CN104838017B - 高分辨率解链的改进校准 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在高分辨率解链PCR实验中进行温度校准的方法和试剂盒。本发明进一步涉及用于最优校准的方法，其允许靶物和校准物的相同或相似解链温度的读出。本发明进一步涉及用于实施所述方法的仪器和执行所述方法的计算机程序。
Description
发明背景
本发明涉及用于在高分辨率解链PCR实验中进行温度校准的方法或试剂盒。本说明书进一步涉及用于最优校准的方法，其允许靶物和校准物的相同或相似解链温度的读出。本说明书进一步涉及用于实施所述方法的仪器和执行所述方法的计算机程序。
高分辨率解链(high resolution melting,HRM)是一种在PCR扩增后检测靶序列中未知核酸变异的方法。与传统方法例如变性梯度凝胶电泳(DGGE)相比，HRM提供用于突变扫描的几个优势。这些优势包括较低的试剂和样品消耗，较少的优化步骤以及在单次实时定量PCR中可执行的封闭测试形式。
在能够非共价结合双链核酸的特殊荧光DNA结合染料(例如480Resolight染料，Roche Applied Science，目录号04909640001)的存在下，对长达约250个碱基对的靶序列PCR扩增后，加入生成的扩增子的HRM步骤。因为所述荧光非共价双链DNA结合染料不抑制PCR，所以其可以以饱和浓度加到扩增反应中。在HRM步骤中，所述荧光非共价双链DNA结合染料被释放，且可以检测到野生型、纯合子和杂合子突变体之间关于扩增子解链图谱的差异(Reed GH,Kent JO,Wittwer CT(2007),Pharmacogenomics 8(6):597-608；Wittwer CT(2009),Hum.Mutat.30(6):857-859；Wittwer等，美国专利号7,582,429)。
根据点突变的类型，观察到的解链温度差异可能非常小。单核苷酸多态性(SNPs)通常导致解链温度在约1.0℃(对于1类SNPs(C/T和G/A碱基改变)和2类SNP(C/A和G/T碱基改变))、约0.5℃(对于3类SNPs(C/G碱基改变))和约0.2℃(对于4类SNPs(A/T碱基改变)为约0.2℃)之间的变化。与野生型相比，杂合子突变通常表现出不同的荧光解链图谱(解链曲线形状)，而纯合子突变通常导致与野生型非常相似的解链图谱，且仅能通过较小的温度变化区分。
关于HRM的现有技术展现出如本文下面所述的几个缺点。为了检测解链温度中的小差异，要求测量***极高的温度精度。实时PCR仪器通常设计为基于模块的***，其使用Peltier元件进行精确温度控制。然而，所述温度控制受制于物理限制，其由例如温度传感器的校准、Peltier元件的控制以及微孔板个体和加热模块底座的几何契合所导致。这些限制通常导致在加热模块中最热和最冷位置之间观察到的0.5-1.0℃的温度范围。因此，反应体积中的温度控制不允许在纯合突变体与其野生型相比具有非常相似的特征性解链图谱(profile)的HRM实验中区分较小的温度变化。
为了修正在基于模块的热循环仪的所有位置处不均匀的温度分布，目前建立了两种不同的方法：
在于特定的仪器上实施HRM实验之前，使用特殊的校准板来执行分开的温度校准运行。将所有位置的所述模块特异性温度数据保存于所述仪器的软件中，并随后用于HRM实验来修正所有位置的温度差异。这种方法建立用于例如Applied Biosystems 7500和7900HT实时PCR***(例如HRM Calibration Plate，目录号PN4425618)和Biorad CFX实时PCR***(例如Melt Calibration Kit，目录号184-5020)。
所述校准方法的缺点在于，当实施分开的温度校准运行时，温度不均一的实验特异性原因无法被修正。这些包括微孔板个体在加热模块底座中的不同契合，以及从底座到板和反应体积的温度传递中相关的差异。此外，例如由不同的离子强度(由纯化方法或样品材料导致的)导致的不同反应条件影响观察到的解链温度。另外，Peltier模块的热老化不能通过此方法补偿。
1)在HRM试验中，内部的温度校准物被加到每一个反应中。所述温度校准物由未标记的双链寡核苷酸组成，其采用低于或高于所述靶序列的预期解链温度的解链温度，并使用在反应中存在的荧光非共价双链DNA结合染料来检测。基于测量到的孔与孔之间校准物的温度差异，修正检测到的目标温度。这一方法建立用于例如Idaho Technology的仪器(High Sensitivity Master Mix，目录号HRLS-ASY-0008)。
温度校准物方法的缺点：对未标记的内部温度校准物的检测基于用于靶突变检测的相同荧光非共价双链DNA结合染料的释放。因此所述目标解链温度必须与校准物解链不重叠。这将扩增子的大小限制到约40-120个碱基对的范围。此外，根据靶物的G/C含量，所述扩增子长度必须优化到适合于允许的解链温度范围。另外，所述扩增子解链的荧光亮度必须不能胜过并因此遮盖内部校准物信号。荧光亮度强烈依赖于产生的PCR产物的量。因此，在执行HRM实验之前，对于每一个靶物，开始核酸材料的量和引物的浓度必须优化。
本说明书的目的是提供用于HRM的方法，其不显示上述缺点。
发明概要
本说明书的第一个方面涉及用于PCR实验中温度校准的方法，其中所述方法包括以下步骤a)在多孔板的每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其包含荧光非共价双链DNA结合染料，b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，c)在每一个孔中扩增所述特定靶核酸，d)在每个孔中解链所述特定靶核酸从而导致自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少，其通过供体生色团和接受体生色团的空间分离进行，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少，在每个孔中监控所述扩增的特定靶核酸的解链温度值，并分开地通过检测自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少，在每个孔中监控所述双链寡核苷酸的解链温度，f)基于所述双链寡核苷酸解链温度值的孔与孔差异，对于每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值。
本说明书的第二个方面涉及用于实施在上述PCR实验中的温度校准的试剂盒，其中所述试剂盒包含a)用于在样品中扩增特定靶核酸序列所有的必要试剂，b)荧光非共价双链DNA结合染料，c)双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链。
本说明书的第三个方面涉及用于实施在上述PCR实验中的温度校准的反应混合物，其中所述反应混合物包含a)靶核酸序列，b)用于扩增特定靶核酸序列的所有的必要试剂，c)荧光非共价双链DNA结合染料，以及d)双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链。
本说明书的第四个方面涉及用于在上述PCR实验中实行温度校准的仪器。
本说明书的第五个方面涉及用于执行在上述PCR实验中温度校准的方法的计算机程序。
附图说明
图1：本图显示了实施例1中32种野生型、32种杂合突变体和32种纯合突变体在不使用校准物时的标准化解链曲线。所述实验在带有热学未校准的PCR模块的仪器上进行。
图2：本图显示了实施例1中32种野生型、32种杂合突变体和32种纯合突变体在使用校准物时的标准化解链曲线。所述实验在带有热学未校准的PCR模块的仪器上进行。
图3：本图显示了实施例1中，六个基因型变体在不使用校准物时的标准化解链曲线。所述实验在带有热学预校准的PCR模块的仪器上进行。
图4：本图显示了实施例1中，六个基因型变体在使用校准物时的标准化解链曲线。所述实验在带有热学预校准的PCR模块的仪器上进行。
发明详述
下述定义用来说明和限定本文所用各种术语的含义和范围。
术语“一个”、“一种”和“所述”除非上下文另有清晰说明，一般包括复数形式。
术语“扩增子”一般指代选择的扩增产物，其通过一组特定的正向和反向引物扩增，例如那些通过本领域中已知扩增技术生产的。
术语“扩增”一般指代从靶核酸产生复数核酸分子，其中引物杂交到所述靶核酸分子上的特定位点来提供用于聚合酶延伸的起始位点。扩增可以通过任何本领域众所周知的方法实现，其诸如但不限于：标准PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、RT-PCR和恒温扩增。
术语“校准物”或“温度校准物”用于本文指代携带FRET对的双链寡核苷酸，在所述双链寡核苷酸解链时，可以检测到FRET对的一个配对物的发射波长。所述校准物用于高分辨率解链实验从而确定在多孔板的孔中的温度差异，其由例如携带所述多孔板的加热模块不规则或多孔板个体和加热模块底座的几何契合所导致。所述温度差异基于发射放射的变化，通过精确测量校准物的解链温度确定。所述变化是强度变化(减少或增加)。
术语“互补”一般指代两个核苷酸的碱基之间在合适的温度和离子缓冲条件下形成有利的热力学稳定性和特异性配对的能力。这种配对依赖于每个核苷酸的氢键特性。最基本的例子是胸腺嘧啶/腺嘌呤和胞嘧啶/鸟嘌呤碱基之间的氢键对。在本说明书中，用于扩增靶核酸的引物可以是在其整个长度与靶核酸分子完全互补，或“半互补”，其中所述引物包含另外的，最少或不能杂交到所述靶核酸的非互补序列。
术语“染料”用于概括所有种类的光吸收分子，因此包含荧光染料、非荧光染料和淬灭剂分子。淬灭剂分子能够淬灭荧光染料的荧光，因为其能够被荧光激发，并例如通过热分发能量。非荧光染料是与传统的荧光染料相反，基本没有荧光发射的染料。
术语“荧光非共价双链DNA结合染料”指代一种生色团，其能够结合双链DNA，并实现qPCR实验中DNA形成和解链分析中解离的测量。所述荧光非共价双链DNA结合染料当结合双链DNA时，以某一波长光的形式发射放射。如果所述双链DNA的两条互补链解离，例如在解链实验中，则放射的发射减少。
术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“福斯特(Foerster)共振能量转移”可以交换使用，指代在至少两个生色团(一个供体生色团和一个接受体生色团)之间的能量转移。当所述供体被合适波长的光放射激发时，供体生色团通常将能量转移到所述受体。所述受体通常以不同波长的光放射的形式再发射转移的能量。当所述受体是“暗”淬灭剂时，其以不同于光的形式散去转移的能量，例如以热的形式。通常使用的“暗”淬灭剂包括BlackHoleQuenchersTM(BHQ),(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.)，Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)，以及BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。
术语“杂交”一般指代不同核酸分子之间与其核苷酸序列一致的碱基配对。术语“杂交”和“退火”可以交换使用。
术语“多孔板”用于本文如本领域的技术专家所知的，指代用于平行分析一个或多个样品的物理、化学或生物学特性的板。多孔板包含96、384、1536或3467个分开的孔。该术语也包括其它类型的反应设备例如8-孔条。
在本发明背景中的术语“突变体”表示多核苷酸，其相对于对应的、天然存在的或未修饰的核酸，包含一个或多个碱基替代。
术语“核酸”或“多核苷酸”可以交换使用，指代可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)多聚物，或其类似物的多聚物。这包括核苷酸的多聚物例如RNA和DNA，以及其合成形式，修饰(例如化学或生物化学修饰)形式，以及混合多聚物(例如包含RNA和DNA亚基两者)。示例性修饰包括甲基化，使用类似物替代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰例如不带电连接(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)，侧基部分(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，以及修饰的连接(例如alpha异头核酸等)。也包括模拟多核苷酸通过氢键和其它化学相互作用结合特定序列的能力的合成分子。典型的，所述核苷酸单体通过磷酸二酯键相连，虽然合成形式的核酸可以包含其它连接(例如肽核酸描述于Nielsen等，(Science 254:1497-1500,1991))。核酸可以是或可以包括例如染色体或染色体片段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA多聚物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针、和引物。核酸可以是，例如单链的，双链的，或三链的，并不受限于任何具体长度。除非另有说明，除了任何明确指明的序列外，具体的核酸序列包含或编码互补序列。
术语“寡核苷酸”指代包括至少两个核酸单体单元(例如核苷酸)的核酸。寡核苷酸典型的包括从约6到约175个核酸单体单元，更典型的从约8到约100个核酸单体单元，还更典型的从约10到约50个氨基酸单体单元(例如约15个、约20个、约25个、约30个、约35个或更多的核酸单体单元)。寡核苷酸的准确长度将依赖于多个因素，包括所述寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任选的通过任何合适的方法制备，包括但不限于从存在的或天然的序列中分离，DNA复制或扩增，逆转录，适当序列的克隆和限制性消化，或直接化学合成，其通过例如Narang等的磷酸三酯方法(Meth.Enzymol.68:90-99,1979)；Brown等的磷酸二酯方法(Meth.Enzymol.68:109-151,1979)；Beaucage等的二乙基亚氨基磷酸酯(diethylphosphoramidite)方法(Tetrahedron Lett.22:1859-1862,1981)；Matteucci等的三酯方法(J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191,1981)；自动化合成方法；或美国专利号4,458,066的固相支持方法，或本领域技术人员已知的其它方法。
术语“引物”一般指代寡核苷酸，其能够退火，或杂交到核酸序列，并在充分的条件下(缓冲液、dNTPs、聚合酶、单价和双价盐、温度等)允许引物互补的核酸的延伸。
术语“qPCR”一般指代被称为实时定量聚合酶链式反应、定量聚合酶链式反应或动态聚合酶链式反应的PCR技术。这种技术使用PCR同时扩增和量化靶核酸，其中所述量化是凭借嵌入的荧光染料或含有仅在杂交到靶核酸后可检测到的荧光报告分子的序列特异性探针。
术语“反应混合物”用于本文如本领域的技术专家所知，指代包含多种用于扩增一个或多个靶核酸的试剂的水性溶液，包括酶、水性缓冲液、盐、引物、靶核酸以及核苷三磷酸。所述反应混合物可以是完全的或不完全的扩增反应混合物。
本文描述了用于PCR实验中温度校准的方法，其克服了已知温度校准方法的限制。在使用根据本说明书的方法的HRM实验中，使用双链寡核苷酸作为温度校准物，将其加到多孔板中的每一个反应中。所述双链寡核苷酸(本文也指代为“温度校准物”或“校准物”)带有FRET对，在所述双链寡核苷酸解链时，可以检测到FRET对的一个配对物的发射波长。基于所述双链寡核苷酸解链温度值的孔与孔之间的差异，将检测到的所述双链寡核苷酸的解链温度值接下来用于修正多孔板每个孔的扩增的特定靶核酸的解链温度值。
本说明书涉及用于PCR反应中温度校准的方法，其中所述方法包括步骤a)在多孔板每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其包含荧光非共价双链DNA结合染料；b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，c)在每个孔中扩增所述特定靶核酸，d)在每个孔中解链所述扩增的特定靶核酸从而导致来自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自所述供体生色团的放射发射增加或自所述接受体生色团的放射发射减少，其通过空间分离供体生色团和接受体生色团进行，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少，在每个孔中监控所述扩增的特定靶核酸的解链温度值，并通过检测自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少，在每个孔中分别监控所述双链寡核苷酸的解链温度值，f)基于所述双链寡核苷酸解链温度值的孔与孔之间的差异，对于每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度。
在一个实施方案中，所述特定靶核酸包含单核苷酸多态性(SNP)。在另一个实施方案中，所述特定靶核酸包含多于一个SNP。SNP是不同样品中对应核酸片段之间的点突变。与不显示出相同SNP的另外一个样品(例如参考样品)相比，这种SNP将样品中所包含的核酸片段的解链温度改变一个确定的值。带有或不带有SNP的对应片段之间解链温度的差异通常非常小并依赖于点突变的类型。SNP典型的导致对应片段之间解链温度0.2℃到1.0℃的变化。所述解链温度的变化i)对于1类SNPs(C/T和G/A碱基改变)和2类SNPs(C/A和G/T碱基改变)为约1.0℃，ii)对于3类SNPs(C/G碱基改变)为约0.5℃，iii)对于4类SNPs(A/T碱基改变)为约0.2℃。温度的变化用于本说明书来确定与另一个样品(例如参考样品)中对应靶核酸相比，SNP在所述特定靶核酸中的存在。
所述供体生色团共价结合于所述双链寡核苷酸第一条链中的位置，所述接受体生色团共价结合于所述双链寡核苷酸第二条链中的位置，使得第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置彼此紧密靠近。所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链的位置，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的位置，使得第一条链中的所述位置与第二条链中的所述位置处于相反的排列。所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链的3’端，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链的5’端，使得第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置处于相反的排列。所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链的5’端，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链的3’端，使得第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置处于相反的排列。
在一个实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸彼此分隔不超过两个碱基对。
在另一个实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸形成互补碱基对。
在一个具体的实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链的5’端，且所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链的3’端，或所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链的3’端，且所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链的5’端。
荧光非共价双链DNA结合染料是本领域众所周知的。这些荧光非共价双链DNA结合染料例如LCIdaho Technology；或BioRad。在一个具体的实施方案中，所述荧光非共价双链DNA结合染料是480Resolight染料。
在一个实施方案中，所述供体生色团是荧光染料，例如VIC、Hex、Yellow555、Red610、Red640、Texas Red、Rox、Cy5或Cy5.5。在一个具体的实施方案中，所述供体生色团是Cy5。
在一个具体的实施方案中，所述荧光非共价DNA结合染料的放射波长和所述供体生色团或所述接受体生色团的放射波长彼此分开，使得能够不依赖其解链温度检测到两个解链事件。这具有即使所述靶核酸和所述双链寡核苷酸的解链温度相同或至少非常相似时，所述荧光非共价双链DNA结合染料的发射波长和所述供体生色团或所述接受体生色团的发射波长能够被区分的优势。
在一个实施方案中，所述接受体生色团是淬灭剂分子，例如BlackHoleQuenchersTM(BHQ),(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.),Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa),和BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。在一个具体的实施方案中，所述淬灭剂分子是选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和BHQ-4的暗淬灭剂。在一个更具体的实施方案中，所述淬灭剂分子是BHQ-3。
在一个实施方案中，所述供体生色团是共价结合的荧光染料，所述接受体生色团是共价结合的淬灭剂分子。如果在所述双链寡核苷酸两条互补链彼此杂交的情况下，所述荧光染料和所述淬灭剂分子彼此非常接近，则当使用某个波长照射荧光染料时，从荧光染料发射的能量(光)被转移到淬灭剂分子，其将能量转换为热且可测量到没有或很少的荧光染料发射的放射。如果所述双链寡核苷酸的两条互补链当解链时互相分离，则所述荧光染料和所述淬灭剂分子彼此空间上分离。在这种情况下，当使用某个波长照射所述荧光染料，从荧光染料发射的放射不能被转移到所述淬灭剂分子且能够测量到荧光染料发射放射的增加。因此，通过测量所述荧光染料发射放射的增加，可以精确测定所述双链寡核苷酸的两条互补链的解链温度。
在另一个实施方案中，所述供体生色团是第一共价结合荧光染料，所述接受体生色团是第二共价结合荧光染料。如果在所述双链寡核苷酸两条互补链彼此杂交的情况下，所述第一共价结合荧光染料和所述第二共价结合荧光染料彼此非常接近，则当使用某个波长照射第一共价结合荧光染料时，第一共价结合荧光染料发射的能量(光)被转移到第二共价结合荧光染料，其转变能量并从第二共价结合荧光染料发射某个波长的放射。如果所述双链寡核苷酸的两条互补链解链，所述第一共价结合荧光染料和所述第二共价结合荧光染料彼此空间分离。在这种情况下，当使用某个波长照射所述第一共价结合荧光染料时，第一共价结合荧光染料发射的放射不再能够被转移到所述第二共价结合荧光染料，且可以测量到第一共价结合荧光染料的发射放射增加，以及第二共价结合荧光染料的发射放射减少。因此，通过测量所述第一共价结合荧光染料发射的放射的增加和/或所述第二共价结合荧光染料发射的放射的减少，可以精确测定所述双链寡核苷酸的两条互补链的解链温度。
在一个实施方案中，所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的至少一部分解链温度值与所述扩增的特定靶核酸的至少一部分解链温度值相同。在另一个实验方案中，所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度值与所述扩增的特定靶核酸的解链温度值相同。在另一个实施方案中，所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不超过10℃。在一个具体的实施方案中，所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不超过5℃。在另一个具体的实施方案中，所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不超过2℃。通过选择所述荧光非共价双链DNA结合染料和所述供体生色团使得其发射不同波长的放射，所述双链寡核苷酸可以被设计为使得所述靶核酸和所述双链寡核苷酸的解链温度相同或至少非常相似。因此在一个实施方案中，所述双链寡核苷酸被设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相同。
所述双链寡核苷酸的供体生色团(例如Cy5)的激发和发射波长与所述荧光非共价双链DNA结合染料(例如480Resolight染料)的激发和发射波长不同。所述双链寡核苷酸的解链可以在与所述荧光非共价双链DNA结合染料检测波长不同的波长范围被检测到。结果，所述校准物的解链温度可能和所述靶物的解链温度重叠。这允许设计两者的解链温度紧密靠近，使得能够在恰好相关的温度校准。由于多孔板中位置和位置之间的温度差异在应用于HRM的温度范围内是不恒定的，提供能够测量所述双链寡核苷酸和所述靶核酸相同的解链温度的校准方法具有特殊的优势。此外，由于所述靶核酸的解链温度和荧光强度不影响从所述双链寡核苷酸检测到的信号，不需要优化所述靶核酸的量或所述引物的浓度来产生不遮盖所述双链寡核苷酸信号的受限的产物量。
所述双链寡核苷酸组成为两条互补的链：所述双链寡核苷酸的第一条链和所述双链寡核苷酸的第二条链。在一个实施方案中，所述第一条链和所述第二条链各自包含10到40个核苷酸。在一个具体的实施方案中，所述第一条链和所述第二条链各自包含20到30个核苷酸。在一个甚至更具体的实施方案中，所述第一条链和所述第二条链各自包含25个核苷酸，
在一个实施方案中，所述第一条链的5’端共价结合供体生色团，例如Cy5，所述第一条链的3’端被磷酸化。所述第二条链的3’端共价结合暗淬灭剂，例如BHQ-3。在另一个实施方案中，所述第二条链的5’端共价结合供体生色团，例如Cy5，所述第二条链的3’端被磷酸化。所述第一条链的3’端共价结合暗淬灭剂，例如BHQ-3。
在一个具体的实施方案中，所述第一条链(SEQ ID NO:01)和所述互补的第二条链(SEQ ID NO:02)包含以下序列和标记物：
SEQ ID NO:015’-Cy5-TGG GGG TGG GGG TGG GGG TGG GGG T-P-3’
SEQ ID NO:025’-ACC CCC ACC CCC ACC CCC ACC CCC A-BHQ-3-3’
如上面已经提到的，设计所述双链寡核苷酸(校准物)使得双链寡核苷酸的至少一部分解链温度值与所述扩增的特定靶核酸的至少一部分解链温度值相等是有利的。因此，根据所述扩增和分析的靶核酸，所述校准物可以包含任何序列。SEQ ID NO:01和SEQ IDNO:02应该被看做一种可能性，其在本实施例1至3中发现适合作为校准物。
在一个具体的实施方案中，所述在PCR实验中用于温度校准的方法包括步骤a)在多孔板每个孔中提供反应混合物，用于在样品中扩增特定靶核酸，其中所述特定靶核酸包含单核苷酸多态性，以及480Resolight染料；b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中所述荧光染料Cy5共价结合于所述双链寡核苷酸的第一条链且其中所述暗淬灭剂BHQ-3共价结合于所述双链寡核苷酸的第二条链，其中荧光染料Cy5共价结合于双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸且暗淬灭剂BHQ3共价结合于双链寡核苷酸的第二条链中的核苷酸，其中所述第一条链中的该核苷酸和所述第二条链中的该寡核苷酸形成互补碱基对，c)在每个孔中扩增特定靶核酸，d)在每个孔中解链所述扩增的特定靶核酸，导致来自480Resolight染料的放射发射减少，并解链所述双链寡核苷酸，其通过空间分离所述荧光染料Cy5和所述暗淬灭剂BHQ-3，导致来自Cy5的放射发射增加，e)通过检测来自480Resolight染料的放射发射的减少，在每个孔中监控所述扩增的靶核酸的解链温度值，和通过检测荧光染料Cy5的发射放射的增加，在每个孔中分别监控所述双链寡核苷酸的解链温度值，f)基于所述双链寡核苷酸的解链温度值在孔与孔之间的差异，对于每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值。
本说明书进一步涉及用于实施上述PCR实验中的温度校准的试剂盒，其中所述试剂盒包含a)用于在样品中扩增特定靶核酸序列的所有必要试剂，b)荧光、非共价双链DNA结合染料，c)双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链。
在一个实施方案中，所述特定靶核酸包含单核苷酸多态性。
在一个实施方案中，所述供体生色团共价结合于所述双链寡核苷酸第一条链中的某位置处，所述接受体生色团共价结合于所述双链寡核苷酸第二条链中的某位置处，使得第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置彼此靠得很近。在具体的实施方案中，第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置在所述双链寡核苷酸的相对位置。
在一个具体的实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸彼此分隔不超过两个碱基对。
在另一个实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸形成互补碱基对。
在一个实施方案中，所述荧光非共价双链DNA结合染料的发射波长和所述供体生色团的发射波长彼此分开。
在一个具体的实施方案中，所述荧光非共价双链DNA结合染料是480Resolight染料。在一个实施方案中，所述供体生色团是Cy5。在一个实施方案中，所述受体染料是淬灭剂分子。在一个具体的实施方案中，所述淬灭剂分子是选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和BHQ-4的暗淬灭剂。在一个更具体的实施方案中，所述淬灭剂分子是BHQ-3。
本说明书进一步涉及用于在上述PCR实验中进行温度校准的反应混合物，其中所述反应混合物包含a)靶核酸序列，b)用于扩增所述特定靶核酸序列的所有必要试剂，c)荧光非共价双链DNA结合染料，和d)双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链。
在一个实施方案中，所述靶核酸包含单核苷酸多态性。
在一个实施方案中，所述用于扩增靶核酸序列的必要试剂包含缓冲液、dNTPs、聚合酶、单价或二价盐、正向引物和反向引物。
在一个实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链中的某位置处，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的某位置处，使得第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置彼此靠得很近。在一个具体的实施方案中，第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置在所述双链寡核苷酸的相对位置。
在一个具体的实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸彼此分隔不超过两个碱基对。
在另一个实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸形成互补碱基对。
在一个实施方案中，所述荧光非共价双链DNA结合染料的发射波长和所述供体生色团的发射波长彼此分开。
在一个具体的实施方案中，所述荧光非共价双链DNA结合染料是480Resolight染料。在一个实施方案中，所述供体生色团是Cy5。在一个实施方案中，所述受体染料是淬灭剂分子。在一个具体的实施方案中，所述淬灭剂分子是选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和BHQ-4的暗淬灭剂。在一个更具体的实施方案中，所述淬灭剂分子是BHQ-3。
本说明书进一步涉及用于实施上述PCR实验中的温度校准的仪器。因此，本说明书涉及用于实现在PCR实验中进行温度校准的方法的仪器，其中所述方法包括步骤a)在多孔板每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其含有荧光非共价双链DNA结合染料；b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，c)在每个孔中扩增特定靶核酸，d)在每个孔中解链所述扩增的特定靶核酸从而导致来自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自供体生色团的放射发射增加，或自接受体生色团的放射发射减少，其通过空间分离所述供体生色团和所述接受体生色团进行，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少来监控每个孔中所述扩增的靶核酸的解链温度值；和分开地通过检测所述供体生色团放射发射的增加，或所述接受体生色团放射发射的减少来监控每个孔中所述双链寡核苷酸的解链温度值，f)基于所述双链寡核苷酸解链温度值的孔与孔差异，对于每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值。
在一个实施方案中，所述靶核酸包含单核苷酸多态性。
在一个实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链中的某位置处，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中某的位置处，使得第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置彼此靠得很近。在一个具体的实施方案中，第一条链中的所述位置和第二条链中的所述位置在所述双链寡核苷酸的相对位置。
在一个具体的实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸彼此分隔不超过两个碱基对。
在另一个实施方案中，所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸形成互补碱基对。
在一个实施方案中，所述荧光非共价双链DNA结合染料的发射波长和所述供体生色团的发射波长彼此分开。
在一个具体的实施方案中，所述荧光非共价双链DNA结合染料是480Resolight染料。在一个实施方案中，所述供体生色团是Cy5。在一个实施方案中，所述受体染料是淬灭剂分子。在一个具体的实施方案中，所述淬灭剂分子是选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和BHQ-4的暗淬灭剂。在一个更具体的实施方案中，所述淬灭剂分子是BHQ-3。
本说明书进一步涉及用于执行上述方法的计算机程序。因此，本说明书涉及用于执行在PCR实验中用于温度校准的方法的计算机程序，其中所述方法包含步骤a)在多孔板每个孔中提供用于扩增样品中特定靶核酸的反应混合物，其含有荧光非共价双链DNA结合染料；b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，c)在每个孔中扩增所述特定靶核酸，d)在每个孔中解链所述扩增的特定靶核酸从而导致自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射减少；以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自供体生色团的放射发射增加，或自接受体生色团的放射发射减少，其通过空间分离所述供体生色团和所述接受体生色团进行，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少来监控每个孔中解链温度值；分开地通过检测自所述供体生色团放射发射的增加，或自所述接受体生色团放射发射的减少来监控每个孔中所述双链寡核苷酸的解链温度值，f)基于所述双链寡核苷酸解链温度值的孔与孔差异，对于每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值。在一个实施方案中，所述特定靶核酸包含单核苷酸多态性。
所述双链寡核苷酸(校准物)的最佳设计、序列和标记应当为了达到本文所述发明的最高可能利益来确定。具体的，所述校准物的下述特点相比现有技术是有利的：
a)所述校准物的Tm应当和典型的靶核酸的Tm可比，因为位置与位置之间的温度差异依赖于所分析的目标温度。
b)对靶物扩增效率没有抑制。这对于从PCR分析中获得完全不受到校准物存在的影响的客观结果是重要的。
c)最小化所述荧光非共价DNA结合染料和所述校准物的荧光染料发射波长的重叠，来减少靶核酸和校准物解链曲线形状的干扰。
d)产生足够的解链信号强度，来提供校准物Tm的可靠读出。
提供下述实施例1至3来帮助理解本说明书，其真正的范围陈述于附加的权利要求中。应当理解可以不脱离本发明的精神实质，对陈述的步骤做出修改。
实施例1
校准物的设计
所述校准物由两条25聚体互补链组成。一条链在5’端使用荧光染料Cy5标记，在3’端被磷酸化。另一条链在3’端使用暗淬灭剂BHQ-3(Biosearch Technologies)标记。
SEQ ID NO:015’-Cy5-TGG GGG TGG GGG TGG GGG TGG GGG T-P-3’
SEQ ID NO:025’-ACC CCC ACC CCC ACC CCC ACC CCC A-BHQ-3-3’
下面提供的实验各自分别在不使用或使用根据本说明书的校准物下进行。
实施例2
在热未校准的PCR模块上通过使用校准物改善温度分辨率
从2ng人基因组DNA(从不同的人血液样品中纯化)扩增两个单核苷酸多态性(SNP)区域。
ADD1基因区使用以下引物序列扩增：
SEQ ID NO:035’-GAT GGC TGA ACT CTG GC-3’
SEQ ID NO:045’-CGA CTT GGG ACT GCT TC-3’
Cyp2C9基因区使用以下引物序列扩增：
SEQ ID NO:055’-CGT TTC TCC CTC ATG ACG-3’
SEQ ID NO:065’-TCA GTG ATA TGG AGT AGG GTC-3’
下述PCR和解链方案使用LightCyclerTM 96实时PCR仪(Roche Applied Science的样机)应用。
观察到的结果：如可清楚的从图1中得到，在未校准的PCR模块上不使用根据本说明书的校准物，六种不同的基因型不能被区分。然而，如果根据本说明书的校准物被引入所述实验，在未校准的PCR模块上，六个组的明显区分是可能的(图2)。
实施例3
在热预校准的PCR模块上通过使用校准物改善温度分辨率
从88个不同人类基因组DNA(从不同的人血液样品中纯化)扩增一个单核苷酸多态性(SNP)区。
TNF alpha基因区使用以下引物序列扩增：
SEQ ID NO:075’-GGG CTA TGG AAG TCG AGT A-3’
SEQ ID NO:085’-CGT CCC CTG TAT CCA TAC C-3’
下述PCR和解链方案使用LightCyclerTM 96实时PCR仪(Roche Applied Science的样机)应用。
观察到的结果：如可清楚的从图3中得到，在预校准的PCR模块上不使用根据本说明书的校准物，六种不同的基因型不能被清楚区分。然而，如果根据本说明书的校准物被引入所述实验，在预校准的PCR模块上，六个组的明显区分是可能的(图4)。所述实验显示，根据本发明的校准物改善不同基因型之间区别的效果，即使实验在带有预校准的PCR模块的仪器上进行。
Claims (27)
1.用于在PCR实验中温度校准的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在多孔板的每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其包含荧光非共价双链DNA结合染料，
b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，且其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，
c)在每一个孔中扩增所述特定靶核酸，
d)在每个孔中解链扩增的特定靶核酸从而导致自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自供体生色团的放射发射增加或自接受体生色团的放射发射减少，其通过空间分离供体生色团和受体生色团实现，
e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少在每个孔中监控所述扩增的特定靶核酸的解链温度值，并且分开地通过检测自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少在每个孔中监控所述双链寡核苷酸的解链温度值，
f)基于所述双链寡核苷酸的解链温度值的孔与孔差异，对每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值；
其中所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射波长和所述供体生色团的放射波长彼此分开。
2.权利要求1的方法，其中所述特定靶核酸包含单核苷酸多态性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸形成互补碱基对。
4.权利要求3的方法，其中所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链的5’端，且所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链的3’端，或者其中所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链的3’端，且所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链的5’端。
5.权利要求1-2和4中任一项的方法，其中所述荧光非共价双链DNA结合染料是480Resolight染料。
6.权利要求3的方法，其中其中所述荧光非共价双链DNA结合染料是 480Resolight染料。
7.权利要求1-2、4和6中任一项的方法，其中所述供体生色团是Cy5。
8.权利要求3的方法，其中所述供体生色团是Cy5。
9.权利要求5的方法，其中所述供体生色团是Cy5。
10.权利要求1-2、4、6和8-9中任一项的方法，其中所述接受体生色团是淬灭剂分子。
11.权利要求3的方法，其中所述接受体生色团是淬灭剂分子。
12.权利要求5的方法，其中所述接受体生色团是淬灭剂分子。
13.权利要求7的方法，其中所述接受体生色团是淬灭剂分子。
14.权利要求10的方法，其中所述淬灭剂分子是选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和BHQ-4的暗淬灭剂。
15.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述淬灭剂分子是选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和BHQ-4的暗淬灭剂。
16.权利要求1-2、4、6、8-9和11-14中任一项的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度与所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不多于5℃。
17.权利要求3的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度与所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不多于5℃。
18.权利要求5的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度与所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不多于5℃。
19.权利要求7的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度与所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不多于5℃。
20.权利要求10的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度与所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不多于5℃。
21.权利要求15的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度与所述扩增的特定靶核酸的解链温度相差不多于5℃。
22.权利要求1-2、4、6、8-9和11-14中任一项的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相同。
23.权利要求3的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相同。
24.权利要求5的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相同。
25.权利要求7的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相同。
26.权利要求10的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相同。
27.权利要求15的方法，其中所述双链寡核苷酸设计为使得所述双链寡核苷酸的解链温度和所述扩增的特定靶核酸的解链温度相同。
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