CN104805040A - 一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104805040A
CN104805040A CN201510154074.5A CN201510154074A CN104805040A CN 104805040 A CN104805040 A CN 104805040A CN 201510154074 A CN201510154074 A CN 201510154074A CN 104805040 A CN104805040 A CN 104805040A
Authority
CN
China
Prior art keywords
subtilis
preparation
bacillus subtilis
grass carp
intestinal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510154074.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104805040B (zh
Inventor
张永安
陈丹丹
郭霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Hydrobiology of CAS
Original Assignee
Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Hydrobiology of CAS filed Critical Institute of Hydrobiology of CAS
Priority to CN201510154074.5A priority Critical patent/CN104805040B/zh
Publication of CN104805040A publication Critical patent/CN104805040A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104805040B publication Critical patent/CN104805040B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用,其步骤：（1）从集贸市场购买草鱼，用MS-222麻醉；（2）取草鱼肠道洗涤，匀浆，离心，取上清，热处理；（3）梯度稀释涂布在TSA平板上，培育；（4）根据枯草芽孢杆菌的形态，挑取单克隆划线分离纯化，通过序列分析及生化实验鉴定；（5）确定其为枯草芽孢杆菌，分离得到2株菌，分别命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GC21和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GC22。获得的枯草芽孢杆菌能够耐酸、耐胆盐，抵抗胃肠道的极端内环境，分泌多种助消化酶，抑制水生动物致病菌，调节草鱼肠道免疫，可作为一种益生菌饲料添加剂用于鱼类致病菌和草鱼肠道炎症的预防和治疗。该菌剂高效、无毒、环境友好且制备工艺简单，易于大规模生产。

Description

一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物学领域，更具体地涉及一种具有益生菌作用的枯草芽孢杆菌制剂，同时还涉及一种具有益生菌作用的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，还涉及一种枯草芽孢杆菌制剂的用途。
背景技术
近年来，机体肠道微生物对生长、消化、免疫和抗病力方面的研究越来越受到人们的关注(Patel,S.,Shukla,R.&Goyal,A.(2015).Probiotics in valorization of innateimmunity across various animal models.Journal of Functional Foods 14,549-61)。将有益细菌(益生菌)添加到食品或饲料中而调节宿主肠道菌群生态平衡(人类到低等生物，如鱼类、贝类)(Cross ML(2002)Microbes versus microbes:immune signals generatedby probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial pathogens.FEMS immunology and medical microbiology 34(4):245-53)，这样不仅可以改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，而且能够抑制抗生素和药物等带来的不利作用。因此益生菌作为促进健康的功能性生物，在促进机体生长及治疗和预防机体疾病方面都显示出广阔的应用前景。
枯草芽孢杆菌是一种具有较强的耐酸、耐盐、耐高温和耐挤压等特性的革兰氏阳性菌。它可以在动物肠道内定植(Barbosa TM,Serra CR,La Ragione RM,Woodward MJ,HenriquesAO(2005)Screening for bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract.Applied and environmental microbiology 71(2):968-78)，形成生物膜，通过产生大量的次级代谢产物，如维生素、氨基酸、促生长因子等，从而促进机体生长；同时，枯草芽孢杆菌在动物肠道内定植后，能产生多种消化酶。草鱼这种典型的草食性鱼类，其本身无法形成纤维素酶以降解纤维素，饲料中添加枯草芽抱杆菌，能够显著提高草鱼肠道中纤维素酶、淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及酯酶等，有利于机体对营养物质的消化吸收(Zhou Y,YuanXC,Liang XF,Fang L,Li J,Guo XZ,Bai XL,He S(2013)Enhancement of growth andintestinal flora in grass carp:The effect of exogenous cellulase.Aquaculture 416:1-7)。有研究结果表明：枯草芽孢杆菌可以通过调节种微生物菌群的平衡来实现水生动物肠道微生物区系的优化，枯草芽孢杆菌能通过分泌一些抑菌物质，如枯草菌素(subtilin)、表面活性素(surfactin)等，或者通过与病原菌竞争宿主细胞的粘附位点，来有效降低水生动物肠道中有害菌的数量，如大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、弧菌(Vibrio)(Cutting SM(2011)Bacillus probiotics.Food microbiology 28(2):214-20)等；同时枯草芽孢杆菌进入肠道后可以迅速消耗肠道内的游离氧，产生乳酸等有机酸，降低肠道pH值，间接抑制病原菌的生长，促进乳酸杆菌等有益厌氧菌的生长，如双歧杆菌、乳酸杆菌等(于明超,李卓佳,林黑着,等.饲料中添加芽孢杆菌和中草药制剂对凡纳滨对虾生长及肠道菌群的影响[J].热带海洋学报,2010,29(4):132-137)。此外，枯草芽孢杆菌对机体局部免疫和***免疫都具有一定的调节作用，可以影响免疫应答的调制元件，如巨噬细胞、NK细胞活性和免疫球蛋白的产生，淋巴细胞的增殖，细胞因子和抗体的产生等(Kanzato H,Fujiwara S,Ise W,Kaminogawa S,Sato R,Hachimura S(2008)Lactobacillus acidophilus strain L-92induces apoptosis of antigen-stimulated T cells by modulating dendritic cellfunction.Immunobiology 213(5):399-408)。有文献报道，枯草芽孢杆菌分泌的表面活性素能够通过抑制NF-κB信号通路中的IκBα和p65的磷酸化从而降低促炎因子TNFα、IL-1β的水平，此外，表面活性素还可通过诱导血红素氧合酶-1(HO-1)的表达，而血红素氧合酶-1可显著诱导抗炎因子的上调而下调促炎因子，从而使得枯草芽孢杆菌具有抗炎作用(Park SY,Kim YH,Kim EK,Ryu EY,Lee SJ(2010)Heme oxygenase-1signals areinvolved in preferential inhibition of pro-inflammatory cytokine release bysurfactin in cells activated with Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide.Chemico-biological interactions 188(3):437-45)。Foligné等研究表明，人外周血单核细胞受到枯草芽孢杆菌PB6刺激后，抗炎因子IL-10显著上调，而促炎因子TNFα、IFNγ以及IL-12并没有发生显著变化；另外，喂服枯草芽孢杆菌PB6芽孢能够显著降低患大肠炎小鼠血液中炎症标志物IL-6及血清淀粉样蛋白A(SAA)的含量(Foligne B,Peys E,Vandenkerckhove J,Van Hemel J,Dewulf J,Breton J,Pot B(2012)Spores from twodistinct colony types of the strain Bacillus subtilis PB6substantiateanti-inflammatory probiotic effects in mice.Clinical nutrition 31(6):987-94)，即PB6具有抗肠炎作用。2010年6月，欧盟已批准使用枯草芽孢杆菌PB6防制家禽细菌性肠炎。
本发明的菌剂所用的枯草芽孢杆菌GC21和GC22均分离自草鱼肠道，作为草鱼饲料益生菌添加剂使用时，避免了其它来源的细菌所造成的免疫原性及安全性问题。本发明的菌剂能够耐酸、酸胆盐，能抵抗草鱼胃肠道内的极端环境，具备益生菌的潜力，能够增强草鱼营养代谢功能、调节草鱼肠道菌落平衡、提高草鱼机体免疫能力而发挥抗炎作用，可用于防治草鱼肠炎，可以用来代替抗生素，在水产领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种具有益生作用的枯草芽孢杆菌制剂，包含从草鱼体内分离的野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GC21和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GC22，该制剂包含2种不同类型的枯草芽孢杆菌，这2种菌株均为能够抑制病原菌且具有益生效果的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌GC21，已于2015年1月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2015068：枯草芽孢杆菌GC22，已于2015年1月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2015069。
本发明的另一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，野生型枯草芽孢杆菌GC21和枯草芽孢杆菌GC22均分离自武汉大学工学部集贸市场购得草鱼体内，经过高温处理获得芽孢，经进一步基因序列鉴定及多次划线分离纯化获得。这2株菌通过在DSM(0.8％肉汤营养液(Difco)，0.1％KCl，0.025％MgSO4·7H2O，1.0mM Ca(NO3)2，10μM MnCl2，1.0μM FeSO4)分别培养72h，离心获得芽孢，将这两种芽孢按照重量1:1的比例混合。
本发明还有一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌GC21或GC22或包含这两种枯草芽孢杆菌的制剂在制备治疗或预防水生动物致病菌药物中的应用，其具有广谱抑菌效果，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，主要针对水生动物致病菌，包括但不限于对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila XS91-4-1)、爱德华氏菌(Edwardsiella HSN-1)、肠型点状气单胞菌(Aeromonas punctata f.intestinali 5820-9)、河弧菌(Vibrio flurialis WY91-24-3)、无乳链球菌(Streptococcus agalactia XQ-1)的抑制作用。
本发明再一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌的制剂作为益生菌在鱼饲料添加剂中的应用，该制剂由枯草芽孢杆菌GC21和枯草芽孢杆菌GC22芽孢构成。该芽孢能够粘附肠道上皮细胞，即具有肠道定植能力，能够在肠道中繁殖；能够抑制水生动物肠道有害细菌，有助于调节动物肠道菌群平衡；具有较高的产纤维素酶、淀粉酶能力，有助于提高机体的消化能力，增强动物营养代谢功能，可作为饲料添加剂，提高动物免疫力，促进生长。此外，该芽孢能够激活草鱼肠道内抗炎因子的表达，抑制肠道炎症，可用于防治草鱼肠道炎症。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，其步骤是：
(1)从集贸市场购买健康草鱼，用MS-222麻醉；
(2)取草鱼肠道洗涤，匀浆，离心，取上清于EP管，80℃处理20min；
(3)梯度稀释涂布在TSA平板上，37℃培育18～24h；
(4)根据文献所报道的枯草芽孢杆菌的形态，挑取单克隆，并用TSB培养，划线分离纯化5次，并通过序列分析(gyrB、rpoB、phoR测序、进化树分析)及生化实验(革兰氏染色、过氧化氢酶、需氧性、明胶液化、淀粉水解、甲基红、枸橼酸盐利用实验)鉴定；
(5)确定其为枯草芽孢杆菌，分离得到2株菌，分别命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisGC21和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GC22。所述的枯草芽孢杆菌GC21，已于2015年1月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2015068；枯草芽孢杆菌GC22，已于2015年1月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2015069。
这2株菌株的微生物学特征为：革兰氏阳性菌，无荚膜，最适生长温度为37℃，菌落表面粗糙不透明，边缘不整齐，呈齿状，微黄色，在液体培养基中生长时形成皱醭。培养基为LB培养基，配方：1L溶液中，10g Tryptone(胰蛋白胨)，5g Yeast Extract(酵母提取物)，10g NaCl(氯化钠),再加入16g Agar(琼脂)，pH7.2。
一种枯草芽孢杆菌GC21或GC22或包含这两种枯草芽孢杆菌的制剂在制备治疗或预防水生动物致病菌药物中的应用，其具有广谱抑菌效果，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，主要针对水生动物致病菌，包括但不限于对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila XS91-4-1)、爱德华氏菌(Edwardsiella HSN-1)、肠型点状气单胞菌(Aeromonas punctata f.intestinali5820-9)、河弧菌(Vibrio flurialis WY91-24-3)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiaXQ-1)的抑制作用。所述的水生动物主要包括各种鱼类，包括但不仅限于草鱼、青鱼、鲢、鳙、鲤或鲫等。其步骤是：
(1)将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila XS91-4-1)、爱德华氏菌(EdwardsiellaHSN-1)、肠型点状气单胞菌(Aeromonas punctata f.intestinali 5820-9)、河弧菌(Vibrioflurialis WY91-24-3)、无乳链球菌(Streptococcus agalactia XQ-1)分别于BHI培养基中37℃，200rpm培养24h；
(2)调整其浓度为108cfu/ml，并将其按1％(V/V)比例加入融化了的BHI固体培养基中，混匀，倾倒平板，并于室温(20-25℃，以下相同)晾干；
(3)调整在TSB液体培养基中过夜培养枯草芽孢杆菌GC21和GC22菌株的浓度为108cfu/ml，各取2μl点种于含病原菌的平板中，将平板置于37℃培养箱，24h后测量抑菌圈的大小，实验重复三次。
一种枯草芽孢杆菌的制剂作为益生菌在鱼饲料添加剂中的应用，本发明通过体外法鉴定了枯草芽孢杆菌GC21和GC22的作为益生菌的微生物学特点，结果表明，枯草芽孢杆菌GC21和GC22能够耐酸、酸胆盐、耐高温；能够分泌纤维素酶以及淀粉酶；能够形成生物膜在肠道中定植，具备益生菌的潜力。具体包括以下步骤：
(1)配制不同pH值的培养基，检测枯草芽孢杆菌GC21和GC22的生长情况；
(2)配制不同胆盐浓度的培养基，检测枯草芽孢杆菌GC21和GC22的生长情况；
(3)不同温度处理(80℃、90℃、100℃)，检测枯草芽孢杆菌GC21和GC22的生长情况；
(4)检测枯草芽孢杆菌GC21和GC22产纤维素酶、淀粉酶能力；
(5)检测枯草芽孢杆菌GC21和GC22生物膜形成能力；
(6)体外检测枯草芽孢杆菌GC21和GC22芽孢对肠细胞的粘附能力。
一种枯草芽孢杆菌GC21或GC22或者包含这两种枯草芽孢杆菌的制剂在制备治疗或预防草鱼炎症药物中的应用，主要是通过体内实验验证了对草鱼肠道免疫的调控作用，该芽孢能够激活草鱼肠道内抗炎因子的表达，抑制肠道炎症，可用于防制草鱼肠道炎症。其步骤是：
(1)含枯草芽孢杆菌的草鱼饲料的制备，将枯草芽孢杆菌GC21和GC22分别接种于DSM培养基中，37℃培养48-72h使其形成芽孢，用PBS调整芽孢浓度为108cfu/g饲料，喷洒在草鱼饲料上，60℃烘干备用；
(2)试验采用单因子随机区组试验设计，将48条草鱼随机分成3个组，每组16条鱼，试验分为3个处理组：A)对照组(CT)，饲喂基础日粮(不添加益生菌)；B)枯草芽孢杆菌组(BS-GC21)，投喂含枯草芽孢杆菌GC21饲料；C)枯草芽孢杆菌组(BS-GC22)，投喂含枯草芽孢杆菌GC22饲料，持续投喂42天。分别在第7天、14天、28天、42天取肠道组织，液氮研磨，利用Trizol(Invitrogen)法提取总RNA，用反转录试剂盒(Promega)获得cDNA，每组每个时间点取4个重复样。用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测肠道中抗炎因子(IL-10及TGF-β)及促炎因子(IL-1β及TNF-α)mRNA水平变化。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明所采用的野生型枯草芽孢杆菌GC21和GC22来自草鱼肠道，作为草鱼饲料益生菌添加剂使用时，避免了其它来源的菌体的免疫原性及安全性问题，无毒副作用，不会造成环境污染，符合绿色渔药标准；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GC21和GC22芽孢，能够耐酸，耐胆碱，使得芽孢能够抵御动物体内极端的胃肠道环境，能够抑制水生动物肠道内病原菌，具有良好的益生效果；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GC21和GC22芽孢能够激活草鱼肠道内抗炎因子的表达，抑制肠道炎症；即它可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中，用于提高机体消化及免疫能力，同时可以用于防制草鱼肠炎。
附图说明
图1为一种枯草芽孢杆菌GC21/GC22芽孢对高温的抵抗能力示意图。
图2为一种枯草芽孢杆菌GC21/GC22生物膜的形成能力示意图。
图3为一种枯草芽孢杆菌GC21/GC22对肠细胞的粘附性及电镜检测结果示意图。
A：扫描电镜观察到菌体与细胞的相互作用；B：扫描电镜观察到芽孢与细胞的相互作用；C：枯草芽孢杆菌GC21/GC22菌体对Caco-2细胞粘附率；D：枯草芽孢杆菌GC21/GC22芽孢对Caco-2细胞粘附率。
图4为一种荧光定量PCR检测枯草芽孢杆菌GC21和GC2诱导草鱼肠道炎症因子表达示意图。
A：白介素-1β(IL-1β)；B：转化生长因子-β(TGF-β)；C：白介素-10(IL-10)；D：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。“*”代表P<0.05；“**”代表P<0.01。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法若未特别说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。
以下实施例中涉及的试验材料和试剂：
1.用于本发明的回收DNA片段均采用凝胶回收试剂盒分离纯化(TIANGEN天根生化科技(北京)有限公司)，细菌基因组提取试剂盒(康为世纪生物技术有限公司)，所有引物及PCR产物克隆片段测序服务均经武汉擎科技术服务公司提供，所有化学试剂均来自国药试剂。
2.嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila XS91-4-1)、爱德华氏菌(Edwardsiella HSN-1))、肠型点状气单胞菌(Aeromonas punctata f.intestinali 5820-9)、河弧菌(Vibrioflurialis WY91-24-3)、无乳链球菌(Streptococcus agalactia XQ-1)(均购自：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。
实施例1：
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，其步骤是：
(1)分离野生型枯草芽孢杆菌：从集贸市场上购买数条鲜活草鱼，取出肠道纵向剪开，用PBS涮洗两次，无菌水涮洗一次，刮取肠道黏膜壁并将刮取物置于新的PBS中，适当稀释，80℃处理20min，涂布TSA平板，37℃培养过夜。挑取平板上与芽孢杆菌相似的菌落于TSB中培养，按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌染色体，用细菌的16S RNA通用引物扩增并测序，测序结果在NCBI中用BLAST比对，分析比对结果，多次划线纯化得到2株形态不同的菌株。16S RNA基因(GenBank序列号：KM873141.1)引物序列如下：
27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。
PCR反应体系按照TaKaRa PrimeSTAR GXL DNA Polymerase使用说明书进行。PCR扩增条件为：94℃，5min；94℃，30sec；55℃，20sec；72℃，30sec，30个循环；72℃延伸5min。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR纯化试剂盒纯化。
(2)野生型枯草芽孢杆菌鉴定：以细菌染色体作为模板，用rpoB(GenBank序列号：CP004405)、gyrB(GenBank序列号：HQ844089)、phoR(GenBank序列号：JN580981)序列引物扩增，引物序列如下：
rpoB-F：5’-AGCGTCGTCTGTCAGCATTAGG-3’
rpoB-R：5’-CATAGAAGGACCGTCAGCAAGG-3’
gyrB-F：5’-ATCATACAGGAACGACGACAC-3’
gyrB-R：5’-CATTCTTGCTCTTGCCGCCA-3’
PhoR-F：5’–TTCTGTATTCGTTGTCTGTATG-3’
PhoR-R：5’–GCGTTCGCGTCATTTCCATC-3’
PCR扩增条件为：94℃，5min；94℃，30sec；55℃，20sec；72℃，30sec，35个循环；72℃延伸5min。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR纯化试剂盒纯化，测序，用MEGA软件做进化树分析，初步确定这2株菌为枯草芽孢杆菌。
(3)生理生化实验(革兰氏染色、过氧化氢酶、需氧性、明胶液化、淀粉水解、甲基红、枸橼酸盐利用实验)鉴定进一步确定从草鱼肠道分离到的细菌为枯草芽孢杆菌，将其分别命名为Bacillus subtilis GC21和GC22。
表1Bacillus subtilis GC21和GC22生理生化实验结果
      
注：168为Bacillus subtilis 168(Bacillus GeneticStock Center，Department ofBiochemistry，The Ohio State University，West 12th Avenue，Columbus，Ohio，43210，USA)；“+”：表示阳性结果：“-”：表示阴性结果。
(4)枯草芽孢杆菌制剂的制备：将上述得到的野生型枯草芽孢杆菌GC21和枯草芽孢杆菌GC22在DSM(0.8％(w/v)肉汤营养液(Difco)，0.1％(w/v)KCl，0.025％(w/v)MgSO4·7H2O，1.0mM Ca(NO3)2，10μM MnCl2，1.0μM FeSO4)培养基中分别培养72h，离心获得芽孢，将这两种芽孢按照重量1:1的比例混合。
实施例2：
一种枯草芽孢杆菌GC21和GC22或者包含这两种枯草芽孢杆菌的制剂在制备治疗或预防水生动物致病菌药物中的应用，采用平板扩散法检测Bacillus subtilis GC21和GC22的抑菌效果，其步骤为：
(1)将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila XS91-4-1)、爱德华氏菌(Edwardsiella HSN-1)、肠型点状气单胞菌(Aeromonas punctata f.intestinali 5820-9)、河弧菌(Vibrioflurialis WY91-24-3)、无乳链球菌(Streptococcus agalactia XQ-1)分别于BHI培养基中37℃，200rpm培养24h；
(2)调整其浓度为108cfu/ml，并将其按1％(V/V)比例加入融化了的BHI固体培养基中，混匀，倾倒平板，并于室温(20-25℃，以下相同)晾干；
(3)调整在TSB液体培养基中过夜培养枯草芽孢杆菌GC21和GC22菌株的浓度为108cfu/ml，各取2μl点种于含病原菌的平板中，将平板置于37℃培养箱，24h后测量抑菌圈的大小，实验重复三次。结果如表2所示。
表2Bacillus subtilis GC21和GC22对不同水生致病菌抑制结果
      
注：△d：抑菌圈的大小，单位为毫米。
上表表明Bacillus subtilis GC21和GC22对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilaXS91-4-1)、爱德华氏菌(Edwardsiella HSN-1)、肠型点状气单胞菌(Aeromonas punctataf.intestinali 5820-9)、河弧菌(Vibrio flurialis WY91-24-3)、无乳链球菌(Streptococcus agalactia XQ-1)这5种水生致病菌均有抑制作用。
实施例3：
一种枯草芽孢杆菌GC21和GC22作为潜在益生菌的生物学特点鉴定，结果表明枯草芽孢杆菌GC21和GC22能够耐酸、酸胆盐、耐高温；能够分泌纤维素酶以及淀粉酶；能够形成生物膜在肠道中定植，具备益生菌的潜力，能够作为饲料添加剂。
一种枯草芽孢杆菌(GC21和GC22)在益生菌中的应用，其步骤是：
(1)枯草芽孢杆菌GC21和GC22耐酸、耐胆盐、耐高温特性测定。将TSB中在过夜培养的枯草芽孢杆菌菌株GC21和GC22以1％接种量转接到DSM培养基(0.8％肉汤营养液(Difco)，0.1％KCl，0.025％MgSO4·7H2O，1.0mM Ca(NO3)2，10μM MnCl2，1.0μM FeSO4)，37℃200rpm72-96h，镜检，确保所有的均为芽孢，若还有营养体，以100μg/ml的溶菌酶处理10min，用PBS调整芽孢浓度为108cfu/ml，进行以下实验。
芽孢对高温的抵抗能力，将芽孢分别在80℃、90℃和100℃条件下处理2、5、10min，涂平板，37℃培养24h，通过平板计数法计算活菌数，每个实验处理设三个重复。结果表明，GC21和GC22芽孢在100℃处理5min仍有很高的存活率，见图1。
芽孢对低pH的抵抗能力，将芽孢用pH分别为1、2、3的PBS洗3次，然后分装于2ml EP管，于37℃孵育2h，涂平板，37℃培养24h，通过平板计数法计算活菌数，每个设三个重复。实验结果见表3，枯草芽孢杆菌GC21在pH＝1.0的PBS中处理2h仍有约107cfu/ml菌存活，枯草芽孢杆菌GC22在pH＝1.0的PBS中处理2h仍有约107.47cfu/ml菌存活。
表3Bacillus subtilis GC21和GC22在不同pH中的耐受性
      
芽孢对草鱼胆汁酸盐的抵抗能力，新鲜健康草鱼3条，用适量MS-222麻醉，分别抽取胆汁，混匀。将芽孢分装于2ml EP管，加入草鱼胆汁，使其终含量分别为2％、4％、6％、8％、10％，37℃孵育2h，涂平板，37℃培养24h，通过平板计数法计算活菌数，每个设三个重复。实验结果见表4，枯草芽孢杆菌GC21和GC22均能耐受10％草鱼胆汁酸盐。
表4Bacillus subtilis GC21和GC22在不同浓度胆汁酸盐中的耐受性
      
(2)纤维素酶活性鉴定实验。过夜培养枯草芽孢杆菌菌株GC21和GC22，调整其浓度为108cfu/ml，点种2μl于羧甲基纤维素固体培养基(CMC)平板上，37℃培养24h。用刚果红(1mg/ml)室温下染色1h，用1M的NaCl脱色1h，之后用1M HCl使背景呈蓝色，可以观察到明显的透明圈。
表5Bacillus subtilis GC21和GC22产纤维素酶能力
      
(3)淀粉酶活性鉴定实验。0.5％淀粉平板的制备：固体LB培养基中加可溶性淀粉至终浓度为0.5％，高压灭菌后制备平板；碘液的配制：先将2g碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加1g碘，振荡溶解后稀释至300mL，保存于棕色玻璃瓶内，使用时稀释5倍。取1μL枯草芽孢杆菌菌株GC21和GC22滴于淀粉平板上，37℃培养16h，取适量碘液滴于平板上，菌落周围产生透明水解圈。
(4)生物膜的形成能力。挑取枯草芽孢杆菌菌株GC21和GC22于TSB中培养18h，调整其浓度为108cfu/ml，以1:100稀释于新鲜TSB中，在96孔板中加入200μl上述稀释液，设三个重复，37℃静置培养24h。培养过后小心吸出表层下的培养液(不要破坏表层生物膜)，用PBS(pH 7.4)涮洗3次，加入0.1％(w/v)结晶紫染色染液染30min，水洗，再用90％酒精洗，晾干(时间不能长)，于酶标仪的595nm波长处读数。结果如图2及表6所示。
表6Bacillus subtilis GC21和GC22生物膜形成能力
      
注：菌株生物膜产生能力的强弱与其在595nm波长处吸收值(Abs595nm)有关，Abs595nm＞2.0视为强“+++”，Abs595nm＝1.0-2.0为中“++”，Abs595nm＜1.0为弱“+”。
(5)对肠细胞的粘附性及电镜检测。人类直肠癌细胞系Caco-2经常作为体外实验的研究模型，培养在37℃、5％CO2添加了100mg/ml的链霉素、100mg/ml的青霉素、2mM谷氨酰胺、10％(v/v)FBS的IMDM中，细胞每2～3天传一代，传10代左右时用于粘附实验。
枯草芽孢杆菌与Caco-2细胞系的粘附实验参照(Monteagudo-Mera A,Rodriguez-Aparicio L,Rua J,Martinez-Blanco H,Navasa N,Garcia-Armesto MR,FerreroMA(2012)In vitro evaluation of physiological probiotic properties of differentlactic acid bacteria strains of dairy and human origin.J Funct Foods 4(2):531-541)，并稍加改动。将Caco-2传代于24孔板中(每孔500ml)培养2天，吸掉培养基，过夜培养枯草芽孢杆菌菌株GC21和GC22菌体/芽孢，并用IMDM培养基调整其浓度为107cfu/ml，各取500ml加入24孔板，每株菌3个重复，无Caco-2细胞的为对照孔。将24孔板置于37℃培养箱孵育2h，孵育之后，吸走未结合的细菌，并用PBS洗4次，再用100μl胰酶(2.5％，v/v)消化贴壁的细胞，并用900μl的PBS涮洗4次，吸取对照孔菌液并用500μlPBS洗4次，对照组和实验组每次的洗液加入同一EP管，总体积为1ml，梯度稀释涂布于TSA(Oxioid，Basingstoke，UK)平板，置于37℃培养过夜，并计数。粘附能力计算公式为：粘附能力(％)＝V1×100/V0，V1：粘附在细胞上的细菌数；V0：对照组细菌数。用于做扫描电镜的细胞培养在含有玻片的24孔板中。在经过以上的孵育试验后，将贴在玻片上的细胞用2.5％(v/v)的PBS(pH 7.4)配制的戊二醛在室温下固定1h，之后用PBS洗3次，然后用30～100％的乙醇梯度脱水，每个梯度5min，再用100％叔丁醇洗3次，并用叔丁醇冷冻干燥，喷金，再用S-4800(日本)场地发射扫描电镜拍照。实验结果如图4所示，枯草芽孢杆菌菌株GC21和GC22菌体及芽孢对Caco-2细胞均有一定的粘附能力，粘附率为0.6％-6.13％(与文献报道的粘附率相似)，并且通过扫描电镜可以观察到菌体及芽孢与细胞的相互作用。结果如图3所示。
实施例4：
枯草芽孢杆菌GC21和GC22在草鱼饲料添加中应用，其步骤是：
(1)含枯草芽孢杆菌的草鱼饲料的制备：
将枯草芽孢杆菌GC21和GC22分别接种于DSM培养基中，37℃培养48-72h使其形成芽孢，用PBS调整芽孢浓度为108cfu/g饲料，喷洒在草鱼饲料上，60℃烘干备用。
(2)枯草芽孢杆菌GC21和GC22在草鱼饲料添加中应用的实验设计
试验采用单因子随机区组试验设计，将48条草鱼随机分成3个组，每组16条鱼，试验分为3个处理组：1)对照组(CT)，饲喂基础日粮(不添加益生菌)；2)枯草芽孢杆菌组(BS-GC21)，投喂含枯草芽孢杆菌GC21饲料；3)枯草芽孢杆菌组(BS-GC22)，投喂含枯草芽孢杆菌GC22饲料，持续投喂42天。分别在第7天、14天、28天、42天取肠道组织，液氮研磨，利用TRizol(Invitrogen)法提取总RNA，用反转录试剂盒(Promega)获得cDNA，每组每个时间点取4个重复样。用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测肠道中抗炎因子(IL-10及TGF-β)及促炎因子(IL-1β及TNF-α)mRNA水平变化。
根据β-actin(GenBank序列号：M25013)、IL-10(GenBank序列号：HQ388294)、TGF-β(GenBank序列号：EU099588)、IL-1β(GenBank序列号：JX014320)及TNF-α(GenBank序列号：HQ696609)的序列设计并合成以下序列：
F-β-actin：5’-CCCAAAGCCAACAGGGAAAAGA-3’,
R-β-actin：5’-GGCAGGGCATAACCCTCGTA-3’,
F-IL-10：5’-GTCATGCTTCTGCTTTCTGAAA-3’,
R-IL-10：5’-TGGCATCCATAAGGACTATTGA-3’,
F-TGF-β：5’-CTGACGGAGTTTGTACCGAAAA-3’,
R-TGF-β：5’-TTATGATGCCTATACAGTGCAAGA-3’,
F-IL-1β：5’-TGTGACGCTGAGAGACGGAAA-3’,
R-IL-1β：5’-GAGTTTCAGTGACCTCCTTCAA-3’,
F-TNF-α：5’-CCATCCATTTAACAGGTGCATAC-3’,
R-TNF-α：5’-CAGCAGATGTGGAAAG-AGACC-3’,
F-IL-1β：5’-TGTGACGCTGAGAGACGGAAA-3’,
R-IL-1β：5’-GAGTTTCAGTGACCTCCTTCAA-3’。
Real-time PCR反应条件如下：94℃，5min；94℃，30sec；60℃，30sec；72℃，10sec，40个循环；72℃延伸5min。并测定溶解曲线检测引物效果。
以β-actin作为内参，采取2(-ΔΔCt)法计算，每个样品重复3次。
(3)枯草芽孢杆菌GC21和GC22在草鱼饲料添加中应用效果的测定
枯草芽孢杆菌GC21和GC22对草鱼肠道炎症因子的影响见图4。结果表明，日粮添加枯草芽孢杆菌GC21和GC22诱导草鱼肠道炎症因子表达的趋势基本相同。在抗炎因子方面，IL-10和TGF-β均下调后上调，只是在时间上略有不同，在试验第28天，日粮添加枯草芽孢杆菌GC21的草鱼肠道中TGF-β的含量极显著高于对照组(P<0.01)；第42天，日粮添加枯草芽孢杆菌GC21和GC22的草鱼肠道中IL-10的含量均显著高于对照组(P<0.05)。促炎因子方面，与对照组相比，IL-1β和TNF-α则是先下调再恢复或者上调。在试验第14天，日粮添加枯草芽孢杆菌GC21和GC22的草鱼肠道中IL-1β均显著低于对照组(P<0.05)，持续下降到第4周，到第6周逐渐恢复。TNF-α的含量也是先有下调趋势，而在第42天，TNF-α的含量则显著上调。实验结果表明鱼体可能通过诱导抗炎因子与促炎因子的相对量或者动态平衡来达到对体内肠炎的最佳保护模型。

Claims (5)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GC21，CCTCC NO：M2015068。
2.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GC22，CCTCC NO：M2015069。
3.权利要求1或2所述的一种枯草芽孢杆菌在制备治疗或预防水生动物致病菌药物中的应用；
所述的水生动物为草鱼、青鱼、鲢、鳙、鲤或鲫。
4.权利要求1或2所述的一种枯草芽孢杆菌的制剂作为益生菌在鱼饲料添加剂中的应用。
5.权利要求1或2所述的一种枯草芽孢杆菌的制剂在制备治疗或预防草鱼炎症药物中的应用。
CN201510154074.5A 2015-04-02 2015-04-02 一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用 Active CN104805040B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510154074.5A CN104805040B (zh) 2015-04-02 2015-04-02 一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510154074.5A CN104805040B (zh) 2015-04-02 2015-04-02 一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104805040A true CN104805040A (zh) 2015-07-29
CN104805040B CN104805040B (zh) 2017-11-10

Family

ID=53690243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510154074.5A Active CN104805040B (zh) 2015-04-02 2015-04-02 一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104805040B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106811429A (zh) * 2015-12-02 2017-06-09 北京大北农科技集团股份有限公司 一株枯草芽孢杆菌菌株及其饲料添加剂的应用与饲料
CN107182867A (zh) * 2017-06-07 2017-09-22 贵州江口绿源水产发展有限公司 一种防治鲤鱼肠炎病的方法
CN110029074A (zh) * 2019-03-15 2019-07-19 河南科技大学 一种枯草芽孢杆菌及其在鱼虾养殖疾病防治中的应用
CN110144310A (zh) * 2019-05-20 2019-08-20 天津科技大学 一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌和应用
CN112662582A (zh) * 2020-12-28 2021-04-16 海南大学 产纤维素酶的海洋细菌hn b15及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法
CN112725226A (zh) * 2020-12-28 2021-04-30 海南大学 产纤维素酶细菌c18的筛选及其微生物制剂的天然纤维素降解方法
CN113862196A (zh) * 2021-11-03 2021-12-31 中谷生物科技(大连)有限公司 一株枯草芽孢杆菌sd-kc-001及其应用
CN116376776A (zh) * 2023-04-20 2023-07-04 湖南省水产科学研究所 防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684450A (zh) * 2008-09-22 2010-03-31 北京欣博阳科技有限公司 一种饲料预混料及其专用枯草芽孢杆菌
CN102559545A (zh) * 2011-12-15 2012-07-11 北京大北农科技集团股份有限公司 一种水产用复合微生态制剂及其预混料

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684450A (zh) * 2008-09-22 2010-03-31 北京欣博阳科技有限公司 一种饲料预混料及其专用枯草芽孢杆菌
CN102559545A (zh) * 2011-12-15 2012-07-11 北京大北农科技集团股份有限公司 一种水产用复合微生态制剂及其预混料

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R SELVAM等: "Effect of Bacillus subtilis PB6,a natural probiotic on colon mucosal inflammation and plasma cytokines levels in inflammatory bowel disease", 《INDIAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY & BIOPHYSICS》 *
李春凤等: "枯草芽孢杆菌在饲料生产及环境防治中的应用", 《中国饲料》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106811429A (zh) * 2015-12-02 2017-06-09 北京大北农科技集团股份有限公司 一株枯草芽孢杆菌菌株及其饲料添加剂的应用与饲料
CN106811429B (zh) * 2015-12-02 2021-06-11 北京大北农科技集团股份有限公司 一株枯草芽孢杆菌菌株及其饲料添加剂的应用与饲料
CN107182867A (zh) * 2017-06-07 2017-09-22 贵州江口绿源水产发展有限公司 一种防治鲤鱼肠炎病的方法
CN110029074A (zh) * 2019-03-15 2019-07-19 河南科技大学 一种枯草芽孢杆菌及其在鱼虾养殖疾病防治中的应用
CN110029074B (zh) * 2019-03-15 2020-12-29 河南科技大学 一种枯草芽孢杆菌及其在鱼虾养殖疾病防治中的应用
CN110144310A (zh) * 2019-05-20 2019-08-20 天津科技大学 一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌和应用
CN112725226A (zh) * 2020-12-28 2021-04-30 海南大学 产纤维素酶细菌c18的筛选及其微生物制剂的天然纤维素降解方法
CN112662582A (zh) * 2020-12-28 2021-04-16 海南大学 产纤维素酶的海洋细菌hn b15及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法
CN112725226B (zh) * 2020-12-28 2022-10-11 海南大学 产纤维素酶细菌c18的筛选及其微生物制剂的天然纤维素降解方法
CN112662582B (zh) * 2020-12-28 2022-10-11 海南大学 产纤维素酶的海洋细菌hn b15及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法
CN113862196A (zh) * 2021-11-03 2021-12-31 中谷生物科技(大连)有限公司 一株枯草芽孢杆菌sd-kc-001及其应用
CN113862196B (zh) * 2021-11-03 2023-09-08 中谷生物科技(大连)有限公司 一株枯草芽孢杆菌sd-kc-001及其应用
CN116376776A (zh) * 2023-04-20 2023-07-04 湖南省水产科学研究所 防治湘华鲮细菌性肠炎的复合微生物与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104805040B (zh) 2017-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104805040B (zh) 一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法和应用
Kongnum et al. Effect of Lactobacillus plantarum isolated from digestive tract of wild shrimp on growth and survival of white shrimp (Litopenaeus vannamei) challenged with Vibrio harveyi
CN101541947B (zh) 分离自母乳的具有益生菌活性和抑制体重增加活性的乳酸菌
CN101048168B (zh) 用于改善的***健康的益生菌乳杆菌属菌株
CN112358999B (zh) 一种罗伊氏乳杆菌及其应用
CN101314763B (zh) 具有抗胃肠道致病菌、抗氧化和降血压作用的短双歧杆菌及其用途
JP2008183011A (ja) 発酵及び培養方法、植物発酵エキス、植物発酵エキス末並びに該植物発酵エキス配合物
CN109749957B (zh) 一种具有水产病原菌拮抗特性的格氏乳杆菌制剂的制备及应用
CN106222158B (zh) 一种包埋乳酸杆菌的微胶囊制备方法
CN104171429A (zh) 一种植物乳杆菌lp28的用途
CN105368749A (zh) 一株枯草芽孢杆菌及包含该菌株的饲料添加剂
Bhatnagar et al. Molecular characterization and dosage application of autochthonous potential probiotic bacteria in Cirrhinus mrigala
KR102251295B1 (ko) 락토바실러스 살리바리우스 v133 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 숙취 예방 또는 해소용 조성물
RU2721127C1 (ru) Lactobacillus salivarius cjls1511, композиция кормовой добавки для животных, содержащая указанную бактерию или ее мертвые клетки, и способ получения указанных мертвых клеток
KR101718577B1 (ko) 질환의 예방 개선제, 지구력 향상제, 항피로제, 및 이들을 이용한 의약품 및 음식품
KR102251294B1 (ko) 락토바실러스 살리바리우스 v133 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 위염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
CN107949633B (zh) 鼠李糖乳杆菌、动物饲料及其组合物及无活性细胞生产法
JP2019517810A (ja) α−グルコシダーゼ阻害剤を多量生産するバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株
CN114015626A (zh) 一种具有抑菌功能的类植物乳杆菌及其复合制剂及应用
Jikang et al. Characterization and in vitro properties of Lactobacillus plantarum and Leuconostoc mesenteroides for probiotic potential and nitrite degradation.
CN116162557B (zh) 一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法
CN117384790B (zh) 一株戊糖片球菌ks5及其在制备助睡眠药品中的应用
TWI358266B (zh)
Chandra et al. Development and assessment of a fish feed to assist in aquaculture nutrition management
TWI458438B (zh) Fermentation and culture methods, plant fermentation extracts, plant fermentation extract powders, and plant fermentation extract complexes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant