CN104817490B - 氨基二硫代甲酸酯类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氨基二硫代甲酸酯类化合物及其制备方法与应用，属于药物化学领域。本发明化合物结构如式Ⅰ所示，研究显示本发明化合物靶向PKM2，是PKM2的激动剂，并发现该类化合物通过阻止PKM2进入细胞核而产生抗肿瘤的作用，具有很好的抗肿瘤作用，而且对肿瘤细胞有很好的选择性。因此本发明化合物可作为抗肿瘤药物，有广阔的应用价值。

Description

氨基二硫代甲酸酯类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化合物及其制备方法与应用，特别涉及新型氨基二硫代甲酸酯类化合物及其制备方法与应用，该类化合物是一类新型的PKM2激动剂，可作为抗肿瘤药物，属于药物化学领域。
背景技术
抗肿瘤药物研究一直是全世界药物研究的热点领域之一。目前，有效的抗肿瘤药物很多，但是药效好、毒副作用低的抗肿瘤药物却很少。因此，目前抗肿瘤药物研究要解决的关键问题是发现疗效好、毒副作用低的抗肿瘤药物。利用肿瘤细胞与正常细胞在代谢过程中的区别，选择性地干预肿瘤细胞代谢过程中的关键环节，有可能达到既不损伤正常细胞，又可以抑制肿瘤细胞生长的目的。
20世纪20年代，Otto Warburg提出肿瘤是利用糖酵解而非更高效的氧化磷酸化来产生能量。这种代谢调节的结果是更高的葡萄糖消耗和乳酸的分泌，这些特点被称为Warburg效应或者叫有氧糖酵解。最近肿瘤代谢又成为肿瘤研究领域的一大热点，这使得很早之前的一个发现重新引起了人们的关注，即所有的癌细胞，不管它们的起始组织是什么，丙酮酸激酶M2亚型(PKM2)的表达都显著上调了。这个发现迅速将PKM2定位为癌症治疗的潜在靶点。
丙酮酸激酶(PK)是催化糖酵解最后一步的酶，将PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)转化为丙酮酸同时将ADP磷酸化为ATP。在哺乳动物中PK有4种亚型，它们的表达谱以及调节可能反应了它们所在不同组织的特殊功能和能量要求。这四种亚型共被2个基因编码，分别是PKLR和PKM，它们的表达分别受组织特异性启动子的调节和选择性剪切的调节。PKLR编码PKL和PKR两种亚型，分别在肝肾和网织红细胞中特异性表达。PKM基因通过选择性剪切产生两种变异体：一种M1，主要表达在骨骼肌，心脏和脑中；另一种M2，它最初是在增值细胞以及胚胎发育期细胞中被鉴定的。其中M1亚型为持续激活的高活性形式，而PKM2可以在低活性和高活性之间转化。而在肿瘤细胞中，PKM2逐渐得取代组织特异性的PK亚型直到它成为主要形式。这种亚型的转变表明PKM2的某种特定性质促进肿瘤生成。这个猜想被一个研究进一步证实，该研究发现，将肿瘤细胞中的PKM2用PKM1代替后，该持续激活的PK亚型，延迟了异种移植肿瘤的生长。
PKM2在癌症异常代谢中的作用的研究也有了实质性的进展。研究发现，它的作用是多方面的，包括了对代谢的作用还有对部分基因的调控作用。有人提出PKM2在增值细胞中是低活性的，而且它的低活性帮助累积了糖代谢中间体。其可用于合成生物大分子，从而促进了细胞的生长和增值。而PKM2除了在胞浆中有糖酵解酶的功能，它也在细胞核中被发现。PKM2的核定位可能是由于C端的NLS序列，这个序列与经典的NLS相比区别在于精氨酸和赖氨酸并不多。有人提出PKM2的转位机制涉及到PKM2和SUMO-E3PIAS3的相互作用，后者促进PKM2的sumoylation和核转位。被提及的PKM2的功能各不相同。核PKM2对于白介素3刺激后的增值以及凋亡刺激后的细胞死亡是必须的，但具体机制如何还不清楚。其他研究提出核PKM2可以与转录因子如β-catenin，Oct-4等相互作用并激活它们，在细胞存活和增值过程中起到作用。表皮生长因子受体的激活诱导了PKM2的核转位以及c-SRC介导的β-catenin磷酸化。在核中，PKM2与磷酸化β-catenin结合并促进它的转录活性；尤其是，诱导cyclingD1的表达，这对EGF诱导的细胞增殖是必须的。而且催化活性失活的PKM2突变体结合β-catenin并转位到细胞核中，然而，它不能激活cycling D1的转录。一个更近的研究提供了新证据证明了糖酵解失活的PKM2在细胞增殖中的作用。PKM2的二聚体被证实在细胞核中是作为蛋白激酶存在的，它用PEP去磷酸化转录因子Stat 3。有趣的是，PKM2的突变体不能形成四聚体，因此作为一个PK活性就小，所以它更喜欢在细胞核中，那儿它可以通过增强Stat3的磷酸化而促进细胞的增值。此外，还有关于核PKM2调节细胞周期的报道，最近有研究发现，PKM2通过磷酸化Bub2，从而帮助后者形成复合物定位到着丝粒帮助细胞进行***。总的来说，PKM2的核功能促进了细胞增殖。PKM2的这些功能可以看作其作为糖酵解关键酶的补充。不同于PKM2，将PKM1靶向到细胞核不会影响细胞的生长和生存。因此，PKM2的细胞核活性有可能是它在肿瘤中高表达的真正原因。
近年来以PKM2为靶点的抗肿瘤新药研究在国际上已开始受到重视，但国内研究的却很少。目前，已发现一些具有较好活性的小分子PKM2激动剂，但非常有限。而且已报道的PKM2激动剂只在酶水平展现出较好的活性，在细胞水平都没有显著的抗肿瘤活性。除非将肿瘤细胞在去除了丝氨酸等营养物质的培养基中培养，已有激动剂才表现出对肿瘤细胞的杀伤作用。我们组率先在国内建立了丙酮酸激酶M2亚型(PKM2)酶活性筛选模型，并对自有化合物库进行了初筛。从中，我们发现了一类结构全新的PKM2激动剂，而且首次发现该类激动剂在细胞水平也具有很好的抗肿瘤活性。而且与正常细胞相比，其对肿瘤细胞有很好的选择性。进一步的，我们合成了一系列先导化合物的衍生物，在酶和细胞两个水平上对其进行活性评价，揭示其构效关系，并优化得到了可作为候选药物进行深入研究的新型PKM2激动剂，并对其进行了初步的机制探讨。发现该类化合物通过阻止PKM2入细胞核而产生抗肿瘤的作用。我们的工作为以PKM2为靶点的新药研究提供了新骨架，更为低毒性抗肿瘤药物的发现提供了新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供氨基二硫代甲酸酯类化合物及其制备方法与应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：
本发明所提供的具有式Ⅰ结构的氨基二硫代甲酸酯类化合物或其药学上可接受的盐，
其中R1选自芳基、取代芳基、芳香杂环基或取代芳香杂环基。
在本发明中，优选的，R1选自以下基团所组成群组中的一种：(1)苯基；(2)经C1-3烷氧基、卤素、C1-3卤烷基、硝基、苄氧基、羟基或氰基取代的苯基；(3)呋喃基、吡啶基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、吲哚基、香豆素基、氮杂吲哚基或3-咪唑并吡啶基。
在本发明中，优选的，R1选自苯基、3,4-二氯苯基、4-氟苯基、2-呋喃基、4-氯苯基、4-甲氧基苯基、4-苄氧基苯基、4-硝基苯基、4-羟基苯基、4-氰基苯基、2-氯苯基、2-甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、3,4-二氟苯基、3-吡啶基、2-噻吩基、2-吡咯基、2-噻唑基、3-吲哚基、3-香豆素基、3-氮杂吲哚基或3-咪唑并吡啶基。
制备所述的化合物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，所述的通式Ⅰ的化合物可按照下述方法制备：
其中，R1为苯基。
制备所述的化合物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，所述的通式Ⅰ的化合物可按照下述方法制备：
其中，R1为3,4-二氯苯基、4-氟苯基、2-呋喃基、4-氯苯基、4-甲氧基苯基、4-苄氧基苯基、4-硝基苯基、4-羟基苯基、4-氰基苯基、2-氯苯基、2-甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、3,4-二氟苯基、3-吡啶基、2-噻吩基、2-吡咯基、2-噻唑基、3-吲哚基、3-香豆素基、3-氮杂吲哚基或3-咪唑并吡啶基。
在本发明中，优选的，式Ⅱ所示结构的化合物可按下述方法制备：
(1)当R1为3,4-二氯苯基、4-氟苯基、2-呋喃基、4-氯苯基、4-甲氧基苯基、4-苄氧基苯基、4-硝基苯基、4-羟基苯基、4-氰基苯基、2-氯苯基、2-甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、3,4-二氟苯基、3-吡啶基、2-噻吩基、2-吡咯基、2-噻唑基、3-吲哚基或3-香豆素基时，
式Ⅲ结构的化合物与多聚甲醛在催化剂CF3COOH·(iPr)2NH作用下发生反应，生成式Ⅱ结构的化合物；
(2)当R1为3-氮杂吲哚基时，
7-氮杂吲哚和乙酰氯在AlCl3的作用下，反应生成式Ⅱ结构的化合物；
(3)当R1为3-咪唑并吡啶基时，
2-氨基吡啶先与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛进行反应，生成的中间产物再与氯丙酮进行反应，生成式Ⅱ结构的化合物。
需要注意的是以上所描述的合成途径是为了阐明本发明化合物的制备，而制备决不仅限于此，即其他合成方法同样可行，所述方法是指熟练人员一般知识内的合成方法。
如果需要，本发明化合物可以利用本领域已知的方法转变为它们的可药用盐。
本发明的另一个目的是提供本发明化合物的用途。
本发明发明人通过实验证实，本发明化合物靶向PKM2，是PKM2的激动剂，并发现该类化合物通过阻止PKM2进入细胞核而产生抗肿瘤的作用，具有很好的抗肿瘤作用，而且对肿瘤细胞有很好的选择性。
因此，本发明提出了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备丙酮酸激酶M2亚型激动剂中的应用。其中，所述的丙酮酸激酶M2亚型激动剂具有阻止丙酮酸激酶M2亚型进入细胞核的作用。及
所述化合物或其药学上接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。其中，所述抗肿瘤药物是用于治疗结肠癌、***或肺癌的药物。及
所述化合物或其药学上接受的盐在制备糖酵解途径的激动剂中的应用。
在本发明的具体实施例中详细给出了表1化合物的制备方法：
目标化合物：
表1
附图说明
图1为化合物22加入细胞后细胞核和细胞浆中PKM2的western检测结果图；其中，Mock为不加化合物的对照组，NZT为已报道的激动剂；
图2为化合物22阻滞细胞周期图；其中，(A)化合物22剂量依赖得将细胞阻滞在G2/M期，(B)化合物22的结构，(C)药物处理组(1μM，5μM)与DMSO对照组G2/M期占整个细胞周期的比例。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中所出现的缩略语的说明：
P 石油醚
E 乙酸乙酯
实施例1 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-(2-苯甲酰基)乙酯(化合物1)的合成
将3-氨甲基吡啶(541mg，5mmol)溶于25mL DCM中，加入TEA(506mg，5mmol)，室温下搅拌10min，加入CS2(457mg，6mmol)，室温下反应20min，加入3-氯苯丙酮(843mg，5mmol)，室温下反应5h，直接减压旋干溶剂，柱层析(P：E＝1：2)，得到白色固体，产率77.2％。熔点：82-84℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.50(s,1H),8.70-8.32(m,2H),7.97(d,J＝7.4Hz,2H),7.66(ddd,J＝10.8,8.5,4.4Hz,2H),7.53(t,J＝7.1Hz,2H),7.37(dd,J＝7.7,4.8Hz,1H),4.86(d,J＝5.3Hz,2H),3.50(dt,J＝11.8,4.7Hz,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ198.72,197.82,149.56,148.90,136.65,135.96,133.90,133.40,129.25,128.37,123.98,47.58,38.65,29.32.
实施例2 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(3,4-二氯-苯甲酰基)]乙酯(化合物2)的合成
将3，4-二氯苯乙酮(756mg，4mmol)溶于10mL DMF中，加入多聚甲醛(240mg，8mmol)，催化剂CF3COOH·(iPr)2NH(860mg，4mmol)，80℃下反应12h，冷却至室温，加入水50mL，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析(P：E＝20：1)，得到油状物中间体(2-1)，收率27.5％。将3-氨甲基吡啶(324mg，3mmol)溶于20mL DCM中，加入TEA(303mg，3mmol)，室温下搅拌5min，加入CS2(274mg，3.6mmol)，反应10min，加入中间体2-1，室温下反应5h，减压蒸除溶剂，柱层析(P:E＝2:1)，得到白色固体，收率56.3％。熔点：139.3-140.2℃。
中间体2-1
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14-7.78(m,1H),7.81-7.60(m,1H),7.60-7.37(m,1H),7.15-6.93(m,1H),6.39(dd,J＝17.1,1.4Hz,1H),6.06-5.70(m,1H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ187.61,136.61,135.80,132.35,130.51,130.37,129.79,129.67,126.69.
产物2
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.52(q,J＝5.3Hz,1H),8.77-8.28(m,2H),8.37-8.05(m,1H),7.92(dd,J＝4.9,3.5Hz,1H),7.79(td,J＝8.3,4.1Hz,1H),7.75-7.58(m,1H),7.60-7.26(m,1H),5.09-4.70(m,2H),3.74-3.39(m,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.18,196.51,149.08,148.40,136.21,135.47,132.88,131.85,131.06,129.81,127.92,123.46,47.11,38.41,28.64.
HRMS calcd.For C16H15Cl2N2OS2 +[M+H]+384.9997,found:384.9989.
实施例3 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(4-氟-苯甲酰基)]乙酯(化合物3)的合成
以4-氟苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。中间体3-1为油状物，收率46.1％；产物3为白色固体，收率35.4％，熔点：127.4-128.1℃。
中间体3-1
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11-7.83(m,2H),7.14(dt,J＝10.6,9.6Hz,3H),6.58-6.23(m,1H),6.12-5.77(m,1H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ188.31,165.96,163.43,132.63,132.60,130.98,130.34,130.25,129.29,114.85,114.64.
产物3
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.60(t,J＝5.5Hz,1H),8.81-8.35(m,2H),8.33-7.92(m,2H),7.93-7.56(m,1H),7.46-7.17(m,3H),4.85(d,J＝5.6Hz,2H),3.72-3.40(m,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.73,197.32,166.84,164.34,149.57,148.85,135.98,133.44,131.45,131.36,123.94,116.35,116.13,47.53,45.79,38.65.
HRMS calcd.For C16H16FN2OS2 +[M+H]+335.0683,found:384.0680.
实施例4 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(2-呋喃甲酰基)]乙酯(化合物4)的合成
以2-乙酰呋喃为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。中间体4-1为油状物，收率36.5％；产物4为白色固体，产率63.5％，熔点：122.9-123.6℃。
中间体4-1
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77-7.56(m,1H),7.31-7.24(m,1H),7.19-6.96(m,1H),6.72-6.42(m,2H),6.00-5.73(m,1H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ177.97,152.91,146.95,131.32,129.38,118.27,112.45.
产物4
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.51(t,J＝5.5Hz,1H),8.82-8.26(m,2H),7.99(dd,J＝1.6,0.6Hz,1H),7.69(dt,J＝7.8,1.9Hz,1H),7.60-7.18(m,2H),6.71(dd,J＝3.6,1.7Hz,1H),4.85(d,J＝5.6Hz,2H),3.49(t,J＝6.8Hz,2H),3.26(t,J＝6.8Hz,2H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.54,186.94,152.05,149.55,148.88,148.35,135.96,133.38,123.96,119.10,113.02,47.58,38.15,29.01.
HRMS calcd.For C14H15N2O2S2 +[M+H]+307.0570,found:307.0563.
实施例5 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(4-氯-苯甲酰基)]乙酯(化合物5)的合成
以4-氯苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。
由于取代基不同，使得原料甲基酮和形成的中间体Michael受体难以分离，因此只是进行粗略柱层析除去多聚甲醛，没有进行精确分离，直接进行下步反应。产物5为白色固体，两步收率21.7％，熔点：113.7-113.9℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.52(t,J＝5.2Hz,1H),8.77-8.34(m,2H),8.22-7.93(m,2H),7.70(dt,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.68-7.52(m,2H),7.36(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),4.85(d,J＝5.3Hz,2H),3.62-3.40(m,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.75,197.74,149.57,148.88,138.80,135.97,135.31,133.40,130.30,129.34,123.95,47.58,38.72,29.23.
HRMS calcd.For C16H16ClN2OS2 +[M+H]+351.0387,found:351.0380.
实施例6 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(4-甲氧基-苯甲酰基)]乙酯(化合物6)的合成
以4-甲氧基苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物6为白色固体，两步收率54.1％，熔点：135.5-135.8℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.49(t,J＝5.2Hz,1H),8.50(dd,J＝19.5,2.4Hz,2H),7.94(d,J＝8.8Hz,2H),7.70(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(dd,J＝7.7,4.8Hz,1H),7.03(d,J＝8.8Hz,2H),4.86(d,J＝5.5Hz,2H),3.84(s,3H),3.44(ddd,J＝17.6,12.1,5.6Hz,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.91,196.99,163.74,149.56,148.89,135.96,133.42,130.71,129.67,123.96,114.40,56.00,47.57,38.21,29.50.
HRMS calcd.For C17H19N2O2S2 +[M+H]+347.0883,found:347.0876.
实施例7 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(4-苄氧基-苯甲酰基)]乙酯(化合物7)的合成
以4-苄氧基苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物7为白色固体，两步收率22.0％，熔点：148.3-148.9℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.72-8.36(m,2H),7.92(dd,J＝9.4,2.3Hz,2H),7.69(dt,J＝7.8,1.9Hz,1H),7.38(dqd,J＝9.6,8.7,4.3Hz,6H),7.11(d,J＝8.9Hz,2H),5.19(s,2H),4.85(s,2H),3.76-3.26(m,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.84,197.04,162.81,149.46,148.83,136.86,136.00,133.44,130.71,129.80,128.96,128.49,128.21,124.00,115.21,69.97,47.39,38.18,29.48.
HRMS calcd.For C23H23N2O2S2 +[M+H]+423.1196,found:423.1194.
实施例8 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(4-硝基-苯甲酰基)]乙酯(化合物8)的合成
以4-硝基苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物8为淡黄色固体，两步收率26.8％，熔点：153.0-154.1℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.69-8.43(m,2H),8.34(d,J＝8.9Hz,2H),8.25-8.09(m,2H),7.71(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),7.38(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),4.86(s,2H),3.54(d,J＝15.1Hz,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.52,197.06,149.96,148.95,148.34,140.58,135.53,132.89,129.32,123.84,123.51,46.92,38.83,28.54.
HRMS calcd.For C16H16N3O3S2 +[M+H]+362.0628,found:362.0625.
实施例9 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(4-羟基-苯甲酰基)]乙酯(化合物9)的合成
以4-羟基苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物9为白色固体，两步收率11.1％，熔点：166.7-167.2℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.75-8.35(m,2H),7.85(d,J＝8.7Hz,2H),7.81-7.60(m,1H),7.38(dd,J＝7.7,4.8Hz,1H),6.87(d,J＝8.7Hz,2H),4.85(s,2H),3.88-3.19(m,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.38,196.29,161.99,148.94,148.33,135.50,132.95,130.46,127.89,123.53,115.18,46.86,37.48,29.03.
HRMS calcd.For C16H17N2O2S2 +[M+H]+333.0726,found:333.0718.
实施例10 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(4-氰基-苯甲酰基)]乙酯(化合物10)的合成
以4-氰基苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物10为白色固体，两步收率16.9％，熔点：146.7-147.5℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.51(t,J＝5.5Hz,1H),8.64-8.41(m,2H),8.11(d,J＝8.5Hz,2H),8.00(d,J＝8.5Hz,2H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(dd,J＝7.7,4.8Hz,1H),4.85(d,J＝5.6Hz,2H),3.52(s,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ198.22,197.65,149.56,148.90,139.70,135.98,133.37,133.31,129.03,123.97,118.59,115.82,47.60,39.11,29.09.
HRMS calcd.For C17H16N3OS2 +[M+H]+342.0729,found:342.0723.
实施例11 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(2-氯-苯甲酰基)]乙酯(化合物11)的合成
以2-氯苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物11为白色固体，两步收率7.45％，熔点：78.0-78.6℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.53(t,J＝5.4Hz,1H),8.84-8.32(m,2H),7.67(dd,J＝9.9,7.8Hz,2H),7.58-7.33(m,4H),4.85(d,J＝5.6Hz,2H),3.44(dt,J＝12.9,6.7Hz,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ201.11,197.53,149.54,148.91,138.53,135.94,133.37,132.94,130.98,130.07,129.67,127.95,123.97,47.57,42.47,29.04.
HRMS calcd.For C16H16ClN2OS2 +[M+H]+351.0387,found:351.0382.
实施例12 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(2-甲氧基-苯甲酰基)]乙酯(化合物12)的合成
以2-甲氧基苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物12为白色固体，两步收率1.4％，熔点：96.2-97.0℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.47(t,J＝5.5Hz,1H),8.62-8.41(m,2H),7.69(dt,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.64-7.46(m,2H),7.36(dd,J＝7.6,4.7Hz,1H),7.17(d,J＝8.3Hz,1H),7.11-6.97(m,1H),4.85(d,J＝5.6Hz,2H),3.86(s,3H),3.58-3.32(m,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ199.94,197.88,158.92,149.53,148.88,135.93,134.54,133.42,130.04,127.49,123.96,120.96,113.01,56.28,47.54,43.61,29.44.
HRMS calcd.For C17H19N2O2S2 +[M+H]+347.0883,found:347.0877.
实施例13 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(4-三氟甲基-苯甲酰基)]乙酯(化合物13)的合成
以4-三氟甲基苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物13为黄色固体，两步收率10.4％，熔点：135.8-136.6℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.51(t,J＝5.5Hz,1H),8.69-8.43(m,2H),8.16(d,J＝8.1Hz,2H),7.90(d,J＝8.3Hz,2H),7.71(d,J＝1.8Hz,1H),7.37(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),4.85(d,J＝5.6Hz,2H),3.53(s,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ198.27,197.68,149.56,148.90,139.65,135.97,133.38,132.96,129.24,126.23,123.97,109.89,47.59,39.08,29.10.
HRMS calcd.For C17H16F3N2OS2 +[M+H]+385.0651,found:385.0644.
实施例14 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(3,4,5-三甲氧基-苯甲酰基)]乙酯(化合物14)的合成
以3,4,5-三甲氧基苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物14为白色固体，两步收率45.7％，熔点：85.6-86.8℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.52(s,J＝5.0Hz,1H),8.49(dd,J＝11.1,10.2Hz,2H),7.70(d,J＝7.8Hz,1H),7.37(dd,J＝7.6,4.9Hz,1H),7.23(d,J＝28.6Hz,2H),4.86(d,J＝5.4Hz,2H),3.85(s,6H),3.74(s,3H),3.61-3.40(m,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.39,197.18,152.76,149.07,148.41,141.95,135.48,132.91,131.54,123.47,105.44,60.12,56.02,47.09,38.10,29.09.
HRMS calcd.For C19H23N2O4S2 +[M+H]+407.1094,found:407.1087.
实施例15 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(3,4,-二氟-苯甲酰基)]乙酯(化合物15)的合成
以3,4-二氟苯乙酮为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物15为白色固体，两步收率24.4％，熔点：128.8-129.7℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.51(s,J＝4.9Hz,1H),8.62-8.35(m,2H),7.99(t,J＝8.2Hz,1H),7.86(d,J＝2.1Hz,1H),7.70(d,J＝7.8Hz,1H),7.56(d,J＝5.1Hz,1H),7.42-7.28(m,1H),4.86(d,J＝5.4Hz,2H),3.49(tt,J＝8.4,4.2Hz,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ207.24,196.61,151.12,149.66,149.45,149.03,148.57,136.05,135.79,134.14,133.38,123.94,117.83,47.51,38.80,29.18.
HRMS calcd.For C16H15F2N2OS2 +[M+H]+353.0588,found:353.0581.
实施例16 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(3-吡啶甲酰基)]乙酯(化合物16)的合成
以3-乙酰基吡啶为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物16为黄色固体，两步收率10.0％，熔点：95.1-95.9℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.52(t,J＝5.3Hz,1H),9.13(t,J＝4.3Hz,1H),8.80(dd,J＝4.7,1.4Hz,1H),8.50(dd,J＝20.1,2.4Hz,2H),8.30(dd,J＝6.1,1.8Hz,1H),7.70(d,J＝7.8Hz,1H),7.56(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),7.36(dd,J＝7.7,4.8Hz,1H),4.86(d,J＝5.5Hz,2H),3.53(t,J＝4.3Hz,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ198.32,197.71,154.06,149.62,149.56,148.89,135.97,135.92,133.39,131.90,124.38,123.97,47.61,39.00,29.05.
HRMS calcd.For C15H16N3OS2 +[M+H]+318.0729,found:318.0725.
实施例17 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(2-噻吩甲酰基)]乙酯(化合物17)的合成
以2-乙酰基噻吩为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物17为白色固体，两步收率52.8％，熔点：135.3-136.2℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.49(t,J＝5.3Hz,1H),8.56-8.45(m,2H),8.02(dd,J＝4.9,1.1Hz,1H),7.96(dd,J＝3.8,1.1Hz,1H),7.69(dt,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.37(ddd,J＝7.8,4.8,0.7Hz,1H),7.24(dd,J＝4.9,3.8Hz,1H),4.85(d,J＝5.6Hz,2H),3.51(t,J＝6.5Hz,2H),3.39(dd,J＝10.3,3.6Hz,2H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.62,191.68,149.56,148.90,143.72,135.95,135.52,134.04,133.38,129.28,123.97,47.59,38.89,29.38.
HRMS calcd.For C14H15N2OS3 +[M+H]+323.0341,found:323.0339.
实施例18 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(2-吡咯甲酰基)]乙酯(化合物18)的合成
以2-乙酰基吡咯为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物18为白色固体，两步收率18.4％，熔点：128.7-129.3℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.85(s,1H),10.47(t,J＝5.3Hz,1H),8.57-8.39(m,2H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(dd,J＝7.7,4.8Hz,1H),7.09(s,1H),6.97(s,1H),6.22-6.13(m,1H),4.86(d,J＝5.5Hz,2H),3.50(t,J＝6.8Hz,2H),3.18(t,J＝6.9Hz,2H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.81,187.76,149.55,148.88,135.95,133.42,131.83,126.09,123.96,117.18,110.33,47.55,37.55,29.85.
HRMS calcd.For C14H16N3OS2 +[M+H]+306.0729,found:306.0724.
实施例19 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(2-噻唑甲酰基)]乙酯(化合物19)的合成
以2-乙酰基噻唑为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物19为淡黄色固体，两步收率9.2％,熔点：114.0-114.9℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12-8.96(m,1H),8.51-8.36(m,2H),8.02-7.93(m,1H),7.70(dd,J＝7.1,4.2Hz,2H),7.28-7.20(m,1H),5.03-4.89(m,2H),3.77-3.62(m,4H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ198.21,191.90,166.19,149.20,148.81,144.87,136.32,132.58,126.59,123.76,48.09,38.91,29.00.
HRMS calcd.For C13H14N3OS3 +[M+H]+324.0294,found:324.0290.
实施例20 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(3-吲哚甲酰基)]乙酯(化合物20)的合成
以3-乙酰基吲哚为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物20为白色固体，两步收率5.6％，熔点：156.6-157.4℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.96(s,1H),10.45(t,J＝5.5Hz,1H),8.56-8.45(m,2H),8.33(d,J＝3.1Hz,1H),8.25-8.13(m,1H),7.75-7.63(m,1H),7.47(dd,J＝6.7,1.7Hz,1H),7.37(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),7.26-7.12(m,2H),4.86(d,J＝5.6Hz,2H),3.55(t,J＝6.9Hz,2H),3.29(t,J＝7.0Hz,2H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ198.09,193.35,149.56,148.87,137.06,135.92,134.52,133.45,125.75,123.95,123.28,122.25,121.72,116.48,112.60,47.53,38.77,30.01.
HRMS calcd.For C18H18N3OS2 +[M+H]+356.0886,found:356.0883.
实施例21 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(3-香豆素甲酰基)]乙酯(化合物21)的合成
以3-乙酰基香豆素为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物21为白色固体，两步收率5.2％，熔点：127.8-128.7℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.49(t,J＝5.5Hz,1H),8.75-8.68(m,1H),8.54-8.42(m,2H),7.98(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.74(ddd,J＝22.0,12.9,4.6Hz,2H),7.50-7.34(m,3H),4.85(d,J＝5.6Hz,2H),3.58-3.37(m,4H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.72,196.12,158.81,155.08,149.56,148.89,147.89,135.96,135.11,133.38,131.33,125.44,124.25,123.97,118.64,116.60,47.60,42.43,28.96.
HRMS calcd.For C19H17N2O3S2 +[M+H]+385.0675,found:385.0672.
实施例22 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(3-N杂吲哚甲酰基)]乙酯(化合物22)的合成
反应的关键为3-乙酰基氮杂吲哚(22-I)的制备。将7-氮杂吲哚(590mg，5mmol)溶于80mL DCM中，加入AlCl3(3.39g，25mmol)，缓慢加入乙酰氯(3.4mL，47.8mmol)，室温下反应10h，将反应液置于冰浴中，缓慢加入甲醇20mL淬灭反应，将反应液浓缩，往剩余物中加入30mL水，用1N NaOH调PH～4左右，EtOAc(15mL×5)萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(P：E＝1：1)，得到白色固体(22-I)，收率82.5％。以22-I为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物22为白色固体，两步收率4.9％，熔点：147.8-148.2℃。
22-I
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.11-12.78(m,1H),8.79-8.69(m,1H),8.47-8.37(m,1H),8.15-7.98(m,1H),7.36-7.28(m,1H),2.64-2.52(m,3H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ193.43,149.21,143.54,132.43,131.83,118.96,118.44,116.79,27.15.
产物22
1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.50(s,1H),10.47(t,J＝5.5Hz,1H),8.56-8.43(m,4H),8.33(dd,J＝4.7,1.6Hz,1H),7.74-7.65(m,1H),7.37(dd,J＝7.7,4.8Hz,1H),7.26(dd,J＝7.9,4.7Hz,1H),4.86(d,J＝5.6Hz,2H),3.55(t,J＝6.8Hz,2H),3.31(d,J＝7.0Hz,2H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.99,193.64,149.56,149.41,148.88,144.72,135.94,134.90,133.43,130.00,123.97,118.59,118.05,115.13,47.55,38.67,29.79.
HRMS calcd.For C17H17N4OS2 +[M+H]+357.0838,found:357.0832.
实施例23 3-吡啶甲氨基二硫代甲酸-[2-(3-咪唑并吡啶甲酰基)]乙酯(化合物23)的合成
反应的关键为原料3-乙酰基咪唑并吡啶(23-I)的合成。将2-氨基吡啶(1.88g，20mmol)溶于3.82gN,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛中，105℃下反应24h，减压浓缩，加入35mL乙醇，氯丙酮(2.08g，22.7mmol)，室温下反应24h，继续减压浓缩，柱层析分离(P：E＝2：1)，得到黄色固体(23-I)，收率70.0％。以23-I为原料，参照实施例2的合成路线合成目标化合物。产物23为白色固体，两步收率14.0％，熔点：164.8-165.6℃。
23-I
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.73-9.47(m,1H),8.46-8.27(m,1H),7.88-7.69(m,1H),7.56-7.42(m,1H),7.25-6.94(m,1H),2.86-2.35(m,3H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ187.25,148.80,143.43,128.96,128.71,123.96,117.69,114.98,27.16.
产物23
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.51(t,J＝5.1Hz,1H),9.54(d,J＝6.8Hz,1H),8.64(s,1H),8.50(dd,J＝10.4,8.8Hz,3H),7.85(d,J＝8.9Hz,1H),7.70(d,J＝7.7Hz,1H),7.38(d,J＝5.0Hz,1H),7.29(t,J＝6.7Hz,1H),4.86(d,J＝5.0Hz,2H),3.59(t,J＝6.8Hz,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H).
13C NMR(100MHz,DMSO)δ197.14,187.57,149.06,148.40,143.81,135.45,132.89,132.63,129.61,128.04,123.48,123.03,117.44,115.60,47.09,38.33,29.28.
HRMS calcd.For C17H17N4OS2 +[M+H]+357.0838,found:357.0832.
试验例1本发明化合物对PKM2的激动活性评价
实验步骤：
PKM2活性通过乳酸脱氢酶(LDH)耦联反应体系检测，通过检测底物NADH含量的减少来判断PKM2催化作用的活力，已知底物NADH被紫外光激发后，可发射340nm荧光，340nm荧光减少量与NADH减少量成正比。因此PKM2的活性就通过单位时间内NADH的减少量来检测。将44ul含底物的反应体系(终浓度：50mM Tris-Cl pH 8.0,200mM KCl,15mM MgCl2,0.1mMPEP,4.0mM ADP and 0.2mM NADH)加入96孔板，再加入1μl化合物和5μl酶混合物(终浓度：10nM hPKM2and 1μM of LDH)。孵育20min后，将96孔板放入FlexStation 3(MolecularDevices)中，每隔30s检测NADH读值，共检测3～6min。记录结果，用GraphPad prism作出量效关系曲线得到化合物AC50的结果。
结果评价：
本发明合成了23个氨基二硫代化合物，并检测了其对PKM2的激动活性，实验结果见表2。可以看到，这些化合物的活性都在10μM以下，其中22号化合物达到了1μM，对PKM2具有较强的激动活性。而且从最大激动率来看，这些化合物大多达到了50％以上。其中22号化合物达到了182％。
表2本发明化合物对PKM2的激动活性测定结果
a：％FBP表示最大激动率与FBP激动率(归一化到100％)的比值，其中FBP为PKM2内源性激动剂。
试验例2本发明化合物对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用评价
实验步骤：
MTT法检测细胞活性，配制MTS溶液和MTS工作液；将细胞接种于96孔板内(5×103个细胞/100μL)，在37℃，5％CO2和95％空气环境的孵箱内孵育12h；每块96孔板设置空白对照组、给药组，给药组分别加入终浓度为0.625μM，1.25μM，2.5μM，5μM，10μM，20μM的化合物溶液，每个浓度平行3个孔，置于孵箱中孵育48h；加入MTS工作液，置于孵箱中孵育4h，在波长490nm处测定OD值。按照下列公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝OD给药组/OD空白对照组×100％。重复实验3次。
结果评价：
已报道的激动剂在细胞水平没有显著的抗增殖作用，除非细胞用无丝氨酸，谷氨酰胺的培养基培养。然而本发明的化合物在细胞水平显示出了较强的作用。本发明选取了10个酶活性较好的化合物在HCT116，Hela以及H1299三种PKM2高表达的肿瘤细胞系中进行了MTT法细胞活性的检测。由于没有合适的PKM2激动剂作为细胞水平的阳性对照，因此本发明选择了紫杉醇作为对照，来验证实验的准确性。实验所测得紫杉醇的活性数据与已报道的活性相当，说明本发明的模型检验准确度与灵敏度还是可以的。结果如表3显示，本发明化合物的活性范围在0.64-5.6μM之间。其中，Hela细胞对这些化合物最敏感，大部分IC50值达到了nM级。为了进一步探索这类化合物对肿瘤细胞的选择性，本发明还对正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B进行了活性检测。从表3中可以看到，大多数化合物表现出了对肿瘤细胞的选择性。这些结果显示这一系列化合物有潜力成为新型的肿瘤选择性的抗肿瘤药物。这也与PKM2靶点的特点相一致。正常细胞更倾向于高活性丙酮酸激酶形式，因此激动PKM2不会损害正常细胞。
表3本发明化合物抑制HCT116、Hela和H1299细胞生长的IC50(μM)
其中BEAS-2B为正常肺支气管上皮细胞。
试验例3本发明化合物抑制PKM2进入细胞核
1)敲低PKM2后，再将化合物22加入细胞中，化合物的活性下降，说明化合物确实是靶向PKM2的。
实验步骤：用慢病毒体系敲低HCT116细胞中PKM2基因，得到shPKM2-1和shPKM2-2两株细胞，用22号化合物分别处理这两株细胞及正常细胞，用MTT法检测化合物对细胞的活性。
结果评价：从表4可以发现，敲低了PKM2之后，化合物的活性由2.5μM降低至8μM左右，说明了该化合物的活性是依赖于PKM2通路的，也说明该化合物很好得靶向到了PKM2这个靶点。
表4化合物22在正常HCT116细胞及敲低了PKM2之后的细胞中活性的比较
2)在细胞中加入化合物22，抑制了细胞中PKM2的入核。
实验步骤：正常培养HCT16细胞至密度约60％时换为无血清培养基同时加入化合物22，终浓度为10μM。四小时后收细胞，PBS洗一遍，利用普利莱核浆分离试剂盒分离细胞核细胞浆，用western检测胞浆中PKM2的量，细胞核上样量为200ug细胞浆上样量为150ug。
结果评价：通过核浆分离，可以更清楚得观察分布在核内和胞浆的PKM2，从图1可以看到，给予22号药物后，核内几乎观察不到PKM2了。图1中NZT为已报道的激动剂代表，可以看到已有激动剂并不能抑制PKM2入核。这个结果说明该化合物与以往激动剂的作用机制不同，是通过抑制PKM2入核，进而抑制其在核内发挥促增殖相关的蛋白激酶活性，从而达到抗肿瘤的作用。
3)在HCT116细胞中加入化合物22后，细胞被明显阻滞在G2/M期。
实验步骤：用6cm培养皿种100万个左右HCT16细胞，孵育36-48h。用胰酶消化后制成单细胞悬液，用预冷PBS漂洗1-2次，然后加1ml PBS重悬。加入预冷的(-20℃)无水乙醇，4℃固定过夜或者-20℃长期保存。离心去固定液，最后预先加入5ml PBS，有助于离心，弃上清。5ml PBS重悬一下，浸泡15min-30min,离心弃上清。475μl PBS重悬，加入1.5ml EP管，加入25μl 20×RNAse A，37℃孵育30min。加入5μl PI染液，4度避光孵育30min，离心去染液，加PBS 500μl重悬，过细胞筛，上机检测。
结果评价：将不同浓度化合物22(1μM，5μM)加入HCT116细胞中，进行细胞检测。从图2可以看到，22号化合物可以将细胞明显得阻滞在G2/M期。与DMSO阴性对照组相比，用1μM和5μM药物处理的HCT116细胞，G2/M期的比例分别增加了22.74％和59.75％(图2，C)。

Claims (9)

1.具有式Ⅰ结构的氨基二硫代甲酸酯类化合物或其药学上可接受的盐，
其中R1选自苯基、2-呋喃基、4-硝基苯基、4-羟基苯基、4-氰基苯基、2-氯苯基、2-甲氧基苯基、3-吡啶基、2-噻唑基或3-氮杂吲哚基。
2.制备权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，所述的式Ⅰ的化合物按照下述方法制备：
其中，R1为苯基。
3.制备权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，所述的式Ⅰ的化合物按照下述方法制备：
其中，R1为2-呋喃基、4-硝基苯基、4-羟基苯基、4-氰基苯基、2-氯苯基、2-甲氧基苯基、3-吡啶基、2-噻唑基或3-氮杂吲哚基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，式Ⅱ所示结构的化合物按下述方法制备：
(1)当R1为2-呋喃基、4-硝基苯基、4-羟基苯基、4-氰基苯基、2-氯苯基、2-甲氧基苯基、3-吡啶基或2-噻唑基时，
式Ⅲ结构的化合物与多聚甲醛在催化剂CF3COOH·(iPr)2NH作用下发生反应，生成式Ⅱ结构的化合物；
(2)当R1为3-氮杂吲哚基时，
7-氮杂吲哚和乙酰氯在AlCl3的作用下，反应生成3-乙酰基氮杂吲哚，3-乙酰基氮杂吲哚与多聚甲醛在催化剂CF3COOH·(iPr)2NH作用下发生反应，生成式Ⅱ结构的化合物。
5.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备丙酮酸激酶M2亚型激动剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的丙酮酸激酶M2亚型激动剂具有阻止丙酮酸激酶M2亚型进入细胞核的作用。
7.权利要求1所述化合物或其药学上接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物是用于治疗结肠癌、***或肺癌的药物。
9.权利要求1所述化合物或其药学上接受的盐在制备糖酵解途径的激动剂中的应用。
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