双表达的细胞里加入荧光探针后，发现荧光强度和β-半乳糖苷酶的量成正相关的关系(NATURE METHODS，2006,3，295-301)。Tetsuo Nagano合成了基于荧光共振能量转移的β-半乳糖苷酶荧光探针，在加入酶前后荧光由绿色变成蓝色(J.AM.CHEM.SOC.2006,128,15946-15947)。
现有一些已经商业化生产的荧光探针，其中有一些品牌AATFluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit*Green Fluorescence*，MUGβ-Galactosidase Assay Kit*Fluorimetric*，Beta Galactosidase Detection试剂盒(Fluorometric)等，美国生命技术(Life technologies)公司生产的FluoresceinDi-β-D-Galactopyranoside(FDG)售价达到5毫克3576元人民币。这些荧光探针存在的一个很大的问题就是合成复杂，需要极大的成本，所以售价居高不下。另一个问题是荧光基团的水溶性太差，在正常细胞生理环境下溶解较难。这些因素限制了β-半乳糖苷酶荧光探针的广泛应用。
因此，通过较少的合成步骤，较低的成本制备效果较好的β-半乳糖苷酶荧光探针具有重要社会价值和经济效益。
脂酶，是一种催化脂类的酯键水解反应的水溶性酶，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物(如霉菌、细菌等)组织中，已广泛应用于食品、医药、洗涤剂等行业。特别是在食品行业中得到了大量的应用，并逐渐成为食品领域中应用最为广泛的酶类之一。同时，在医学上血清脂肪酶活性测定可用于胰腺疾病诊断，特别是在急性胰腺炎时，发病后4～8h内血清脂肪酶活性升高，24h达峰值，一般持续8～14天。开发便捷灵敏的脂肪酶检测方法具有重要的意义。
常用的脂肪酶检测有以下几种方法。浊度测定法，在制作琼脂平板时加入脂肪酶的底物及有色指示剂。在琼脂平板上点上待测脂肪酶(打孔加样或滤纸片点样)在脂肪酶水解作用下加样点的周围出现透明圈(R.C.Lawrence，Nature,1967,213，1264-1265)pH测定法，基于脂肪酶水解释放脂肪酸导致反应液p H降低,采用p H电极监测，用标准NaOH进行滴定检测(Tietz NW，Clin Chem.,1989,35，1688-1693)。还有滴定法，免疫学方法(孙艳，江西医学检验,2002,20，382-384)，荧光检测方法等。
脂肪酶荧光检测具有更高的灵敏度和便捷性。ICN医药公司推出一个试剂盒可用于脂肪酸的定量。其测定的基本原理是利用一种哺乳动物的脂蛋白为脂肪酶底物，该脂蛋白与一种acrylodan荧光探针共轭。当没有脂肪酸时该探针在432nm发光,而有脂肪酸存在时该探针在505nm发光(Frederic Beisson，Lipid Sci.Technol.,2000，133-153)。Lavis将荧光素进行修饰，在酶切之前没有荧光，酶切之后将荧光素释放，产生荧光(Chem.Sci.,2011,2,521–530)。Katie R将DDAOG一边接上酯基，在酶切之前没有荧光，酶切后产生荧光(ChemBioChem 2015,16,70-75)。目前商业化的脂肪酶荧光检测试剂有sigama公司的4-Methylumbelliferyloleate，发射在449nm，激发在327nm。美国life science公司的Lipase Substrate,green fluorescent售价达到0.1毫克2819元。这些荧光探针存在的一个很大的问题就是合成复杂，需要极大的成本，所以售价居高不下。另一个问题是荧光基团的水溶性太差，在正常细胞生理环境下溶解较难。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种荧光探针及其制备方法、应用。本发明通过三步合成了基于6-羟基喹啉盐的β-半乳糖苷酶荧光探针，通过两步合成了基于6-羟基喹啉盐的脂肪酶荧光探针，极大的降低了其生产成本，同时具有较好的水溶性和荧光检测效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了6-羟基喹啉及其衍生物在制备荧光探针中的应用。
本发明还提供了一种荧光探针，其结构如式Ⅰ所示：
其中，R1、R2、R3选自
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的荧光探针的结构如式Ⅱ或式Ⅲ所示：
本发明还提供了所述荧光探针在酶检测中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述应用中所述酶为β-半乳糖苷酶和/或脂肪酶。
本发明还提供了所述荧光探针的制备方法，由6-羟基喹啉及其衍生物与酶底物制得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：以四乙酰基-α-D-溴代半乳糖和6-羟基喹啉为原料，在有机溶剂存在的条件下，经无机碱催化，发生反应获得第一产物；
步骤2：在醇类溶剂存在的条件下，以步骤1获得的所述第一产物和甲醇钠反应脱去乙酰基，调节pH值为中性，在有机溶剂中沉淀，获得第二产物；
步骤3：在有机溶剂存在的条件下，取步骤2获得的所述第二产物和碘甲烷反应，即得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中所述有机溶剂为二甲基甲酰胺或异丙醇。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中无机碱为碳酸铯。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中四乙酰基-α-D-溴代半乳糖，6-羟基喹啉和碳酸铯的摩尔比为1:(1～1.5):0.8。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中所述反应的温度为15～35℃，所述反应的时间为10～14h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2中所述醇类溶剂为甲醇。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2中有机溶剂为***或正己烷。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2中步骤1获得的所述第一产物和甲醇钠的摩尔比为1:1～1:3。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤3中所述有机溶剂为二甲基甲酰胺或异丙醇。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤3中步骤2获得的所述第二产物和碘甲烷的摩尔比为1:3～1:10。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤3中所述反应的温度为90～110℃，所述反应的时间为10～15h。
具体的，β-半乳糖苷酶荧光检测探针合成方法包括如下步骤：
第一步以四乙酰基-α-D-溴代半乳糖(CAS：3068-42-4)和6-羟基喹啉(CAS：580-16-5)为原料，溶于二甲基甲酰胺或异丙醇等有机溶剂中，加入碳酸铯15～35℃搅拌10～14h，得到第一步产物。
第二步将上一步产物溶于醇类溶剂，在甲醇钠中脱去乙酰基，在盐酸溶液使中使反应物显中性后在***或正己烷等有机溶剂中沉淀。
第三步将沉淀溶于二甲基甲酰胺或异丙醇等有机溶剂，加入碘甲烷，在100℃下搅拌10～15小时，得到浅黄色固体产物，为β-半乳糖苷酶荧光检测探针。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：在有机溶剂存在的条件下，以十二酰氯、6-羟基喹啉为原料、以三乙胺为催化剂发生反应，获得第一产物；
步骤2：在醇类溶剂存在的条件下，以步骤1获得的所述第一产物和碘甲烷发生反应，在有机溶剂中沉淀，即得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中所述有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中十二酰氯、6-羟基喹啉和三乙胺的摩尔比为1:1.2:1.2。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中所述反应的温度为60～80℃，所述反应的时间为12～18h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2中所述醇类溶剂为异丙醇。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2所述有机溶剂为***。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2所述第一产物和碘甲烷的摩尔比为1:3～1:10。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2所述反应的温度为80～90℃，所述反应的时间为12～18h。
具体的，脂肪酶荧光检测探针合成方法包括如下步骤：第一步以十二酰氯(CAS：112-16-3)和6-羟基喹啉(CAS：580-16-5)为原料，溶于干燥二氯甲烷或三氯甲烷等有机溶剂中，加入三乙胺(CAS：121-44-8)，在60～80℃下搅拌过夜，得到第一步产物，通过色谱柱纯化。将第一步产物和碘甲烷(CAS：74-88-4)在异丙醇等醇类溶剂中80～90℃搅拌过夜，在***等低极性溶剂中沉淀得到终产物。
在进行β-半乳糖苷酶和脂肪酶荧光检测时，选用sigama试剂公司生产的β-Galactosidase from Escherichia coli和猪胰腺脂肪酶,吸收光谱使用北京普析公司的TU-1901紫外-可见分光光度计，荧光检测使用Horiba Scientific公司的FluoroMax-4荧光仪。分别测定两种荧光探针在加入β-半乳糖苷酶/脂肪酶之前和之后的吸收光谱和荧光发射光谱变化，加入β-半乳糖苷酶/脂肪酶后荧光光谱随时间变化以及底物的米氏常数。
本发明提供了一种荧光探针及其制备方法、应用。本发明通过三步合成了基于6-羟基喹啉盐的β-半乳糖苷酶荧光探针，通过两步合成了基于6-羟基喹啉盐的脂肪酶荧光探针，极大的降低了其生产成本，同时具有较好的水溶性和荧光检测效果。
(1)β-半乳糖苷酶荧光检测探针
本发明通过三步合成方法极大的降低了成本，每毫克合成成本不到20元，同时，荧光探针在加入β-半乳糖苷酶后荧光由蓝色变成红色，最大发射从430nm红移到580nm，具有更好的对比效果。本发明中的荧光检测探针由于分子体积小，带正电荷，，荧光探针易溶于去离子水中，所有光谱均在水溶液中测量，具有更好水溶性效果(见图1)，更适应于细胞生理环境下的β-半乳糖苷酶检测。
(2)脂肪酶荧光检测探针
本发明通过两步合成方法极大的降低了成本。同时，荧光探针在加入脂肪酶后荧光由蓝色变成红色，最大发射从430nm红移到580nm,具有更好的对比效果。本发明中的荧光检测探针由于分子体积小，带正电荷，具有更好水溶性效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示荧光探针溶液中加入(左边)和不加(右边)β-半乳糖苷酶后荧光随时间变化图片(365nm激发，pH6.86缓冲液，22～25℃，5分钟)；
图2示荧光探针溶液在加入β-半乳糖酶前后的紫外-可见吸收光谱变化和荧光发射光谱变化(360nm激发，pH6.86缓冲液，22～25℃)；黑色虚线2和蓝色虚线3分别表示在未加入酶之前荧光探针溶液的紫外-可见光吸收和荧光发射光谱；黑色实线1和红色实线4分别表示加入酶之后荧光探针溶液的紫外-可见光吸收和荧光发射光谱；
图3示荧光探针溶液中加入β-半乳糖酶后荧光发射光谱随时间变化(30min,360nm激发，pH6.86缓冲液，25℃)；由左边最高峰的红色到最低的褐色实线依次表示为2分钟(线1)、4分钟(线2)、6分钟(线3)、8分钟(线4)、10分钟(线5)、12分钟(线6)、16分钟(线7)、20分钟(线8)和30分钟(线9)时刻的荧光探针溶液在加入酶后的荧光发射光谱；
图4示荧光底物对半乳糖苷酶的米氏方程酶动力学分析；
图5示荧光探针溶液在加入脂肪酶酶前后的紫外-可见吸收光谱变化和荧光发射光谱变化；(360nm激发，pH6.86缓冲液，25℃)；黑色虚线1和蓝色虚线3分别表示在未加入酶之前荧光探针溶液的紫外-可见光吸收和荧光发射光谱；黑色实线2和红色实线4分别表示加入酶之后荧光探针溶液的紫外-可见光吸收和荧光发射光谱；
图6示荧光探针溶液中加入脂肪酶后荧光发射光谱随时间变化(30min,360nm激发，pH6.86缓冲液，25℃)；由左边最高峰的红色到最低的紫色实线依次表示为2分钟(线1)、4分钟(线2)、8分钟(线3)、10分钟(线4)、16分钟(线5)、20分钟(线6)和30分钟(线7)时刻的荧光探针溶液在加入酶后的荧光发射光谱；
图7示荧光底物对脂肪酶的米氏方程酶动力学分析；
图8示实施例1制备的β-半乳糖酶荧光探针核磁图谱；
图9示实施例1制备的β-半乳糖酶荧光探针质谱图谱；
图10示实施例4制备的脂肪酶荧光探针核磁图谱；
图11示实施例4制备的脂肪酶荧光探针质谱图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种荧光探针及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的荧光探针及其制备方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。所有试剂均购于阿拉丁试剂有限公司，溶剂购于国药试剂。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 β-半乳糖苷酶荧光检测探针的制备
第一步：将1g(2.43mmol)四乙酰基-α-D-溴代半乳糖和0.35g(2.43mmol)6-羟基喹啉溶于15ml二甲基二酰胺中，加入1g(3.07mmol)碳酸铯，在15℃下搅拌10个小时后反应结束。将反应液倒入200ml 0.1M HCl溶液中，用乙酸乙酯萃取，将溶剂真空旋干后使用乙酸乙酯和二氯甲烷(1:1)作为洗脱液通过硅胶色谱柱纯化。得到白色粉末状固体(0.3g)。1HNMR(400MHz,Methanol-d4),δ(TMS,ppm):8.75(dd,J＝4.4,1.7Hz,1H),8.35–8.26(m,1H),7.99(d,J＝9.0Hz,1H),7.58–7.43(m,3H),5.56–5.39(m,3H),5.31(dd,J＝10.3,3.5Hz,1H),4.41(ddd,J＝7.3,6.1,1.2Hz,1H),4.22(dd,J＝6.5,2.2Hz,2H),2.19(s,3H),2.07(s,3H),2.03(s,3H),1.99(s,3H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,476.1512；found,476.1545.反应结构式如下：
第二步：将第一步产物0.2g(0.42mmol)溶于10ml甲醇，加入0.023g(0.42mmol)甲醇钠,在25℃下搅拌10小时。反应结束后加入稀盐酸溶液调至中性，在***中沉淀得到白色固体(0.12g)。将白色粉末状固体全部溶于15ml二甲基二酰胺，加入0.1ml碘甲烷，90℃反应15小时，将反应液在***中沉淀得到白色固体产物(0.05g)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):9.35(d,J＝5.7Hz,1H),9.09(d,J＝8.4Hz,1H),8.53–8.43(m,1H),8.11(dd,J＝8.5,5.7Hz,1H),7.98(d,J＝8.2Hz,2H),5.17(d,J＝7.6Hz,1H),4.62(s,3H),3.81–3.46(m,6H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,323.1324；found,323.1315。反应式如下：
实施例2 β-半乳糖苷酶荧光检测探针的制备
第一步：将1g(2.43mmol)四乙酰基-α-D-溴代半乳糖和0.55g(3.65mmol)6-羟基喹啉溶于15ml二甲基二酰胺中，加入1g(3.07mmol)碳酸铯，在25℃下搅拌14个小时后反应结束。将反应液倒入200ml 0.1M HCl溶液中，用乙酸乙酯萃取，将溶剂真空旋干后使用乙酸乙酯和二氯甲烷(1:1)作为洗脱液通过硅胶色谱柱纯化。得到白色粉末状固体(0.3g)。1HNMR(400MHz,Methanol-d4),δ(TMS,ppm):8.75(dd,J＝4.4,1.7Hz,1H),8.35–8.26(m,1H),7.99(d,J＝9.0Hz,1H),7.58–7.43(m,3H),5.56–5.39(m,3H),5.31(dd,J＝10.3,3.5Hz,1H),4.41(ddd,J＝7.3,6.1,1.2Hz,1H),4.22(dd,J＝6.5,2.2Hz,2H),2.19(s,3H),2.07(s,3H),2.03(s,3H),1.99(s,3H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,476.1512；found,476.1545。
第二步：将第一步产物0.2g(0.42mmol)溶于10ml甲醇，加入0.068g(1.26mmol)甲醇钠,在25℃下搅拌10小时。反应结束后加入稀盐酸溶液调至中性，在***中沉淀得到白色固体(0.13g)。将白色粉末状固体全部溶于15ml二甲基二酰胺，加入0.3ml碘甲烷，110℃反应15小时，将反应液在***中沉淀得到白色固体产物(0.06g)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):9.35(d,J＝5.7Hz,1H),9.09(d,J＝8.4Hz,1H),8.53–8.43(m,1H),8.11(dd,J＝8.5,5.7Hz,1H),7.98(d,J＝8.2Hz,2H),5.17(d,J＝7.6Hz,1H),4.62(s,3H),3.81–3.46(m,6H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,323.1324；found,323.1315。
实施例3 β-半乳糖苷酶荧光检测探针的制备
第一步：将1g(2.43mmol)四乙酰基-α-D-溴代半乳糖和0.47g(3.04mmol)6-羟基喹啉溶于15ml二甲基二酰胺中，加入1g(3.07mmol)碳酸铯，在35℃下搅拌12个小时后反应结束。将反应液倒入200ml 0.1M HCl溶液中，用乙酸乙酯萃取，将溶剂真空旋干后使用乙酸乙酯和二氯甲烷(1:1)作为洗脱液通过硅胶色谱柱纯化。得到白色粉末状固体(0.33g)。1HNMR(400MHz,Methanol-d4),δ(TMS,ppm):8.75(dd,J＝4.4,1.7Hz,1H),8.35–8.26(m,1H),7.99(d,J＝9.0Hz,1H),7.58–7.43(m,3H),5.56–5.39(m,3H),5.31(dd,J＝10.3,3.5Hz,1H),4.41(ddd,J＝7.3,6.1,1.2Hz,1H),4.22(dd,J＝6.5,2.2Hz,2H),2.19(s,3H),2.07(s,3H),2.03(s,3H),1.99(s,3H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,476.1512；found,476.1545。
第二步：将第一步产物0.2g(0.42mmol)溶于10ml甲醇，加入0.045g(0.84mmol)甲醇钠,,在25℃下搅拌10小时。反应结束后加入稀盐酸溶液调至中性，在***中沉淀得到白色固体(0.125g)。将白色粉末状固体全部溶于15ml二甲基二酰胺，加入0.2ml碘甲烷，100℃反应12.5小时，将反应液在***中沉淀得到白色固体产物(0.05g)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):9.35(d,J＝5.7Hz,1H),9.09(d,J＝8.4Hz,1H),8.53–8.43(m,1H),8.11(dd,J＝8.5,5.7Hz,1H),7.98(d,J＝8.2Hz,2H),5.17(d,J＝7.6Hz,1H),4.62(s,3H),3.81–3.46(m,6H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,323.1324；found,323.1315。
实施例4 脂肪酶荧光检测探针
将十二酰氯2.3g(10.51mmol)和6-羟基喹啉1.5g(10.34mmol)溶解在50ml干燥的二氯甲烷中，缓慢加入三乙胺1.2g(11.88mmol)。在60℃下搅拌12小时。将粗产物用色谱柱纯化(乙酸乙酯：石油醚＝2：1)，得到褐色固体产物2.63g。将上一步产物0.9g(2.75mmol)和碘甲烷1g(7.04mmol)溶于15ml异丙醇，在90℃下搅拌12小时，将粗产物在***中沉淀，得到终产物。1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):9.50(d,J＝5.7Hz,1H),9.24(d,J＝8.4Hz,1H),8.60(d,J＝9.5Hz,1H),8.30(d,J＝2.6Hz,1H),8.20(dd,J＝8.5,5.7Hz,1H),8.14(dd,J＝9.6,2.6Hz,1H),4.65(s,3H),2.72(t,J＝7.4Hz,2H),1.70(p,J＝7.4Hz,2H),1.45–1.20(m,16H),0.93–0.81(m,3H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,343.2467；found,343.2453。反应式如下:
实施例5 脂肪酶酶荧光检测探针
将十二酰氯2.3g(10.51mmol)和6-羟基喹啉1.5g(10.34mmol)溶解在50ml干燥的二氯甲烷中，缓慢加入三乙胺1.2g(11.88mmol)。在80℃下搅拌18小时。将粗产物用色谱柱纯化(乙酸乙酯：石油醚＝2：1)，得到褐色固体产物2.70g。将上一步产物0.9g(2.75mmol)和碘甲烷3.88g(27.5mmol)溶于15ml异丙醇，在80℃下搅拌18小时，将粗产物在***中沉淀，得到终产物。1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):9.50(d,J＝5.7Hz,1H),9.24(d,J＝8.4Hz,1H),8.60(d,J＝9.5Hz,1H),8.30(d,J＝2.6Hz,1H),8.20(dd,J＝8.5,5.7Hz,1H),8.14(dd,J＝9.6,2.6Hz,1H),4.65(s,3H),2.72(t,J＝7.4Hz,2H),1.70(p,J＝7.4Hz,2H),1.45–1.20(m,16H),0.93–0.81(m,3H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,343.2467；found,343.2453。
实施例6 脂肪酶酶荧光检测探针
将十二酰氯2.3g(10.51mmol)和6-羟基喹啉1.5g(10.34mmol)溶解在50ml干燥的二氯甲烷中，缓慢加入三乙胺1.2g(11.88mmol)。在70℃下搅拌15小时。将粗产物用色谱柱纯化(乙酸乙酯：石油醚＝2：1)，得到褐色固体产物2.60g。将上一步产物0.9g(2.75mmol)和碘甲烷2.71g(19.25mmol)溶于15ml异丙醇，在80℃下搅拌16小时，将粗产物在***中沉淀，得到终产物。1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):9.50(d,J＝5.7Hz,1H),9.24(d,J＝8.4Hz,1H),8.60(d,J＝9.5Hz,1H),8.30(d,J＝2.6Hz,1H),8.20(dd,J＝8.5,5.7Hz,1H),8.14(dd,J＝9.6,2.6Hz,1H),4.65(s,3H),2.72(t,J＝7.4Hz,2H),1.70(p,J＝7.4Hz,2H),1.45–1.20(m,16H),0.93–0.81(m,3H).质谱HRMS(ESI+):calcd for[M+H]+,343.2467；found,343.2453。
实施例7 β-半乳糖苷酶荧光检测探针
选用实施例1制备的β-半乳糖苷酶荧光探针进行β-半乳糖苷酶荧光检测时，选用sigama试剂公司生产的β-Galactosidase from Escherichia coli，吸收光谱使用北京普析公司的TU-1901紫外-可见分光光度计，荧光检测使用Horiba Scientific公司的FluoroMax-4荧光仪。测定荧光探针在加入β-半乳糖苷酶之前和之后的吸收光谱和荧光发射光谱变化，加入β-半乳糖苷酶后荧光光谱随时间变化以及底物的米氏常数。
如图1所示荧光探针溶液中加入(左边)和不加(右边)β-半乳糖苷酶后荧光随时间变化图片(365nm激发，pH6.86缓冲液，25℃,5分钟)。左边为加入β-半乳糖苷酶的荧光探针溶液，右边为未加入β-半乳糖苷酶的荧光探针溶液。在5分钟内，荧光发生明显的变化，由蓝色变成红色。在普通紫外灯激发下，能够产生明显的对比效果，具有响应快、肉眼易观察的优良性质。
如图2所示荧光探针溶液在加入β-半乳糖酶前后的紫外-可见吸收光谱变化和荧光发射光谱变化。(360nm激发，pH6.86缓冲液，25℃)
可以从吸收和发射光谱发现，在加入酶后，酶将荧光探针的底物和荧光发色团切断。最大发射波长从430nm红移到588nm,所以产生了偏红色荧光。吸收光谱向右红移了一部分。
如图3所示荧光探针溶液中加入β-半乳糖酶后荧光发射光谱随时间变化(30min,360nm激发，pH6.86缓冲液，25℃)；荧光探针溶液中加入β-半乳糖酶后，荧光发射光谱随着时间的变化在30分钟内基本完成。可以通过发射光谱的变化直观的观测到酶切的生化过程。
如图4所示荧光底物对半乳糖苷酶的米氏方程酶动力学分析。结果如下：
本发明合成的荧光探针底物在测量条件下酶切的最大速度达到2.64nM/S-1，米氏常数为5.07μM。
选用实施例2、实施例3制备的β-半乳糖苷酶荧光探针进行β-半乳糖苷酶荧光检测，结果与实施例1制备的β-半乳糖苷酶荧光探针进行β-半乳糖苷酶荧光检测结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
综合上述试验结果表明，本发明通过三步合成方法极大的降低了成本，每毫克合成成本不到20元，同时，荧光探针在加入β-半乳糖苷酶后荧光由蓝色变成红色，最大发射从430nm红移到580nm,具有更好的对比效果。本发明中的荧光检测探针由于分子体积小，带正电荷，具有更好水溶性效果，更适应于细胞生理环境下的β-半乳糖苷酶检测。
AAT Bioquest和SensoLyte公司开发的β-半乳糖苷酶检测试剂盒采用的荧光探针最大荧光发射波长分别在514nm和460nm，为蓝绿色，由于波长较短，检测过程中的背景光很容易对检测效果造成影响。美国生命技术(Life technologies)公司生产的FluoresceinDi-β-D-Galactopyranoside(FDG)，合成步骤复杂，售价达到5毫克3576元人民币,其荧光探针激发/发射波长为490nm/514nm，发蓝绿色光。
实施例8 脂肪酶荧光检测探针
选用实施例4制备的脂肪酶荧光探针进行脂肪酶荧光检测时，选用sigama试剂公司生产的猪胰腺脂肪酶，吸收光谱使用北京普析公司的TU-1901紫外-可见分光光度计，荧光检测使用Horiba Scientific公司的FluoroMax-4荧光仪。测定荧光探针在加入脂肪酶之前和之后的吸收光谱和荧光发射光谱变化，加入脂肪酶后荧光光谱随时间变化以及底物的米氏常数。
如图5所示荧光探针溶液在加入脂肪酶酶前后的紫外-可见吸收光谱变化和荧光发射光谱变化(360nm激发，pH6.86缓冲液，25℃)；
可以从吸收和发射光谱发现，在加入酶后，酶将荧光探针的底物和荧光发色团切断。最大发射波长从415nm红移到588nm,所以产生了偏红色荧光。吸收光谱在350nm处，有了一处新的吸收峰，说明脂肪酶将底物切断，将发色团释放出来。
如图6所示荧光探针溶液中加入脂肪酶后荧光发射光谱随时间变化(30min,360nm激发，pH6.86缓冲液，25℃)；
荧光探针溶液中加入脂肪酶后，荧光发射光谱随着时间的变化在30分钟内基本完成。可以通过发射光谱的变化直观的观测到酶切的生化过程。
如图7所示荧光底物对脂肪酶的米氏方程酶动力学分析。具体如下：
本发明合成的荧光探针底物在测量条件下酶切的最大速度达到4.24nM/S-1，米氏常数为7.56μM。
选用实施例5、实施例6制备的脂肪酶荧光探针进行脂肪酶荧光检测，结果与实施例4制备的脂肪酶荧光探针进行脂肪酶荧光检测结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
综合上述试验结果表明，本发明通过两步合成方法极大的降低了成本。同时，荧光探针在加入脂肪酶后荧光由蓝色变成红色，最大发射从4300nm红移到580nm,具有更好的对比效果。本发明中的荧光检测探针由于分子体积小，带正电荷，具有更好水溶性效果。
sigama公司的4-Methylumbelliferyloleate，发射在449nm,激发在327nm。美国life science公司的Lipase Substrate,green fluorescent售价达到0.1毫克2819元，其荧光探针激发/发射波长为507nm/515nm,发蓝绿色光。这些荧光探针存在的一个很大的问题就是合成复杂，需要极大的成本，所以售价居高不下。同时激发波长和发射波长相差小，发射蓝绿色光，生物发光很可能产生蓝绿色背景光度检测造成影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种荧光探针，其特征在于，其结构如式Ⅰ所示：
其中，R1、R2、R3选自
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，其结构如式II或式Ⅲ所示：
3.根据权利要求1或2所述的荧光探针在酶检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酶为β-半乳糖苷酶和/或脂肪酶。
5.根据权利要求1或2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，由6-羟基喹啉及其衍生物与酶底物制得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：以四乙酰基-α-D-溴代半乳糖和6-羟基喹啉为原料，在有机溶剂存在的条件下，经无机碱催化，发生反应获得第一产物；
步骤2：在醇类溶剂存在的条件下，以步骤1获得的所述第一产物和甲醇钠反应脱去乙酰基，调节pH值为中性，在有机溶剂中沉淀，获得第二产物；
步骤3：在有机溶剂存在的条件下，取步骤2获得的所述第二产物和碘甲烷反应，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述反应的温度为90～110℃，所述反应的时间为10～15h。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：在有机溶剂存在的条件下，以十二酰氯、6-羟基喹啉为原料、以三乙胺为催化剂发生反应，获得第一产物；
步骤2：在醇类溶剂存在的条件下，以步骤1获得的所述第一产物和碘甲烷发生反应，在有机溶剂中沉淀，即得。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述反应的温度为80～90℃，所述反应的时间为12～18h。
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