CN104805103A - 一种来自水稻的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1，该磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供一种含有OsPMI1的原核表达载体。本发明还提供一种磷酸甘露糖异构酶的酶活分析方法。并且本发明提供一种含有OsPMI1的表达盒和一种植物表达载体，以及该表达盒和表达载体在植物遗传转化方面的应用。本发明利用OsPMI1基因构建的植物表达载体，以甘露糖为筛选剂，成功实现了转化水稻细胞。本发明成功分离和克隆出植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，由于该磷酸甘露糖异构酶基因来源于植物(水稻)，对人类没有潜在危险。可以用于替代来自大肠杆菌的磷酸甘露糖异构酶，从而降低潜在的安全风险。

Description

一种来自水稻的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种来自水稻(Oryza sativa)的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1的分离和克隆及应用。

背景技术

转基因技术，是20世纪80年代初发展起来的一种有效的植物定向改良方法。该技术主要通过农杆菌介导、基因枪转化等方法将目的基因导入受体，经过标记筛选和分子检测，获得稳定表达的转化体，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。全球转基因作物的研发和应用正步入快车道。由于转基因作物的基因来源超越了本物种的范围，打破了原有物种生殖隔离的界限，转基因技术的潜在安全风险也引起广泛关注。

筛选标记基因的潜在安全风险是目前公众对转基因技术担忧的一个重要方面。现有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记。抗生素标记基因与***的目的基因一起转入目标作物中，用于帮助在植物遗传转化筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植株。标记基因本身并无安全性问题。但该类基因可能随食物进入肠道,存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。

为避免对抗生素等传统筛选剂的依赖，降低抗生素抗性基因等筛选标记的潜在风险，近年来一些安全性更好的筛选标记基因应用于转基因作物的研发，并取得了很好的效果。如磷酸甘露糖异构酶(phosphate mannoseisomerase，PMI)基因是一种糖代谢基因，水稻等许多高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏磷酸甘露糖异构酶，或者表达量很低，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用。因此磷酸甘露糖异构酶可以作为筛选标记基因。而且与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达磷酸甘露糖异构酶，可以利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率较高。甘露糖广泛存在于海藻、蕨类等植物中，同时PMI的催化产物6-磷酸果糖是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。因此PMI基因是一种安全筛选标记，有效避免了抗生素、除草剂等抗性基因存在的潜在风险。目前，PMI筛选标记基因已在水稻、小麦、玉米、马铃薯等作物中得到成功应用，在开发安全性较好的转基因作物及其产品方面，具有广泛的应用前景。

但现在广泛使用的磷酸甘露糖异构酶是从原核生物大肠杆菌中分离而来的，这是因为目前人们还没有意识到从原核生物大肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧，或者是人们对这种从原核生物大肠杆菌中分离出的PMI的安全性没有引起足够的重视。因此，本领域有对安全性更好的高等植物源PMI筛选标记基因的迫切需求，但目前还没有高等植物源的PMI筛选标记基因的报道。

发明内容

本申请的发明人基于在转基因领域多年的研究经验，意识到从原核生物大肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。针对目前来自大肠杆菌的PMI筛选标记所可能带来的安全隐患，以及高度植物源PMI筛选标记基因研究较少的现状，本发明希望获得高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，并以其为安全的筛选标记基因进行植物遗传转化。

为了实现本发明的目的，发明人针对可能含有磷酸甘露糖异构酶基因的不同植物，进行了大量植物提取实验和酶活分析，并最终从水稻中成功分离、克隆了磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1，并以其作为筛选标记基因，成功获得了转基因植物。

更具体而言，本申请的发明人从水稻(Oryza sativa)中分离、克隆了磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1。另外，本发明还构建了含有OsPMI1的原核表达载体，应用于OsPMI1蛋白的酶活分析；构建了含有OsPMI1的植物表达载体，并以其作为筛选标记，应用于植物遗传转化。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，该磷酸甘露糖异构酶基因提取自水稻，本发明将其命名为OsPMI1。

优选地，该磷酸甘露糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO:1为：

在第二个方面，本发明提供一种水稻磷酸甘露糖异构酶的酶活鉴定方法，通过设计OsPMI1原核表达引物，经亚克隆获得融合GST(谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione-S-transferase)片段的原核表达载体，并转入大肠杆菌表达菌株BL21，通过两步偶联法鉴定酶活。

在第三个方面，本发明提供一种含有所述OsPMI1基因的植物表达载体。构建方法是利用XhoI酶切位点，用XhoI酶切pCAMBIA1381载体并回收大片段，由于克隆的OsPMI1序列两端加有XhoI酶切位点，可以利用T₄连接酶将OsPMI1连接到pCAMBIA1381载体，得到植物表达载体pCAMBIA1381-OsPMI1。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的OsPMI1基因。

在另一个方面，本发明提供一种利用pCAMBIA1381-OsPMI1表达载体，获得可以甘露糖为碳源的水稻转化细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带OsPMI1筛选标记基因的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移至含有甘露糖的筛选培养基上，以获得可利用甘露糖为碳源的水稻抗性愈伤组织(水稻细胞)。

其中所述步骤(1)中的种子是水稻成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基。

另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述OsPMI1基因作为筛选标记，基于上述方法获得植物(尤其是水稻)抗性愈伤组织，然后利用植物抗性愈伤组织获得转基因植物或植物部分。

优选地，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。

优选地，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。

在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻品种日本晴。

下面的表1中给出了在一种优选实现方式中，本发明所采用的培养基的示例性配方。本领域技术人员应该理解，各培养基除了采用本发明的特殊配方之外，还可以采用普通的培养基，其也能够实现本发明的目的，只是效果上存在一定差异。

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO₃ ^-]/[NH₄ ⁺]＝40mM/10mM。

在一种优选实现方式中，所选用的前筛选培养基中[NO₃ ^-]/[NH₄ ⁺]＝40mM/12.5mM，脯氨酸的含量为485mg/L、谷氨酰胺的含量为505mg/L、酪蛋白酶水解物275mg/L、蔗糖29.3g/L。这种配比的前筛选培养基对于水稻而言，效率尤其高。

本发明成功分离和克隆出高等植物来源的PMI基因，本发明还成功构建了含有OsPMI1的原核表达载体；构建含有OsPMI1的植物表达载体，并以OsPMI1作为筛选标记，应用于植物遗传转化。由于该PMI来源于植物(水稻)，对人类没有潜在危险，这非常有利于转基因植物的推广应用，有效降低现有转基因技术在筛选标记基因方面的潜在安全性风险，解决抗生素标记基因可能带来的潜在威胁，消除人们关于转基因食品安全方面的疑虑。

附图说明

图1为pCAMBIA1381-OsPMI1载体质粒示意图。

图2为经过含pCAMBIA1381-OsPMI1质粒的农杆菌转化后，在甘露糖筛选压下，产生的水稻抗性愈伤组织。

具体实施方式

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook andDavid Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Vols 1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira,PlantTransformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——OsPMI1基因的获得和克隆

该序列是以大肠杆菌的PMI蛋白序列为基准，在水稻基因组中获得的。提取水稻(Oryza sativa)的RNA，并反转录为cDNA；按照OsPMI1的CDS(编码序列，coding sequence)序列，设计基因特异性克隆引物，正向引物5’-ATGGCCGGCCCTACTCCTCCTC-3’，反向引物5’-TTAATTGAAGAATCTGCTATTG-3’；再以cDNA为模板，进行PCR扩增。该引物对PMI的克隆效果更好。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1287bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书操作)，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后；然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆。将经过鉴定的阳性克隆，交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为含有OsPMI1的重组质粒，命名为PGEM-T-OsPMI1。其中OsPMI1核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。细菌的PMI蛋白氨基酸序列如下：

MQKLINSVQNYAWGSKTALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPKSSSRVQNAAGDIVSLRDVIESDKSTLLGEAVAKRFGELPFLFKVLCAAQPLSIQVHPNKHNSEIGFAKENAAGIPMDAAERNYKDPNHKPELVFALTPFLAMNAFREFSEIVSLLQPVAGAHPAIAHFLQQPDAERLSELFASLLNMQGEEKSRALAILKSALDSQQGEPWQTIRLISEFYPEDSGLFSPLLLNVVKLNPGEAMFLFAETPHAYLQGVALEVMANSDNVLRAGLTPKYIDIPELVANVKFEAKPANQLLTQPVKQGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDKETTISQQSAAILFCVEGDATLWKGSQQLQLKPGFSAFIAANESPVTVKGHGRLARVYNKL

实施例2——OsPMI1基因的原核表达载体的构建

通过设计OsPMI1原核表达引物，正向引物5’-GGATCCATGGCCGGCCCTACTCCTCCTC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，反向引物5’-CTCGAGTTAATTGAAGAATCTGCTATTG-3’(下划线为XhoI酶切位点)，以PGEM-T-OsPMI1重组质粒为模板，进行PCR扩增，回收PCR扩增的目的片段与用BamHI和XhoI酶切的pGEX-6P-1表达载体(购自GE公司)连接，得到融合GST(谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione-S-transferase)片段的原核表达载体pGEX-OsPMI1，并转入大肠杆菌表达菌株BL21。

实施例3——OsPMI1酶活分析

将含有原核表达载体pGEX-OsPMI1的BL21菌株画线，挑单克隆接种于3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基(成分见表1农杆菌培养培养基，不加琼脂)，37℃振荡培养过夜(200r/min)。次日室温下，5000r/min离心5min，弃上清，沉淀用3mL新鲜LB液体培养基重悬，按1：100比例接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养3h(200r/min)，至OD600(Optical density 600nm，600nm吸光值)达0.6-1.0时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，isopropyl thiogalactoside)至终浓度为1mM，继续37℃振荡培养6h(200r/min)。

250mL培养物用80mL Bind/Wash Buffer(成分为43mM Na₂HPO₄，14.7mM KH₂PO₄，1.37M NaCl，27mM KCl，pH7.3)重悬，超声波处理(超声破碎30s，间隔10s，重复60次)至液体透明，27000r/min离心20min，上清过柱纯化(GST·Bind^TM柱子，购自Novagen公司，按说明书操作)，收集洗脱液，用Prescission蛋白酶(购自Amersham公司，按说明书操作)4℃处理16h以去除GST标签后，再次过柱，收集流出液(含有目标蛋白OsPMI1)。

使用纯化的蛋白，利用两步偶联法，进行酶活检测。反应体系为3mL：50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液，其中含5mM MgCl₂，0.5mM的NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，Nicotinamide Adenine DinucleotidePhosphate)，1U/mL的6-磷酸葡萄糖异构酶，1U/mL的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，1mM 6-磷酸甘露糖(底物)，0.1mL纯化蛋白，加入底物6-磷酸甘露糖起始反应。

将上述除去底物的体系混合后在25℃孵育2min后，加入6-磷酸甘露糖(底物)起始反应。以不加纯化蛋白，加0.1mL缓冲液的为空白对照，在340nm处分别测定0min和5min的吸光值，获得纯化蛋白和空白对照的A₃₄₀/min(340nm吸光值每分钟变化值)，按照如下公式计算酶活：(纯化蛋白的A₃₄₀/min－空白对照的A₃₄₀/min)×3/0.622，酶活单位为U/mL酶蛋白。酶活分析结果反映着纯化蛋白代谢底物6-磷酸甘露糖的能力。结果表明纯化蛋白能代谢6-磷酸甘露糖，而空白对照不能代谢6-磷酸甘露糖。

实施例4——OsPMI1植物表达载体的构建

以PGEM-T-OsPMI1重组质粒为模板，通过正向引物5’-CTCGAGATGGCCGGCCCTACTCCTCCTC-3’(下划线为XhoI酶切位点)，反向引物5’-CTCGAGTTAATTGAAGAATCTGCTATTG-3’(下划线为XhoI酶切位点)，进行PCR扩增，回收PCR扩增的目的片段，与用XhoI线性化处理的pCAMBIA1381载体连接，得到植物表达载体pCAMBIA1381-OsPMI1，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

实施例5——以OsPMI1为筛选标记基因的水稻遗传转化方法

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴(安徽省农业科学院水稻研究所保存)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5d。预培养结束后，将状态良好、***旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pCAMBIA1381-OsPMI1载体的农杆菌菌株EHA105(安徽省农业科学院水稻研究所保存)在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density 660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5d。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。所获得的抗性愈伤组织参见图2。图中可看出，新生长出的抗性愈伤颜色为淡黄色，质地紧凑，颗粒感较强，说明是状态较好的胚性愈伤组织，适于进行后续的分化再生操作。需要说明的是附图中所表示的实验结果视图，本应为彩图，但考虑到专利法的规定，申请人将其转换为灰度图像，但是即便转为灰度图像，从图中的深浅度依然能够分辨出不同实验结果的区别。

利用所获得的抗性愈伤组织，可以进行水稻植株或植物部分的培养。本申请的发明人利用该抗性愈伤组织成功地培育出了相应的水稻植株。

因此，从上面的实验可以证明，本发明所获得的DNA序列可以作为筛选标记用于植物细胞及相应植株的遗传转化和培育。

应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1，其特征在于，该磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1分离、克隆自水稻。

2.根据权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1，其特征在于，所述磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1的核苷酸序列包含下述序列或者由下述序列构成：

3.一种原核表达载体，其特征在于，所述原核表达载体包含权利要求1或2所述的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1。

4.一种用于鉴定所述磷酸甘露糖异构酶的酶活分析方法，其特征在于，所述鉴定方法包括：利用两步偶联法对包含权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶基因的编码蛋白或权利要求3所述的原核表达载体的表达蛋白进行酶活分析。

5.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1或2所述的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1。

6.一种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体包含权利要求1或2所述的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1和/或权利要求5所述的表达盒。

7.一种利用含有权利要求1中所述的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1的植物表达载体获得植物转化细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将植物种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得能够用于转化的愈伤组织；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触5-30分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述植物表达载体，所述植物表达载体中携带所述的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1；

(4)将步骤(3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，在预定温度下培养24-72小时；

(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养3-10天；

(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基中包含甘露糖，所述抗性愈伤组织为能够代谢甘露糖的植物转化细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻，所述植物转化细胞为水稻转化细胞。

9.一种权利要求1或2所述磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1、权利要求5所述的表达盒、权利要求6所述的植物表达载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1作为筛选标记，基于权利要求7所述的方法获得植物转化细胞，并利用所述植物转化细胞获得转基因植物或植物部分。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物；所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。