CN104818295A - 制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法，所述方法包括构建表达双特异性抗体的两个质粒，两个质粒都含双启动子，分别表达一种不同的荧光蛋白；将两种重组质粒进行转化、培养和提取，两种重组质粒共转染至宿主细胞中，筛选表达双荧光的阳性单克隆细胞株，并根据荧光强度评估产量和稳定性。本发明的方法能够方便快捷、提前筛选出高产细胞株，它不仅能够缩短试验周期，并且可以减少人力物力的投入，准确性高。

Description

制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法

技术领域

本发明涉及抗体制备领域，特别是涉及一种制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，hetero conjugate antibody)是一类具有双功能的抗体分子，两价抗体中的Fab段具有不同特异性，能与不同的配体结合。抗肿瘤和抗免疫活性细胞CDl6或CD3的双特异性抗体，不仅具有激活NK细胞或T细胞作用，而且可以通过抗肿瘤的Fab段特异性结合肿瘤细胞发挥作用，提高局部NK细胞或T细胞浓度，增强效应分子杀伤肿瘤能力。也可通过抗体与某些细胞因子融合制备免疫细胞因子(immunocytokine)，加强肿瘤细胞附近细胞因子浓度，激发机体免疫功能，有效地杀伤肿瘤，减少毒副作用。另外，也可以应用人源性抗肿瘤单抗或人源性Fc段和鼠源性Fab段的嵌和性抗体，克服鼠源性抗体免疫原性，增强抗体介导细胞毒作用，达到杀伤肿瘤作用。双特异性抗体中包含着两种不同识别特异性抗原的Fab段，通过特异结合肿瘤抗原同时结合不同效应细胞和分子，达到有效杀伤肿瘤的作用。

目前，中国仓鼠卵巢细胞(CHO(Cricetulus griseus,hamster,Chinese,ovary)广泛用于生产抗体，通常高产的细胞株一方面是通过甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)或者蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine,MSX)进行加压扩增来得到，另一方面也有很多报道通过基因工程来得到高产细胞株。许多公司通过构建高转染效率的质粒如引入慢病毒载体(lentiviralvectors(LVs))来增强外源基因的整合效率，从而提高抗体产量或者通过增加增强子及隔离子来增强启动子的活力进而寻找高产细胞株；也有些公司改良转染方式，如采用Ca₃(PO4)₂试剂、PEI试剂或电穿孔等转染手段来提高转染效率等等，通过以上方法提高了转染效率后，从中筛选出找出稳定高产细胞株，进入下游的放大生产，仍需要一个漫长的过程。从传统的实验流程上来看，该过程通常需要6到12个月才能得到稳定的细胞株系，且需要消耗大量的人力物力，最终也不一定能够获得理想的高产细胞株。因此在大规模生产生物制品中，除了构建良好的高表达的质粒载体，提高转染效率等途径外，还需要找到一种方便快捷的能够提前筛选出高产细胞株，以及后期监测细胞株稳定性的方法，这样不仅能够缩短试验周期，并且可以减少人力物力的投入，这也是制备双特异性抗体成功的关键。

目前，缺少一套完善的能够早期筛选、鉴定稳定表达双特异性抗体细胞株的方法；大多数公司通过外源的包被来检测并筛选高产克隆细胞株，但是不能够完全真实地反映克隆细胞株的表达状态。

发明内容

因此，为了解决目前筛选表达双特异性抗体细胞株稳定性方法耗时长，鉴定过程繁琐，且准确性不高等不足之处，本发明提供一种新的制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法。

本发明的关键在于所使用的质粒为双启动子质粒，且引入了荧光蛋白作为指示标签。荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的分子量为20-30kD的一类同源性蛋白，主要包括绿色荧光蛋白和它的一些突变体，如蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝绿荧光蛋白等等，还有从珊瑚中发现的红色荧光蛋白。它们具有自动发光、易检测等特点，在生物中它们常常作为报告基因。

内部核糖体进入位序列(internal ribosome entry site,IRES)，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5’帽结构，从而使得直接从信使RNA(mRNA)中间起始翻译成为可能。它可在同一个载体中协同共表达两个目的基因，无需担心共转染的效率及其他共转染过程中可能产生的问题。当报告基因与目的基因协同共表达，其对目的蛋白生物活性的影响最低。常用构建于真核生物双顺反子(bicistronic mRNA)中间，如此一来，第一个蛋白通常靠5’帽子结构起始翻译，而第二个蛋白则依靠IRES起始翻译。IRES前后的两个蛋白的表达通常是成比例的，因此可以根据其中一个报告基因的表达情况来反映另外一个蛋白的表达情况。

本发明可以用于筛选表达双特异性抗体CHO细胞系。其中，双特异性抗体包括两个结构单元：单元一和单元二。单元一有两种形式，其一为两条多肽如重链轻链配对，其二为一条多肽如可变区片段单链(ScFv，single chainvariable fragments)或者ScFv与重链恒定区融合蛋白，与抗原一特异结合；单元二具有与单元一相同的两种形式，但单元二与单元一的形式可以相同，也可以不同。每个单元构建在一个双启动子表达载体上，若是两条多肽形式，则荧光蛋白利用内部核糖体进入位序列连接在一条多肽的C端；若是一条多肽形式，则荧光蛋白直接***到载体的另一个启动子下游多克隆位点处(multiple cloning site,(MCS))。本发明通过在表达双特异性抗体的双启动子双质粒***(质粒A和质粒B，均为双启动子载体)上进行改造。其中，质粒A(图1)表达单元A，含有一条多肽，将荧光蛋白A(FPA)的cDNA连入表达单元A的质粒A的空闲启动子下游多克隆位点中，质粒B(图3)表达单元B，含有两条多肽，将内部核糖体进入位序列、荧光蛋白B(FPB)的cDNA依次连入表达单元B的质粒B中的任一条多肽后面；质粒A和质粒B共转染哺乳动物细胞中共表达后，通过流式细胞仪分析细胞的荧光情况，来判断细胞中该双抗的两个单元是否均表达，并且通过直接检测内源的荧光信号，根据荧光信号强度来筛选高产双特异性抗体的细胞株。

本发明提供的制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法，其包括以下步骤：

步骤1：构建表达双特异性抗体的的两个质粒，两个质粒都含双启动子，其中一个质粒表达的蛋白为特异结合肿瘤抗原的一条或两条多肽；另一个质粒表达的蛋白为特异结合免疫活性细胞抗原的一条或两条多肽；所述两个含双启动子的质粒还分别表达一种不同的荧光蛋白；若质粒表达的蛋白是两条多肽形式，则荧光蛋白利用内部核糖体进入位序列连接在一条多肽的C端，若是一条多肽形式，则荧光蛋白直接***到载体的另一个启动子下游多克隆位点；

步骤2：将步骤1中得到的两种重组质粒进行转化、培养和提取；

步骤3：将步骤2中提取的两种重组质粒共转染至宿主细胞中；

步骤4：筛选表达双荧光的阳性单克隆细胞株。

在一种实施方式中，上述步骤1中是选择表达载体的构建，分别构建单元A-FPA，单元B-IRES-FPB表达载体。根据单元A、B、IRES、FPA、FPB基因序列及载体中的多克隆位点设计引物，其中将FPA这段基因用DNA聚合酶扩增出来后，切胶回收，分别酶切质粒A和FPA回收产物，将FPA***到质粒A中，由此得到的新的质粒记为质粒ANF(图2)，单元B-IRES–FPB分别进行两次PCR后，切胶回收，随后进行重叠PCR，切胶回收后，分别酶切单元B-IRES-FPB片段，和质粒B，即用单元B-IRES-FPB代替原始质粒中的单元B，由此得到的新质粒记为质粒BIF(图4)。

在一种实施方式中，若所述质粒表达的蛋白为一条多肽，则质粒上一个启动子用于起始转录蛋白单元，另一个启动子用于起始转录荧光蛋白；若质粒表达的蛋白为单元为两条多肽，则质粒上的一条多肽的DNA编码序列的3’通过IRES连接荧光蛋白的DNA编码序列。

在一种实施方式中，在上述步骤2中还包括无菌纯化提取的质粒。将两种重组质粒分别转化大肠杆菌，挑取单克隆菌落进行大量培养，利用无内毒素试剂盒提取质粒，检测质粒浓度和纯度。将所提质粒进行无菌纯化，并进行无菌检测。

在一种实施方式中，在上述步骤3中还包括添加筛选压力。在步骤3中将质粒ANF和质粒BIF共转染至哺乳动物细胞中，转染后两天添加相应的筛选压力。筛选压力可以为嘌呤霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。

在一种实施方式中，在上述步骤4中用流式细胞仪或者荧光显微镜进行筛选。培养2周后，筛选高产细胞株，用流式细胞仪或者荧光显微镜分选表达阳性单克隆细胞。

在一种实施方式中，还包括将筛选后的阳性单克隆细胞株进行扩大培养，用流式细胞仪或荧光显微镜检测其荧光强度。将分选后的单克隆细胞培养，扩大培养后，用流式细胞仪或荧光显微镜检测检测其荧光强度，用ELISA检测其抗体产量，比较二者之间的联系。

在一种实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是中国仓鼠卵巢细胞。

在一种实施方式中，所述荧光蛋白能够正确指示转染后蛋白表达情况，可以为绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，橙色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白等等。

在一种实施方式中，根据上述方法制备和筛选得到的表达双特异性抗体细胞株。

在一种实施方式中，质粒ANF使用的载体为pCHO 1.0Expression Vector(简称pCHO，购自Life technologies，货号A13696-01)，但需要进行改造，其中将含有嘌呤霉素抗性基因替换为潮霉素(Hygromycin)抗性基因，改造后的载体命名为HpCHO；质粒BIF使用的载体为未改造的pCHO，其带有嘌呤霉素(Puromycin)和甲氨蝶呤(MTX)抗性基因。

在一种实施方式中，还包括对筛选后的阳性单克隆细胞株利用流式细胞术进行快速稳定性评估，在10代以内确定单克隆细胞株的稳定性。

在一种实施方式中，根据前述方法得到的表达双特异性抗体细胞株，表达产物中双抗体相对含量(双抗体相对所有抗体的含量)，可以通过计算两种荧光的平均荧光强度比值例如GFP/RFP比值进行评估。

在一种实施方式中，根据前述方法得到的表达双抗体细胞株，其表达水平的稳定性可以通过流式细胞学分析细胞荧光强度分布例如直方图情况进行评估。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是单链单元的表达载体质粒A结构模式图。

图2是单链单元与荧光蛋白A(FPA)共表达载体质粒ANF结构模式图。

图3是单价单元的表达载体质粒B结构模式图。

图4是单价单元与荧光蛋白B(FPB)共表达载体质粒BIF结构模式图。

图5是共转染后48小时显微镜荧光检测图。

图6是流式分析细胞株荧光情况图，6A为双阴性细胞、6B为单荧光(GFP)阳性细胞和6C为双荧光阳性细胞。

图7抗体产量与细胞平均荧光强度的相关性分析图，7A是GFP平均荧光强度与抗体产量的相关性图，图7B分析RFP平均荧光强度与抗体产量的相关性图。

图8统计分析蛋白印迹检测的抗体纯度和流式荧光强度比图，图8A是蛋白印迹图，泳道1-7分别对应的是克隆1-7表达上清，图8B是荧光强度比值与双抗体相对含量之间的相关性，荧光强度比值＝GFP平均荧光强度/RFP平均荧光强度。

图9不同克隆细胞株的流式细胞学直方图。

图10不同克隆细胞株的连续30代产量评估图。

具体实施方式

一、实验材料

本实验的双特异性抗体为单价单链双特异性抗体(MSBODY(monomer andScFv bispecific antibody))，MSBODY是由武汉友芝友生物制药有限公司根据PCT/CN2012/084982中公开的方法制备，并且可以从该公司购得。MSBODY是由两个单元组成：一个单元为针对肿瘤细胞或微生物有特异性的轻链-重链对，称为单价单元；另一个单元为融合肽，所述融合肽包含单链可变片段(scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中所述融合肽针对免疫细胞具有特异性，称为单链单元。其中，单价单元的轻链恒定区(CL)与人IgG抗体轻链恒定区完全一致。单价单元特异性结合不同的肿瘤靶点抗原或微生物靶点抗原，如Her2，EGFR，EpCAM，CD19和CD20等；单链单元特异性结合免疫细胞的表面抗原，如CD3、CD16、CD19、CD28和CD64等。

绿色荧光蛋白(GFP)(序列来源：GenBank access no.U55762)、红色荧光蛋白(RFP)(序列来源：GenBank access no.HM771696.1)、内部核糖体进入位序列(IRES)(序列来源：GenBank access no.KC710231.1)这些基因片段均交给金唯智生物公司合成。其他实验材有：大肠杆菌Trans10(购自全式金，货号CD101-02)，T4DNA连接酶(NEB，货号M0202S)，PyrobestDNA聚合酶(Takara，货号DR005A)，限制性内切酶AvrII(NEB，货号R0174L)，限制性内切酶BstZ17I(NEB，货号R0594L)，限制性内切酶EcoRV-HF(NEB，货号R3195L)和限制性内切酶PacI(NEB，货号R0547L)；卡那霉素(Amersco，货号0408-10G)；质粒提取试剂盒(购自Tiangen，货号DP104)、DNA片段胶回收试剂盒(Tiangen，货号DP210)；真核表达载体pCHO 1.0Expression Vector(简称pCHO)，哺乳动物细胞株CHO-S、培养基CDForti-CHO、培养基OptiPRO^TMSFM和转染试剂FreeStyle^TM MAX Reagent均来自试剂盒Kit(Life technologies，货号A13696-01)，羊抗人IgG-HRP二抗(购自sigma，货号A8667)。

二、实验方法

1.表达载体的构建选择

选择HpCHO作为表达载体，构建单链单元-GFP表达质粒ANF，其中单链单元为抗人T细胞表面抗原CD3的单链抗体，荧光蛋白A为绿色荧光蛋白(GFP)；选择pCHO作为表达载体，构建单价单元-IRES–RFP表达质粒BIF，其中单价单元1和2为抗人HER2抗原的重链轻链配对抗体，荧光蛋白B为红色荧光蛋白(RFP)。根据单价单元-IRES–RFP和单链单元-GFP基因序列及pCHO1.0和HpCHO载体中的多克隆位点设计引物，见表1。其中单价单元和IRES以及RFP间采用重叠延伸PCR法进行连接。

表1PCR引物序列

      

引物IRES-F和IRXFP-R用于扩增IRES基因片段；

引物HpCHOGFP-F和HpCHOGFP-R用于扩增GFP基因片段；

引物IRXFP-F和HpCHOGFP-R用于扩增RFP基因片段；

PCR扩：IRES、GFP、RFP片段的条件为95℃5分钟，按照下列程序循环25次：95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸90秒，最后一个循环72℃延伸10分钟。

重叠延伸PCR法：连接IRES和RFP的条件为以纯化回收的IRES、RFP为混合模板并使用引物IRES-F和HpCHOGFP-R，其他试剂同常规PCR，不加引物，按照下列参数循环4次：95℃变性2分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，然后加入引物IRES-F和HpCHOGFP-R按照下列程序循环25次：95℃变性30秒，56℃退火30秒杀，72℃延伸2分钟，最后一个循环72℃延伸10分钟，得到的DNA片段为IRES-RFP。

琼脂糖凝胶回收：将PCR产物进行电泳后，切取目的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自Tiangen，货号DP210)进行回收，并测其回收产物的浓度。

酶切：将所回收的产物及相应的载体，用限制性内切酶进行酶切，37℃孵育3h。GFP和质粒A用EcoRV-HF和PacI和限制性内切酶PacI双酶切，IRES-RFP和质粒B用PacI酶切。

连接：将酶切后的片段和相应载体，用T4DNA连接酶进行连接，连接条件为16℃过夜。

2.重组载体的质粒扩增

将步骤1的连接产物转化大肠杆菌Trans10，挑取单菌落送至上海生工测序部进行测序。测序正确的单菌落接种于含100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时，8000×g离心10分钟收集菌体，使用Tiangen去内毒素大提试剂盒(Tiangen，货号DP117)抽提质粒，在质粒溶于100μl超纯水后，再加入142μl异丙醇和42μl 5M NaCl，将质粒沉淀出来，弃上清，加70％乙醇0.8ml洗涤沉淀两次，弃上清，超净台中风干，加入灭菌的超纯水100μl，测其浓度和OD值。所得的质粒即为重组质粒。

3.重组质粒的共转化

转染前24小时，在125ml锥形瓶中接种CHO-S细胞，培养体积30ml，细胞密度为0.5×10⁶细胞/毫升，使用CD Forti-CHO培养基，37℃8％CO₂摇床中培养，转染的当天细胞计数，确保细胞活力大于95％，细胞密度1×10⁶细胞/毫升，然后将细胞放在摇床上培养准备转染，转染前细胞不要离心，因为离心过程会降低转染效率。

在转染过程中，向一个1.5ml离心管中加入150μl OptiPRO^TMSFM培养基，然后加入5μl FreeStyle^TM MAX Reagent转染试剂，向一个1.5ml离心管中加入150μl OptiPRO^TM SFM培养基，然后加入5μg质粒DNA，轻柔的混合。添加的时候枪头要浸入液面以下，然后轻柔的翻转混合。将稀释的转染试剂溶液加入到稀释的DNA溶液中，轻柔的上下翻转几下试剂瓶，但是不要使用振荡器，将质粒转染试剂混合物在室温下孵育10分钟使其形成复合物。孵育时间不得超过20分钟，将质粒转染试剂复合物一滴一滴的加入培养细胞的锥形瓶中，边加边轻柔的摇晃。将转染后的细胞放在转速150rpm，37℃，8％CO2的摇床上培养。

4.转染后，鉴定转染效率并用抗生素进行筛选

转染48小时后，流式细胞仪和荧光显微镜检测其转染效率，并换上含有潮霉素(300μg/ml)，嘌呤霉素(5μg/ml)，以及甲氨蝶呤(50nM)的培养基培养细胞。

5.用甲氨蝶呤扩增

待细胞在前期加有抗生素的培养基中活力上升到85％左右后，进行第二次加压，加大甲氨蝶呤的浓度，用含500nM或1000nM的甲氨蝶呤的CDFortiCHO培养基进行加压培养。

6.筛选高表达的阳性细胞株

将用MTX压力筛选过后扩增出来的表达细胞用流式细胞仪进行分选，将荧光信号强的细胞选出，以1个细胞每孔的接种密度接种到96孔板中，培养两周后，扩大培养。

7.流式细胞仪分析表达双抗性抗体的细胞株

取扩大培养后细胞活力90％以上的细胞株200μl，根据细胞密度用PBS进行稀释，稀释到细胞密度约为0.5×10⁶细胞/毫升，流式细胞仪上机检测，用两种荧光通道(FL1和FL3)进行检测，将所得结果用FlowJo7.6软件进行分析，具体见表2。

表2统计分析蛋白印迹分析双抗体相对含量和荧光强度比

      

8.对阳性克隆进行14天产量评估检测抗体产量

待扩大培养后的细胞活力为90％以上后，对细胞株进行产量评估，步骤如下：

a.接种3×10⁵，活力>90％的细胞于30ml新鲜培养基(只包含8mM L-谷氨酰胺和1％抗聚集试剂(Anti-Clumping Agent，购自Life technologies，货号0010057AE)，不含嘌呤霉素和MTX)中，于37℃，8％CO₂,150rpm摇床培养。

b.细胞培养14天后，收获上清，10,000rpm离心10分钟，取上清用0.22μm滤膜过滤后-20℃储存。

c.用proteinA纯化上清得到抗体，用紫外分光光度计检测抗体的产量，具体见表3。

表3紫外分光光度计分析抗体产量以及流式细胞仪分析克隆荧光强度

      

      

9.检测阳性克隆表达双抗体相对含量

将14天培养后收集的上清，取20μl进行SDS-PAGE(非还原)后，进行蛋白免疫印迹(Western blot)检测(图8A)。转印后的硝酸纤维素膜用ECL发光液(购自Pierce，货号32106)反应后，在Bio-rad化学发光检测仪上拍照。用Imagelab软件进行条带灰度分析，并计算双抗体相对含量，见上述表3；双抗体相对含量是指双抗体占重组细胞表达产物中的所有抗体片段(包括双抗体、单价单元、单链单元和其他抗体片段)的质量百分比。

分析克隆GFP/RFP平均荧光强度比值与双抗体相对含量的相关性，使用Graphpad Prism5软件的Gaussian方法(图8B)。

10.检测阳性克隆的稳定性

将阳性克隆进行连续传代，每两天传代一次，连续传30代。每5代进行一次流式细胞学直方图分析，见图9，和14天产量评估，见图10。流式细胞学直方图分析具体方法见步骤7。14天产量评估方法见步骤8。将30代克隆产量不低于0代克隆产量的70％记为稳定克隆，并与该克隆的0-30代的流式细胞学直方图进行比较，结果见表4。

表4不同克隆细胞株稳定性与流式细胞学直方图的比较

      

三、实验结果

因为连接在IRES下游的基因表达水平会明显低于连接在IRES上游的基因表达水平，所以检测的所有细胞单克隆，RFP的荧光强度要远远低于GFP的荧光强度。考虑到此种情况，对于RFP单阳性的细胞，本实施例未做统计。则所说单阳性，专指GFP单阳性。

如图5所示，单克隆会出现三种情况：双阳性(1#)、双阴性(2#)和单阳性(3#)。

图6则进一步说明三种情况的单克隆细胞在流式细胞仪检测中的结果，与荧光显微镜观察的结果一致：荧光显微镜下看不到任何荧光的克隆(图5的2#)，流式检测为双阴性，见图6A，不表达荧光；荧光显微镜下只看到绿色荧光的克隆(图5的3#)，流式检测为单阳性见，图6B，表达一种荧光；荧光显微镜下能看到绿色和红色荧光的克隆(图5的1#)，流式检测为双阳性，见图6C，表达两种荧光。以下表5是统计8种细胞株荧光表达百分比情况。

表5统计8种细胞株荧光表达百分比情况

      

图7表明细胞的抗体表达量与平均荧光强度成正比，即荧光越强的细胞，抗体产量也越高。

图8表明细胞表达的双抗体相对含量与GFP/RFP平均荧光强度比值符合正态分布(R²＝0.9914)，即当GFP/RFP平均荧光强度比值在100至132之间，双抗体相对含量最大，为80％以上；GFP/RFP平均荧光强度比值小于100或大于132，则双抗体相对含量都明显下降。

图9和10表明阳性克隆细胞株的稳定性可以由早期克隆的流式细胞学直方图来确定。FL1通道(绿色荧光)检测结果显示，当流式细胞学直方图在克隆细胞株传至10代，表现为单峰形式，则该克隆30代的表达量不低于0代表达量的70％，是为稳定细胞株。FL3通道(红色荧光)因为强度较弱，在本实施例中不作参考。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。

Claims (13)

1.制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：构建表达双特异性抗体的两个质粒，所述两个质粒都含双启动子，其中一个质粒表达的蛋白为特异结合肿瘤抗原的一条或两条多肽；另一个质粒表达的蛋白为特异结合免疫活性细胞抗原的一条或两条多肽；所述两个含双启动子的质粒还分别表达一种不同的荧光蛋白；若质粒表达的蛋白是两条多肽形式，则荧光蛋白利用内部核糖体进入位序列连接在一条多肽的C端，若是一条多肽形式，则荧光蛋白直接***到载体的另一个启动子下游多克隆位点；

步骤2：将步骤1中得到的两种重组质粒进行转化、培养和提取；

步骤3：将步骤2中提取的两种重组质粒共转染至宿主细胞中；

步骤4：筛选表达双荧光的阳性单克隆细胞株。

2.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：若所述质粒表达的蛋白为一条多肽，则质粒上一个启动子用于起始转录蛋白单元，另一个启动子用于起始转录荧光蛋白；若质粒表达的蛋白为两条多肽，则质粒上的一条多肽的DNA编码序列的3’通过IRES连接荧光蛋白的DNA编码序列。

3.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述步骤2中两种重组质粒分别转化大肠杆菌。

4.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：在所述步骤2中还包括无菌纯化提取的质粒。

5.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：在所述步骤3中还包括添加筛选压力；优选地所述筛选压力为嘌呤霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。

6.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：在所述步骤4中用流式细胞仪或者荧光显微镜进行筛选。

7.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：还包括将筛选后的阳性单克隆细胞株进行扩大培养，用流式细胞仪或荧光显微镜检测其荧光强度。

8.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：还包括对筛选后的阳性单克隆细胞株利用流式细胞术进行快速稳定性评估，在10代以内确定单克隆细胞株的稳定性。

9.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述宿主细胞是哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

10.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述荧光蛋白能够正确指示转染后蛋白表达情况，是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。

11.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述双特异性抗体细胞株的表达产物中双抗体相对含量通过计算两种荧光的平均荧光强度比值进行评估。

12.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述双抗体细胞株表达水平的稳定性通过流式细胞学分析细胞荧光强度分布进行评估。

13.根据权利要求1-12任一所述方法制备和筛选的表达双特异性抗体细胞株。