CN104784712A - 集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)将0.1～1重量份疏水性抗肿瘤药物、1～10重量份的磁共振敏感分子探针、4～40重量份甲氧基封端的聚乙二醇-聚己内酯、0.8～8重量份的带有主动靶向集团的聚合物胶束及0.8～8重量份FITC-PEG-PCL溶解在1～100重量份四氢呋喃中制成混合物；步骤(2)将步骤(1)制备的混合物加入到5～800重量份去离子水中，经过透析挥发以去除有机溶剂，得到靶向FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束；步骤(3)将步骤(2)制备的靶向FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束经过滤膜过滤、离心以除去未装载包裹的抗肿瘤药物，制得内核装载疏水性药物和磁共振敏感分子探针，外壳带有主动靶向集团的集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体。
Description
技术领域
本发明涉及一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，具体涉及一种具有主动靶向功能的，同时装载疏水性抗肿瘤药物和磁共振分子影像探针的双功能纳米聚合物胶束体系的制备。这种纳米聚合物胶束体系在药物释放、肿瘤早期诊断、靶向分子探针、磁共振影像示踪、疗效评估等生物医学工程领域具有广阔的应用前景。
背景技术
全世界每年约有600万人死于恶性肿瘤，中国现有癌症患者约450万人，死亡率约30％，且呈逐年递增的趋势。肿瘤的非手术治疗包括放疗和化疗，均以杀死肿瘤细胞为目的，但它们最大的弊端由于缺乏对肿瘤细胞的特异性识别，所以治疗时将肿瘤细胞和正常细胞一并杀死，为了克服肿瘤治疗中的瓶颈问题，目前国内外众多学者致力于研究“肿瘤靶向传递***”。
在“肿瘤靶向传递***”的研究中，由于纳米粒子的微小体积和特殊结构，可以对药物在体内的分布、吸收、排除等行为达成控制，其作为药物载体具有特殊的优势。由于肿瘤组织自身的特征：如血管网丰富、血管内皮疏松、***缺乏等，使纳米粒子容易从血管中进入肿瘤组织局部而不易被***吸收返回到血液循环***，通过这种增强的渗透及滞留作用(enhancedpermeability and retention，EPR)，纳米粒子可以在肿瘤局部聚集从而获得被动靶向功能。同时，对纳米粒子可以进行表面化学修饰后易偶联或吸附适当的配体(包括抗体、半抗原、糖、叶酸等)，利用配体与细胞表面受体特异性结合的原理，以提高纳米载体对靶目标的特异性及敏感性，从而实现靶向诊断或治疗。2005年美国政府拨款10亿元用于纳米技术的研究，这比用于人类基因组测序的昂贵费用多2倍多。在我国纳米技术的发展也是方兴未艾，日新月异。
在众多的研究中利用聚合物纳米胶束进行抗癌药物及影像对比剂的靶向传输已经成为一个热门的研究领域。在纳米胶束外壳的构造方面，聚乙二醇(PEG)是迄今所发现的生理性能较好的一种聚合物，它具有高度的亲水性、良好的生物相容性、并可显著减少蛋白黏附、网状内皮***的吸收和吞噬细胞的吞噬，从而延长纳米胶束在体内的循环时间。在聚合物胶束结构的设计中，常采用聚己内酯(poly-ε-caprolactone，PCL)来构筑胶束的内核，因为PCL的药物通透性好，兼具可生物降解性，所以主要用作控释载体，用于药物的控制释放。叶酸(Folic acid，FA)受体是一种与糖基化磷脂酰肌醇(glycosylp-hosphatidylinositol，GPI)连接的膜糖蛋白，对叶酸有高度亲合性。叶酸通过γ-羧基偶联其它小分子化合物如抗肿瘤药物后，仍能保持与叶酸受体的高亲合性。此外，叶酸分子具有分子量小、无免疫源性、无毒、生物相容性好等特点。自从发现叶酸受体在绝大多数恶性肿瘤细胞表面有大量表达以来，基于叶酸受体表达的组织分布特点、叶酸受体与叶酸的高度亲和性以及叶酸受体介导的细胞内吞转运机制，叶酸靶向的肿瘤显像技术和药物控释日渐成为关注的焦点。叶酸-药物偶联物与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合后，通过内吞作用(endocytosis)进入肿瘤细胞。在细胞内的弱酸性环境(pH 5)中，叶酸受体构型发生改变，释出叶酸-药物偶联物，而受体又可回到细胞膜表面，再转运其它的叶酸分子或叶酸-药物偶联物。
紫杉醇是广谱抗癌药物，对卵巢癌、乳腺癌、食管癌等上皮组织肿瘤疗效甚佳，但紫杉醇在水中的溶解性很差。为了改善紫杉醇的水溶性，临床应用的紫杉醇注射液中加入的成分容易导致过敏反应和毒性反应，严重限制了紫杉醇的临床使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，克服现有技术中疏水性抗肿瘤药物使用过程中容易导致过敏反应和毒性反应，严重限制了临床使用的缺陷。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)将0.1～1重量份疏水性抗肿瘤药物、1～10重量份的磁共振敏感分子探针、4～40重量份甲氧基封端的聚乙二醇-聚己内酯、0.8～8重量份的带有主动靶向集团的聚合物胶束及0.8～8重量份FITC-PEG-PCL溶解在1～100重量份四氢呋喃中制成混合物；
步骤(2)将步骤(1)制备的混合物加入到5～800重量份去离子水中，经过透析挥发以去除有机溶剂，得到靶向FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束；
步骤(3)将步骤(2)制备的靶向FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束经过滤膜过滤，以除去未装载包裹的抗肿瘤药物，再经过离心去除未装载包裹和游离状态的抗肿瘤药物，制得内核装载疏水性药物和磁共振敏感分子探针，外壳带有主动靶向集团的集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体。
本发明的有益效果是：添加有一定量的带有主动靶向集团的聚合物胶束，提高了胶束体系与肿瘤细胞的特异性结合能力，从而提高了抗肿瘤药物的局部浓度和抗肿瘤效应，并减少抗肿瘤药物的毒副作用，为克服诸如卵巢肿瘤细胞多药耐药提供理论依据。
本发明方法利用胶束的自组装特性，在纳米聚合物胶束壳内同时装载抗肿瘤药物和磁共振敏感分子探针，在达到将抗肿瘤药物特异性运输到肿瘤局部的同时，可用MRI敏感分子探针进行动态观察肿瘤细胞的生长情况、药物在肿瘤内的分布情况、显示治疗过程中靶点的分子改变，为了解抗肿瘤药物的药代动力学提供了机会和途径；同时也为临床治疗卵巢肿瘤实现“个体化”提供了机会和可能。
在同一纳米聚合物胶束体系中，同时实现诊断和治卵巢肿瘤的目的，既有利于临床肿瘤的诊断和治疗，同时有利于推动磁共振特异性探针和开发新的肿瘤靶点提供了坚实的理论依据，从而推动我国无创体外诊断方法的发展和进步。
本发明一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法其具有制备条件温和，操作简单，易于实施的特点。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述疏水性抗肿瘤药物为PTX；所述磁共振敏感分子为超顺磁性氧化铁纳米颗粒。
本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒为Fe3O4、CoFe3O4或MnFe2O4。
本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，步骤(3)所述滤膜为0.45μm的滤膜；所述经过离心去除未装载包裹和游离的抗肿瘤药物是经超滤离心管离心，离心速度为1000-5000rpm。离心速度过小不能有效分离目标产物或分离不彻底，离心速度过大纳米粒子可能会发生聚集。
本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述带有主动靶向集团的纳米聚合物胶束为球形无聚集，粒径为50～100nm。该纳米聚合物胶束在水溶液中分散均一稳定，粒径可控，适合于进一步的生物学应用。
本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述带有主动靶向集团的聚合物胶束通过以下方法制备得到：将叶酸溶解在无水的四氢呋喃中,加入1,1′-羰基二咪唑，在室温下搅拌后，加入氨基封端聚乙二醇-聚己内酯，室温下继续搅拌，反应结束后，用去离子水透析，以除去游离的叶酸和其他副产品，冷冻干燥后，得到白色的粉末状的负载叶酸靶向集团的FA-PEG-PCL。
采用上述进一步的有益效果是：在纳米聚合物胶束表面负载叶酸分子，赋予纳米聚合物胶束肿瘤主动靶向功能，提高了胶束体系与肿瘤细胞的特异性结合能力，从而提高了抗肿瘤药物的局部浓度和抗肿瘤效应，并减少抗肿瘤药物的毒副作用，以期克服卵巢肿瘤细胞多药耐药。
本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述FITC-PEG-PCL通过以下方法的制备得到：将NH2-PEG-PCL溶于四氢呋喃中，在超声条件下，滴入到PH＝10的水溶液中，制备成胶束溶液，然后加入FITC，室温下搅拌24～48h，然后用去离子水透析，冷冻干燥后，得到FITC-PEG-PCL。
本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒通过以下方法制备得到：保证合成的整个过程处于完全无水的真空状态，称取Fe(acac)3与1,2-十六烷醇、油酸及油胺混合于苄醚内,在氩气保护下逐渐加热至250-300℃回流，等溶液冷却至室温后用甲醇沉淀得到黑色固体,将黑色固体回溶于油酸油胺与正己烷的混合物中,再用甲醇离心沉淀,即得到目标产物，再溶于正己烷中密封，冷藏保存待用。优选所述Fe(acac)3、1,2-十六烷醇、油酸及油胺的摩尔比例为1:5:3:3。
本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述甲氧基封端的聚乙二醇-聚己内酯通过以下方法制备得到：整个合成过程在无水无氧环境下进行，将干燥的mPEG和ε-已内酯干燥单体加入到氩气保护的单颈瓶中，再加入催化剂异辛酸亚锡混合，制得的混合物在氩气保护下100-120℃磁力搅拌48-72小时，待反应产物冷却到室温后，将其溶于四氢呋喃，然后用冰***沉淀，沉淀的产物溶于四氢呋喃再用正己烷沉淀，收集沉淀物用氩气吹干，以挥发剩余的四氢呋喃和正己烷，产物真空干燥24-48小时，氩气保护后，置真空干燥器中保存。
本发明在高温有机相中合成超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)，利用聚乙二醇(PEG)引发ε-己内酯(CL)开环聚合法制备两亲聚合物胶束即嵌段聚合物(mPEG-b-PCL)。将与肿瘤组织有特异相互作用的生物活性分子叶酸高效负载于mPEG-b-PCL的亲水性外壳上，赋予其对肿瘤细胞的主动靶向性，利用受体与配体的特异性识别、结合以及通体介导的内吞作用增加肿瘤细胞对载药胶束的摄取。最后将聚合物胶束的疏水嵌段构成内核并作为微药库通过化学键合或物理包埋的方式结合用于显影的分子影像探针SPIO纳米粒子和用于抗肿瘤治疗的药物紫杉醇，在实现增加紫杉醇的水溶性的同时，将磁共振敏感分子探针包裹在胶束内部，加强影像成像的敏感性，提高对肿瘤的诊断与监测。最终设计并制备出将主动靶向功能、显影功能和抗肿瘤效应等多种功能整合于同一个胶束体系中的多功能纳米胶束体系。
附图说明
图1为负载叶酸后具有主动靶向官能团的纳米粒的动态光散射粒度分布数据；
图2为靶向纳米聚合物胶束中PTX在37℃(pH 7.4)时的药物释放行为曲线；
图3a为不同铁离子浓度时非靶向和靶向纳米聚合物胶束与SKOV3细胞共培养时细胞活性的生物学评价；
图3b分别为PTX、非靶向药物载体和靶向纳米聚合物胶束载体与SKOV3共培养时细胞活性的生物学评价；
图4当铁离子浓度为4微克/毫升时，非靶向纳米聚合物胶束载体和靶向纳米聚合物胶束载体分别与SKOV3细胞共培养时，2,6,12,24小时的激光共聚焦显微镜图片；
图5非靶向纳米聚合物胶束载体和靶向纳米聚合物胶束载体与SKOV3共培养时细胞内吞铁的定量分析；
图6非靶向纳米聚合物胶束载体和靶向纳米聚合物胶束载体随标记细胞浓度变化时的显影效果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法中所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒、甲氧基封端的聚乙二醇-聚己内酯(M-PEG-PCL，聚乙二醇-聚己内酯)、负载叶酸靶向集团的FA-PEG-PCL(叶酸靶向聚乙二醇-聚己内酯)，FITC-PEG-PCL(异硫氰酸荧光素标记的聚乙二醇-聚己内酯)的具体合成可以通过以下方法制备得到：
(一)超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)合成
保证合成的整个过程处于完全无水的真空状态，称取1mmol Fe(acac)3(即铁(III)乙酰丙酮化物)与5mmol 1,2-十六烷醇、3mmol油酸及3mmol油胺混合于10mL苄醚内,在氩气保护下逐渐加热至250～300℃回流1～1.5h.等溶液冷却至室温后用200ML甲醇沉淀得到黑色固体,将沉淀回溶于混合了油酸油胺的正己烷中,再用甲醇离心(转速)沉淀,即得到的目标产物，再溶于正己烷中密封，置于冰箱4℃冷藏保存。用动态光散射测量合成的SPIO纳米颗粒的粒径大小。
(二)甲氧基封端的聚乙二醇-聚己内酯(M-PEG-PCL)两亲性共聚物合成
合成过程应保证在无水无氧环境下进行，精确称取1-5重量份干燥的mPEG和800-2000重量份的ε-已内酯干燥单体加入到氩气保护的单颈瓶中，加入2-200重量份异辛酸亚锡为催化剂，上述混合物在氩气保护下100-120℃磁力搅拌48-72小时，待反应产物冷却到室温后，将其溶于10mL四氢呋喃(THF)，然后用6-10重量份的冰***沉淀，沉淀的产物溶于四氢呋喃再用6-10重量份的正己烷沉淀如此反复3-5次。收集沉淀物用氩气吹干，以挥发剩余的四氢呋喃和正己烷。产物真空干燥24-48小时，氩气保护后，置真空干燥器中保存。
(三)负载叶酸靶向集团的FA-PEG-PCL的制备
将1-5重量份叶酸溶解在5-25mL的无水的四氢呋喃(THF)中,加入100-400重量份的1,1′-羰基二咪唑(CDI)，在室温下搅拌2-4h后，加入500-2500份氨基封端聚乙二醇-聚己内酯，室温下继续搅拌24h。反应结束后，用去离子水透析(MWO＝100kDa)，以除去游离的叶酸和其他副产品。冷冻干燥后，得到负载叶酸靶向集团的FA-PEG-PCL是一种白色的粉末。
(四)FITC-PEG-PCL的制备
将1-5重量份的NH2-PEG-PCL溶于四氢呋喃溶液中，在超声条件下，滴入到5-10重量份的PH＝10的水溶液中，制备成胶束溶液，然后加入1500-4000重量份的FITC，室温下搅拌24-48h，然后用去离子水透析(MWO＝100kDa)，冷冻干燥后，得到FITC-PEG-PCL。
实施例1
制备装载抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)和超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)的纳米聚合物胶束。
通过双亲性嵌段聚合物胶束自组装包裹SPIO纳米粒和装载疏水性抗肿瘤药物紫杉醇。将0.6mg的PTX，Fe3O4纳米粒子6.0mg，13.5mgMPEG-PCL和3mgFA-PEG-PCL，3mg FITC-PEG-PCL溶解在1.5ml四氢呋喃(THF)中，然后将上述混合物在超声状态下加入到15ml去离子水中，经透析2-3天挥发THF以除去有机溶剂和未装载包裹的抗肿瘤药物，得到的FA-NP/SPIO/PTX的纳米聚合物胶束，胶束溶液再经450nm的滤膜过滤及超滤离心管以2500-3000rpm离心2次。
实施例1制备的FA-NP/SPIO/PTX的纳米聚合物胶束粒径的测量。
用动态光散射测量带有主动靶向集团、搞肿瘤药物和医学磁共振分子探针的纳米聚合物胶束的粒径大小及分布情况，如图1所示。说明具有主动靶向集团的胶束在水相中粒径为50-100nm，分散窄，尺寸均一。
实施例1制备的FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束中药物PTX的体外释放曲线。
PTX从叶酸靶向纳米聚合物胶束中释放实验通过透析袋扩散技术，以含有0.5％的吐温80的磷酸盐缓冲液(PBS,pH＝7.4)为介质,精确称量23mg装载PTX的纳米聚合物制备成0.5mL的胶束溶液，将溶液转移至透析袋中(Spectra MWCO＝6000-8000)，将透析袋浸入30ml释放介质中，在37℃下以75转/分钟的转速连续摇晃96h。分别在1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h，24h、48h、72h、96h这些时间点，从释放介质中取出取3ml样品，并补充等量的新鲜介质以维持非饱和的沉淀条件，通过高效液相色谱法(HLPC)测量各时间点释放的PTX。HLPC的条件为：Agilent EclipseXDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相由乙腈和水组成(50:50)流动速率1ml/min，进样量10μl,紫杉醇的检测波长为227nm。结果如图2所示。
实施例1制备的FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束的体外生物学评价。
(1)未装载PTX的靶向纳米聚合物胶束和非靶向纳米聚合物胶束的体外噻唑蓝分析法即MTT法，评价靶向纳米聚合物胶束和非靶向纳米聚合物胶束在没有装载抗肿瘤药物时的的生物安全性。
取200ul DMEM完全培养基按5×103个细胞/孔的密度将人卵巢癌细胞(SKOV3)接种于96孔板，将孔板置于37℃、5％CO2的细胞恒温培养箱中孵育24h后，分别加入不同体积的未装载PTX的带有主动靶向的纳米胶束使铁的终浓度为1uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM为试验组,加入同样铁离子浓度的未装载PTX非靶向纳米胶束作为对照组，将孔板置于培养箱中孵育24h后，吸出上清液，PBS洗涤2次，加入新鲜培养液再培养3天。将20ulMTT(浓度为5mg/ml)加入到180ul的完全培养基中，使每孔的终体积仍为200ul，继续在培养箱中孵育4h，终止孵育。吸出上清液，每孔加入200ulDMSO，轻轻振荡10min，等蓝色颗粒充分溶解后，用酶联免疫检测标仪进行分析。结果见图3a，数据表明在随着铁离子浓度的升高，带有主动靶向的纳米胶束和非靶向纳米胶束在没有装载抗肿瘤药物PTX之前对实验细胞是没有明显毒性的。
(2)装载药物后靶向纳米聚合物胶束和非靶向纳米聚合物胶束对SKOV3细胞的生物活性评价。
按上述细胞培养及种植法将SKOV3细胞接种于96孔板，孔板置在恒温培养箱中孵育24h后，在孔板中分别加入临床治疗卵巢癌常用的抗肿瘤药物PTX、非靶向纳米聚合物胶束和靶向纳米聚合物胶束，使药物终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0uM,细胞与药物共培养24h后，吸出上清液，PBS洗涤2次，加入新鲜培养液再培养3天,用MTT法评价药物对细胞的生物活性影响,结果见图3b。数据表明装载抗肿瘤药物PTX后，与非靶向纳米聚合物胶束相比，在相同药物浓度时靶向纳米聚合物胶束对SKOV3细胞有明显的细胞毒性作用。
采用激光共聚焦显微镜评价非靶向纳米聚合物胶束和实施例1制备的FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束对细胞的标记和定位。
将按1×105个SKOV3细胞接种于含有培养液的35mm玻璃培养皿中置于37℃、5％CO2的细胞恒温培养箱中孵育24h后，向培养液中分别加入非靶向纳米聚合物胶束和靶向纳米聚合物胶束，使铁离子终浓度为4ug/ml，两种纳米聚合物胶束分别与SKOV3细胞共培养2,6,12,24小时后，吸出上清液，PBS洗涤3次，固定，DAPI染色细胞核，用激光共聚焦成像***获取荧光图像，评价两种纳米聚合物胶束对细胞标记效率和进入细胞内定位分析。结果如图4所示。结果显示与非靶向纳米聚合物胶束相比，SKOV3细胞对FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束的吞噬明显增多，并且是呈时间依赖性的，说明细胞吞噬增多主要依赖于靶向集团。
SKOV3细胞内吞铁的定量测试。
将对数生长期的SKOV3细胞，按1×105个/ml的细胞密度接种于500ul新鲜培养液DMEM(含5％小牛血清)的48孔板内，在细胞恒温培养箱中37℃孵育24h后，加入不同体积的非靶向纳米聚合物胶束和靶向纳米聚合物胶束溶液使铁离子的终浓度为4ug/ml。将加入不同材料的两组孔板均置于培养箱中分别孵育2h、6h、12h、24h，弃去培养液，PBS洗涤3-5次，洗去未结合的纳米粒子。加入1ml含有EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞3-5min后，加入RMPI-1640培养液终止消化。以1200rpm的转速离心5min，重复3次。后一次离心后，弃去上清液，收集细胞，在显微镜下进行细胞计数。计数后加入1ml高锰酸钾(KMNO4)，放在循环周期振荡器上振荡12h，稀释样品到所需浓度，用酶联免疫检测标仪测定测量细胞内的铁含量。结果如图5所示。结果表明SKOV3细胞与非靶向纳米聚合物胶束共孵育时，细胞内吞噬的铁量随时间的变化没有明显的增加。相反细胞与FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束共孵育时，细胞内吞噬的铁量随时间的变化呈现明显增加的趋势，孵育24时,细胞内吞噬的铁量达到9.25pg/细胞，同时说明主动靶向集团可以增加细胞对FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束的吞噬，从而包裹在胶束内核的SPIO纳米颗粒可以达到显影的目的。
非靶向聚合物胶束载体和实施例1制备的FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束载体的显影效果评价。
SKOV3细胞分别与相同铁离子浓度(4ug/ML)的非靶向聚合物胶束、靶向纳米聚合物共培养24h,用多聚甲醛固定细胞，再用PBS洗涤3次，最后将细胞分别按0.05、0.1、0.2、0.5、1、2×105个/ml的细胞密度均匀分散于明胶交联戊二醛的微量离心管中，使用临床磁共振扫描仪头线圈(磁场强度3T,自旋回波序列:TR＝5000ms,TE＝10-500ms)进行磁共振扫描，以纯水作为对照，评价非靶向纳米聚合物胶束载体和靶向纳米聚合物胶束载体进入肿瘤细胞后显影能力，结果如图6所示。从图6中可以观察到：与非靶向纳米聚合物胶束比较，靶向纳米聚合物胶束能明显降低T2信号。
实施例2
制备装载抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)和超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)的纳米聚合物胶束。
通过双亲性嵌段聚合物胶束自组装包裹SPIO纳米粒和装载疏水性抗肿瘤药物紫杉醇。将0.1mg的PTX，1.0mg CoFe3O4纳米颗粒，4mgMPEG-PCL和0.8mgFA-PEG-PCL，0.8mg FITC-PEG-PCL溶解在2ml四氢呋喃(THF)中，然后将上述混合物在超声状态下加入到20ml去离子水中，经透析3天挥发THF以除去有机溶剂和未装载包裹的抗肿瘤药物，得到的FA-NP/SPIO/PTX的纳米聚合物胶束，胶束溶液再经450nm的滤膜过滤及超滤离心管以3000rpm离心2次，制得内核装载疏水性药物和磁共振敏感分子探针，外壳带有主动靶向集团的集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体。
非靶向聚合物胶束载体和实施例2制备的FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束载体的显影效果评价。
SKOV3细胞分别与相同铁离子浓度(4ug/ML)的非靶向聚合物胶束、靶向纳米聚合物共培养24h,用多聚甲醛固定细胞，再用PBS洗涤3次，最后将细胞分别按0.05、0.1、0.2、0.5、1、2×105个/ml的细胞密度均匀分散于明胶交联戊二醛的微量离心管中，使用临床磁共振扫描仪头线圈(磁场强度3T,自旋回波序列:TR＝5000ms,TE＝10-500ms)进行磁共振扫描，以纯水作为对照，评价非靶向聚合物胶束载体和靶向纳米聚合物胶束载体进入肿瘤细胞后显影能力，结果显示与非靶向聚合物胶束比较，靶向纳米聚合物胶束能更别明显降低T2信号。
实施例3
制备装载抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)和超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)的纳米聚合物胶束。
通过双亲性嵌段聚合物胶束自组装包裹SPIO纳米粒和装载疏水性抗肿瘤药物紫杉醇。将1mg的PTX，10mgMnFe2O4纳米颗粒，35mgMPEG-PCL和8mgFA-PEG-PCL，8mg FITC-PEG-PCL溶解在15ml四氢呋喃(THF)中，然后将上述混合物在超声状态下加入到150ml去离子水中，经透析3天挥发THF以除去有机溶剂和未装载包裹的抗肿瘤药物，得到的FA-NP/SPIO/PTX的纳米聚合物胶束，胶束溶液再经450nm的滤膜过滤及超滤离心管以3000rpm离心2次，制得内核装载疏水性药物和磁共振敏感分子探针，外壳带有主动靶向集团的集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体。
非靶向纳米聚合物胶束载体和实施例2制备的FA-NP/SPIO/PTX纳米聚合物胶束载体的显影效果评价。
SKOV3细胞分别与相同铁离子浓度(4ug/ML)的非靶向纳米聚合物胶束、靶向纳米聚合物共培养24h,用多聚甲醛固定细胞，再用PBS洗涤3次，最后将细胞分别按0.05、0.1、0.2、0.5、1、2×105个/ml的细胞密度均匀分散于明胶交联戊二醛的微量离心管中，使用临床磁共振扫描仪头线圈(磁场强度3T,自旋回波序列:TR＝5000ms,TE＝10-500ms)进行磁共振扫描，以纯水作为对照，评价非靶向纳米聚合物胶束载体和靶向纳米聚合物胶束载体进入肿瘤细胞后显影能力，结果显示与非靶向纳米聚合物胶束比较，靶向纳米聚合物胶束能明显降低T2信号。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)将0.1～1重量份疏水性抗肿瘤药物、1～10重量份的磁共振敏感分子探针、4～40重量份甲氧基封端的聚乙二醇-聚己内酯、0.8～8重量份的带有主动靶向集团的纳米聚合物胶束及0.8～8重量份F I TC-PEG-PCL溶解在1～100重量份四氢呋喃中制成混合物；
步骤(2)将步骤(1)制备的混合物加入到5～800重量份去离子水中，经过透析挥发以去除有机溶剂，得到靶向FA-NP/SPI O/PTX纳米聚合物胶束；
步骤(3)将步骤(2)制备的靶向FA-NP/SPI O/PTX纳米聚合物胶束经过滤膜过滤、离心处理，以除去未装载包裹和游离的抗肿瘤药物，制得内核装载疏水性药物和磁共振敏感分子探针，外壳带有主动靶向集团的集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体。
2.根据权利要求1所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，所述疏水性抗肿瘤药物为PTX；所述磁共振敏感分子探针为超顺磁性氧化铁纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒为Fe3O4、CoFe3O4或MnFe2O4。
4.根据权利要求1所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述滤膜为0.45μm的滤膜；所述经过离心去除未装载包裹和游离的抗肿瘤药物是经超滤离心管离心，离心速度为1000～5000rpm。
5.根据权利要求1所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，所述带有主动靶向集团的纳米聚合物胶束为球形无聚集，粒径为50～100nm。
6.根据权利要求1所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，所述带有主动靶向集团的聚合物胶束通过以下方法制备得到：将叶酸溶解在无水的四氢呋喃中,加入1,1′-羰基二咪唑，在室温下搅拌后，加入氨基封端聚乙二醇-聚己内酯，室温下继续搅拌，反应结束后，用去离子水透析，以除去游离的叶酸和其他副产品，冷冻干燥后，得到白色的粉末状的负载叶酸靶向集团的FA-PEG-PCL。
7.根据权利要求1所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，所述FITC-PEG-PCL通过以下方法的制备得到：将NH2-PEG-PCL溶于四氢呋喃中，在超声条件下，滴入到PH＝10的水溶液中，制备成胶束溶液，然后加入FITC，室温下搅拌24～48h，然后用去离子水透析，冷冻干燥后，得到FITC-PEG-PCL。
8.根据权利要求1所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒通过以下方法制备得到：保证合成的整个过程处于完全无水的真空状态，称取Fe(acac)3与1,2-十六烷醇、油酸及油胺混合于苄醚内,在氩气保护下逐渐加热至250-300℃回流1～1.5小时，等溶液冷却至室温后用甲醇沉淀得到黑色固体,将黑色固体回溶于油酸油胺与正己烷的混合物中,再用甲醇离心沉淀,即得到目标产物，再溶于正己烷中密封，冷藏保存待用。
9.根据权利要求8所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，所述Fe(acac)3、1,2-十六烷醇、油酸及油胺的摩尔比例为1:5:3:3。
10.根据权利要求1所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，其特征在于，所述甲氧基封端的聚乙二醇-聚己内酯通过以下方法制备得到：整个合成过程在无水无氧环境下进行，将干燥的mPEG和ε-已内酯干燥单体加入到氩气保护的单颈瓶中，再加入催化剂异辛酸亚锡混合，制得的混合物在氩气保护下100～120℃磁力搅拌48～72小时，待反应产物冷却到室温后，将其溶于四氢呋喃，然后用冰***沉淀，沉淀的产物溶于四氢呋喃再用正己烷沉淀，收集沉淀物用氩气吹干，以挥发剩余的四氢呋喃和正己烷，产物真空干燥24～48小时，氩气保护后，置真空干燥器中保存。
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