CN104825453A - 金鸡纳生物碱衍生物作为细胞毒性化合物的应用 - Google Patents

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卡罗尔·卡克普扎克
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    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
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    • A61K31/49—Cinchonan derivatives, e.g. quinine
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract

本发明的主题是通式1所示的金鸡纳生物碱9-氧-炔丙基醚类在制备用于癌症化疗的药物中的应用，

Description

金鸡纳生物碱衍生物作为细胞毒性化合物的应用
技术领域
本发明的主题是9-氧-炔丙基辛可宁(9-O-propargylcinchonine)在制备用于抗癌治疗的药物中的应用。
背景技术
癌症是被报道在人类中主要的健康失调疾病之一，拥有最高的死亡率和越来越多的新病例，这首先涉及延长的寿命和生活方式。癌症的治疗是很困难的、昂贵的，而且在多数情况下也是没有成效的。因此，迫切需要一种具有抑制细胞生长活性的新物质。它们往往来源于天然产物，特别来自生物碱及其衍生物，如紫杉醇(taxol)、喜树碱(camptothecin)或长春花生物碱(Vinca alkaloids)(供参考，见Taglialatela-Scafati,O.Modern Alkaloids,Fattorusso E.(ed.),Wiley-VCH,2007,p.25)。金鸡纳树树皮生物碱，例如奎宁(quinine)、奎尼丁(quinidine)、辛可尼定(cinchonidine)和辛可宁(cinchonine)，不具有特定的抗肿瘤特性。在具有多重耐药性(multi drug resistance,MDR)的癌症疾病的实验性疗法中，抗癌药物的组合已被使用，例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿霉素(doxorubicin)、甲基强的松龙(methylprednisolone)或不具抗癌金鸡纳生物碱(奎宁或辛可宁)的长春碱(vinblastine)。这些生物碱抑制上述抗癌药从多重耐药性癌细胞上移除，从而提高这类药物的作用(Lee,S.-Y.et al.Environ.Tox.,2011,26,424and Solary,E.et al.,Leukemia,2000,14,2085)。
在实验抗癌分化治疗中，接着，可能对与癌症生长相关联的基因表达有影响的化合物被使用，与破坏癌细胞的传统化疗药剂结合。体外乳腺癌细胞(MCF-7)的弱生长抑制和分化被报道是因为高浓度的奎宁和奎尼丁(IC50：分别为40μMand 113μM)，根据化疗标准，这不具资格这些作为活性药物的物质(Martirosyan,A.R.et al.Biochem.Pharmacol.,2004,68,1729)。
发明内容
本发明的目的是开发具有细胞毒活性的金鸡纳生物碱衍生物在抗癌治疗中的新应用。
本发明的主题是由分子式1代表的通式所示9-氧-炔丙基醚类在制备用于癌症化疗药物中的应用，
其中，单独的醚类在C-8和C-9原子具有以下绝对构型：
(8R，9S)-辛可宁构型，或
(8R，9R)-9-epi-辛可宁构型。
用在金鸡纳生物碱化学中的常用编号被用来定义该绝对构型。
细胞毒活性测试使用以下癌细胞系进行：MCF-7(乳腺癌)，HeLa(***)、A549(肺癌)和KB(鼻咽癌)，来自ECACC(European Collection ofCell Cultures，欧洲细胞株/微生物保藏中心)。
细胞毒性试验采用磺酰罗丹明(sulphorhodamine B)的标准程序实施。它们参与癌症细胞系在对数生长期中用被测试化合物72小时的培养，然后，使用结合细胞蛋白的染色剂(磺酰罗丹明)的吸收，分光光度测定细胞抑制生长的程度。所述测试是根据在如下报道的流程展开的：Vichai,V.,Kirtikara,K.NatureProtocols,2006,1,1112。
用于所述实验的细胞的制备：
将在对数生长期中测试的细胞系的细胞接种到24孔板中，每孔20000个细胞/2ml生长培养基，然后，在保温箱中，在37℃下、5％CO2气氛中培养24小时。
测试化合物溶液的制备：
测试化合物的溶液在DMSO中制备，按照如下浓度范围：0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100μM。
被测试的细胞系的细胞，在层流室中用测试化合物的溶液进行处理，这确保了无菌操作工作条件，按照如下流程：前三个孔作为对照实验，它们只含有20μL的DMSO；将测试化合物的溶液，从最低浓度开始(每三个孔为同一浓度水平)，依次加入随后的孔中(20μL)，然后将板放入保温箱中72小时。
培养结束后，加入500μL冷(4℃)的50％三氯乙酸(TCA)，将黏附的细胞固定，并在4℃下培养1小时。然后，每孔用无菌水冲洗并干燥。此操作重复五次。被固定的细胞通过加入500μL溶解于1％乙酸中的0.4％染色剂(磺酰罗丹明)被染色。通过倾倒来移除板上未被吸附的染色剂，用1％的乙酸冲洗细胞四次。然后，所述板在空气中干燥约5分钟。每孔中加入10mM的Tris-基缓冲溶液(三羟甲基氨基甲烷)1500μL，并使用定轨摇床振动5分钟，用于溶解未被吸附的染色剂。然后，将每孔中的200μL溶液分别转移到新的96孔板的两个孔中，使用读板器通过分光光度测定在波长为490-530nm处溶液的吸收。假设对照组溶液的吸收为100％，计算测试化合物的细胞生长抑制百分率。
根据细胞系的类型，使用如下生长介质：
·将MCF-7细胞系在购自Sigma(目录编号为D5796)的杜尔贝科改良依格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DME)中生长。
·将HeLa、A549和KB细胞系在购自Sigma(目录编号为R8758)的RPMI-1640培养基中生长。
IC50值，表示被需要获得50％细胞生长抑制率的化合物的浓度，用于测定所有待测衍生物。IC50<4μg/mL的衍生物通常被假定为活性的(缩写为A)，IC50范围在4–30μg/mL之间的衍生物被认为是中等活性的(缩写为MA)，而IC50>30μg/mL的衍生物被认为是非活性的(缩写为NA)(National Cancer Institute,Division of Cancer Treatment,Drug Research and Development.ProgramProcedure.Instruction and technical documentation change notice,instruction14.Screening data summary interpretation and outline of current screening.Edition NCI,NIH,Bethesda Rev.,1980,6,31–62)。
为了能够比较，用已知的细胞毒性剂5-氟-2’-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶和其它金鸡纳生物碱辛可宁做相同的测试。
通式1所示化合物的细胞毒活性测试结果在表1中显示。以下数值是三个独立测试结果的平均值。
表1：
PCN化合物的抗乳腺癌、***、肺癌和鼻咽癌的肿瘤细胞系的体外细胞毒性在高活性的范围之内。在每一种情况下，化合物PCN的细胞毒性高于目前使用的抗癌剂，如5-氟-2'-脱氧尿苷和5-氟尿嘧啶。
本发明的一个方面是9-氧-炔丙基辛可宁(PCN)在制备用于乳腺癌化疗的药物中的应用。
进行的试验证实，PCN在IC50值为3.0μg/mL时具有抗MCF-7细胞系的最高活性。它的细胞毒性为5FU的2倍以上，目前在抗癌治疗中使用的对照化合物的活性是5FdU的1.3倍。
本发明的另一方面是9-氧-炔丙基辛可宁(PCN)在制备用于***化疗的药物中的应用。
进行的试验证实，PCN在IC50值为3.5μg/mL时具有最高活性。PCN的细胞毒性为5FU(对照化合物)的2倍，为5FdU的1.2倍。
本发明的另一方面是9-氧-炔丙基辛可宁(PCN)在制备用于肺癌化疗的药物中的应用。
进行的试验证实，PCN在IC50值为3.9μg/mL时具有最高活性。PCN的细胞毒性为5FU(对照化合物)的1.8倍以上，略多于5FdU的细胞毒性。
本发明的另一方面是9-氧-炔丙基辛可宁(PCN)在制备用于鼻咽癌化疗的药物中的应用。
进行的试验证实，PCN在IC50值为3.2μg/mL时具有最高活性。PCN的活性分别为5FU和5FdU的2.3倍和1.4倍。
通式1化合物的细胞毒性与在C-8和C-9原子的绝对构型有关。具有最高活性的PCN化合物是(8R，9S)构型的辛可宁衍生物，改变为相反构型(8S，9R)，被发现其从PCD衍生物和辛可尼丁制备，导致了细胞毒活性约3倍的降低。
本发明的主题通过说明PCN化合物的合成的实施例来解释。
金鸡纳生物碱9-氧-炔丙基醚类是由专利EP1477488公开的过程从金鸡纳树皮分离得到的天然生物碱制备的。
具体实施方式
实施例1
辛可宁(883mg，3mmol)溶解于无水DMF(12mL)中，随后，将溶液置于冰浴中。将混合物冷却至约5℃，将氢化钠(在矿物油中的50％的NaH，300mg，2当量)在0.5小时内分批加入。将溶液搅拌2小时，使用注射器加入炔丙基溴在甲苯中的80％溶液(0.42mL，3.75mmol，1.25当量)。将反应混合物在室温下静置过夜。接着，将二氯甲烷(50ml)加入到反应混合物中，有机溶液依次用饱和NaCl溶液(30mL)和蒸馏水(30mL)洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥，随后，将干燥剂滤出，使用真空蒸发器蒸发溶剂，保持水浴温度在40-45℃范围。粗产物9-氧-炔丙基辛可宁(PCN)在装有硅胶(60H,0.045–0.075mm/200–300目，来自Merck)的色谱柱上以如下梯度被纯化：二氯甲烷/正己烷，二氯甲烷，1％甲醇/二氯甲烷，5％甲醇/二氯甲烷。PCN化合物作为油被获得，具有>99％的纯度和大约80％的产率。
1H NMR(300/400MHz,CDCl3):δ1.24(m,1H),1.52(m,2H),2.11(m,1H),2.28(q,1H,J＝8.0Hz),2.46(t,1H,J＝2.3Hz),2.72–2.97(m,3H),3.11(m,1H),3.49(s,1H),3.92(d,1H,J＝1.8Hz),3.95(d,1H,J＝1.8Hz),4.21(d,1H,J＝2.4Hz),4.25(d,1H,J＝2.4Hz),5.01(d,1H,J＝3.7Hz),5.14(d,1H,J＝11.1Hz),6.10(ddd,1H,J＝17.3,10.1,7.6Hz),7.26(s,1H),7.48(d,1H,J＝4.3Hz),7.59(m,1H),7.73(m,1H),8.15(d,1H,J＝8.4Hz),8.18(d,1H,J＝8.5Hz),8.91(d,1H,J＝4.3Hz)。
13C NMR(CDCl3):δ20.35,28.10,40.00,49.22,49.98,56.48,60.30,75.13,114.74,123.24,126.81,129.18,130.46,148.51,150.08。
MS ES(m/z):(–)331(M–H)–,367/369(M+Cl)–；(+)333(M+H)+,355(M+Na)+。

Claims (5)

1.通式1所示的金鸡纳生物碱9-氧-炔丙基醚类在制备用于癌症化疗的药物中的应用，
1
其中，单独的醚类在C-8和C-9原子具有以下绝对构型：
（8R，9S）- 辛可宁构型，或
（8R，9R）- 9-epi-辛可宁构型。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，9-氧-炔丙基辛可宁用于制备乳腺癌化疗药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，9-氧-炔丙基辛可宁用于制备***化疗药物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，9-氧-炔丙基辛可宁用于制备肺癌化疗药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，9-氧-炔丙基辛可宁用于制备鼻咽癌化疗药物。
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