CN104805170B - 灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法 - Google Patents

灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种灵芝三萜酸发酵提取工艺方法，具体涉及一种能有效提高产量的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，属于生物发酵技术领域。一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，包括如下步骤：(1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖25.0‑27.0g/L，玉米粉10.2‑12.2g/L，麸皮粉9.8‑11.8g/L和蛋白胨4.9‑6.9g/L；(2)发酵培养；(3)提取分离。本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法能有效解决现有技术中灵芝子实体栽培资源浪费，三萜酸培养提取时间长，有效提取率和纯度不高，不易进行大规模工业化生产的问题。

Description

灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法
技术领域
本发明涉及一种灵芝三萜酸发酵提取工艺方法，具体涉及一种能有效提高产量的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，属于生物发酵技术领域。
背景技术
灵芝三萜酸属于灵芝的二级代谢物，是灵芝中除多糖外的另一种关键性药效成分，具有止痛、镇静抑制组胺释放、解毒、保肝、毒杀肿瘤细胞、提高机体免疫力、降血糖等作用。
现有技术中灵芝三萜酸的发酵提取水平不高，产量偏低限制了其工业化生产的发展，不能满足现代工业化发酵生产的需要。
在申请号00111953.2的中国专利中提出了液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝三萜酸的技术。该技术的缺点是灵芝三萜的发酵周期太长，液体好氧发酵加上静置培养的总发酵时间长达2-3周，生产周期过长，因此，其整体生产效率较低。
目前，现有技术中采用的有机溶剂法通常需要较长的提取时间并消耗大量的提取溶剂，同时大量有机溶剂的使用会给人体和环境带来不利的影响。另外由于灵芝子实体由纤维素、半纤维素和木质素等主要成分构成，结构紧密，传统的浸提法时间长、耗能高，活性成分提取物得率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法能有效解决现有技术中灵芝子实体栽培资源浪费，三萜酸培养提取时间长，有效提取率和纯度不高，不易进行大规模工业化生产的问题。
本发明的技术方案如下：
一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，所述灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法包括如下步骤：
(1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖25.0-27.0g/L，玉米粉10.2-12.2g/L，麸皮粉9.8-11.8g/L和蛋白胨4.9-6.9g/L；
(2)发酵培养：在培养基中添加400-500mg/L的桔梗水提物或180-220mg/L的金银花和枸杞醇提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵培养条件如下：发酵起始pH值为5.5-6.5，温度为28-32℃，摇床转速为150-170r/min，发酵时间为166-170h；发酵过程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝子实体；
(3)提取分离：包括以下步骤：
①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三至四次，所述萃取方法为：先将灵芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按0.8-1.2:14(W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度为4.8-5.2％(W:V)的NaHCO3溶液按照2.8-3.2:1(V:V)比例混合，浸泡22-26h后，提取萃取液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min；然后过滤分离；
②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按0.8-1.2:8(W:V)比例加入浓度为4.8-5.2％(W:V)NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min，之后利用孔径为0.4-0.5μm的微孔滤膜过滤得到滤液β；接着将滤液α和滤液β合并，开启分散机，调整转速至4800-5200r/min，分散18-22min，得上清液；之后在3.8-4.2℃冰浴条件下，将上清液用5.8-6.2mol/L的稀盐酸进行酸化至pH＝2.8-3.2，得到酸化液；
③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取3-5次后，收集并合并萃取液，将萃取液静置35-45min，用孔径0.4-0.5μm的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
④将黄色清液在44-46℃条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在58-62℃水浴条件下干燥烘干至恒重；
步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照95:5-98:2的体积配比配制而成。
进一步的，所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗90-110g，用水煎制煮沸25-35min，倒出药渣，补加适量冷水于药渣中，再煮沸18-22min，倒出药汁，之后再补加适量冷水于药渣中，煮沸18-22min，倒出药汁，合并药汁，过滤药汁，将过滤后的药汁于55-65℃下干燥，得到桔梗水提物。
所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照0.8-1.2：1的质量配比混合后，30-50目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用2.5-3.5倍的乙醇提取2.5-3.5h，获得萃取液，将剩余物质再加入2.5-3.5倍的乙醇提取1.5-2.5h，再次获得萃取液，之后合并两次获得的萃取液，旋蒸减压浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物；所述乙醇的体积百分浓度为93-97％。
更进一步的，步骤(3)的第③步中所述的萃取液在静置前先加入纤维素复合酶进行酶解，酶解温度45-55℃，pH＝5.5-6.5，酶解时间18-22min，纤维素复合酶的加入量为萃取液的1.5-2.5％(W:V)；所述纤维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活力4.8-5.2:2.8-3.2:1.8-2.2混合而成。
本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法对比现有技术有如下优点：
1)菌种的培养周期短；
2)原材料易得，生产成本低；
3)节能降耗；
4)提高灵芝三萜酸的生产效率和提取得率，所得的灵芝三萜酸质量稳定；
5)产量稳定，不受季节和原材料的影响；
6)适合大规模工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和具体实施例来对本发明进行详细的说明。
(一)具体实施方式如下：
一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，所述灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法包括如下步骤：
(1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖25.0-27.0g/L，玉米粉10.2-12.2g/L，麸皮粉9.8-11.8g/L和蛋白胨4.9-6.9g/L；
(2)发酵培养：在培养基中添加400-500mg/L的桔梗水提物或180-220mg/L的金银花和枸杞醇提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵培养条件如下：发酵起始pH值为5.5-6.5，温度为28-32℃，摇床转速为150-170r/min，发酵时间为166-170h；发酵过程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝子实体；
(3)提取分离：包括以下步骤：
①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三至四次，所述萃取方法为：先将灵芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按0.8-1.2:14(W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度为4.8-5.2％(W:V)的NaHCO3溶液按照2.8-3.2:1(V:V)比例混合，浸泡22-26h后，提取萃取液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min；然后过滤分离；
②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按0.8-1.2:8(W:V)比例加入浓度为4.8-5.2％(W:V)NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min，之后利用孔径为0.4-0.5μm的微孔滤膜过滤得到滤液β；接着将滤液α和滤液β合并，开启分散机，调整转速至4800-5200r/min，分散18-22min，得上清液；之后在3.8-4.2℃冰浴条件下，将上清液用5.8-6.2mol/L的稀盐酸进行酸化至pH＝2.8-3.2，得到酸化液；
③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取3-5次后，收集并合并萃取液，将萃取液静置35-45min，用孔径0.4-0.5μm的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
④将黄色清液在44-46℃条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在58-62℃水浴条件下干燥烘干至恒重；
步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照95:5-98:2的体积配比配制而成。
步骤(3)的第③步中所述的萃取液在静置前可先加入纤维素复合酶进行酶解，酶解温度45-55℃，pH＝5.5-6.5，酶解时间18-22min，纤维素复合酶的加入量为萃取液的1.5-2.5％(W:V)；所述纤维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活力4.8-5.2:2.8-3.2:1.8-2.2混合而成。
所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗90-110g，用水煎制煮沸25-35min，倒出药渣，补加适量冷水于药渣中，再煮沸18-22min，倒出药汁，之后再补加适量冷水于药渣中，煮沸18-22min，倒出药汁，合并药汁，过滤药汁，将过滤后的药汁于55-65℃下干燥，得到桔梗水提物。
所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照0.8-1.2：1的质量配比混合后，30-50目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用2.5-3.5倍的乙醇提取2.5-3.5h，获得萃取液，将剩余物质再加入2.5-3.5倍的乙醇提取1.5-2.5h，再次获得萃取液，之后合并两次获得的萃取液，旋蒸减压浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物；所述乙醇的体积百分浓度为93-97％。
(二)实施例如下：下面通过实施例进一步说明本发明：
实施例组1
实施例1-1
一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，所述灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法包括如下步骤：
(1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖26.0g/L，玉米粉11.2g/L，麸皮粉10.8g/L和蛋白胨5.9g/L；
(2)发酵培养：在培养基中添加450mg/L的桔梗水提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵培养条件如下：发酵起始pH值为6，温度为30℃，摇床转速为160r/min，发酵时间为168h；发酵过程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝子实体；
所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗100g，用水煎制煮沸30min，倒出药渣，补加适量冷水于药渣中，再煮沸20min，倒出药汁，之后再煮沸20min，倒出药汁，合并药汁，过滤，于60℃下干燥，得到桔梗水提物；
(3)提取分离：包括以下步骤：
①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三次，所述萃取方法为：先将灵芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按1:14(W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度为5％(W:V)的NaHCO3溶液按照3:1(V:V)比例混合，浸泡24h后，提取萃取液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超声辅助设备，在400W超声输出功率下，采用55kHz的超声频率，超声处理30min，停滞10min，再次超声处理30min；然后过滤分离；
②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按1:8(W:V)比例加入浓度为5.0％(W:V)NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在400W超声输出功率下，采用55kHz的超声频率，超声处理30min，停滞10min，再次超声处理30min，之后利用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤得到滤液β；接着将滤液α和滤液β合并，开启分散机，调整转速至5000r/min，分散20min，得上清液；之后在4℃冰浴条件下，将上清液用6mol/L的稀盐酸进行酸化至pH＝3，得到酸化液；
③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取4次后，收集并合并萃取液，静置40min，用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
④将黄色清液在45℃条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在60℃水浴条件下干燥烘干至恒重；
步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照18:1的体积配比配制而成。
实施例1-2
实施例1-2与实施例1-1区别在于：将培养基中添加的桔梗水提物替换为200mg/L的金银花和枸杞醇提物。
所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照1：1的质量配比混合后，40目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用3倍的乙醇提取3h，获得萃取液，将剩余物质再加入3倍的乙醇提取2h，再次获得萃取液，之后合并两次获得的萃取液，旋蒸减压浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物；所述乙醇的体积百分浓度为95％。
实施例1-3
实施例1-3与实施例1-1区别在于：步骤(3)的第③步中所述的萃取液在静置前先加入纤维素复合酶进行酶解，酶解温度50℃，pH＝6.0，酶解时间20min，纤维素复合酶的加入量为萃取液的2.0％(W:V)；所述纤维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活力5:3:2混合而成。
实施例组2
实施例2-1
一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，所述灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法包括如下步骤：
(1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖25.0g/L，玉米粉10.2g/L，麸皮粉9.8g/L和蛋白胨4.9g/L；
(2)发酵培养：在培养基中添加400mg/L的桔梗水提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵培养条件如下：发酵起始pH值为5.5，温度为28℃，摇床转速为160r/min，发酵时间为166h；发酵过程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝子实体；
所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗100g，用水煎制煮沸30min，倒出药渣，补加适量冷水于药渣中，再煮沸20min，倒出药汁，之后再煮沸20min，倒出药汁，合并药汁，过滤，于60℃下干燥，得到桔梗水提物；
(3)提取分离：包括以下步骤：
①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三次，所述萃取方法为：先将灵芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按0.8:14(W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度为4.8％(W:V)的NaHCO3溶液按照2.8:1(V:V)比例混合，浸泡22h后，提取萃取液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超声辅助设备，在380W超声输出功率下，采用50kHz的超声频率，超声处理28min，停滞8min，再次超声处理28min；然后过滤分离；
②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按0.8:8(W:V)比例加入浓度为4.8％(W:V)NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在380W超声输出功率下，采用50kHz的超声频率，超声处理28min，停滞8min，再次超声处理28min，之后利用孔径为0.4μm的微孔滤膜过滤得到滤液β；接着将滤液α和滤液β合并，开启分散机，调整转速至4800r/min，分散18min，得上清液；之后在3.8℃冰浴条件下，将上清液用5.8mol/L的稀盐酸进行酸化至pH＝2.8，得到酸化液；
③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取3次后，收集并合并萃取液，静置35min，用孔径0.5μm的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
④将黄色清液在44℃条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在58℃水浴条件下干燥烘干至恒重；
步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照19:1的体积配比配制而成。
实施例2-2
实施例1-2与实施例1-1区别在于：将培养基中添加的桔梗水提物替换为180mg/L的金银花和枸杞醇提物。
所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照0.8：1的质量配比混合后，30目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用2.5倍的乙醇提取2.5h，获得萃取液，将剩余物质再加入2.5倍的乙醇提取1.5h，再次获得萃取液，之后合并两次获得的萃取液，旋蒸减压浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物；所述乙醇的体积百分浓度为93％。
实施例2-3
实施例1-3与实施例1-1区别在于：步骤(3)的第③步中所述的萃取液在静置前可先加入纤维素复合酶进行酶解，酶解温度45℃，pH＝5.5，酶解时间18min，纤维素复合酶的加入量为萃取液的1.5％(W:V)；所述纤维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活力4.8:2.8:1.8混合而成。
实施例组3
实施例3-1
一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，所述灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法包括如下步骤：
(1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖27.0g/L，玉米粉12.2g/L，麸皮粉11.8g/L和蛋白胨6.9g/L；
(2)发酵培养：在培养基中添加500mg/L的桔梗水提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵起始pH值为6.5，温度为32℃，摇床转速为170r/min，发酵时间为170h；发酵过程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝子实体；
所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗110g，用水煎制煮沸35min，倒出药渣，补加适量冷水于药渣中，再煮沸22min，倒出药汁，之后再补加适量冷水于药渣中，煮沸22min，倒出药汁，合并药汁，过滤药汁，将过滤后的药汁于65℃下干燥，得到桔梗水提物；
(3)提取分离：包括以下步骤：
①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三至四次，所述萃取方法为：先将灵芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按1.2:14(W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度为5.2％(W:V)的NaHCO3溶液按照3.2:1(V:V)比例混合，浸泡26h后，提取萃取液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超声辅助设备，在420W超声输出功率下，采用60kHz的超声频率，超声处理32min，停滞12min，再次超声处理32min；然后过滤分离；
②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按1.2:8(W:V)比例加入浓度为5.2％(W:V)NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在420W超声输出功率下，采用60kHz的超声频率，超声处理32min，停滞12min，再次超声处理32min，之后利用孔径为0.5μm的微孔滤膜过滤得到滤液β；接着将滤液α和滤液β合并，开启分散机，调整转速至5200r/min，分散22min，得上清液；之后在4.2℃冰浴条件下，将上清液用6.2mol/L的稀盐酸进行酸化至pH＝3.2，得到酸化液；
③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取5次后，收集并合并萃取液，将萃取液静置45min，用孔径0.5μm的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
④将黄色清液在46℃条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在62℃水浴条件下干燥烘干至恒重；
步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照49:1的体积配比配制而成。
实施例3-2
实施例1-2与实施例1-1区别在于：将培养基中添加的桔梗水提物替换为220mg/L的金银花和枸杞醇提物。
所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照1.2：1的质量配比混合后，50目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用3.5倍的乙醇提取3.5h，获得萃取液，将剩余物质再加入3.5倍的乙醇提取2.5h，再次获得萃取液，之后合并两次获得的萃取液，旋蒸减压浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物；所述乙醇的体积百分浓度为97％。
实施例3-3
实施例1-3与实施例1-1区别在于：步骤(3)的第③步中所述的萃取液在静置前可先加入纤维素复合酶进行酶解，酶解温度55℃，pH＝6.5，酶解时间22min，纤维素复合酶的加入量为萃取液的2.5％(W:V)；所述纤维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活力5.2:3.2:2.2混合而成。
在以上各实施例中：
经过对各实施例的测试，该灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法各项技术指标如下各表所示：
表1为本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法的各实施例接种前培养基的总糖量、总氮浓度及碳氮比和发酵结束时培养基的残糖量和残氮浓度的实验数据：
项目 总糖量 总氮浓度 碳氮比 残糖量 残氮浓度
实施例1-1 3.0％ 0.103％ 29.1:1 0.8％ 8.6％
实施例1-2 2.8％ 0.091％ 30.7:1 0.7％ 6.7％
实施例1-3 3.3％ 0.106％ 31.1:1 1％ 9.5％
实施例2-1 2.8％ 0.104％ 26.8:1 0.9％ 7.9％
实施例2-2 3.5％ 0.115％ 30.2:1 1.2％ 10％
实施例2-3 3.1％ 0.113％ 27.4:1 0.9％ 8.8％
实施例3-1 2.9％ 0.101％ 28.7:1 0.7％ 6.7％
实施例3-2 3.2％ 0.116％ 25.8:1 1.1％ 9.6％
实施例3-3 2.9％ 0.114％ 25.4:1 0.9％ 7.6％
从表1各实施例接种前培养基的总糖量、总氮浓度及碳氮比，以及发酵结束时的残糖量和残氮浓度，对比可明显看出，本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法具有合适的初始发酵环境，为发酵过程中生物量的提高奠定了良好的基础，发酵后残糖量和残氮浓度较低。
表2为本发明所提供的灵芝三萜酸提取分离工艺方法的各实施例中所获取的灵芝发酵菌丝体的实验数据
项目 单位 实施例1-1 实施例2-1 实施例3-1 常规工艺
生物量(DCW) g/L 9.5 9.1 8.9 7.6
生物量提高率 - 25.0％ 19.7％ 17.1％ -
胞内三萜酸 mg/L 229 217 211 192.5
胞内三萜酸提高率 - 19.0％ 12.9％ 9.6％ -
胞外三萜酸 mg/L 289 308 334 230
胞外三萜酸提高率 - 25.7％ 33.9％ 45.2％ -
项目 单位 实施例1-2 实施例2-2 实施例3-2 常规工艺
生物量(DCW) g/L 9.7 9.3 9.1 7.6
生物量提高率 - 27.7％ 22.4％ 19.8％ -
胞内三萜酸 mg/L 249 237 221 192.5
胞内三萜酸提高率 - 29.3％ 23.1％ 14.8％ -
胞外三萜酸 mg/L 310 340 366 230
胞外三萜酸提高率 - 34.7％ 47.8％ 59.1％ -
项目 单位 实施例1-3 实施例2-3 实施例3-3 常规工艺
生物量(DCW) g/L 10.67 10.23 10.0 7.6
生物量提高率 - 30.5％ 24.6％ 21.8％ -
胞内三萜酸 mg/L 274 261 243 192.5
胞内三萜酸提高率 - 32.2％ 25.4％ 16.3％ -
胞外三萜酸 mg/L 341 374 403 230
胞外三萜酸提高率 - 38.2％ 52.6％ 75.2％ -
从表2可明显看出，本发明所提供的灵芝三萜酸提取分离工艺方法过程中所获取的灵芝发酵菌丝体的生物量较常规工艺能提高17.1％-30.5％，最终所获取的和胞外三萜酸较常规工艺均有大幅提高，其中胞内三萜酸提高率为9.6％-32.2％，胞外三萜酸提高率为25.7％-75.2％。
表3本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法的各实施例有机溶剂的回收比例及消耗比例的实验数据：
项目 有机溶剂回收比例 有机溶剂消耗比例
实施例1-1 98.46％ 1.54％
实施例1-2 98.77％ 1.23％
实施例1-3 99.39％ 0.61％
实施例2-1 97.31％ 2.69％
实施例2-2 97.69％ 2.31％
实施例2-3 96.92％ 3.08％
实施例3-1 98.67％ 1.33％
实施例3-3 98.57％ 1.43％
实施例3-3 99.24％ 0.76％
从表3明显看出，本发明所提供的灵芝三萜酸提取分离工艺方法的各实施例有如下优点：(1)有机溶剂消耗较少，不容易对提取分离得到的灵芝三萜酸造成二次污染；(2)回收比例高，在一定程度上节省成本。
表4本发明所提供的灵芝总三萜酸提取分离工艺的各实施有效提取率和提取纯度的实验数据：
项目 有效提取率 总三萜纯度
实施例1-1 4.58％ 94.7％
实施例1-2 4.72％ 95.3％
实施例1-3 5.38％ 93.6％
实施例2-1 5.11％ 96.9％
实施例2-2 4.22％ 95.3％
实施例2-3 6.12％ 95.6％
实施例3-1 5.52％ 96.6％
实施例3-2 5.63％ 94.2％
实施例3-3 6.11％ 95.9％
从表4明显看出，本发明所提供的灵芝三萜酸提取分离工艺方法的各实施例均具有较高的有效提取率，提取分离所得的灵芝三萜酸纯度高；特别是加入复合纤维酶的实施例1-3、实施例2-3、实施例3-3比没加复合纤维酶的实施例1-1、实施例2-1、实施例3-1增加20％左右的总三萜酸有效提取率。
上述具体实施方式只是对本发明的技术方案进行详细解释，本发明并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于：所述灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法包括如下步骤：
(1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖25.0-27.0g/L，玉米粉10.2-12.2g/L，麸皮粉9.8-11.8g/L和蛋白胨4.9-6.9g/L；
(2)发酵培养：在培养基中添加400-500mg/L的桔梗水提物或180-220mg/L的金银花和枸杞醇提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵培养条件如下：发酵起始pH值为5.5-6.5，温度为28-32℃，摇床转速为150-170r/min，发酵时间为166-170h；发酵过程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝子实体；
(3)提取分离：包括以下步骤：
①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三至四次，所述萃取方法为：先将灵芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按0.8-1.2:14(W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度为4.8-5.2％(W:V)的NaHCO3溶液按照2.8-3.2:1(V:V)比例混合，浸泡22-26h后，提取萃取液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min；然后过滤分离；
②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按0.8-1.2:8(W:V)比例加入浓度为4.8-5.2％(W:V)NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min，之后利用孔径为0.4-0.5μm的微孔滤膜过滤得到滤液β；接着将滤液α和滤液β合并，开启分散机，调整转速至4800-5200r/min，分散18-22min，得上清液；之后在3.8-4.2℃冰浴条件下，将上清液用5.8-6.2mol/L的稀盐酸进行酸化至pH＝2.8-3.2，得到酸化液；
③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取3-5次后，收集并合并萃取液，将萃取液静置35-45min，用孔径0.4-0.5μm的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
④将黄色清液在44-46℃条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在58-62℃水浴条件下干燥烘干至恒重；
步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照95:5-98:2的体积配比配制而成。
2.根据权利要求1所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于：
步骤(1)所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖26.0g/L，玉米粉11.2g/L，麸皮粉10.8g/L和蛋白胨5.9g/L。
3.根据权利要求2所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于：
步骤(2)所述的培养基中添加450mg/L桔梗水提物或者200mg/L金银花和枸杞醇提物，发酵起始pH值为6.0，温度为30℃，摇床转速为160r/min，发酵时间为168h。
4.根据权利要求1或2或3所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于：所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗90-110g，用水煎制煮沸25-35min，倒出药渣，补加适量冷水于药渣中，再煮沸18-22min，倒出药汁，之后再补加适量冷水于药渣中，煮沸18-22min，倒出药汁，合并药汁，过滤药汁，之后将过滤后的药汁于55-65℃下干燥，得到桔梗水提物。
5.根据权利要求1或2或3所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于：所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照0.8-1.2：1的质量配比混合后，30-50目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用2.5-3.5倍的乙醇提取2.5-3.5h，获得萃取液，将剩余物质再加入2.5-3.5倍的乙醇提取1.5-2.5h，再次获得萃取液，之后合并两次获得的萃取液，浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物；所述乙醇的体积百分浓度为93-97％。
6.根据权利要求1或2或3所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于：步骤(3)中所述的萃取液在静置前先加入纤维素复合酶进行酶解，酶解温度45-55℃，pH＝5.5-6.5，酶解时间18-22min，纤维素复合酶的加入量为萃取液的1.5-2.5％(W:V)；所述纤维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活力4.8-5.2:2.8-3.2:1.8-2.2混合而成。
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