CN104822824A - 用于烃的生物氧化的遗传工程改造的微生物 - Google Patents

用于烃的生物氧化的遗传工程改造的微生物 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于烃的生物氧化，包括从烷烃产生醇或从烯烃产生环氧化物的遗传工程改造的微生物，以及相关方法和***。

Description

用于烃的生物氧化的遗传工程改造的微生物
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且借此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是200206_408WO_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件是1GB，在2013年10月14日创建，并且经由EFS-Web以电子方式提交。
背景
技术领域
本公开涉及用于烃的生物氧化，包括从烷烃产生醇或从烯烃产生环氧化物(诸如从甲烷产生甲醇)的遗传工程改造的微生物，以及用于烃的氧化的方法和***。
相关领域的描述
非常规气体是用于描述致密砂岩气、页岩气、气体水合物以及煤层甲烷的集合术语。甲烷是天然气的主要组分(约75％)，其它成分包括乙烷、丙烷、丁烷(约20％)、更少量的CO2、氧气、氮气、硫化氢以及微量的稀有气体。将这些其它成分与甲烷分离以产生销售级天然气。非常规气体与“常规”天然气是相同的物质；气储层的特定特征引出其“非常规”名称。虽然可以在没有任何特殊完井的情况下开采常规天然气，但大多数非常规气体产生需要岩石碎裂以允许气体通过钻井孔从岩石逸出至表面。非常规气藏占据北美有待被提取的天然气的越来越大的比重。
便宜的天然气资源的丰富度呈现了使用基于甲烷的燃料和化学品的机会，由此减少对石油进口的依赖。然而，用于将天然气转化成更高价值的产品的传统催化工艺是高成本的并且具有众多处理要求、环境条件(例如，高压和高温)以及安全问题。虽然生物转化方法提供了一种潜在的替代方案，但先前策略，诸如使用原生的甲烷营养菌从甲烷产生甲醇，对于商业使用而言提供了不足的工艺产率和低效率。
鉴于与甲烷和天然气的其它组分转化成更高价值的燃料和化学品相关的限制，本领域中明确需要安全、有效、专一、环保清洁并且有成本效益的新方法。本发明通过提供使用遗传工程改造的微生物从烷烃以生物合成方式产生甲醇和其它醇产物的有效并且有成本效益的方法来解决这一问题。此外，用于烷烃氧化的生物催化剂也能够将烯烃底物转化成环氧化物，这是当前通过化学催化方法不足以达成的反应。
发明概要
在一个方面，本公开提供了非天然存在的微生物，其包含：编码甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸，这种酶在化学或环境应激存在下是稳定的；其中至少一种醇脱氢酶在微生物中被灭活；并且其中这种微生物能够将甲烷转化成甲醇。在某些实施方案中，非天然存在的微生物是甲烷营养菌。
在某些实施方案中，微生物能够利用H2作为还原剂用于将甲烷转化成甲醇。在其它实施方案中，微生物包含编码氢化酶的核酸，这种氢化酶能够利用H2作为还原剂用于将甲烷转化成甲醇。
在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶是pMMO、sMMO、AMO或P450。在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶包含与SEQ ID NO:1-654中的任一者具有至少70％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，化学或环境应激是>60℃的温度、>9的pH或<5的pH，或至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
在某些实施方案中，醇脱氢酶通过遗传修饰被灭活。在其它实施方案中，醇脱氢酶通过化学或环境应激被灭活。在某些实施方案中，化学或环境应激是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。在某些实施方案中，醇脱氢酶可以包括甲醇脱氢酶。在某些实施方案中，醇脱氢酶包含与SEQ ID NO:655、656、657、658、659、660、661、662、663、664以及665中的任一者具有至少70％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，微生物能够将乙烷转化成乙醇、丙烷转化成丙醇、丁烷转化成丁醇或混合烷烃气体底物转化成混合醇产物。在一些实施方案中，混合烷烃气体底物是湿天然气或其部分分离的衍生物。
在某些实施方案中，微生物能够将乙烯转化成环氧乙烷、丙烯转化成环氧丙烷、丁烯转化成环氧丁烷、丁二烯转化成丁二烯1,2氧化物或混合烯烃气体底物转化成混合环氧化物产物。
本公开还提供了将甲烷和其它低碳烷烃转化成其对应的醇、将低碳烯烃转化成其对应的环氧化物的方法，以及包含非天然存在的微生物的***。
本公开的这些和其它方面将在参考以下发明详述和附图之后变得显而易见。本文所公开的所有参考文献借此以全文引用的方式并入，如同每一者个别地并入一样。
附图简述
图1示出了如本公开中所提供的示例性甲醇生物合成途径，其显示将甲醇生物合成分成两个依序进行的催化步骤以及对内源MDH和其它ADH活性的抑制。
图2示出了一种示例性***，其包括用于将烷烃底物转化成其相关的醇的气相生物反应器，所述气相生物反应器含有固定的非天然存在的微生物的细胞物质；空气/O2源和连接器；气体底物源和连接器；H2源和连接器；化学或环境控制单元(例如，温度)；收集单元(任选地包括冷凝器和/或蒸馏单元)；以及再循环单元。
发明详述
本公开提供了用于烃的特定氧化，包括混合气体底物氧化成混合氧化产物的组合物、方法以及***，其中微生物经过遗传工程改造以：包括编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸，这种酶在化学或环境应激存在下是稳定的；并且具有至少一种在微生物中被灭活的醇脱氢酶。如本文所提供，使烃氧化，包括将烷烃转化成其对应的醇或将烯烃转化成其对应的环氧化物的方法包括提供遗传工程改造的微生物或来源于其的无细胞部分以及使其暴露于：O2；包含低碳烷烃(例如，甲烷、乙烷、丙烷或丁烷)、低碳烯烃(例如，乙烯、丙烯、丁烯或丁二烯)的气体底物或包含低碳烷烃和/或烯烃的混合气体底物；以及还原剂；其中将烷烃随后转化成其对应的醇和/或将烯烃随后转化成其对应的环氧化物。可以将遗传工程改造的微生物或来源于其的无细胞部分固定于固体基质上并且合并至包括气相生物反应器的用于将烷烃转化成醇以及将烯烃转化成环氧化物的***中。
在更详细地阐述本公开之前，提供用于本文中的某些术语的定义可能有助于理解本公开。额外的定义在本公开通篇阐述。
在本发明描述中，除非另有指示，否则术语“约”意味着所指示的范围、值或结构的±20％。术语“基本上由……组成”将权利要求书的范围限制于指定的材料或步骤以及不会本质上影响所要求保护的发明的基本和新颖的特征的那些。应了解，如本文所用的术语“一(a/an)”指的是所列组分中的“一者或多者”。替代物的使用(例如，“或”)应被理解为意味着替代物中的任一者、两者或其任何组合。如本文所用的术语“包括”和“具有”同义地使用，这些术语和其变型意图被解释为非限制性的。术语“包含”意味着如权利要求书中所提及的规定特征、整数、步骤或组分的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、组分或其群组的存在或添加。
如本文所用的术语“非天然存在”，也称为“重组”，当用于提及微生物时意味着这种微生物具有至少一个遗传变异，所述遗传变异通常不会在所提及的物种的天然存在的菌株中发现，包括所提及的物种的野生型菌株。遗传变异包括例如引入编码蛋白质的可表达核酸分子、其它核酸添加、核酸缺失、核酸取代或细菌的遗传物质的其它功能破坏的修饰。所述修饰包括例如所提及的物种的异源或同源多肽的编码区和其功能片段。额外的修饰包括例如非编码调控区，其中修饰改变基因或操纵子的表达。示例性蛋白质包括甲烷氧化途径内的蛋白质(例如，甲烷单加氧酶)。对编码酶的核酸分子或其功能片段的遗传修饰可以向从天然存在的状态改变的非天然存在的微生物赋予生物化学反应的能力或代谢途径的能力或者提高此类能力。
如本文所用的术语“微生物”，也称为“微生物生物体”、“微菌”或“生物体”，指的是来自古生菌(Archaea)、细菌(Bacteria)或真核生物(Eukarya)域的任何原核或真核微生物物种。这个术语意图包括具有显微尺寸的原核或真核生物体。
如本文所用的术语“甲烷营养菌”指的是专性甲基营养菌，其具有使作为其主要碳源和能源的甲烷氧化的能力。
如本文所用的“甲烷”指的是具有化学式CH4的最简单的烷烃化合物。甲烷是在室温和室压下无色无味的气体。甲烷的来源包括天然来源，诸如天然气田，以及经由产甲烷微生物生物合成，以及工业或实验室合成。甲烷包括纯甲烷；基本上纯化的组合物，诸如“管道质量天然气”或“干天然气”，其为95-98％百分比甲烷；以及未纯化的组合物，诸如“湿天然气”，其中其它烃尚未被去除并且甲烷占组合物的60％以上。
如本文所用的“天然气液”，也称为“天然气相关烃”，指的是在进行处理以产生管道质量干天然气期间从湿天然气中分离的各种烃(例如，乙烷、丙烷、丁烷)。“湿天然气的部分分离的衍生物”包括天然气液。
如本文所用的“具有甲烷单加氧酶活性的酶”指的是能够使甲烷中的C-H键氧化以形成甲醇的任何酶。具有甲烷单加氧酶活性的酶可以对除甲烷以外的多种其它底物(例如，乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯、丁烯或丁二烯)具有氧化活性。具有甲烷单加氧酶活性的酶包括多组分酶以及包含活性位点的亚单元。示例性的具有甲烷单加氧酶活性的酶包括pMMO、sMMO、氨单加氧酶以及P450。
如本文所用的“稳定”当用于提及具有催化活性(例如，甲烷单加氧酶活性)的酶和化学或环境应激时，意味着这种酶在暴露于化学或环境应激期间保留实质的活性，即，与不存在应激条件的情况相比在应激条件下至少25％或更多的催化活性。如本文所用，提及已经被遗传工程改造成在化学或环境应激存在下“稳定”的具有催化活性的酶也可能意味着工程改造的酶在暴露于化学或环境应激期间与暴露于相同应激条件的野生型或参考酶相比保留显著的催化活性(即，野生型或参考酶在暴露于应激条件期间与正常条件相比保留小于25％的催化活性)。
如本文所用的“化学应激”或“环境应激”指的是影响微生物正常代谢、存活的能力，或来源于微生物的蛋白质或酶发挥功能的能力的化学或环境条件。
如本文所用的“H2”，也称为“分子氢”，指的是无色无味的二氢气体。其为最小的气体分子并且由两个质子和两个电子组成。
如本文所用的“还原剂(reducing agent)”，也称为“还原剂(reductant)”、“还原剂(reducer)”或“还原等效物”，指的是向另一物质贡献电子的元素或化合物。
如本文所用的“醇脱氢酶”(ADH)指的是能够将醇转化成其对应的醛、酮或酸的任何酶。醇脱氢酶可以具有能够转化至少几种醇底物的一般特异性，或可以具有接受一种或两种醇底物的狭窄特异性。
如本文所用的“甲醇脱氢酶”(MDH)指的是一种类型的醇脱氢酶，其催化甲醇转化成甲醛。
如本文所用的“甲醇”，也称为“甲基醇”或“木醇”指的是具有化学式CH3OH的无色、水溶性的液体。
如本文所用的“颗粒性甲烷单加氧酶”(pMMO)指的是膜结合的颗粒性酶，其在甲烷营养菌中催化甲烷氧化成甲醇。pMMO包括多组分酶以及包含这种酶的活性位点的亚单元。
如本文所用的“可溶性甲烷单加氧酶”(sMMO)指的是在细胞裂解物的可溶部分(细胞质)中所发现的酶，其在甲烷营养菌中催化甲烷氧化成甲醇。sMMO包括多组分酶以及包含这种酶的活性位点的亚单元。
如本文所用的“P450”，也称为“细胞色素P450”或“CYP”，指的是一组具有光谱底物特异性的酶，其催化有机化合物的氧化，最通常是将氧原子***有机底物的R-H键中的单加氧酶反应。
如本文所用的“H2还原剂”指的是分子氢(H2)，其充当电子供体以推动具有甲烷单加氧酶活性的酶的催化。
如本文所用的用于提及酶(例如，醇脱氢酶)的“被灭活”意味着这种酶与野生型或参考酶相比具有小于25％的活性。灭活可以通过遗传方法实现，诸如抑制转录或表达，或通过使用环境条件实现，诸如高温。化学灭活可以通过高酸度或碱度、高盐浓度或暴露于特定化学品来实现。
如本文所用的“混合烷烃气体底物”指的是含有两种或更多种低级烷烃的混合物(即，来自由甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷组成的群组的两种或更多种烷烃的任何组合)的气态组合物。
如本文所用的“混合醇产物”指的是含有两种或更多种低级醇的混合物(例如，来自由甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇组成的群组的两种或更多种醇的任何组合)的组合物。混合醇产物中的醇组成取决于被非天然存在的微生物氧化的混合烷烃气体底物的烷烃组成。
如本文所用的“混合烯烃气体底物”指的是含有两种或更多种低级烯烃的混合物(即，来自由乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯组成的群组的两种或更多种烯烃的任何组合)的气态组合物。
如本文所用的“混合环氧化物产物”指的是含有两种或更多种低级环氧化物的混合物(例如，来自由环氧乙烷、环氧丙烷以及环氧丁烷组成的群组的两种或更多种环氧化物的任何组合)的组合物。混合环氧化物产物中的环氧化物组成取决于被非天然存在的微生物氧化的混合烯烃气体底物的烯烃组成。
如本文所用的“丁烯(butylene)”，也称为“丁烯(butene)”，指的是具有式C4H8的烃。取决于丁烷的起始同分异构体和自由键的位置，丁烯存在几个同分异构体。丁烯包括例如1,1-丁烯；1,2-丁烯；2,2-丁烯；1,3-丁烯；2,3-丁烯(顺式和反式)；1,4-丁烯；1,1-异丁烯；1,2-异丁烯；以及1,3-异丁烯。
如本文所用的“丁二烯”，也称为“1,3-丁二烯”，指的是具有式C4H6的简单的共轭二烯。“丁二烯”还可以包括1,2-丁二烯同分异构体。
如本文所用的“外源”意味着将所提及的分子(例如，核酸)或所提及的活性(例如，甲烷单加氧酶活性)引入宿主微生物中。分子可以例如通过将核酸引入宿主遗传物质中来引入，诸如通过整合至宿主染色体中或通过引入核酸作为非染色体遗传物质(如在质粒上)。当这个术语用于提及编码核酸的表达时，其指的是将编码核酸以可表达形式引入宿主微生物中。当用于提及酶活性或蛋白质活性时，这个术语指的是引入宿主参考微生物中的活性。因此，术语“内源”或“原生”指的是存在于宿主微生物中的所提及的分子或活性。术语“嵌合”当用于提及核酸时指的是并非内源的任何核酸，其包含在自然界中不会一起被发现的序列。举例来说，嵌合核酸可以包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或来源于相同来源，但以不同于自然界中所发现的方式排列的调控序列和编码序列。术语“异源”指的是来源于除了所提及的物种或菌株以外的来源的分子或活性，而“同源”指的是来源于宿主微生物的分子或活性。因此，如本公开中所提供的包含外源核酸的微生物可以利用异源或同源核酸或这两者。
应了解，当外源核酸包括在微生物中时，如上文所论述，这种外源核酸指的是所提及的编码核酸或蛋白质活性。还应了解，可以将这类外源核酸引入宿主微生物中的独立的核酸分子上、多顺反子核酸分子上或编码融合蛋白的单个核酸分子上或其组合，并且仍视为一种以上外源核酸。举例来说，如本文所论述，可以对微生物进行修饰以表达两种或更多种编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸(例如，编码pMMO和AMO的核酸)。在将两种编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸引入宿主微生物中的情况下，应了解，这两种外源核酸可以作为单个核酸分子引入，例如在单个质粒上、在独立的质粒上，可以在单个位点或多个位点处整合至宿主染色体中，并且仍视为两种外源核酸。类似地，应了解，可以将两种以上外源核酸分子以任何所需的组合引入宿主微生物中，例如在单个质粒上、在独立的质粒上，可以在单个位点或多个位点处整合至宿主染色体中，并且仍视为两种或更多种外源核酸。因此，所提及的外源核酸或酶活性的数量指的是编码核酸的数量或蛋白质活性的数量，而不是引入宿主微生物中的独立的核酸分子的数量。
如本文所用的“核酸”，也称为多聚核苷酸，指的是由共价连接的亚单元(称为核苷酸)组成的聚合化合物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)、多聚脱氧核糖核酸(DNA)，这两者可以是单链或双链。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA以及半合成DNA。
如本文所用的“无细胞部分”当用于提及非天然存在的微生物时指的是已经从细胞中分离的部分(例如，细胞器、细胞质)。无细胞部分可以是相对未纯化的(例如，细胞裂解物)。无细胞部分还包括通过差速离心分离的相对纯化的细胞器部分。
如本文所用的“气相生物反应器”，也称为“气相反应器”，指的是支持生物活性环境的制造或工程化的装置或***，在这个环境中微生物或来源于微生物的无细胞部分接触并催化气体底物。生物活性环境可以包含微生物生长或由微生物(即，甲烷单加氧酶活性)或来源于所述微生物的催化活性无细胞部分进行的化学过程。微生物或来源于其的无细胞部分可以被固定至反应器内的固体基质或固定至包括反应器本身的表面。
如本文所用的“流化床反应器”，也称为“流化床生物反应器”，指的是填充床和搅拌槽、连续流反应器的组合的生物反应器。在流化床反应器中，附着至粒子床载体的微生物或来源于其的无细胞部分是通过流体(气体或液体)向上通过而悬浮以使得粒子床载体在流体中自由地循环。流化床反应器具有极佳的传质和传热特征。
如本文所用的“固体基质”指的是能够具有暂时或永久地附着于固体基质上、固体基质内或固体基质背面的微生物或来源于微生物的无细胞部分的固体物质。固定的微生物可以在固体基质的表面(例如，呈生物膜形式)上生长。固体基质支撑体可以呈多种形状，诸如片、环、珠，并且可以包含许多材料，包括聚丙烯、砂、粒状活性碳、硅藻土以及陶瓷。
非天然存在的微生物
在某些实施方案中，提供了非天然存在的微生物，其经过遗传工程改造以包含编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸，这种酶在化学或环境应激存在下是稳定的，其中至少一种醇脱氢酶在微生物中被灭活，并且其中这种微生物能够将甲烷转化成甲醇。
转型指的是核酸(例如，外源核酸)转移至宿主微生物的基因组中，得到遗传上稳定的遗传性。含有转型的核酸的宿主微生物被称作“非天然存在”或“重组”或“转型”或“转基因”的微生物。宿主微生物可以选自在来自古生菌、细菌或真核生物域的任何原核或真核微生物物种中产生的非天然存在的微生物。示例性细菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimiasucciniciproducens)、艾利特根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)以及恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。示例性酵母或真菌物种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、假丝酵母属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowia)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、球拟酵母属(Torulopsis)、红酵母属(Rhodotorula)以及解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。应了解，任何适合的宿主微生物都可以用于引入适合的遗传修饰(例如，编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸，这种酶在化学或环境应激存在下是稳定的)以产生如本说明书中所提供的非天然存在的微生物。
在一些实施方案中，宿主微生物可以是甲基营养菌，其可以使C1化合物(缺乏碳碳键)氧化；或甲烷营养菌，其一般为专性甲基营养菌，这种细菌具有使作为碳源和能源的甲烷氧化的能力。甲烷营养菌基于其碳同化途径和内部膜结构被分成三组：I型(γ变形菌)、II型(α变形菌以及X型(γ变形菌)。I型甲烷营养菌使用单磷酸核酮糖(RuMP)途径用于碳同化，而II型甲烷营养菌使用丝氨酸途径。X型甲烷营养菌使用RuMP途径，但也表达低水平的丝氨酸途径的酶。甲烷营养菌被分成几个属：甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)以及甲基胞菌属(Methylocella)。甲烷营养菌还包括兼性甲烷营养菌，其天然地具有利用一些多碳底物作为唯一碳源和能源的能力。兼性甲烷营养菌包括甲基胞菌属、甲基孢囊菌属以及甲基荚膜菌属(Methylocapsa)的一些种类(例如，森林甲基胞菌(Methylocella silvestris)、沼泽甲基胞菌(Methylocella palustris)、冻原甲基胞菌(Methylocella tundrae)、道氏甲基孢囊菌菌株SB2(Methylocystis daltona strain SB2)、布氏甲基孢囊菌(Methylocystis bryophila)以及金色甲基荚膜菌KYG(Methylocapsaaurea KYG))。示例性甲烷营养菌包括：荚膜甲基球菌Bath菌株(Methylococcus capsulatus Bath strain)、甲基单胞菌属16a(ATCC PTA2402)、发孢甲基弯菌OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b；NRRLB-11,196)、生孢甲基弯菌(Methylosinus sporium；NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(Methylocystis parvus；NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica；NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(Methylomonas albus；NRRL B-11,200)、荚膜甲基杆菌(Methylobactercapsulatus；NRRL B-11,201)、嗜有机甲基杆菌(Methylobacteriumorganophilum；ATCC 27,886)、甲基单胞菌属AJ-3670(FERM P-2400)、森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌(ATCC 700799)、冻原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、布氏甲基孢囊菌、金色甲基荚膜菌KYG、极端嗜酸甲烷营养菌(Methylacidiphilum infernorum)、培氏甲基细菌(Methylibium petroleiphilum)以及嗜碱甲基微菌20Z(Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z)。
甲基营养菌涵盖多样化的组，包括革兰氏阴性与革兰氏阳性属。甲基营养菌包括兼性甲基营养菌(具有使不含碳碳键的有机化合物氧化的能力，但还可以利用其它碳底物，诸如糖和复合碳水化合物)、专性甲基营养菌(限于使用不含碳碳键的有机化合物)以及甲烷营养菌。甲基营养菌属的实例包括：嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基菌属(Methylobacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、副球菌属(Paracoccus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、节杆菌属(Arthrobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。示例性甲基营养菌包括：扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、耐辐射甲基杆菌(Methylobacteriumradiotolerans)、杨树甲基杆菌(Methylobacterium populi)、嗜中温甲基杆菌(Methylobacterium chloromethanicum)、结瘤甲基杆菌(Methylobacterium nodulans)、克莱拉甲基单胞菌(Methylomonasclara)、培氏甲基细菌、鞭毛甲基菌(Methylobacillus flagellates)、波氏硅杆菌DSS-3(Silicibacter pomeroyi DSS-3)、瘤状伯克霍尔德菌STM815(Burkholderia phymatum STM815)、致病乙酸细菌NIH1.1(Granulibacter bethesdensis NIH1.1)以及脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)。
所选的甲烷营养性宿主细菌还可以在选择性条件下经历菌株驯化以鉴别具有用于生产的改善的特性的变体。改善的特性可以包括增加的生长速率、所需产物的产率以及对可能存在的过程污染物的耐受性(参看例如U.S.6,689,601)。在特定实施方案中，选择高度生长的变体甲烷营养菌，其为能够在作为唯一碳源和能源的甲烷上生长的生物体并且具有比亲本、参考或野生型细菌更快的指数期生长速率(即，更短的倍增时间)。
在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶是甲烷单加氧酶(MMO)。甲烷单加氧酶是由甲烷营养菌表达的酶。MMO利用酶相关的金属中心使二氧(O2)的O-O键***。一个氧原子被还原以形成H2O，而另一个氧原子攻击甲烷的C-H键并且合并至甲烷中以形成甲醇。还原剂是完成氧化反应并且再生MMO所需要的。存在两种类型的在甲烷营养菌中发现的MMO：可溶性MMO(sMMO)，其使用NADH作为体内还原剂；和颗粒性或膜结合的MMO(pMMO)，其生理还原剂目前尚未确定。在体外已经使用许多其它还原剂用于MMO，包括甲酸盐、杜氢醌(duroquinol)以及H2，并且测试还原剂用于驱动MMO活性的方法在本领域中是已知的(参看例如Shiemke等,1995,Arch.Biochem.Biophys.321:421-8；美国专利公布2003/0203456)。pMMO一般在除了甲基胞菌属以外的几乎所有的甲烷营养菌中发现，而甲烷营养菌的一个小子组，诸如荚膜甲基球菌Bath和发孢甲基弯菌OB3b，可以表达sMMO或pMMO，这取决于培养基中的铜浓度。sMMO包含三种组分：由mmoXYZ编码的羟化酶(MMOH)、由mmoC编码的还原酶(MMOR)以及由mmoB编码的调控蛋白(MMOB)。包含活性位点的MMOH由三个多肽组成，以α2β2γ2二聚体排列。mmoX编码含有活性位点的α亚单元。pMMO由三个亚单元组成：α(pmoB)、β(pmoA，含有活性位点)以及γ(pmoC)，以α3β3γ3三聚体排列。MMO具有大范围的底物，不过sMMO具有比pMMO更宽范围的底物活性。pMMO还可以使诸如乙烷、丙烷、丁烷以及戊烷的其它烷烃氧化成其对应的醇(在Jiang等,2010,Biochemical Engineering Journal49:277-288中评述)。pMMO还可以使丙烯氧化成环氧丙烷；丁-1-烯氧化成1,2-环氧丁烷；1,3-丁二烯氧化成1,2-环氧丁-3-烯；顺-丁-2-烯氧化成顺-2,3-环氧丁烷和丁烯醛；以及反-丁-2-烯氧化成反-2,3-环氧丁烷、丁烯醇以及丁烯醛。sMMO可以使乙烷、丙烷、丁烷、己烷、辛烷以及2-甲基丙烷氧化成其相关的醇(Jiang等,同上)。sMMO还可以使乙烯氧化成环氧乙烷；丙烯氧化成环氧丙烷；丁-1-烯氧化成1,2-环氧丁烷；顺-丁-2-烯氧化成顺-2,3-环氧丁烷和顺-2-丁烯-1-醇；以及反-丁-2-烯氧化成反-2,3-环氧丁烷和反-2-丁烯-1-醇(Jiang等,同上；Colby等,1977,Biochem J.165:395-402)。pMMO相较于sMMO具有更高的比活性和稳定性。在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶是pMMO或sMMO。
用于测量MMO活性的试验在本领域中是已知的。举例来说，比色萘试验可以用于监测sMMO活性(参看例如Brusseau等,1990,Biodegradation 1:19-29)。纯化的sMMO或在铜缺乏培养基中生长的细胞可以使萘氧化成1-萘酚与2-萘酚的混合物，其通过与四氮化的邻二甲氧基苯胺反应形成具有大的分子吸收能力的紫色重氮染料来检测。sMMO和pMMO活性可以通过使用气相色谱法监测全细胞、细胞提取物、可溶部分或膜部分中丙烯的氧化来测量(参看例如Prior和Dalton,1985,J.Gen.Microbiol.131:155-163；Dispirito等,1992,Biodegradation 2:151-164；Zahn和Dispirito,1996,J.Bacteriol178:1018-1029)。
已经对来自许多甲烷营养菌的sMMO和pMMO基因进行测序和表征(参看例如Stainthorpe等,1989,Arch.Microbiol.152:154-159；Stainthorpe等,1990,Gene 91:27-34；Coufal等,2000,Eur.J.Biochem.267:2174-2185；Cardy等,1991,Mol.Microbiol.5:335-342；Cardy等,1991,Arch.Microbiol.156:477-483；Semrau等,1995,J.Bacteriol.177:3071-3079；Stolvar等,1999,Microbiol.145:1235-1244；Gilbert等,2000,Appl.Environ.Microbiol.66:966-975；Bodrossy等,1995,AppliedEnviron.Microbiol.61:3549-3555；Bodrossy等,1999,FEMS Microbiol.Lett.170:335-341；Lin等,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:6458-6462；Hou等2008,Biol.Direct.3:26)。可以在根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物中使用的示例性pMMO氨基酸序列提供于SEQ ID NO:1-643和SEQ ID NO:644-648中。
在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶是氨单加氧酶。氨单加氧酶(AMO)是通过使催化氨氧化成羟胺的细菌硝化而表达的膜结合的酶。AMO是pMMO同源物，也已知其使甲烷和其它烷烃(至多C8)氧化成其对应的醇(Hyman等,1988,Applied Environ.Microbiol.54:3187-3190)。AMO操纵子由amoC、amoA以及amoB基因组成，其中amoA含有活性位点。AMO活性试验在本领域中是已知的(参看例如Moir等,1996,FEBS Lett.387:71-74；Ensign等,1993,J.Bacteriol.175:1971)。已经在许多细菌中对AMO进行测序和表征(参看例如McTavish等,1993,J.Bacteriol.175:2436-2444；Norton等,2002,Arch.Microbiol.177:139-149)。可以在根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物中使用的示例性AMO氨基酸序列提供于SEQ ID NO:649-654中。
在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶是P450。P450，也称为细胞色素P450或CYP，指的是催化有机化合物氧化的酶的超家族。P450具有大范围的底物，包括脂质、类固醇激素以及异生物质。由P450催化的最常见反应是单加氧酶反应，其中将一个氧原子***有机底物(R-H)中，而将另一个氧原子还原成水。P450酶已经在大范围的生物体中发现，包括动物、植物、真菌、细菌(不包括大肠杆菌(E.coli))以及古生菌。来自分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)HXN-1500、CYP153A6以及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CYP102A1(BM3)的可溶性细胞色素P450已经显示使小烷烃氧化成其对应的醇，包括对于CYP153A6的甲烷(Chen等,2012,Protein Eng.Design Selection 25:171-178；Chen,Mike Ming Yu,2011,Directedevolution of cytochrome P450for small alkane hydroxylation.Dissertation(Ph.D.),California Institute of Technology)。P450活性可以通过使用气相色谱法-质谱法测量多种烷烃至醇的生物转化来分析(例如，Kubota等,2005,Biosci.Biotechnol.Biochem.69:2421-2430；Fujii等,2004,Biosci.Biotechnol.Biochem.68:2171-2177)。已经对众多P450基因进行测序和表征(参看例如Nelson等,1996,Pharmacogenetics 6:1-42；Funhoff等,2006,J.Bacteriol.188:5220-7；Kubota等,2005,Biosci.Biotechnol.Biochem.69:2421-2430)。
如上文所描述，具有甲烷单加氧酶活性的酶可以包含多种组分。在某些实施方案中，编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的核酸可以包含编码具有甲烷单加氧酶活性的酶(例如，这种酶的所有亚单元)或构成这种酶的活性位点的单个亚单元的基因簇或操纵子的多聚核苷酸。举例来说，在具有甲烷单加氧酶活性的酶是pMMO的情况下，核酸可以包含有包含pmoCAB基因簇或pmoA基因(β亚单元)的多聚核苷酸。在另一个实例中，在具有甲烷单加氧酶活性的酶是sMMO的情况下，核酸可以包含有包含mmoXYZ基因簇或mmoX基因(α亚单元)的多聚核苷酸。
本公开的非天然存在的微生物包含在化学或环境应激存在下稳定的具有甲烷单加氧酶活性的酶，意味着这种酶在暴露于化学或环境应激期间保留实质的活性(即，与不存在应激条件的情况相比在应激条件下至少25％的催化活性)。举例来说，具有MMO活性并且在化学或环境应激存在下具有先有的稳定性的酶，例如在>60℃下具有温度稳定性的来自嗜热甲烷营养菌的pMMO酶，可以被选择用于转型至宿主微生物中。所选的pMMO酶在>60℃的温度下与常温(例如，25-30℃)相比保留至少25％的MMO活性。在化学或环境应激存在下稳定的具有甲烷单加氧酶活性的酶与不存在应激条件的情况相比可以保留至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的催化活性。
在某些实施方案中，编码天然地在化学或环境应激存在下具有所需稳定性的具有甲烷单加氧酶活性的酶的核酸用于使根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物转型。举例来说，已经分离出嗜热(例如，Bodrossy等,1995,Applied Environ.Microbiol.61:3549-3555)、嗜碱(例如，Lin等,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:6458-6462)以及嗜酸(例如，Hou等,2008,Biol.Direct 3:26)甲烷营养菌。可以将编码来源于嗜热、嗜碱或嗜酸甲烷营养菌的MMO的核酸引入其它微生物中，包括缺乏MMO的微生物和具有没有所需化学或环境稳定性的MMO的甲烷营养菌，以提供具有甲烷单加氧酶活性并且分别在高温、高pH或低pH存在下具有稳定性的酶。可以用于本公开的非天然存在的微生物中的来自热稳定的甲烷营养菌的示例性pMMO氨基酸序列提供于SEQ ID NO:644-648中。编码天然地在化学或环境应激中具有所需稳定性(例如，热稳定性)的具有甲烷单加氧酶活性的其它酶(例如，AMO、P450)的核酸的来源可以是展现相同的化学或环境稳定性(例如，热稳定性)的微生物。提供了可以用于本公开的非天然存在的微生物中的来自耐盐细菌(SEQ ID NO:652、653)和来自高度耐应激细菌(SEQ ID NO:654)的示例性AMO氨基酸序列。
根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物可以包含已经被遗传工程改造成在化学或环境应激存在下“稳定”的具有催化活性的酶，意味着工程改造的酶在暴露于化学或环境应激期间与暴露于相同应激条件的野生型或参考酶相比保留显著的催化活性(即，野生型或参考酶在暴露于应激条件期间与不存在应激条件的情况相比保留小于25％的催化活性)。野生型或参考酶在暴露于应激条件期间与不存在应激条件的情况相比可以保留24％、20％、15％、10％、5％或更小(<25％)的催化活性。具有甲烷单加氧酶活性的酶在所选的化学或环境应激存在下的稳定性可以使用本领域中已知的多种活性试验来测量。
编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的参考核酸，也称为“野生型”或“亲本”核酸，用作具有所需稳定性的变体酶的遗传工程改造的起始分子。举例来说，在化学或环境应激中不会展现特定稳定性的来自甲烷营养菌(例如，发孢甲基弯菌OB3b)的sMMO或pMMO编码核酸可以被选作用于设计具有所选的化学或环境应激稳定性(例如，温度>60℃)的变体MMO酶的参考分子。可以进行遗传工程改造的示例性参考pMMO氨基酸序列提供于SEQ ID NO:1-643中。可以进行遗传工程改造的示例性参考AMO氨基酸序列提供于SEQ ID NO:649-654中。具有甲烷单加氧酶活性的酶的变体(例如，pMMO)和编码其的核酸的设计可以使用基于***发育的方法来完成，这些方法描述于例如美国专利号8,005,620和Gustafsson(Curr.Opin.Biotechnol.14:366,2003；这些方法以引用的方式并入)以及Welch等(J.R.Soc.Interface.6:S467,2009)、Villalobos等(BMC Bioinformatics 7:285,2006)、Minshull等(Curr.Opin.Chem.Biol.9:202,2005)、Gustafsson等(TrendsBiotechnol.22:346,2004)以及Minshull(Methods 32:416,2004)中。
在宿主微生物中具有甲烷单加氧酶活性的内源酶(即，在化学或环境应激中不稳定的酶)可能不需要被灭活，并且可以与所引入的在化学或环境应激中稳定的具有甲烷单加氧酶活性的酶一起存在于非天然存在的微生物中。
通过基于***发育的方法产生的具有甲烷单加氧酶活性的每种变体酶是与具有甲烷单加氧酶活性的参考或亲本野生型酶至少70％、75％、80％、85％或90％一致(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致)的多肽。在某些实施方案中，变体酶相对于具有甲烷单加氧酶活性的参考或亲本野生型酶在预定位置处还含有至少一个氨基酸取代(例如，1、2、3、5、6、7、8、9或10个或更多个或至多20或30个或更多个取代)，条件是变体保留甲烷单加氧酶活性。
使用本领域中已知的多种方法，可以使如本文所描述的非天然存在的微生物转型以包含至少一个外源核酸来提供具有新的或增强的活性(即，在化学或环境应激存在下稳定的甲烷单加氧酶活性)的宿主生物体，或可以进行遗传修饰以去除或大大降低内源基因功能(例如，甲醇脱氢酶活性)。用于核酸在微生物生物体中的外源表达的重组方法在本领域中是众所周知的。所述方法可以发现描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,ColdSpring Harbor Laboratory,New York(2001)；以及Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)中。pMMO或sMMO在异源宿主中的表达先前已有描述(参看例如Jahng等,1996,Biotechnol.Bioeng.51:349-59；Han等,2009,Sheng wu Gong Cheng Xue Bao 25:1151-9；Gou等,2006,263:136-141；Ramakrishnan等,2010,Nature 465:115-119)。
虽然甲烷营养菌的遗传工程改造工具不如其它微生物(例如，大肠杆菌)一样广泛，但如下文所概述，已经取得了重大的进展，从而允许甲烷营养菌的遗传操纵。
适用于在甲烷营养菌中表达异源核酸的表达***和表达载体是已知的。适用于适合的宿主微生物的转型的载体或盒是可得到的。
甲基营养菌的电穿孔先前已经描述于Toyama等,1998,FEMSMicrobiol.Lett.166:1-7(扭脱甲基杆菌)；Kim和Wood,1997,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:105-108(甲基营养型嗜甲基菌AS1(Methylophilus methylotrophus AS1))；Yoshida等,2001,Biotechnol.Lett.23:787-791(甲基菌属菌株12S)；以及US2008/0026005(扭脱甲基杆菌)中。
细菌缀合，其指的是涉及供体与受体细胞直接接触的特定类型的转型，更频繁地用于将核酸转移至甲烷营养菌中。细菌缀合涉及将“供体”与“受体”细胞彼此紧密接触地混合在一起。缀合通过在供体与受体细菌之间形成细胞质连接而发生，其中新合成的供体核酸单向转移至受体细胞中。缀合反应中的受体是可以通过从供体细菌水平转移来接受核酸的任何细胞。缀合反应中的供体是含有缀合性质粒、缀合性转座子或动员质粒的细菌。供体质粒的物理转移可以通过自传递质粒或借助于“辅助”质粒而发生。涉及甲烷营养菌的缀合先前已经描述于Stolyar等,1995,Mikrobiologiya 64:686-691；Motoyama等,1994,Appl.Micro.Biotech.42:67-72；Lloyd等,1999,Archives of Microbiology171:364-370；以及Odom等,PCT公布WO 02/18617；Ali等,2006,Microbiol.152:2931-2942中。
异源核酸分子在甲烷营养菌中的表达在本领域中是已知的(参看例如美国专利6,818,424、美国专利公布2003/0003528)。甲基营养菌的基于Mu转座子的转型已有描述(参看例如Akhverdyan等,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:857-871)。用于异源基因的单一和多拷贝表达而不会***灭活甲基杆菌中的宿主基因的mini-Tn7转座子***已有描述(参看例如美国专利公布2008/0026005)。
可以使用使甲烷营养菌中的内源基因功能灭活、敲除或缺失的各种方法。使用***载体在缓慢生长的甲烷营养菌中构建缺失/***突变体的等位基因交换也已经描述于Toyama和Lidstrom,1998,Microbiol.144:183-191；Stolyar等,1999,Microbiol.145:1235-1244；Ali等,2006,Microbiology 152:2931-2942；Van Dien等,2003,Microbiol.149:601-609中。
可以利用用于外源核酸的高度表达的适合的同源或异源启动子。举例来说，美国专利7,098,005描述了使用在甲烷或甲醇存在下高度表达的启动子用于甲烷营养菌中的异源基因表达。可以使用的额外的启动子包括脱氧木酮糖磷酸合成酶甲醇脱氢酶操纵子启动子(Springer等,1998,FEMS Microbiol.Lett.160:119-124)；用于PHA合成的启动子(Foellner等1993,Appl.Microbiol.Biotechnol.40:284-291)；或从甲基营养菌中的原生质粒鉴别的启动子(EP296484)。非原生启动子包括lac操纵子Plac启动子(Toyama等,1997,Microbiology 143:595-602)，或杂合启动子，诸如Ptrc(Brosius等,1984,Gene 27:161-172)。还可以利用在宿主C1代谢生物体中外源核酸分子的表达的调控。举例来说，甲基营养菌和甲烷营养菌中重组蛋白质表达的可诱导/可调控***已经描述于美国专利公布2010/0221813中。
如本文所提供的非天然存在的微生物还包含至少一种灭活的醇脱氢酶(ADH)。如本文所用的醇脱氢酶指的是催化醇可逆地转化成对应的醛或酮，同时NAD+还原成NADH的任何酶。如果醇脱氢酶与野生型或参考酶相比具有小于25％的活性或在暴露于化学或环境应激期间或之后与在正常条件期间相比具有小于25％的活性，那么这种醇脱氢酶被灭活。举例来说，灭活的ADH(例如，遗传灭活)与野生型ADH相比可以具有24％、20％、15％、10％、5％或1％或更小的活性。在另一个实例中，灭活的ADH在暴露于化学或环境应激(例如，热>60℃)期间或之后与不存在化学或环境应激的情况(例如，在常温下)相比可以具有24％、20％、15％、10％、5％或1％或更小的活性。根据本文所公开的实施方案中的任一者，至少一种醇脱氢酶包括甲醇脱氢酶。甲醇脱氢酶(MDH)催化甲醇转化成甲醛。ADH基因已经在许多微生物中鉴别到(参看例如Harms等,1987,J.Bacteriol.169:3969-3975；de Vries等,1992,J.Bacteriol.174:5346-5353；Anderson等,1990,Gene 90:173-176；Anthony和Williams,2003,Biochim.Biophys.Acta 1647:18-23；Ward等,2004,PLoS Biol.2:e303；Bennetzen和Hall,1982,J.Biol.Chem.257:3018-3025；Reid和Fewson,1994,Crit.Rev.Microbiol.20:13-56)。
醇脱氢酶可以显示出广泛的或非特异性的氧化活性(参看例如Anthony和Zatman,1965,Biochem.J.96:808；Lu等,2010,J.Am.Chem.Soc.132:15451-5)。由具有甲烷单加氧酶活性的酶产生的醇或环氧化物产物(包括甲醇)可以被内源醇脱氢酶进一步氧化成不合需要的产物。本文所提供的非天然存在的微生物由于甲醇、其它醇产物(例如，乙醇、丙醇以及丁醇)或环氧化物的下游代谢可能展现较差产率。通过使至少一种醇脱氢酶(例如，甲醇脱氢酶)灭活，可以实现醇或环氧化物产物损失的减少和产物产率的改善。在其它实施方案中，提供了非天然存在的微生物，其中两种、三种、四种或更多种醇脱氢酶被灭活。举例来说，可以在发孢甲基弯菌OB3b、荚膜甲基球菌菌株Bath以及嗜碱甲基微菌20Z中被灭活的ADH序列提供于SEQ IDNO:655-665中。ADH的灭活可以通过本领域中已知的方法来确认(参看例如Wadzinski和Ribbons,1975,J.Bacteriol.122:1364-1374；Frank等,1989,Eur.J.Biochem.184:187-195；Guo和Lidstrom,2006,Arch.Microbiol.186:139-49；Anthony和Zatman,1967,Biochem.J.104:960-9；Kalyuzhnaya等,2008,J.Bacteriol.190:3817-3823；Schmidt等,2010,Microbiol.156:2575-2586)。
在某些实施方案中，醇脱氢酶通过遗传修饰被灭活。使微生物中的内源基因功能灭活、敲除或缺失的遗传方法在本领域中是众所周知的。举例来说，在有待被灭活的基因的序列已知的情况下，可以使用靶向的基因破坏，其中将外来DNA***结构基因中以破坏转录。这可以用包含DNA***物(例如，遗传标志)的基因盒来实现，这些DNA***物侧接有与有待被破坏的基因的一部分具有高度同源性的序列。在将所述盒引入宿主微生物中之后，原生DNA复制机制将外来DNA***结构基因中(参看例如Hamilton等,1989,J.Bacteriol.171:4617-4622；Balbas等,1993,Gene 136:211-213)。基因破坏方法的实例包括转座子诱变(例如，Simon等,1983,Nature Biotechnol.1:784-791；Hayes,2003,Annual Rev.Genet.37:3-29)；内含子***(例如，Karberg等,2001,Nat.Biotechnol.19:1162-7；Zhong等,2003,Nucleic Acids Res.31:1656-64)；使用PCR片段的靶向敲除(例如，Murphy,2011,Methods Mol.Biol.765:27-42；Baudin等,1993,NucleicAcids Res.21:3320-30)；等位基因交换(例如，Toyama和Lidstrom,1998,Microbiol.144:183-191；Stolyar等,1999,Microbiol.145:1235-1244)；以及Cre-lox重组敲除***(例如，Gueldener等,2002,Nucleic AcidsRes.30:e23；Pomerantsev等,2006,Infect.Immun.74:682-693)。
在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶稳定的化学或环境应激使醇脱氢酶灭活。在其它实施方案中，醇脱氢酶通过化学或环境应激被灭活，这种化学或环境应激是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。如果针对在特定化学或环境应激中的稳定性来选择编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的核酸并且将其引入微生物中，那么转型的微生物暴露于特定化学或环境应激可以经过设计以保留MMO活性，同时使至少一种ADH(例如，MDH)灭活。在一些实施方案中，微生物的大量或大多数的内源酶通过化学或环境应激被灭活，但具有MMO活性的酶除外。使用化学或环境应激使下游醇(例如，甲醇)或环氧化物代谢酶灭活避免了需要进行ADH和其它非特异性酶的基因敲除，从而改善醇或环氧化物的生产效率。举例来说，非天然存在的微生物可以用编码在>60℃下热稳定的具有MMO活性的酶(例如，pMMO)的外源核酸来转型。微生物中的ADH(包括MDH)以及大多数其它内源酶在这种高温下被灭活，其允许有效地产生所需的醇(例如，甲醇)。因为甲烷的氧化是高度放热的，所以具有MMO活性的酶的增加的热稳定性的另一个优点在于其允许在更高温度下操作生物反应器，从而改善冷却效率并且降低成分，同时使得催化剂更加耐受小的局部温度剧增，这种温度剧增可能在商业级反应器中发生。此外，酶反应通常在更高温度下更快速地进行，这可以改善总体工艺产率。
在优选的实施方案中，所选的宿主微生物并不展现出引入微生物中的具有甲烷单加氧酶活性的酶所展现的特定的化学或环境应激稳定性。
环境或化学应激指的是影响微生物正常代谢、存活的能力，或微生物的蛋白质或酶(例如，甲醇脱氢酶)执行其功能的能力的条件。环境应激条件包括温度极限(热或冷)、光利用率、水利用率以及氧浓度。化学应激条件包括增加的金属浓度、pH应激(高酸度或碱度)、增加的盐浓度、暴露于化学品，以及低养分利用率。举例来说，环境应激可以是至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃或至少95℃的温度。在另一个实例中，化学应激可以是至少8、至少8.5、至少9、至少9.2、至少9.4、至少9.6、至少9.8或至少10的pH，或至多6、至多5.5、至多5、至多4.8、至多4.6、至多4.4、至多4.2或至多4的pH。根据本文所公开的实施方案中的任一者，化学或环境应激可以是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸的引入向如本文所提供的非天然存在的微生物赋予将甲烷转化成甲醇的能力。归因于具有甲烷单加氧酶活性的一些酶(例如，sMMO和pMMO)的广泛特异性，根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物可能还能够分别将乙烷、丙烷以及丁烷转化成其对应的醇，即乙醇、丙醇以及丁醇，或将乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯转化成其对应的环氧化物。在某些实施方案中，丁醇基本上包含正丁醇(即，正丁醇占丁醇产物的至少50％或更多)。在某些实施方案中，丙醇基本上包含正丙醇(即，正丙醇占丙醇产物的至少50％或更多)。在某些实施方案中，根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物能够将混合烷烃气体底物转化成混合醇产物。混合烷烃气体底物可以是湿(未处理的)天然气或其部分分离的衍生物(例如，在处理期间从湿天然气中分离的天然气液)。天然气液包括乙烷、丙烷以及丁烷。在某些实施方案中，根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物能够将低碳烷烃(即，选自甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷的两种或更多种烷烃的任何组合)转化成其对应的醇。
根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物可能还能够分别将乙烯、丙烯、丁烯、丁二烯转化成其对应的环氧化物，即环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷以及丁二烯1,2氧化物。在某些实施方案中，根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物能够将混合烯烃气体底物转化成混合环氧化物产物。混合烯烃气体底物可以是来自石油裂化器的气流或其部分分离的衍生物。在某些实施方案中，根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物能够将低碳烯烃(即，选自乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯的两种或更多种烯烃的任何组合)转化成其对应的环氧化物。
如本公开中所提到，具有甲烷单加氧酶活性的酶使用还原剂来催化甲烷和其它低碳烷烃氧化成其对应的醇或烯烃氧化成其对应的环氧化物，并且再生这种酶。sMMO的生理还原剂是NADH。然而，NADH或类似辅因子不太可能用于生物反应器中。已知具有甲烷单加氧酶活性的酶使用其它还原剂，诸如氢醌(例如，杜氢醌)、甲酸盐或H2(Shiemke等,1995,Arch.Biochem.Biophys.321:421-8；Shiemke等,2004,J.Bacteriol.186-928-937；Patel等,1982,Appl.Environ.Microbiol.44:1130-1137；Hanczar等,2002,Arch.Microbiol.177:167-172)。在某些实施方案中，根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物能够利用H2作为还原剂用于将甲烷转化成甲醇。在其它实施方案中，编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸已经使用本文所描述的基于***发育的方法进行遗传修饰以能够直接利用H2作为还原剂(即，没有任何辅助蛋白，诸如氢化酶)。在其它实施方案中，根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物包含编码氢化酶的核酸(外源或内源)，这种氢化酶能够使用H2作为还原剂。氢化酶催化分子氢的可逆氧化，并且可能是氢驱动的MMO活性所需要的。使用H2作为MMO活性的还原剂可以允许更好地控制热产生，因为甲烷氧化可以作为两个放热半反应而发生(见图1)，这两个放热半反应可以依序进行，而不是同时进行(即，CH4+O2+H2→H2O+CH3OH)。其次，水副产物的产生可以独立于甲醇产生而进行，从而减少对高成本的甲醇蒸馏的需要。
使用可用于几百种微生物的全基因组序列，在相关或远缘物种(包括例如同源物、直系同源物、间接同源物等)中编码具有甲烷单加氧酶活性的酶或醇脱氢酶的基因的鉴别是常规的并且在本领域中众所周知。因此，本文中关于来自特定微生物的特定核酸所描述的编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸可以容易地包括来自其它微生物的编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的其它核酸。此外，在宿主微生物中有待被灭活的醇脱氢酶的鉴别可以通过宿主微生物序列与同源或异源微生物中已知的醇脱氢酶蛋白质的相似度来鉴别。
本文所描述的蛋白质、蛋白质域以及其片段(诸如具有甲烷单加氧酶活性的酶或醇脱氢酶)的多肽序列和编码核酸可以包括天然的和重组工程改造的变体。核酸变体指的是可以含有一个或多个取代、添加、缺失、***，或可以是或包含参考核酸的片段的核酸。参考核酸指的是所选的野生型或亲本核酸，其编码具有甲烷单加氧酶活性的酶。变体核酸与参考核酸可以具有40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，只要变体核酸编码仍然可以执行必需的功能或生物活性(例如，使甲烷氧化成甲醇)的多肽即可。变体多肽与参考蛋白可以具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，只要变体多肽仍然可以执行其必需的功能或生物活性(例如，使甲烷氧化成甲醇)即可。在某些实施方案中，引入根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物中的具有甲烷单加氧酶活性的酶包含与选自SEQ IDNO:1-643、SEQ ID NO:644-648以及SEQ ID NO:649-654的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，在根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物中被灭活的醇脱氢酶包含与选自SEQ ID NO:655-665的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。这些变体相比亲本(或野生型)蛋白质可以具有改善的功能和生物活性(例如，更高的酶活性或对底物改善的特异性)。归因于遗传密码中的冗余，核酸变体可能影响或可能不影响氨基酸序列。核酸变体还可以编码与参考氨基酸序列相比包含一个或多个保守取代的氨基酸序列。保守取代可以在多肽中天然地发生(例如，天然存在的遗传变体)，或当重组产生多肽时可以被引入。保守取代是一个氨基酸取代具有类似特性的另一个氨基酸，以使得本领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲疏水性质(hydropathic nature)基本上不改变。氨基酸取代一般可以基于残基的极性、电荷、可溶性、疏水性和/或两亲性质的相似性来进行，并且在本领域中是已知的。可以使用众所周知和常规实施的诱变方法将氨基酸取代、缺失以及添加引入多肽中(参看例如Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY 2001)。寡核苷酸引导的位点特异性(或区段特异性)诱变程序可以用于提供改变的多聚核苷酸，其具有根据所需的取代、缺失或***而改变的特定密码子。蛋白质的缺失或截短变体还可以通过使用邻近于所需缺失的适宜的限制性核酸内切酶位点来构建。或者，诸如丙氨酸扫描诱变、易错聚合酶链反应诱变以及寡核苷酸引导的诱变的随机诱变技术可以用于制备多肽变体(参看例如Sambrook等,同上)。
编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的核酸可以与其它核酸序列组合，诸如启动子、多聚腺苷酸化信号、限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段，等等。
野生型(或亲本)核酸或多肽与其变体之间的差异可以通过本领域中常规实施的方法来确定以确定同一性，这些方法经过设计以在所测试的序列之间得到最大匹配。用以确定序列同一性的方法可以从公开可用的计算机程序来应用。用以确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括例如BLASTP、BLASTN(Altschul,S.F.等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))以及FASTA(Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85；2444-2448(1988))。程序的BLAST系列从NCBI和其它来源公开可用(BLAST Manual,Altschul,S.等,NCBI NLM NIHBethesda,MD)。
用于确定多肽变体是否折叠成与非变体多肽或片段可比的构象的试验包括例如蛋白质与对原生或未折叠的表位具有特异性的单克隆或多克隆抗体反应的能力、配体结合功能的保留、酶活性的保留(如适用)以及突变型蛋白质对于用蛋白酶消化的敏感性或抗性(参看Sambrook等,同上)。多肽、变体以及其片段可以在不改变所得蛋白质分子的生物活性的情况下(即，在不以统计上显著或生物学上显著的方式改变一种或多种功能活性的情况下)制备。举例来说，所述取代一般通过将一个氨基酸与包括在同一组内的另一个氨基酸互换来进行，所述组诸如极性残基、带电残基、疏水残基和/或小残基等的组。任何氨基酸取代的影响可以仅仅通过针对在生物试验中发挥功能的能力或结合至同源配体或靶分子的能力来测试所得经过修饰的蛋白质以经验方式确定。
密码子优化
重组蛋白质的表达在其原始宿主外往往很困难。举例来说，密码子使用偏性的变化已经在细菌的不同物种间观测到(Sharp等,2005,Nucl.Acids.Res.33:1141-1153)。重组蛋白质甚至在其原生宿主内的过度表达也可能很困难。在本发明的某些实施方案中，有待引入根据本文所公开的实施方案中的任一者的微生物中的核酸(例如，编码在化学或环境应激存在下稳定的具有甲烷单加氧酶活性的酶的核酸)可以经历密码子优化以增强蛋白质表达。密码子优化指的是改变用于生物体转型的核酸的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用而不改变DNA编码的多肽。用于异源生物体中的最佳基因表达的密码子优化方法在本领域中是已知的并且先前已有描述(参看例如Welch等,2009,PLoS One 4:e7002；Gustafsson等,2004,TrendsBiotechnol.22:346-353；Wu等,2007,Nucl.Acids Res.35:D76-79；Villalobos等,2006,BMC Bioinformatics 7:285；美国专利公布2011/0111413；以及美国专利公布2008/0292918)。
使用非天然存在的微生物使烃氧化的方法
在某些实施方案中，提供了将甲烷转化成甲醇的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含甲烷的气体底物；以及还原剂；其中将甲烷气体转化成甲醇。根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物可以作为活的全细胞(例如，在培养物中、在生物膜上或作为湿细胞浆)、非活的全细胞(例如，冻干的全细胞制剂、冻干细胞的复原的全细胞制剂)，或来源于其的无细胞部分(例如，膜部分)而提供。甲烷单加氧酶活性可以通过与特定细胞器缔合而从全细胞中分离，从而允许使用差速离心所得到的无细胞部分(参看例如Nguyen等,1994,J.Biol.Chem.269:14995-15005；Scott和Higgins,1981,Microbiol.125:63-72)。无细胞部分可以包括离心的无细胞提取物的细胞裂解物和可溶部分或膜部分。无细胞部分还可以包括含有具有MMO活性的酶的蛋白质提取物，诸如洗涤剂溶解的部分(参看例如Smith和Dalton,1989,Eur.J.Biochem.182:667-671)或纯化的酶(参看例如Lieberman等,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:3820-3825)。全细胞和无细胞部分可以呈基本上无水状态(例如，冻干的)而提供。具有MMO活性的酶(例如，pMMO)的冻干制剂已经显示保留催化活性(参看例如美国专利公布2002/0168733；Nguyen等,1994,J.Biol.Chem.269:14995-15005)。
在某些实施方案中，非天然存在的微生物是甲烷营养菌。在某些实施方案中，具有甲烷单加氧酶活性的酶是pMMO、sMMO、氨单加氧酶或P450。在其它实施方案中，pMMO酶包含如由SEQ IDNO:644-648提供的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1-643提供的氨基酸序列的遗传工程改造的稳定变体。在其它实施方案中，AMO酶包含选自SEQ ID NO:652-654的氨基酸序列或包含SEQ ID NO:649-651中的任一者的氨基酸序列的遗传工程改造的稳定变体。
在某些实施方案中，使用根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分将甲烷转化成甲醇的方法在化学或环境应激下进行。在其它实施方案中，化学或环境应激是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。化学或环境应激可以是至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃或至少95℃的温度。在另一个实例中，化学应激可以是至少8、至少8.5、至少9、至少9.2、至少9.4、至少9.6、至少9.8、至少10的pH或至多6、至多5.5、至多5、至多4.8、至多4.6、至多4.4、至多4.2、至多4的pH。
在某些实施方案中，醇脱氢酶通过化学或环境应激被灭活。在一些实施方案中，醇脱氢酶通过化学或环境应激被灭活，这种化学或环境应激是>60℃的温度、>9的pH或<5的pH。或者，醇脱氢酶可以通过遗传修饰被灭活。至少一种在非天然存在的微生物中被灭活的醇脱氢酶可以包括甲醇脱氢酶。在甲烷营养菌中可以被灭活的醇脱氢酶的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO:655-665提供。
使根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分暴露于包含甲烷的气体底物，其提供了用于转化成甲醇的甲烷底物。包含甲烷的气体底物可以是基本上纯化的形式，诸如管道质量天然气。在某些实施方案中，包含甲烷的气体底物是气体的混合物，诸如湿天然气。气体混合物可以包含低碳烷烃(例如，选自由甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷组成的群组的两种或更多种烷烃的任何组合)。
二氧(O2)作为氧化剂提供，其中一个氧原子被还原以形成H2O，而另一个并入至甲烷中以形成甲醇。O2的来源可以是空气、纯O2或包含O2的合成气体混合物(例如，O2与N2的混合物)。在某些实施方案中，O2与包含甲烷的气体底物混合。气态O2可以在注入容纳非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分的生物反应器中之前与气体底物混合，或气体可以同时但独立地注入生物反应器中，其中混合在通过生物反应器期间发生。或者，将O2在包含甲烷的气体底物之前提供给非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分。在O2在包含甲烷的气体底物之前提供的某些实施方案中，O2向生物反应器中的进料可以在将气体底物引入生物反应器中之后继续进行，或可以在添加之后或添加气体底物之前停止。在O2在包含甲烷的气体底物之前提供的某些实施方案中，使非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分暴露于O2一段足够的时间以使得很大一部分具有MMO活性的酶已经使二氧活化。
提供还原剂用于推动甲烷氧化并且再生具有甲烷单加氧酶活性的酶，并且可以是能够驱动甲烷单加氧酶活性的任何还原剂，包括例如H2、甲酸盐以及氢醌。在某些实施方案中，利用H2气作为还原剂。在其它实施方案中，将H2气与包含甲烷的气体底物混合提供给非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分。气态H2可以在注入容纳非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分的生物反应器中之前与气体底物混合，或气体可以同时但独立地注入生物反应器中，其中混合在通过生物反应器期间发生。或者，将H2气在包含甲烷的气体底物之后依序提供给非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分。在H2在包含甲烷的气体底物之后提供的某些实施方案中，气体底物向生物反应器中的进料可以在将H2引入生物反应器中之后继续进行，或可以在添加之后或添加H2之前停止。在H2在包含甲烷的气体底物之后提供的某些实施方案中，使非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分暴露于包含甲烷的气体底物一段足够的时间以使得很大一部分具有MMO活性的酶已经使甲烷氧化并且被锁定于氧结合的状态。包含甲烷的气体底物和H2气的依序添加可以将甲烷氧化反应分成两个催化步骤(见图1)，从而允许对生物反应器进行更好的热控制。
在某些实施方案中，还原剂是甲酸盐。
在某些实施方案中，本文所描述的方法使用固定于固体基质上、固体基质内或固体基质背面的根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分。在其它实施方案中，非天然存在的微生物或来源于其的无细胞提取物呈基本上无水状态(例如，冻干的)。非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分暂时或永久地附着于生物反应器内的固体基质上、固体基质内或固体基质背面。将养分、底物以及其它所需因子供给固体基质以使得细胞可以催化所需反应。非天然存在的微生物可以在固体基质的表面(例如，呈生物膜形式)上生长。非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分可以附着于固体基质的表面上或固体基质内，而没有细胞生长或呈非活的状态。微生物的示例性固体基质支撑体包括聚丙烯环、陶瓷生物环、陶瓷鞍、纤维支撑体(例如，膜)、多孔玻璃珠、聚合物珠、木炭、活性碳、干燥硅胶、颗粒氧化铝、渥太华砂(Ottawa sand)、粘土、聚氨酯细胞支撑片以及流化床粒子载体(例如，砂、粒状活性碳、硅藻土、海藻酸钙凝胶珠)。
非天然存在的甲烷营养菌可以使用本领域中已知的多种方法来培养。在某些实施方案中，使培养物在控制培养单元中生长，诸如发酵罐、生物反应器、中空纤维膜生物反应器、填充床生物反应器，等等。经典的分批培养方法是封闭***，其中在培养开始时设定培养基的组成，并且在培养过程中不会经受外部改变。因此，在培养过程开始时，用所需生物体或生物体接种培养基，并且在不向***中添加任何物质的情况下允许生长或代谢活性发生。通常，然而，“分批”培养是关于添加碳源的批次，并且常常在诸如pH和氧浓度的控制因素下进行尝试。在分批***中，***的代谢物和生物质组成不断地变化直至终止培养的时间。在分批培养物内，细胞缓和通过静态停滞期至高度生长对数期并且最终到达静止期，在静止期中生长速率减小或停止。如果未加处理，那么在静止期中的细胞将最终死亡。在对数期中的细胞常常负责一些***中的最终产物或中间物的大量生产。静止期或后指数期生产可以在其它***中获得。
补料分批***是标准分批***的变化。补料分批培养过程包含具有以下修改的典型分批***：随着培养进行以增量方式添加底物。当降解物阻遏倾向于抑制细胞代谢时并且在需要培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批***是适用的。补料分批***中实际底物浓度的测量是困难的并且因此基于可测量因素的变化来估计，这些因素诸如pH、溶解氧以及如CO2的废气的分压。分批和补料分批培养方法是常用的并且在本领域中是已知的(参看例如Thomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA；Deshpande,1992,Appl.Biochem.Biotechnol.36:227，以引用的方式并入本文中)。
连续培养是“开放”***，其中将确定成分培养基连续添加至生物反应器中并且同时移出等量的条件培养基以供处理。连续培养一般将细胞维持于恒定的高液相密度下，其中细胞主要处于对数期生长中。或者，可以用固定的细胞实施连续培养，其中连续添加碳和养分并且从细胞团中连续地移出有价值的产物、副产物以及废产物。细胞固定可以使用大范围的由天然和/或合成材料组成的固体支撑体来进行。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一个因素或许多因素。举例来说，一种方法将以固定比率维持有限的养分，诸如碳源或氮水平，并且允许调节所有其它参数。在其它***中，可以连续地改变影响生长的许多因素，同时使通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续***努力维持稳态生长条件，并且因此由于抽去培养基而引起的细胞损失必须与培养物中的细胞生长速率保持平衡。调节连续培养过程的养分和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术在本领域中是众所周知的，并且多种方法由Brock(同上)详述。
液相生物反应器(例如，搅拌槽、填充床、单液相、双液相、中空纤维膜)在本领域中是众所周知的，并且可以用于根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物的生长以及生物催化。然而，甲烷和其它烃在水中相对低的溶解度可能限制具有甲烷单加氧酶活性的酶的催化速率。
通过使用气相生物反应器，用于生物催化或生物修复的底物被根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分从气体吸收，而不是从液体吸收。具有微生物的气相生物反应器的使用在本领域中是已知的(例如，美国专利2,793,096；U.S.4,999,302；美国专利5,585,266；U.S.5,079,168；美国法定发明登记H1430；美国专利公布2003/0032170；Emerging Technologies inHazardous Waste Management III,1993,Tedder和Pohland编,第411-428页；美国专利6,143,556)。示例性气相生物反应器包括单流程***、封闭回路泵送***以及流化床反应器。通过利用气相生物反应器，甲烷或其它气态底物可容易地用于由具有甲烷单加氧酶活性的酶进行生物催化。此外，甲醇产物从水溶液中的蒸馏，这代表了液相生物反应器中的显著成本，可以在气相生物反应器中得以避免。在某些实施方案中，根据本文所公开的实施方案中的任一者的方法在气相生物反应器中进行。在某些实施方案中，根据本文所公开的实施方案中的任一者的方法在流化床反应器中进行。在流化床反应器中，流体(即，气体或液体)向上通过粒子床载体，通常是砂、粒状活性碳或硅藻土，微生物可以在这些载体上附着并生长。流体速度是粒子床载体和所附着的微生物悬浮(即，床流化)的速度。附着至粒子床载体的微生物在流体中自由地循环，从而允许流体中的底物至微生物的有效质量转移以及增加的微生物生长。示例性流化床反应器包括推流反应器和完全混合反应器。具有微生物生物膜的流化床反应器的使用在本领域中是已知的(例如，Pfluger等,2011,Bioresource Technology102:9919-9926；Fennell等,1992,Biotechnology and Bioengineering40:1218-1232；Ruggeri等,1994,Water Science Technology 29:347-351；美国专利4,032,407；美国专利4,009,098；美国专利4,009,105；以及美国专利3,846,289)。
本公开中所提供的甲烷营养菌可以作为分离的纯培养物生长，与可以帮助生长的异源非甲烷营养性生物体或与甲烷营养菌的一种或多种不同菌株/或物种可以组合产生混合培养物。
如本公开中所提到，具有甲烷单加氧酶活性的酶可以具有广泛的底物特异性，并且可以将包括乙烷、丙烷以及丁烷的其它低碳烷烃氧化成其对应的醇并且将包括乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯的低碳烯烃氧化成其对应的环氧化物。因此，根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物以及将甲烷转化成甲醇的方法可以类似地应用于转化以下的方法：乙烷转化成乙醇、丙烷转化成丙醇、丁烷转化成丁醇、包含低碳烷烃的混合烷烃气体底物转化成混合醇产物、乙烯转化成环氧乙烷、丙烯转化成环氧丙烷、丁烯转化成环氧丁烷，或包含低碳烯烃的混合烯烃气体底物转化成混合环氧化物产物。
在某些实施方案中，提供了将乙烷转化成乙醇的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含乙烷的气体底物；以及还原剂；其中将乙烷气体转化成乙醇。
在某些实施方案中，提供了将丙烷转化成丙醇的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含丙烷的气体底物；以及还原剂；其中将丙烷气体转化成丙醇。在其它实施方案中，丙醇基本上包含正丙醇。
在某些实施方案中，提供了将丁烷转化成丁醇的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含丁烷的气体底物；以及还原剂；其中将丁烷气体转化成丁醇。在其它实施方案中，丁醇基本上包含正丁醇。
在某些实施方案中，提供了将混合烷烃气体底物转化成混合醇产物的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含低碳烷烃的混合气体底物；以及还原剂；其中将低碳烷烃转化成对应的醇。包含低碳烷烃的混合气体底物可以包含两种或更多种来自由以下组成的群组的烷烃：甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷。
在某些实施方案中，本公开所提供的将甲烷转化成甲醇的方法在环境温度和压力下氧化至少1、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol甲烷/min/mg催化剂(例如，全细胞或无细胞提取物)干重。在某些实施方案中，本文所提供的将甲烷转化成甲醇的方法产生>1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L或>50000L甲醇/天。
在某些实施方案中，本公开所提供的将乙烷转化成乙醇的方法在环境温度和压力下氧化至少1、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol乙烷/min/mg催化剂(例如，全细胞或无细胞提取物)干重。在某些实施方案中，本文所提供的将乙烷转化成乙醇的方法产生>1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L或>50000L乙醇/天。
在某些实施方案中，本公开所提供的将丙烷转化成丙醇的方法在环境温度和压力下氧化至少1、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol丙烷/min/mg催化剂(例如，全细胞或无细胞提取物)干重。在某些实施方案中，本文所提供的将丙烷转化成丙醇的方法产生>1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L或>50000L丙醇/天。
在某些实施方案中，本公开所提供的将丁烷转化成丁醇的方法在环境温度和压力下氧化至少1、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol丁烷/min/mg催化剂(例如，全细胞或无细胞提取物)干重。在某些实施方案中，本文所提供的将丁烷转化成丁醇的方法产生>1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L或>50000L丁醇/天。
在某些实施方案中，提供了将乙烯转化成环氧乙烷的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含乙烯的气体底物；以及还原剂；其中将乙烯气体转化成环氧乙烷。
在某些实施方案中，提供了将丙烯转化成环氧丙烷的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含丙烯的气体底物；以及还原剂；其中将丙烯气体转化成环氧丙烷。在其它实施方案中，环氧丙烷基本上包含环氧正丙烷。
在某些实施方案中，提供了将丁烯转化成环氧丁烷的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含丁烯的气体底物；以及还原剂；其中将丁烯气体转化成环氧丁烷。在其它实施方案中，环氧丁烷基本上包含环氧正丁烷。
在某些实施方案中，提供了将丁二烯转化成包含丁二烯1,2氧化物的环氧化物产物的方法。
在某些实施方案中，提供了将混合烯烃气体底物转化成混合环氧化物产物的方法，这种方法包括：提供根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；使非天然存在的微生物暴露于O2；包含低碳烯烃的混合气体底物；以及还原剂；其中将低碳烯烃转化成对应的环氧化物。包含低碳烯烃的混合气体底物可以包含两种或更多种来自由以下组成的群组的烯烃：乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯。
在某些实施方案中，本公开所提供的将乙烷转化成乙烯的方法在环境温度和压力下氧化至少1、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol乙烯/min/mg催化剂(例如，全细胞或无细胞提取物)干重。在某些实施方案中，本文所提供的将乙烯转化成环氧乙烷的方法产生>1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L或>50000L环氧乙烷/天。
在某些实施方案中，本公开所提供的将丙烯转化成环氧丙烷的方法在环境温度和压力下氧化至少1、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol丙烯/min/mg催化剂(例如，全细胞或无细胞提取物)干重。在某些实施方案中，本文所提供的将丙烯转化成环氧丙烷的方法产生>1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L或>50000L环氧丙烷/天。
在某些实施方案中，本公开所提供的将丁烯转化成环氧丁烷的方法在环境温度和压力下氧化至少1、5、10、30、50、70、90、100、150、200、250、300、500nmol丁烯/min/mg催化剂(例如，全细胞或无细胞提取物)干重。在某些实施方案中，本文所提供的将丁烯转化成环氧丁烷的方法产生>1L、>10L、>100L、>1000L、>10000L或>50000L环氧丁烷/天。
应了解，根据本文所公开的实施方案中的任一者的方法可以使用包含两种或更多种低碳烷烃(例如，甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷)和低碳烯烃(例如，乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯)的任何组合的气体底物。举例来说，气体底物可以仅包含烷烃，仅包含烯烃，或包含两者的组合。
使烃氧化的***
在某些实施方案中，提供了将烷烃转化成醇或将烯烃转化成环氧化物的***，其包括：气相生物反应器，所述气相生物反应器包含固定于固体基质上的根据本文所公开的实施方案中的任一者的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；连接器，所述连接器用于将包含至少一种低碳烷烃或烯烃的气体底物从气源运送至生物反应器中；其中将气体底物传送至紧密靠近非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分以使得这种微生物或无细胞部分将低碳烷烃氧化成对应的醇产物或将烯烃氧化成对应的环氧化物产物。示例性***提供于图2中。用于甲烷催化转化成甲醇、其它烷烃转化以及烯烃转化成环氧化物的包括气相反应器、连接器、气源、冷凝器、蒸馏单元以及再循环单元的***在本领域中是众所周知的，并且可以适合于气相生物反应器。
在某些实施方案中，使烃转化氧化的***进一步包括化学或环境控制单元，其能够维持反应器中的化学或环境应激条件。举例来说，控制单元可以维持生物反应器中特定的温度或温度范围、特定的pH或pH范围，或特定的盐或化学浓度或浓度范围。在一些实施方案中，环境控制单元包括温度控制单元，其能够维持生物反应器中至少60℃的恒温。在其它实施方案中，化学控制单元包括pH控制单元，其能够维持生物反应器中至少9的pH、或者5或低于5的pH。在某些实施方案中，温度控制单元能够维持至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃或至少95℃的温度。化学控制单元能够维持至少8、至少8.5、至少9、至少9.2、至少9.4、至少9.6、至少9.8或至少10的pH，或至多6、至多5.5、至多5、至多4.8、至多4.6、至多4.4、至多4.2或至多4的pH。
在某些实施方案中，***可以进一步包括用于将H2从H2气源运送至生物反应器中的连接器。在某些实施方案中，***可以进一步包括用于将空气从空气源运送至生物反应器中的连接器。在某些实施方案中，***可以进一步包括用于将O2从O2气源运送至生物反应器中的连接器。
在某些实施方案中，***可以进一步包括用于收集醇或环氧化物产物的收集单元。在其它实施方案中，收集单元进一步包括冷凝器。冷凝器可以用于将从生物反应器外流至收集单元中的气体蒸气冷却成液体。收集单元可以进一步包括用于分离醇或环氧化物产物与水副产物或其它杂质的蒸馏单元。
在某些实施方案中，***可以进一步包括用于将气体底物中的任何未转化的低碳烷烃或烯烃再循环返回至生物反应器中用于生物催化的再循环单元。
在某些实施方案中，气态底物包含甲烷，并且对应的醇产物包含甲醇。在某些实施方案中，气态底物包含乙烷，并且对应的醇产物包含乙醇。在某些实施方案中，气态底物包含丙烷，并且对应的醇产物包含丙醇。在其它实施方案中，丙醇基本上包含正丙醇。在某些实施方案中，气态底物包含丁烷，并且对应的醇产物包含丁醇。在其它实施方案中，丁醇基本上包含正丁醇。在某些实施方案中，气态底物包含低碳烷烃的混合物(以下烷烃中的两者或更多者的任何组合：甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷)。在某些实施方案中，气态底物包含乙烯，并且对应的环氧化物产物包含环氧乙烷。在某些实施方案中，气态底物包含丙烯，并且对应的环氧化物产物包含环氧丙烷。在某些实施方案中，气态底物包含丁烯，并且对应的环氧化物产物包含环氧丁烷。在某些实施方案中，气态底物包含丁二烯，并且对应的环氧化物产物包含丁二烯1,2氧化物。
在某些实施方案中，气相生物反应器是流化床反应器。在某些实施方案中，固体基质是聚丙烯环、陶瓷生物环、陶瓷鞍、纤维支撑体(例如，膜)、多孔玻璃珠、聚合物珠、木炭、活性碳、干燥硅胶、颗粒氧化铝、渥太华砂、粘土、聚氨酯细胞支撑片或流化床粒子载体(例如，砂、粒状活性碳、硅藻土、海藻酸钙凝胶珠)。在某些实施方案中，固体基质包含聚丙烯、陶瓷、玻璃、木炭、砂、活性碳或硅藻土。在某些实施方案中，非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分呈基本上无水状态(例如，冻干的)固定于固体基质上。
实施例
实施例1：发孢甲基弯菌甲烷营养菌生长和转型
培养基制备.
制备NMS培养基.
MgSO4·7H2O......................................1.0g
CaCl2·6H2O......................................0.20g
螯合铁溶液(见下文).........................2.0ml
KNO3....................................................1.0g
微量元素溶液(见下文)......................0.5ml
KH2PO4..............................................0.272g
Na2HPO4·12H2O..............................0.717g
纯化的琼脂(例如，Oxoid L28).........12.5g
蒸馏过的去离子水...................................1.0L
调整pH至6.8。在121℃下高压灭菌15分钟。
螯合铁溶液：
柠檬酸铁(III)铵*..................0.1g
EDTA钠盐...........................0.2g
HCl(浓)..............................0.3ml
蒸馏过的去离子水............100.0ml
*0.5g氯化铁(III)可以替代。
每升最终培养基使用2.0ml这种螯合铁溶液。
微量元素溶液：
EDTA............................500.0mg
FeSO4·7H2O................200.0mg
ZnSO4·7H2O.................10.0mg
MnCl2·4H2O...................3.0mg
H3BO3.............................30.0mg
CoCl2·6H2O..................20.0mg
CaCl2·2H2O....................1.0mg
NiCl2·6H2O....................2.0mg
Na2MoO4·2H2O.............3.0mg
蒸馏水................................1.0L
在121℃下高压灭菌15分钟。
生长和缀合。将来自大肠杆菌的质粒缀合至甲烷营养菌中的程序是基于由Martin,H.和Murrell,J.C.(1995)开发的方法。通过标志交换诱变来构建发孢甲基弯菌的甲烷单加氧酶突变体。FEMS Microbiol.Lett.127:243-248。
简单地说，使用标准电穿孔方法将有待缀合的动员质粒首先转型至大肠杆菌S17-1中。通过在含有20ug/mL卡那霉素的LB琼脂上选择卡那霉素(kanamycin)抗性集落来确认转型。将转型的集落接种至含有20ug/mL卡那霉素的LB培养基中，并且在37℃下振荡过夜。然后，在无菌的47mm硝化纤维素过滤器(0.2mm孔径)上收集过夜培养物的10mL等分试样。在过滤器上用50mL无菌NMS培养基洗涤大肠杆菌供体菌株以去除残余培养基和抗生素。
平行地，将发孢甲基弯菌(M.trichosporium)OB3b受体菌株的样品接种至含有20-50mL NMS培养基的100mL血清瓶中。然后，用氧气与甲烷的1:1混合物吹扫瓶的顶空，并且用丁基丁基橡胶隔片将瓶密封并卷边。在30℃孵育箱中连续振荡这些瓶直至达到约0.3的OD600。然后，在与大肠杆菌供体菌株相同的过滤器上收集细胞。再次用50mL无菌NMS培养基洗涤过滤器。将过滤器放置(细胞朝上)在含有0.02％(w/v)朊蛋白胨的NMS琼脂板上，并且在30℃下在甲烷和氧气存在下孵育24小时。24小时后，使细胞再悬浮于10mL无菌(NMS)培养基中，随后通过离心而浓缩。使团粒再悬浮于1mL无菌NMS培养基中。将等分试样(100ul)铺展至含有10ug/mL卡那霉素的NMS琼脂板上。
在维持于30℃下的含有甲烷与氧气的1:1混合物的密封室中孵育这些板。每2天补充气体混合物直至形成集落，通常在7-14天之后。将集落划线至含有卡那霉素的NMS板上以确认卡那霉素抗性以及进一步分离转型的甲烷营养菌细胞与残余大肠杆菌供体细胞。
实施例2：将热稳定的pMMO基因引入发孢甲基弯菌甲烷营养菌中。
用适当启动子合成来自温泉甲基热菌(Methylothermus thermalis)的所有pMMO亚单元的密码子优化的型式(SEQ ID NO:176和648)。然后，将基因克隆并且都转型至如上文所描述的野生型发孢甲基弯菌中。通过细胞对抗生素选择的抗性来确认转型，并且通过northern印迹法(以确认RNA转录)、western印迹法或ELISA方法(以确认蛋白质表达)来确认基因表达。
为了确认热稳定的pMMO酶的活性，将转型的细胞和非转型的对照接种至含有20-50mL NMS培养基和10ug/mL卡那霉素的100mL血清瓶中。用甲烷与氧气的1:1混合物吹扫瓶的顶空，并且用丁基橡胶隔片将瓶密封并卷边。然后连续振荡这些瓶，同时在30℃下孵育。每2天更新顶空气体直至达到约0.5的OD600。通过离心收集细胞，用25mM MOPS[3-(N-吗啉基)丙烷磺酸]、2mM L-半胱氨酸以及1mM CuSO4(pH 7.0)洗涤，然后再悬浮于等体积的相同缓冲液中。分析细胞制剂的MMO活性，其在本文中定义为每分钟每毫克细胞干重所形成的环氧丙烷的量。反应容器由用铝盖和聚四氟乙烯内衬的丁基橡胶隔片密封的具有10ml顶空的小瓶组成。将1mL细胞悬浮液等分至每个小瓶中，并且将小瓶密封并卷边。使反应混合物升温至28℃或60℃，并且孵育10分钟，随后添加底物。将丙烯和O2注入顶空(1:1混合物)中之后，在适当温度下在旋转振荡器上以150rpm或200rpm振荡小瓶。30分钟后从水相移出样品并且通过气相色谱法分析。为了实现多次酶周转，将H2以等体积比包括在气体混合物中。通过在转型与未转型的细胞之间比较60℃下所观测到的丙烯氧化活性的差异来确定嗜热pMMO活性。
气相色谱法.用含有填充有80×100目Carbopack C+0.1％SP-1000(Supelco)的玻璃柱(2.6mm内径，3.1m)的Shimadzu GC-14A型气相色谱仪来定量环氧丙烷形成。气相色谱仪用AOC-17自动注射器和Shimadzu CR-601Chromatopac记录器构造。氦气用作载气(20ml/min)。注射器和检测器(火焰离子化检测器)温度分别是200℃和175℃。将含水样品在80℃下等温操作6分钟。在单时间点试验中通过将峰面积与标准回归曲线相比较来定量产物形成。
实施例3：在发孢甲基弯菌甲烷营养菌中由热稳定的pMMO产生醇。
将上文所描述的热稳定的pMMO转型的菌株的瓶生长培养物以1:100接种至3L New Brunswick夹套型发酵容器中的1L NMS培养基中。在50mL/min甲烷和100mL/min O2的恒定进料下以800rpm搅拌培养物。适当时通过在线添加NaOH和HCl来维持pH。将温度维持于30℃。NaNO3、KHPO4、CuSO4以及Fe-EDTA的添加是根据细胞的生长速率以一定时间间隔进行。在晚对数期(OD约25)通过离心收集细胞并且如上述用MOPS缓冲液洗涤。
将细胞固定于固相支撑体上，例如ISOLITETM，其为硅藻土产品(78％SiO2、12％Al2O3以及5％Fe2O3)，这种固相支撑体用于固定细胞并且用于土壤通气。这是对许多有机分子没有吸附能力的惰性材料。在去离子水中预先洗涤ISOLITETM以除尘，然后在120℃下在烘箱中干燥48小时。将再悬浮细胞的300ml样品添加至烧瓶中的150克ISOLITETM中。然后，将烧瓶放置在孵育箱/振荡器上(20rpm，在55℃下)一小时以使细胞结合至ISOLITETM。然后从ISOLITETM中去除水相，并且干燥固相并填充至标准的1cm直径不锈钢反应器中。将反应器加热至60℃并且连接至10mL/min 25:25:50甲烷:H2:O2的连续进料。反应器出口以1:100分割用于通过气相色谱法进行连续废气分析，而大部分流传送至冷凝器以捕获水与甲醇。通过气相色谱法以及通过在多个时间点评估冷凝器中捕获的大批物质来实时检测甲醇。
实施例4：荚膜甲基球菌甲烷营养菌生长和转型
生长和缀合。将来自大肠杆菌的质粒缀合至甲烷营养菌中的程序是基于由Martin,H.和Murrell,J.C.(1995)开发的方法。通过标志交换诱变来构建荚膜甲基球菌的甲烷单加氧酶突变体。FEMS Microbiol.Lett.127:243-248。
简单地说，使用标准电穿孔方法将有待缀合的动员质粒首先转型至大肠杆菌S17-1中。通过在含有20ug/mL卡那霉素的LB琼脂上选择卡那霉素抗性集落来确认转型。将转型的集落接种至含有20ug/mL卡那霉素的LB培养基中，并且在37℃下振荡过夜。然后，在无菌的47mm硝化纤维素过滤器(0.2mm孔径)上收集过夜培养物的10mL等分试样。在过滤器上用50mL无菌NMS培养基洗涤大肠杆菌供体菌株以去除残余培养基和抗生素。
平行地，将荚膜甲基球菌(M.capsulatus)受体菌株的样品接种至含有20-50mL NMS培养基的100mL血清瓶中。然后，用氧气与甲烷的1:1混合物吹扫瓶的顶空，并且用丁基丁基橡胶隔片将瓶密封并卷边。在45℃孵育箱中连续振荡这些瓶直至达到约0.3的OD600。然后，在与大肠杆菌供体菌株相同的过滤器上收集细胞。再次用50mL无菌NMS培养基洗涤过滤器。将过滤器放置(细胞朝上)在含有0.02％(w/v)朊蛋白胨的NMS琼脂板上，并且在37℃下在甲烷和氧气存在下孵育24小时。24小时后，使细胞再悬浮于10mL无菌(NMS)培养基中，随后通过离心而浓缩。使团粒再悬浮于1mL无菌NMS培养基中。将等分试样(100μl)铺展至含有10μg/mL卡那霉素的NMS琼脂板上。
在维持于45℃下的含有甲烷与氧气的1:1混合物的密封室中孵育这些板。每2天补充气体混合物直至形成集落，通常在7-14天之后。将集落划线至含有卡那霉素的NMS板上以确认卡那霉素抗性以及进一步分离转型的甲烷营养菌细胞与残余大肠杆菌供体细胞。
实施例5：ADH基因从荚膜甲基球菌甲烷营养菌中缺失。
从荚膜甲基球菌中去除可能通过氧化甲醇而降低生产产率的原生adh基因。合成荚膜甲基球菌adh基因Genbank登录号AAU92947.1(SEQ ID NO:655)、AAU92153.1(SEQ ID NO:656)以及AAU91107.1(SEQ ID NO:657)的合成cDNA构建体，其在每个基因的5'区中并有几个终止突变和读框移位。将这些cDNA构建体克隆至用于缀合，但缺乏在甲烷营养菌中发挥功能的复制起点的适当载体中，并且使用上文所描述的方法引入荚膜甲基球菌中。这种技术确保了任何卡那霉素抗性荚膜甲基球菌集落必须已经通过重组并入基因组中。
同源重组事件的鉴别在本领域中得到充分确立，并且通常是通过PCR和测序，使用基因组中的独特引物和载体构建体以确认适当***来进行。然后，在不存在选择压力(例如，卡那霉素)下使同源重组体生长几代，并且通过复制平板培养(或等效的技术)鉴别已经损失抗性标志的敏感克隆体。约50％的敏感回复体具有突变形式的靶基因替代野生型型式。通过全基因组测序来确认靶adh基因的损失。
实施例6：将热稳定的pMMO基因引入荚膜甲基球菌甲烷营养菌中。
用适当启动子合成来自温泉甲基热菌的所有pMMO亚单元的密码子优化的型式(SEQ ID NO:176和648)。然后，将基因克隆并且转型至如上文所描述的野生型荚膜甲基球菌与adh敲除菌株中。通过细胞对抗生素选择的抗性来确认转型，并且通过northern印迹法(以确认RNA转录)、western印迹法或ELISA方法(以确认蛋白质表达)来确认基因表达。
为了确认热稳定的pMMO酶的活性，将转型的细胞和非转型的对照接种至含有20-50mL NMS培养基和10ug/mL卡那霉素的100mL血清瓶中。用甲烷与氧气的1:1混合物吹扫瓶的顶空，并且用丁基橡胶隔片将瓶密封并卷边。然后连续振荡这些瓶，同时在45℃下孵育。每2天更新顶空气体直至达到约0.5的OD600。通过离心收集细胞，用25mM MOPS[3-(N-吗啉基)丙烷磺酸]、2mM L-半胱氨酸以及1mM CuSO4(pH 7.0)洗涤，然后再悬浮于等体积的相同缓冲液中。分析细胞制剂的MMO活性，其在本文中定义为每分钟每毫克细胞干重所形成的环氧丙烷的量。反应容器由用铝盖和聚四氟乙烯内衬的丁基橡胶隔片密封的具有10ml顶空的小瓶组成。将1mL细胞悬浮液等分至每个小瓶中，并且将小瓶密封并卷边。使反应混合物升温至40℃或80℃，并且孵育10分钟，随后添加底物。将丙烯和O2注入顶空(1:1混合物)中之后，在适当温度下在旋转振荡器上以150rpm或200rpm振荡小瓶。30分钟后从水相移出样品并且通过气相色谱法分析。为了实现多次酶周转，将H2以等体积比包括在气体混合物中。通过在转型与未转型的细胞之间比较80℃下所观测到的丙烯氧化活性的差异来确定嗜热pMMO活性。
气相色谱法.用含有填充有80×100目Carbopack C+0.1％SP-1000(Supelco)的玻璃柱(2.6mm内径，3.1m)的Shimadzu GC-14A型气相色谱仪来定量环氧丙烷形成。气相色谱仪用AOC-17自动注射器和Shimadzu CR-601Chromatopac记录器构造。氦气用作载气(20ml/min)。注射器和检测器(火焰离子化检测器)温度分别是200℃和175℃。将含水样品在80℃下等温操作6分钟。在单时间点试验中通过将峰面积与标准回归曲线相比较来定量产物形成。
实施例7：在荚膜甲基球菌甲烷营养菌中由热稳定的pMMO产生醇。
将上文所描述的热稳定的pMMO转型的荚膜甲基球菌菌株的瓶生长培养物以1:100接种至3L New Brunswick夹套型发酵容器中的1L NMS培养基中。在50mL/min甲烷和100mL/min O2的恒定进料下以800rpm搅拌培养物。适当时通过在线添加NaOH和HCl来维持pH。将温度维持于45℃。NaNO3、KHPO4、CuSO4以及Fe-EDTA的添加是根据细胞的生长速率以一定时间间隔进行。在晚对数期(OD约15)通过离心收集细胞并且如上述用MOPS缓冲液洗涤。
将细胞固定于固相支撑体上，例如ISOLITETM，其为硅藻土产品(78％SiO2、12％Al2O3以及5％Fe2O3)，这种固相支撑体用于固定细胞并且用于土壤通气。这是对许多有机分子没有吸附能力的惰性材料。在去离子水中预先洗涤ISOLITETM以除尘，然后在120℃下在烘箱中干燥48小时。将再悬浮细胞的300ml样品添加至烧瓶中的150克ISOLITETM中。然后，将烧瓶放置在孵育箱/振荡器上(20rpm，在75℃下)一小时以使细胞结合至ISOLITETM。然后从ISOLITETM中去除水相，并且干燥固相并填充至标准的1cm直径不锈钢反应器中。将反应器加热至80℃并且连接至10mL/min 10:10:10:10:50甲烷:乙烷:丙烷:丁烷:O2的进料。这种进料与用以再生pMMO催化剂的10mL/min H2气的进料交替进行。反应器出口以1:100分割用于通过气相色谱法进行连续废气分析，而大部分流传送至冷凝器以捕获水与产物醇。通过气相色谱法以及通过在多个时间点评估冷凝器中捕获的大批物质来实时检测混合醇的产生。
2012年10月15日提交的美国临时专利申请序列号61/714,123的公开内容以全文并入本文中。
上文所描述的各种实施方案可以组合以提供更多的实施方案。本说明书中所提及的和/或申请资料表中所列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、国外专利、国外专利申请以及非专利公布以全文引用的方式并入本文中。必要时可以修改实施方案的方面以采用各种专利、申请以及公布的概念来提供更多的实施方案。
依据上文详述的描述可以对实施方案作出这些和其它改变。一般来说，在以上权利要求书中，所用的术语不应解释为将权利要求书限于说明书和权利要求书中所公开的特定实施方案，而应解释为包括所有可能的实施方案以及所述权利要求书所赋予的等效物的完整范围。因此，权利要求书不受本公开所限制。

Claims (110)

1.一种非天然存在的微生物，其包含：
编码具有甲烷单加氧酶活性的酶的外源核酸，所述酶在化学或环境应激存在下是稳定的；
其中至少一种醇脱氢酶在所述微生物中被灭活；并且
其中所述微生物能够将甲烷转化成甲醇。
2.如权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是甲烷营养菌。
3.如权利要求1或2所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能够利用H2作为还原剂用于将甲烷转化成甲醇。
4.如权利要求3所述的非天然存在的微生物，其中所述具有甲烷单加氧酶活性的酶能够直接利用H2作为还原剂用于将甲烷转化成甲醇。
5.如权利要求3所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含编码氢化酶的核酸，所述氢化酶利用H2作为还原剂用于将甲烷转化成甲醇。
6.如前述权利要求中任一项所述的非天然存在的甲烷营养菌，其中所述具有甲烷单加氧酶活性的酶是pMMO、sMMO、AMO或P450。
7.如权利要求6所述的非天然存在的甲烷营养菌，其中所述具有甲烷单加氧酶活性的酶包含与SEQ ID NO:1-654中的任一者的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
8.如前述权利要求中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述化学或环境应激是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
9.如前述权利要求中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述醇脱氢酶是通过所述化学或环境应激被灭活。
10.如权利要求9所述的非天然存在的微生物，其中所述化学或环境应激是>60℃的温度、>9的pH或<5的pH。
11.如权利要求1至8中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述醇脱氢酶是通过遗传修饰被灭活。
12.如前述权利要求中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一种醇脱氢酶包括甲醇脱氢酶。
13.如前述权利要求中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述至少一种醇脱氢酶包含与SEQ ID NO:655、656、657、658、659、660、661、662、663、664以及665中的任一者具有至少70％同一性的氨基酸序列。
14.如前述权利要求中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能够将乙烷转化成乙醇、丙烷转化成丙醇或丁烷转化成丁醇。
15.如前述权利要求中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能够将乙烯转化成环氧乙烷、丙烯转化成环氧丙烷或丁烯转化成环氧丁烷。
16.如前述权利要求中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能够将混合烯烃底物转化成混合环氧化物产物。
17.如权利要求1至14中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物能够将混合烷烃气体底物转化成混合醇产物。
18.如权利要求17所述的非天然存在的微生物，其中所述混合烷烃气体底物是湿天然气或其部分分离的衍生物。
19.一种将甲烷转化成甲醇、乙烷转化成乙醇、丙烷转化成丙醇或丁烷转化成丁醇的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1至18中任一项所述的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；
使所述非天然存在的微生物暴露于O2；分别包含甲烷、乙烷、丙烷或丁烷的气体底物；以及还原剂；
其中分别将所述甲烷气体转化成甲醇，将所述乙烷气体转化成乙醇，将所述丙烷气体转化成丙醇，并且将所述丁烷气体转化成丁醇。
20.如权利要求19所述的方法，其中将所述非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分呈基本上无水状态固定于固体基质上。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述方法是在化学或环境应激下进行。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述化学或环境应激是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述还原剂是H2气。
24.如权利要求23所述的方法，其中将H2气与所述气体底物混合。
25.如权利要求23所述的方法，其中将所述H2气在所述气体底物之后提供给所述非天然存在的生物体。
26.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述还原剂是甲酸盐。
27.如权利要求19至26中任一项所述的方法，其中将O2与所述气体底物混合。
28.如权利要求19至26中任一项所述的方法，其中将O2在所述气体底物之前提供给所述非天然存在的生物体。
29.如权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述丙醇基本上包含正丙醇。
30.如权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述丁醇基本上包含正丁醇。
31.如权利要求19至30中任一项所述的方法，其中所述方法是在气相生物反应器中进行。
32.如权利要求19至30中任一项所述的方法，其中所述方法是在流化床反应器中进行。
33.一种将混合烷烃气体底物转化成混合醇产物的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1至18中任一项所述的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；
使所述非天然存在的微生物暴露于包含以下的混合烷烃气体底物：低碳烷烃；O2；以及还原剂；
其中将所述混合烷烃气体底物的所述低碳烷烃转化成对应的醇。
34.如权利要求33所述的方法，其中将所述非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分固定于固体基质上并且呈基本上无水状态。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述方法是在化学或环境应激下进行。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述化学或环境应激是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
37.如权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述还原剂是H2气。
38.如权利要求37所述的方法，其中将H2气与所述气体底物混合。
39.如权利要求37所述的方法，其中将所述H2气在所述包含低碳烷烃的混合烷烃气体底物之后提供给所述非天然存在的生物体。
40.如权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述还原剂是甲酸盐。
41.如权利要求33至40中任一项所述的方法，其中将O2与所述混合烷烃气体底物混合。
42.如权利要求33至40中任一项所述的方法，其中将O2在所述包含低碳烷烃的混合烷烃气体之前提供给所述非天然存在的生物体。
43.如权利要求33至42中任一项所述的方法，其中所述方法是在气相生物反应器中进行。
44.如权利要求33至42中任一项所述的方法，其中所述方法是在流化床反应器中进行。
45.如权利要求33至44中任一项所述的方法，其中所述包含低碳烷烃的混合烷烃气体底物包含至少两种或更多种选自以下的烷烃：甲烷、乙烷、丙烷以及丁烷。
46.一种将乙烯转化成环氧乙烷、丙烯转化成环氧丙烷或丁烯转化成环氧丁烷的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1至18中任一项所述的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；
使所述非天然存在的微生物暴露于O2；分别包含乙烯、丙烯或丁烯的气体底物；以及还原剂；
其中分别将所述乙烯气体转化成环氧乙烷，将所述丙烯气体转化成环氧丙烷，并且将所述丁烯气体转化成环氧丁烷。
47.如权利要求46所述的方法，其中将所述非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分固定于固体基质上并且呈基本上无水状态。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述方法是在化学或环境应激下进行。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述化学或环境应激是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述还原剂是H2气。
51.如权利要求50所述的方法，其中将H2气与所述气体底物混合。
52.如权利要求50所述的方法，其中将所述H2气在所述气体底物之后提供给所述非天然存在的微生物。
53.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述还原剂是甲酸盐。
54.如权利要求46至53中任一项所述的方法，其中将O2与所述气体底物混合。
55.如权利要求46至53中任一项所述的方法，其中将O2在所述气体底物之前提供给所述非天然存在的微生物。
56.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述丙烯基本上包含环氧正丙烷。
57.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述丁烯基本上包含环氧正丁烷。
58.如权利要求46至57中任一项所述的方法，其中所述方法是在气相生物反应器中进行。
59.如权利要求46至57中任一项所述的方法，其中所述方法是在流化床反应器中进行。
60.一种将混合烯烃气体底物转化成混合环氧化物产物的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1至18中任一项所述的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；
使所述非天然存在的微生物暴露于包含以下的混合烯烃气体底物：低碳烯烃；O2；以及还原剂；
其中将所述混合烯烃气体底物的所述低碳烯烃转化成对应的环氧化物。
61.如权利要求60所述的方法，其中将所述非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分固定于固体基质上并且呈基本上无水状态。
62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述方法是在化学或环境应激下进行。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述化学或环境应激是至少60℃的温度、至少9的pH、或者5或低于5的pH。
64.如权利要求60至63中任一项所述的方法，其中所述还原剂是H2气。
65.如权利要求64所述的方法，其中将H2气与所述气体底物混合。
66.如权利要求64所述的方法，其中将所述H2气在所述包含低碳烯烃的混合烯烃气体底物之后提供给所述非天然存在的微生物。
67.如权利要求60至63中任一项所述的方法，其中所述还原剂是甲酸盐。
68.如权利要求60至67中任一项所述的方法，其中将O2与所述混合烯烃气体底物混合。
69.如权利要求60至67中任一项所述的方法，其中将O2在所述包含低碳烯烃的混合烯烃气体之前提供给所述非天然存在的微生物。
70.如权利要求60至69中任一项所述的方法，其中所述方法是在气相生物反应器中进行。
71.如权利要求60至69中任一项所述的方法，其中所述方法是在流化床反应器中进行。
72.如权利要求60至71中任一项所述的方法，其中所述包含低碳烯烃的混合烯烃气体底物包含至少两种或更多种选自由以下组成的群组的烯烃：乙烯、丙烯、丁烯以及丁二烯。
73.一种将烷烃转化成醇的***，其包括：
气相生物反应器，所述气相生物反应器包含固定于固体基质上的如权利要求1至18中任一项所述的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；
连接器，所述连接器用于将包含至少一种低碳烷烃的气态底物从气源运送至所述生物反应器中；
其中将所述气态底物传送至紧密靠近所述非天然微生物或来源于其的无细胞部分以使得所述微生物或无细胞部分将所述低碳烷烃氧化成对应的醇产物。
74.如权利要求73所述的***，其进一步包括化学或环境控制单元，所述控制单元能够维持所述生物反应器中的化学或环境应激条件。
75.如权利要求74所述的***，其中所述环境控制单元包括温度控制单元，所述温度控制单元能够维持所述生物反应器中至少60℃的恒温。
76.如权利要求74所述的***，其中所述化学控制单元包括pH控制单元，所述pH控制单元能够维持所述生物反应器中至少9的pH、或者5或低于5的pH。
77.如权利要求73至76中任一项所述的***，其进一步包括连接器，所述连接器用于将H2从H2气源运送至所述生物反应器中。
78.如权利要求73至77中任一项所述的***，其进一步包括连接器，所述连接器用于将空气从空气源运送至所述生物反应器中。
79.如权利要求73至78中任一项所述的***，其进一步包括连接器，所述连接器用于将O2从O2源运送至所述生物反应器中。
80.如权利要求73至79中任一项所述的***，其进一步包括收集单元，所述收集单元用于收集所述醇产物。
81.如权利要求80所述的***，其中所述收集单元包括冷凝器。
82.如权利要求80或81所述的***，其进一步包括蒸馏单元，所述蒸馏单元用于分离所述醇产物与水副产物。
83.如权利要求73至82中任一项所述的***，其进一步包括再循环单元，所述再循环单元用于将未转化的低碳烷烃再循环返回至所述生物反应器中。
84.如权利要求73至83中任一项所述的***，其中所述气态底物包含甲烷并且所述对应的醇产物包含甲醇。
85.如权利要求73至83中任一项所述的***，其中所述气态底物包含乙烷并且所述对应的醇产物包含乙醇。
86.如权利要求73至83中任一项所述的***，其中所述气态底物包含丙烷并且所述对应的醇产物包含丙醇。
87.如权利要求86所述的***，其中丙醇基本上包含正丙醇。
88.如权利要求73至83中任一项所述的***，其中所述气态底物包含丁烷并且所述对应的醇产物包含丁醇。
89.如权利要求88所述的***，其中丁醇基本上包含正丁醇。
90.如权利要求73至89中任一项所述的***，其中所述气相生物反应器是流化床反应器。
91.如权利要求73至90中任一项所述的***，其中所述固体基质包含聚丙烯、陶瓷、玻璃、木炭、砂、活性碳或硅藻土支撑体。
92.如权利要求73至89和91中任一项所述的***，其中所述非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分被固定于固体基质上并且呈基本上无水状态。
93.一种将烯烃转化成环氧化物的***，其包括：
气相生物反应器，所述气相生物反应器包含固定于固体基质上的如权利要求1至18中任一项所述的非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分；
连接器，所述连接器用于将包含至少一种低碳烯烃的气态底物从气源运送至所述生物反应器中；
其中将所述气态底物传送至紧密靠近所述非天然微生物或来源于其的无细胞部分以使得所述微生物或无细胞部分将所述低碳烯烃氧化成对应的环氧化物产物。
94.如权利要求93所述的***，其进一步包括化学或环境控制单元，所述控制单元能够维持所述生物反应器中的化学或环境应激条件。
95.如权利要求94所述的***，其中所述环境控制单元包括温度控制单元，所述温度控制单元能够维持所述生物反应器中至少60℃的恒温。
96.如权利要求94所述的***，其中所述化学控制单元包括pH控制单元，所述pH控制单元能够维持所述生物反应器中至少9的pH、或者5或低于5的pH。
97.如权利要求93至96中任一项所述的***，其进一步包括连接器，所述连接器用于将H2从H2气源运送至所述生物反应器中。
98.如权利要求93至96中任一项所述的***，其进一步包括连接器，所述连接器用于将空气从空气源运送至所述生物反应器中。
99.如权利要求93至96中任一项所述的***，其进一步包括连接器，所述连接器用于将O2从O2源运送至所述生物反应器中。
100.如权利要求93至96中任一项所述的***，其进一步包括收集单元，所述收集单元用于收集所述环氧化物产物。
101.如权利要求100所述的***，其中所述收集单元包括冷凝器。
102.如权利要求100或101所述的***，其进一步包括蒸馏单元，所述蒸馏单元用于分离所述环氧化物产物与水副产物。
103.如权利要求93至102中任一项所述的***，其进一步包括再循环单元，所述再循环单元用于将未转化的低碳烯烃再循环返回至所述生物反应器中。
104.如权利要求93至103中任一项所述的***，其中所述气态底物包含乙烯并且所述对应的环氧化物产物包含环氧乙烷。
105.如权利要求93至103中任一项所述的***，其中所述气态底物包含丙烯并且所述对应的环氧化物产物包含环氧丙烷。
106.如权利要求93至103中任一项所述的***，其中所述气态底物包含丁烯并且所述对应的环氧化物产物包含环氧丁烷。
107.如权利要求93至103中任一项所述的***，其中所述气态底物包含丁二烯并且所述对应的环氧化物产物包含丁二烯1,2氧化物。
108.如权利要求93至107中任一项所述的***，其中所述气相生物反应器是流化床反应器。
109.如权利要求93至108中任一项所述的***，其中所述固体基质包含聚丙烯、陶瓷、玻璃、木炭、砂、活性碳或硅藻土支撑体。
110.如权利要求93至107和109中任一项所述的***，其中所述非天然存在的微生物或来源于其的无细胞部分被固定于固体基质上并且呈基本上无水状态。
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