CN104784688A - Il-17a/f异二聚体多肽及其治疗用途 - Google Patents

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萨拉·希莫威茨
菲利普·E·哈斯
梅利莎·斯塔罗瓦斯尼克
吴雁
詹姆斯·M·李
戴维·P·阿诺特
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Abstract

本申请涉及IL-17A/F异二聚体多肽及其治疗用途。本发明涉及一种新的天然存在的人细胞因子，其由白介素-17和白介素-17F的异二聚体组成，在本文中称为白介素17A/F(IL-17A/F)。本文中还提供了包含那些核酸序列的载体和宿主细胞，包含与异源多肽序列融合的本发明多肽的嵌合多肽分子，能结合本发明多肽的特异性抗体及用于生成本发明多肽的方法。本文中进一步提供了用于治疗变性软骨病症及其它炎性疾病的方法。

Description

IL-17A/F异二聚体多肽及其治疗用途
本申请是申请日为2007年11月20日、中国申请号为200780040465.8、发明名称为“IL-17A/F异二聚体多肽及其治疗用途”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明一般涉及本文中称为白介素-17A/F(IL-17A/F)的新的人细胞因子的鉴定和分离。
发明背景
胞外蛋白质在多细胞生物体的形成、分化及维持等中发挥重要的作用。许多细胞个体的命运(例如增殖、迁移、分化、或与其它细胞的相互作用)典型地受自其它细胞和/或紧邻环境接受的信息控制。此信息通常由分泌型多肽(例如(促)有丝***因子、存活因子、细胞毒性因子、分化因子、神经肽、及激素)传播，继而所述分泌型多肽被不同的细胞受体或膜结合蛋白质所接受和诠释。这些分泌型多肽或信号传导分子通常穿过细胞分泌途径以到达其在胞外环境中的作用位点。
分泌型蛋白质具有各种工业应用，包括作为药物、诊断剂(diagnostic)、生物传感器和生物反应器。目前可获得的大多数蛋白质药物(诸如溶栓剂、干扰素、白介素、红细胞生成素、集落刺激因子、及各种其它细胞因子)是分泌型蛋白质。它们的受体(其为膜蛋白质)也具有作为治疗剂或诊断剂的潜力。
膜结合的蛋白质和受体能在多细胞生物体的形成、分化及维持等中发挥重要作用。许多细胞个体的命运(例如增殖、迁移、分化、或与其它细胞的相互作用)典型地受自其它细胞和/或紧邻环境接受的信息控制。此信息通常由分泌型多肽(例如(促)有丝***因子、存活因子、细胞毒性因子、分化因子、神经肽、及激素)传播，继而所述分泌型多肽被不同的细胞受体或膜结合蛋白质所接受和诠释。此类膜结合蛋白质和细胞受体包括但不限于细胞因子受体、受体激酶、受体磷酸酶、细胞-细胞相互作用中牵涉的受体、及细胞粘附素分子(像选择蛋白和整联蛋白)。例如，调节细胞生长和分化的信号的转导是部分通过各种细胞蛋白质的磷酸化来调节的。蛋白质酪氨酸激酶(即催化该过程的酶)还可以起生长因子受体的作用。例子包括成纤维细胞生长因子受体和神经生长因子受体。
与分泌型蛋白质类似，膜结合蛋白质和受体分子具有各种工业应用，包括作为药剂和诊断剂。例如，受体免疫粘附素可用作治疗剂以阻断受体-配体相互作用。膜结合蛋白质还可以用于筛选相关受体/配体相互作用的潜在肽或小分子抑制剂。
工业及学术界都在努力鉴定新的、天然的分泌型蛋白质和天然受体或膜结合蛋白质。许多努力聚焦于筛选哺乳动物重组DNA文库以鉴定新的分泌型蛋白质的编码序列。筛选方法和技术的例子记载于文献中[参见例如Klein等,Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996)；美国专利No.5,536,637)]。
在这点上，本发明涉及鉴定已经显示与免疫介导的和炎性的疾病有关的白介素-17(IL-17)家族的新的分泌型多肽。免疫相关和炎性疾病是相当复杂的、通常是多重互联的生物学途径的现象或结果，在正常生理学中所述生物学途径对于应答创伤(insult)或损伤、自创伤或损伤启动修复、及发动针对外来生物体的先天性和获得性防御是至关重要的。在这些正常生理学途径引起别的创伤或损伤(或是与应答的强度直接相关、或是作为异常调节或过度刺激的结果、或是作为对自身的反应、或是作为这些的组合)时发生疾病或病理。
虽然这些疾病的发生通常牵涉多步途径且通常牵涉多种不同生物学***/途径，但是这些途径的一种或多种中的临界点干涉可具有改善或治疗的效应。治疗性干涉可以通过拮抗有害过程/途径或刺激有益过程/途径而发生。
许多免疫相关疾病是已知的，而且已经被广泛地研究。此类疾病包括免疫介导的炎性疾病(诸如类风湿性关节炎、免疫介导的肾病、肝胆病、炎性肠病(IBD)、银屑病、及哮喘)、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷病、瘤形成等等。
T淋巴细胞(T细胞)是哺乳动物免疫应答的重要成分。T细胞识别与主要组织相容性复合体(MHC)内的基因编码的自身分子(self-molecule)结合(associated)的抗原。该抗原可以与MHC分子一起展示在抗原呈递细胞、受病毒感染的细胞、癌细胞、移植物等的表面上。T细胞***清除那些对宿主哺乳动物造成健康威胁的改变的细胞。T细胞包括辅助性T细胞和细胞毒性T细胞。辅助性T细胞在识别抗原呈递细胞上的抗原-MHC复合物后大量增殖。辅助性T细胞还分泌多种细胞因子，即淋巴因子，其在B细胞、细胞毒性T细胞及多种参与免疫应答的其它细胞的活化中发挥中心作用。
体液介导的免疫应答和细胞介导的免疫应答两者中的中心事件是辅助性T细胞的活化和克隆扩增。辅助性T细胞活化是通过T细胞受体(TCR)-CD3复合物与抗原呈递细胞表面上的抗原-MHC相互作用而启动的。这种相互作用介导诱导静息辅助性T细胞进入细胞周期(G0至G1的转变)的生化事件的级联，而且导致IL-2(有时IL-4)的高亲和力受体的表达。活化的T细胞行进整个周期，增殖并分化成记忆细胞或效应细胞。
在经由TCR介导的信号外，T细胞的活化还牵涉由抗原呈递细胞释放的细胞因子诱导的或经由与抗原呈递细胞和T细胞上的膜结合分子相互作用而诱导的额外共刺激。已有显示细胞因子IL-1和IL-6提供共刺激信号。同样，抗原呈递细胞表面上表达的B7分子与T细胞表面上表达的CD28和CTLA-4分子之间的相互作用招致(effect)T细胞活化。活化的T细胞表达数目增加的细胞粘附分子，诸如ICAM-1、整联蛋白、VLA-4、LFA-1、CD56等等。
某种化合物刺激免疫***的能力的确立指示是混合淋巴细胞培养或混合淋巴细胞反应(MLR)中的T细胞增殖。在许多免疫应答中，炎性细胞浸润损伤或感染部位。迁移细胞可能是嗜中性的、嗜曙红的、单核细胞的或淋巴细胞的，正如可以通过受侵袭组织的组织学检查来测定的。Current Protocolsin Immunology,编John E.Coligan,1994,John Wiley&Sons,Inc.。
免疫相关疾病可以通过抑制免疫应答来治疗。在免疫介导的和炎性的疾病中使用抑制具有免疫刺激活性的分子的中和性抗体会是有益的。可以利用抑制免疫应答的分子(直接使用蛋白质或经由使用抗体激动剂)来抑制免疫应答，如此改善免疫相关疾病。
白介素-17(IL-17)是T细胞衍生的促炎性分子，其刺激上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞生成其它炎性细胞因子和趋化因子，包括IL-6、IL-8、G-CSF、及MCP-1[参见Yao,Z.等,J.Immunol.,122(12):5483-5486(1995)；Yao,Z.等,Immunity,3(6):811-821(1995)；Fossiez,F.等,J.Exp.Med.,183(6):2593-2603(1996)；Kennedy,J.等,J.Interferon Cytokine Res.,16(8):611-7(1996)；Cai,X.Y.等,Immunol.Lett,62(1):51-8(1998)；Jovanovic,D.V.等,J.Immunol.,160(7):3513-21(1998)；Laan,M.等,J.Immunol.,162(4):2347-52(1999)；Linden,A.等,Eur Respir J,15(5):973-7(2000)；及Aggarwal,S.和Gurney,A.L.,JLeukoc Biol,71(1):1-8(2002)]。IL-17还与其它细胞因子(包括TNF-α和IL-1β)协同作用以进一步诱导趋化因子表达(Chabaud,M.等,J.Immunol.161(1):409-14(1998))。白介素17(IL-17)对多种类型的细胞展现多效生物学活性。IL-17还具有诱导ICAM-1表面表达、T细胞增殖、及CD34+人祖细胞生长并分化为嗜中性细胞的能力。还已经将IL-17与骨代谢联系起来，而且已有提示其在以存在活化的T细胞和TNF-α生成为特征的病理性疾患(诸如类风湿性关节炎和骨植入物松弛)中发挥重要作用(Van Bezooijen等,J.Bone Miner.Res.,14:1513-1521[1999])。发现自类风湿性关节炎患者衍生的滑膜组织的活化的T细胞比自正常个体或骨关节炎患者衍生的滑膜组织的活化的T细胞分泌更高量的IL-17(Chabaud等,Arthritis Rheum.,42:963-970[1999])。提示该促炎性细胞因子在类风湿性关节炎中活跃地促成滑膜炎症。除其促炎作用外，IL-17似乎还通过另一种机制来促成类风湿性关节炎的病理。例如，已有显示IL-17诱导成骨细胞中破骨细胞分化因子(ODF)mRNA的表达(Kotake等,J.Clin.Invest.,103:1345-1352[1999])。ODF刺激祖细胞分化成破骨细胞，即骨吸收(bone resorption)中牵涉的细胞。因为在类风湿性关节炎患者的滑液中IL-17水平显著升高，看来IL-17诱导的破骨细胞形成在类风湿性关节炎中的骨吸收中发挥至关重要的作用。还认为IL-17在某些其它自身免疫病中发挥关键作用，诸如多发性硬化(Matusevicius等,Mult.Scler.,5:101-104(1999)；Kurasawa,K.等,Arthritis Rheu 43(11):2455-63(2000))和银屑病(Teunissen,M.B.等,J Invest Dermatol 111(4):645-9(1998)；Albanesi,C.等,J InvestDermatol 115(1):81-7(2000)；及Homey,B.等,J.Immunol.164(12):6621-32(2000))。
已有进一步显示IL-17通过胞内信号传导而刺激人巨噬细胞中Ca2+内向通量(influx)和[cAMP]i降低(Jovanovic等,J.Immunol.,160:3513[1998])。经IL-17处理的成纤维细胞诱导NF-κB的活化[Yao等,Immunity,3:811(1995)；Jovanovic等,见上文]，而经IL-17处理的巨噬细胞活化NF-κB和由促***原活化的蛋白激酶(Shalom-Barek等,J.Biol.Chem.,273:27467[1998])。另外，IL-17还与骨及软骨生长中牵涉的哺乳动物细胞因子样因子7共享序列相似性。与IL-17多肽共享序列相似性的其它蛋白质有人胚胎衍生的白介素相关因子(EDIRF)和白介素-20。
与IL-17广范围的效应一致，已经发现IL-17的细胞表面受体在许多组织和细胞类型中广泛表达(Yao等,Cytokine,9:794[1997])。虽然人IL-17受体(IL-R)的氨基酸序列(866个氨基酸)预测为具有单个跨膜域和一个长的、525个氨基酸的胞内域的蛋白质，但是受体序列是独特的，而且不与来自细胞因子/生长因子受体家族的任何受体的序列相似。这与IL-17本身与其它已知蛋白质缺乏相似性结合起来，指明IL-17及其受体可能是信号传导蛋白及受体的新家族的一部分。已经证明IL-17活性是经由与其独特的细胞表面受体(本文中称为人IL-17R)结合而介导的，其中先前的研究显示了T细胞与可溶形式的IL-17受体多肽接触抑制了由PHA、伴刀豆球蛋白A及抗TCR单克隆抗体诱导的T细胞增殖和IL-2生成(Yao等,J.Immunol.,155:5483-5486[1995])。因此，对鉴定和表征与已知细胞因子受体，特别是IL-17受体具有同源性的新多肽具有极大的兴趣。
目前公认白介素17为细胞因子新出现家族的原型成员。人和其它脊椎动物基因组的大规模测序揭示了编码明显与IL-17有关的蛋白质的别的基因的存在，如此定义细胞因子的新家族。在人和小鼠中有IL-17家族的至少6个成员，包括IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F以及新受体IL-17RH1、IL-17RH2、IL-17RH3和IL-17RH4(参见2001年6月28日公布的WO01/46420)。已经证明一个此类IL-17成员(称为IL-17F)结合人IL-17受体(IL-17R)(Yao等,Cytokine,9(11):794-800(1997))。初始的表征提示，像IL-17一样，数种这些新鉴定的分子具有调控免疫功能的能力。对数种这些因子鉴定出的有力炎性作用及与主要人类疾病的新出现联系提示这些蛋白质在炎性过程中可具有重要作用，而且可提供治疗性干预的机会。
编码人IL-17F的基因位于IL-17附近(Hymowitz,S.G.等,Embo.J.,20(19):5332-41(2001))。IL-17和IL-17F共享44％的氨基酸同一性，而IL-17家族的其它成员共享更有限的15-27％的氨基酸同一性，这提示IL-17和IL-17F在IL-17家族内形成独特的亚组(Starnes,T.等,J.Immunol.,167(8):4137-40(2001)；Aggarwal,S.和Gurney,A.L.,J.Leukoc Biol.,71(1):1-8(2002))。IL-17F表现出具有与IL-17相似的生物学作用，而且能够促进自极其多种细胞生成IL-6、IL-8、和G-CSF。与IL-17类似，其能够诱导软骨基质释放，并抑制新软骨基质合成(参见2002年11月28日公布的US-2002-0177188-A1)。如此，像IL-17一样，IL-17F可潜在地促成炎性病症的病理。最近，这些作者观察到T细胞中的IL-17和IL-17F两者都是通过白介素23(IL-23)的作用而诱导的(Aggarwal,S.等,J.Biol.Chem.,278(3):1910-4(2003))。IL-17和IL-17F共享相似的染色体定位和显著的序列相似性的观察结果以及IL-17和IL-17F表现出通过相同细胞群体应答特定刺激而被诱导的观察结果导致新的人细胞因子的鉴定，所述新的人细胞因子是由IL-17和IL-17F的共价异二聚体组成的(本文中称为IL-17A/F)。人IL-17A/F显然是新的细胞因子，其与人IL-17和IL-17F在蛋白质结构及基于细胞的活性测定法中都是可区别的。通过使用纯化的重组人IL-17A/F作为标准品，开发了人IL-17A/F特异性ELISA。通过使用此特异性ELISA，检测到人IL-17A/F的诱导表达，这证实IL-17A/F是自培养物中活化的人T细胞天然生成的。因此，IL-17A/F显然是可作为分离的、活化的人T细胞的天然产物来检测的新的细胞因子，其重组形式在蛋白质结构和基于细胞的测定法中都已经被表征为与相关细胞因子是不同的且是可区别的。如此，这些研究提供并鉴定了可加强免疫***来应答先前可能不曾具有免疫活性的特定抗原的新免疫刺激物(即IL-17A/F)。因此，新鉴定的免疫刺激物具有重要的临床应用。该新IL-17A/F细胞因子或其激动剂因此会找到作为免疫刺激物的实际效用，而抑制IL-17A/F活性的分子(拮抗剂)预期会在期望抑制免疫应答时(诸如在自身免疫病中)找到实际效用。具体地，此新细胞因子的抗体会拥有治疗性质，所述抗体模拟(激动性抗体)或抑制(拮抗性抗体)IL-17A/F的免疫学活性。起抑制该新细胞因子活性的作用的小分子也会具有潜在的治疗用途。
发明概述
A.实施方案
本发明涉及对于在哺乳动物(包括人)中诊断和治疗免疫相关疾病有用的组合物和方法。本发明基于在哺乳动物中刺激或抑制免疫应答的蛋白质(包括激动性和拮抗性抗体)的鉴定。免疫相关疾病可以通过抑制或增强免疫应答来治疗。增强免疫应答的分子刺激或加强对抗原的免疫应答。刺激免疫应答的分子可以治疗性用于其中免疫应答的增强会是有益的情况。或者，抑制免疫应答、减弱或降低对抗原的免疫应答的分子(例如中和性抗体)可以治疗性用于其中免疫应答的减弱会是有益的情况(例如炎症)。因而，本发明的IL-17A/F多肽及其激动剂和拮抗剂还可用于制备药品和药物，其用于免疫相关的和炎性的疾病的治疗。在一个具体的方面中，此类药品和药物包含治疗有效量的IL-17A/F多肽、其激动剂或拮抗剂及药学可接受载体。优选地，该混合物是无菌的。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种鉴定IL-17A/F多肽的激动剂或拮抗剂的方法，其包括使IL-17A/F多肽与候选分子接触，并监测由所述IL-17A/F多肽介导的生物学活性。优选地，IL-17A/F多肽是天然序列IL-17A/F多肽。在一个具体的方面中，IL-17A/F激动剂或拮抗剂是抗IL-17A/F抗体。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含与载体或赋形剂混合的IL-17A/F多肽或能结合所述多肽的激动性或拮抗性抗体的物质组合物。一方面，组合物包含治疗有效量的多肽或抗体。另一方面，在组合物包含免疫刺激性分子时，该组合物可用于：(a)增强炎性细胞浸润入有所需要的哺乳动物的组织中，(b)在有所需要的哺乳动物中刺激或增强免疫应答，(c)在有所需要的哺乳动物中增加T淋巴细胞应答抗原的增殖，(d)刺激T淋巴细胞的活性，或(e)增加血管通透性。在进一步的方面中，在组合物包含免疫抑制性分子时，该组合物可用于：(a)减弱炎性细胞浸润入有所需要的哺乳动物的组织中，(b)在有所需要的哺乳动物中抑制或降低免疫应答，(c)降低T淋巴细胞的活性，或(d)在有所需要的哺乳动物中减少T淋巴细胞应答抗原的增殖。另一方面，组合物包含别的活性成分，其可以是例如别的抗体或细胞毒剂或化疗剂。优选地，所述组合物是无菌的。
在另一个实施方案中，本发明涉及在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的IL-17A/F多肽、其激动剂、或其拮抗剂。在一个优选的方面中，免疫相关病症选自：***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、骨关节炎(osteoarthritis)、幼年型慢性关节炎(juvenile chronic arthritis)、脊椎关节病(spondyloarthropathies)、***性硬化(systemic sclerosis)、特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies)、斯耶格伦氏综合征(syndrome)、***性血管炎(systemic vasculitis)、结节病(sarcoidosis)、自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)、自身免疫性血小板减少症(autoimmune thrombocytopenia)、甲状腺炎(thyroiditis)、糖尿病(diabetesmellitus)、免疫介导的肾病(immune-mediated renal disease)、中枢和周围神经***的脱髓鞘病(demyelinating diseases of the central and peripheral nervoussystems)(诸如多发性硬化(multiple sclerosis)、特发性脱髓鞘多神经病(idiopathic demyelinating polyneuropathy)或格-巴二氏综合征(Guillain-Barrésyndrome)、及慢性炎性脱髓鞘多神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy))、肝胆病(hepatobiliary diseases)(诸如传染性、自身免疫性慢性活动性肝炎(infectious,autoimmune chronic active hepatitis)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、肉芽肿性肝炎(granulomatous hepatitis)、及硬化性胆管炎(sclerosing cholangitis))、炎性肠病(inflammatory boweldisease)、麸胶敏感性肠病(gluten-sensitive enteropathy)、及惠普尔氏病(Whipple's disease)、自身免疫或免疫介导的皮肤病(autoimmune orimmune-mediated skin diseases)(包括大疱性皮肤病(bullous skin diseases)、多形红斑(erythema multiforme)、及接触性皮炎(contact dermatitis))、银屑病(psoriasis)、变应性疾病(allergic diseases)(诸如哮喘(asthma)、变应性鼻炎(allergic rhinitis)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、食物超敏反应(foodhypersensitivity)及荨麻疹(urticaria))、肺的免疫学疾病(immunologic diseasesof the lung)(诸如嗜曙红细胞性肺炎(eosinophilic pneumonia)、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)及超敏感性肺炎(hypersensitivitypneumonitis))、移植相关疾病(transplantation associated diseases)(包括移植物排斥(graft rejection)和移植物抗宿主病(graft-versus-host-disease))。
在另一个实施方案中，本发明提供了能特异性结合任何上文或下文所述多肽的抗体。任选地，所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段或单链抗体。一方面，本发明涉及能结合IL-17A/F多肽的分离的抗体。另一方面，所述抗体模拟IL-17A/F多肽的活性(激动性抗体)，或者相反地，所述抗体抑制或中和IL-17A/F多肽的活性(拮抗性抗体)。另一方面，抗体是单克隆抗体，其优选具有非人的互补决定区(CDR)残基和人框架区(FR)残基。抗体可以是经过标记的或带标记物的，而且可以是固定化在固体支持物上的。在进一步的方面中，抗体是抗体片段、单克隆抗体、单链抗体、或抗独特型抗体。另一方面，抗体片段或单链抗体包含选自图6中所示下组氨基酸序列的Fab片段：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、及SEQ ID NO:42，其中所述Fab片段进一步包含三个重链可变区，其包含由SEQ ID NO:9-42的氨基酸残基7至16组成的CDR-H1、由SEQ ID NO:9-42的氨基酸残基30至46组成的CDR-H2、及由SEQID NO:9-42的氨基酸残基78至至少氨基酸残基96组成的CDR-H3，其中所述Fab片段能够结合IL-17A/F。另一方面，抗体片段或单链抗体包含选自图6中所示下组氨基酸序列的Fab片段：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、及SEQ ID NO:42，其中所述Fab片段进一步至少包含如下重链可变区，其包含由SEQ IDNO:9-42的氨基酸残基7至16组成的CDR-H1及由SEQ ID NO:9-42的氨基酸残基30至46组成的CDR-H2，其中所述Fab片段能够结合IL-17A/F。另一方面，抗体片段或单链抗体包含选自图6中所示下组氨基酸序列的Fab片段：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、及SEQ ID NO:42，其中所述Fab片段进一步至少包含如下重链可变区，其包含由SEQ ID NO:9-42的氨基酸残基7至16组成的CDR-H1及由SEQID NO:9-42的氨基酸残基78至至少氨基酸残基96组成的CDR-H3，其中所述Fab片段能够结合IL-17A/F。另一方面，抗体片段或单链抗体包含选自图6中所示下组氨基酸序列的Fab片段：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、及SEQ ID NO:42，其中所述Fab片段进一步至少包含如下重链可变区，其包含由SEQ IDNO:9-42的氨基酸残基30至46组成的CDR-H2及由SEQ ID NO:9-42的氨基酸残基78至至少氨基酸残基96组成的CDR-H3，其中所述Fab片段能够结合IL-17A/F。另一方面，抗体片段或单链抗体包含选自图6中所示下组氨基酸序列的Fab片段：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、及SEQ ID NO:42，其中所述Fab片段进一步包含至少一个如下重链可变区，其包含由SEQ ID NO:9-42的氨基酸残基7至16组成的CDR-H1、由SEQ ID NO:9-42的氨基酸残基30至46组成的CDR-H2、或由SEQ ID NO:9-42的氨基酸残基78至至少氨基酸残基96组成的CDR-H3，其中所述Fab片段能够结合IL-17A/F。另一方面，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、或SEQ ID NO:42的所述CDR-H1区至少包含与氨基酸序列GFTI对应的氨基酸残基7-10(本文中称为SEQ ID NO:77)，其中所述SEQ ID NO:77能够结合IL-17A/F。另一方面，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、或SEQ ID NO:42的所述CDR-H2区至少包含与氨基酸序列YADSVK对应的氨基酸残基41-46(本文中称为SEQ ID NO:78)，其中所述SEQ ID NO:78能够结合IL-17A/F。
在又一个实施方案中，本发明涉及选自下组核苷酸序列的分离的核酸分子：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:75及SEQ ID NO:76，其中所述核酸分子编码如SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、或SEQ ID NO:42所示的Fab片段，其中所述Fab片段能够结合IL-17A/F。
另一方面，本发明提供了一种能够结合IL-17A/F的分离的Fab片段，其由编码诸如上文所述氨基酸序列的核苷酸序列所编码。本文中还描述了生成其的方法，其中那些方法包括在适于表达所述Fab片段的条件下培养含有包含合适编码核酸分子的载体的宿主细胞，并自细胞培养物回收所述Fab片段。
在又一个实施方案中，本发明提供了包含与药学可接受载体混合的抗IL-17A/F抗体的组合物。一方面，组合物包含治疗有效量的抗体。优选地，组合物是无菌的。组合物可以以液体药用配制剂形式施用，可以保存所述液体药用配制剂以实现延长的贮存稳定性。或者，抗体是单克隆抗体、抗体片段、人源化抗体、或单链抗体。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含：
(a)包含IL-17A/F多肽或其激动剂、拮抗剂或能特异性结合所述多肽的抗体的物质组合物；
(b)装有所述组合物的容器；和
(c)贴于所述容器的标签，或所述容器里包括的包装插页，其提及所述IL-17A/F多肽或其激动剂或拮抗剂在治疗免疫相关疾病中的用途。组合物可以包含治疗有效量的IL-17A/F多肽或其激动剂或拮抗剂。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种在哺乳动物中诊断免疫相关疾病的方法，其包括(a)在自所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中及(b)在相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中检测编码IL-17A/F多肽的基因的表达水平，其中与对照样品相比测试样品中更高或更低的表达水平指明作为测试组织细胞来源的哺乳动物中存在免疫相关疾病。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种在哺乳动物中诊断免疫性疾病的方法，其包括(a)使抗IL-17A/F抗体与自所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品接触，并(b)在所述测试样品中检测所述抗体与IL-17A/F多肽之间复合物的形成；其中所述复合物的形成指示所述疾病存在与否。检测可以是定性的或者定量的，而且可以与在相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中监测所述复合物形成进行比较而实施。测试样品中形成的更大数量的复合物指明作为测试组织细胞来源的哺乳动物中免疫性疾病的存在与否。抗体优选携带可检测标记物。复合物形成可以通过例如光学显微镜检术、流式细胞仪、荧光测定法、或本领域已知的其它技术来监测。测试样品通常自怀疑具有免疫***缺陷或异常的个体获得。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于在样品中测定IL-17A/F多肽存在的方法，其包括将怀疑含有IL-17A/F多肽的细胞的测试样品暴露于抗IL-17A/F抗体，并测定所述抗体对所述细胞样品的结合。在一个具体的方面中，样品包含怀疑含有IL-17A/F多肽的细胞，且抗体能结合所述细胞。抗体优选是可检测标记的和/或结合至固体支持物的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种免疫相关疾病诊断试剂盒，其含有合适包装中的抗IL-17A/F抗体和载体。试剂盒优选含有说明书，其关于使用抗体来检测IL-17A/F多肽的存在。优选地，载体是药学可接受的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种诊断试剂盒，其含有合适包装中的抗IL-17A/F抗体。试剂盒优选含有说明书，其关于使用抗体来检测IL-17A/F多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种在哺乳动物中诊断免疫相关疾病的方法，其包括在自所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中检测IL-17A/F多肽的存在与否，其中所述测试样品中IL-17A/F多肽的存在与否指示所述哺乳动物中存在免疫相关疾病。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于鉴定IL-17A/F多肽的激动剂的方法，其包括：
(a)在适于诱导通常由IL-17A/F多肽诱导的细胞应答的条件下使细胞与有待筛选的测试化合物接触；并(b)测定所述细胞应答的诱导以确定测试化合物是否是有效的激动剂，其中所述细胞应答的诱导指示所述测试化合物是有效的激动剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于鉴定能够抑制IL-17A/F多肽活性的化合物的方法，其包括使候选化合物与IL-17A/F多肽接触且接触的条件和时间足以容许这两种成分相互作用，并测定IL-17A/F多肽活性是否受到抑制。在一个具体的方面中，候选化合物或IL-17A/F多肽是固定化在固体支持物上的。另一方面，非固定化的成分携带可检测的标记物。在一个优选的方面中，此方法包括如下步骤：
(a)在适于诱导通常由IL-17A/F多肽诱导的细胞应答的条件下在IL-17A/F多肽存在时使细胞与有待筛选的测试化合物接触；并(b)测定所述细胞应答的诱导以确定测试化合物是否是有效的拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于鉴定在通常表达IL-17A/F多肽的细胞中抑制该多肽表达的化合物的方法，其中该方法包括使细胞与测试化合物接触，并测定IL-17A/F多肽的表达是否受到抑制。在一个优选的方面中，该方法包括如下步骤：
(a)在适于容许IL-17A/F多肽表达的条件下使细胞与有待筛选的测试化合物接触；并(b)测定对所述多肽表达的抑制。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种用于在患有免疫相关病症的哺乳动物中治疗该病症的方法，其包括给所述哺乳动物施用编码(a)IL-17A/F多肽、(b)IL-17A/F多肽的激动剂、或(c)IL-17A/F多肽的拮抗剂的核酸分子，其中所述激动剂或拮抗剂可以是抗IL-17A/F抗体。在一个优选的实施方案中,所述哺乳动物是人。在另一个优选的实施方案中，核酸是经回体(ex vivo)基因疗法施用的。在进一步优选的实施方案中，核酸包含在载体内，更优选腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒或逆转录病毒载体。
又一方面，本发明提供了一种包含如下病毒载体的重组病毒颗粒，所述病毒载体基本上由启动子，编码(a)IL-17A/F多肽、(b)IL-17A/F多肽的激动剂多肽、或(c)IL-17A/F多肽的拮抗剂多肽的核酸，及用于多肽的细胞分泌的信号序列组成，其中所述病毒载体与病毒结构蛋白结合。优选地，信号序列来自哺乳动物，诸如来自天然IL-17A/F多肽。
在更进一步的实施方案中，本发明涉及一种包含如下核酸构建体的回体生产细胞(producer cell)，所述核酸构建体表达逆转录病毒结构蛋白而且还包含如下逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体基本上由启动子，编码(a)IL-17A/F多肽、(b)IL-17A/F多肽的激动剂多肽、或(c)IL-17A/F多肽的拮抗剂多肽的核酸，及用于多肽的细胞分泌的信号序列组成，其中所述生产细胞包装与结构蛋白结合的逆转录病毒载体以生成重组逆转录病毒颗粒。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于增强炎性细胞从血管结构浸润入哺乳动物组织中的方法，其包括给所述哺乳动物施用(a)IL-17A/F多肽或(b)IL-17A/F多肽的激动剂，其中来自哺乳动物中血管结构的炎性细胞浸润得到增强。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于减弱炎性细胞从血管结构浸润入哺乳动物组织中的方法，其包括给所述哺乳动物施用(a)IL-17A/F多肽或(b)IL-17A/F多肽的拮抗剂，其中来自哺乳动物中血管结构的炎性细胞浸润得到减弱。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种提高哺乳动物中T淋巴细胞活性的方法，其包括给所述哺乳动物施用(a)IL-17A/F多肽或(b)IL-17A/F多肽的激动剂，其中哺乳动物中T淋巴细胞的活性得到提高。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种降低哺乳动物中T淋巴细胞活性的方法，其包括给所述哺乳动物施用(a)IL-17A/F多肽或(b)IL-17A/F多肽的拮抗剂，其中哺乳动物中T淋巴细胞的活性得到降低。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种增加哺乳动物中T淋巴细胞增殖的方法，其包括给所述哺乳动物施用(a)IL-17A/F多肽或(b)IL-17A/F多肽的激动剂，其中哺乳动物中T淋巴细胞的增殖得到增加。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种减少哺乳动物中T淋巴细胞增殖的方法，其包括给所述哺乳动物施用(a)IL-17A/F多肽或(b)IL-17A/F多肽的拮抗剂，其中哺乳动物中T淋巴细胞的增殖得到减少。
在更进一步的实施方案中，本发明涉及上文所述IL-17A/F多肽、或其激动剂或拮抗剂、或抗IL-17A/F抗体在制备可用于治疗响应IL-17A/F多肽或其激动剂或拮抗剂(例如抗IL-17A/F)的疾患的药物中的用途。在一个具体的方面中，本发明涉及IL-17A/F多肽、或其激动剂或拮抗剂在用于治疗变性软骨病症(degenerative cartilaginous disorder)的方法中的用途。
在更进一步的实施方案中，本发明涉及一种在哺乳动物中治疗变性软骨病症的方法，其包括给患有所述病症的所述哺乳动物施用治疗有效量的IL-17A/F多肽、其激动剂或拮抗剂。
在更进一步的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其含有包含与药学可接受载体混合的IL-17A/F多肽、或其激动剂或拮抗剂的组合物；装有所述组合物的容器；及贴于所述容器的标签，其提及所述组合物在治疗变性软骨病症中的用途。
另一方面，本发明涉及一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的一种或多种能够抑制IL-17A/F多肽中IL-17A(SEQ ID NO:3)和IL-17F(SEQ ID No:4)两者的拮抗剂。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人受试者。
在一个实施方案中，此方法包括施用治疗有效量的IL-17A拮抗剂和IL-17F拮抗剂。
在另一个实施方案中，IL-17A拮抗剂是能特异性结合IL-17A(SEQ IDNO:3)的抗体或其片段。
在又一个实施方案中，IL-17F拮抗剂是能特异性结合IL-17F(SEQ ID NO:4)的抗体或其片段。
在进一步的实施方案中，IL-17A拮抗剂是能特异性结合IL-17A(SEQ IDNO:3)的抗体或其片段，而IL-17F拮抗剂是能特异性结合IL-17F(SEQ ID NO:4)的抗体或其片段。
在更进一步的实施方案中，拮抗剂是能特异性结合IL-17A/F多肽中IL-17A(SEQ ID NO:3)和IL-17F(SEQ ID NO:4)两者的抗体或其片段。
在一个不同的实施方案中，抗体是能识别IL-17A(SEQ ID NO:3)和IL-17F(SEQ ID NO:4)两者上存在的相同或相似表位的交叉反应性抗体。
在进一步的实施方案中，抗体是具有IL-17A和IL-17F特异性的双特异性抗体或其片段。
在所有的实施方案中，抗体可以是单克隆抗体，其可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括在所述哺乳动物中同时靶向IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物同时施用治疗有效量的两种不同抗体，其中一种抗体能特异性结合IL-17A，而另一种抗体能特异性结合IL-17F。免疫相关病症可以是***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎(infectious orautoimmune chronic active hepatitis)、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括在所述哺乳动物中同时靶向IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的交叉反应性抗体，其中所述抗体能识别IL-17A(即一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽)和IL-17F(即一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽)两者上存在的相同或相似表位。免疫相关病症可以是***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括在所述哺乳动物中同时靶向IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由两条臂组成，其中所述抗体的一条臂能识别IL-17A，而所述抗体的另一条臂能识别IL-17F。免疫相关病症可以包括***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括在所述哺乳动物中同时靶向IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由能识别IL-17A的重链和能识别IL-17F的轻链组成。免疫相关病症可以包括***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括在所述哺乳动物中同时靶向IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由能识别IL-17F的重链和能识别IL-17A的轻链组成。免疫相关病症可以包括***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
B.别的实施方案
在本发明的其它实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码IL-17A/F多肽的核苷酸序列。
一方面，分离的核酸分子包含如下核苷酸序列，其与(a)编码具有本文所公开全长氨基酸序列、本文所公开缺乏信号肽的氨基酸序列、或本文所公开全长氨基酸序列的任何其它明确确定片段的IL-17A/F多肽的DNA分子，或(b)(a)的DNA分子的互补物(complement)具有至少大约80％核酸序列同一性、或者至少大约81％核酸序列同一性、或者至少大约82％核酸序列同一性、或者至少大约83％核酸序列同一性、或者至少大约84％核酸序列同一性、或者至少大约85％核酸序列同一性、或者至少大约86％核酸序列同一性、或者至少大约87％核酸序列同一性、或者至少大约88％核酸序列同一性、或者至少大约89％核酸序列同一性、或者至少大约90％核酸序列同一性、或者至少大约91％核酸序列同一性、或者至少大约92％核酸序列同一性、或者至少大约93％核酸序列同一性、或者至少大约94％核酸序列同一性、或者至少大约95％核酸序列同一性、或者至少大约96％核酸序列同一性、或者至少大约97％核酸序列同一性、或者至少大约98％核酸序列同一性及或者至少大约99％核酸序列同一性。
在其它方面中，分离的核酸分子包含如下核苷酸序列，其与(a)包含本文所公开全长IL-17A/F多肽cDNA的编码序列、本文所公开缺乏信号肽的IL-17A/F多肽的编码序列、或本文所公开全长氨基酸序列的任何其它明确确定片段的编码序列的DNA分子，或(b)(a)的DNA分子的互补物具有至少大约80％核酸序列同一性、或者至少大约81％核酸序列同一性、或者至少大约82％核酸序列同一性、或者至少大约83％核酸序列同一性、或者至少大约84％核酸序列同一性、或者至少大约85％核酸序列同一性、或者至少大约86％核酸序列同一性、或者至少大约87％核酸序列同一性、或者至少大约88％核酸序列同一性、或者至少大约89％核酸序列同一性、或者至少大约90％核酸序列同一性、或者至少大约91％核酸序列同一性、或者至少大约92％核酸序列同一性、或者至少大约93％核酸序列同一性、或者至少大约94％核酸序列同一性、或者至少大约95％核酸序列同一性、或者至少大约96％核酸序列同一性、或者至少大约97％核酸序列同一性、或者至少大约98％核酸序列同一性及或者至少大约99％核酸序列同一性。
在进一步的方面中，本发明涉及包含如下核苷酸序列的分离的核酸分子，所述核苷酸序列与(a)编码由本文所公开ATCC保藏的任何人蛋白质cDNA所编码的相同成熟多肽的DNA分子，或(b)(a)的DNA分子的互补物具有至少大约80％核酸序列同一性、或者至少大约81％核酸序列同一性、或者至少大约82％核酸序列同一性、或者至少大约83％核酸序列同一性、或者至少大约84％核酸序列同一性、或者至少大约85％核酸序列同一性、或者至少大约86％核酸序列同一性、或者至少大约87％核酸序列同一性、或者至少大约88％核酸序列同一性、或者至少大约89％核酸序列同一性、或者至少大约90％核酸序列同一性、或者至少大约91％核酸序列同一性、或者至少大约92％核酸序列同一性、或者至少大约93％核酸序列同一性、或者至少大约94％核酸序列同一性、或者至少大约95％核酸序列同一性、或者至少大约96％核酸序列同一性、或者至少大约97％核酸序列同一性、或者至少大约98％核酸序列同一性及或者至少大约99％核酸序列同一性。
另一个实施方案涉及IL-17A/F多肽编码序列的片段或其互补物，其可以找到作为例如杂交探针(用于可任选编码包含抗IL-17A/F抗体结合位点的多肽的IL-17A/F多肽编码片段)或作为反义寡核苷酸探针的用途。此类核酸片段通常是长至少大约20个核苷酸、或者长至少大约30个核苷酸、或者长至少大约40个核苷酸、或者长至少大约50个核苷酸、或者长至少大约60个核苷酸、或者长至少大约70个核苷酸、或者长至少大约80个核苷酸、或者长至少大约90个核苷酸、或者长至少大约100个核苷酸、或者长至少大约110个核苷酸、或者长至少大约120个核苷酸、或者长至少大约130个核苷酸、或者长至少大约140个核苷酸、或者长至少大约150个核苷酸、或者长至少大约160个核苷酸、或者长至少大约170个核苷酸、或者长至少大约180个核苷酸、或者长至少大约190个核苷酸、或者长至少大约200个核苷酸、或者长至少大约250个核苷酸、或者长至少大约300个核苷酸、或者长至少大约350个核苷酸、或者长至少大约400个核苷酸、或者长至少大约450个核苷酸、或者长至少大约500个核苷酸、或者长至少大约600个核苷酸、或者长至少大约700个核苷酸、或者长至少大约800个核苷酸、或者长至少大约900个核苷酸及或者长至少大约1000个核苷酸，其中在此语境中术语“大约”意指所述核苷酸序列长度+/-10％的该所述长度。注意到可以以常规方式如下确定IL-17A/F多肽编码核苷酸序列的新片段，即使用许多公知的序列比对软件之任一种来比对IL-17A/F多肽编码核苷酸序列与其它已知核苷酸序列，并确定哪个多肽编码核苷酸序列片段是新的。本文中涵盖所有此类多肽编码核苷酸序列。还涵盖由这些核苷酸分子片段所编码的多肽片段，优选那些包含抗IL-17A/F抗体结合位点的IL-17A/F多肽片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的IL-17A/F多肽，其由任何上文所鉴定的分离的核酸序列所编码。
在某一方面中，本发明涉及包含如下氨基酸序列的分离的IL-17A/F多肽，所述氨基酸序列与具有本文所公开全长氨基酸序列、本文所公开缺乏信号肽的氨基酸序列、或本文所公开全长氨基酸序列的任何其它明确确定片段的IL-17A/F多肽具有至少大约80％氨基酸序列同一性、或者至少大约81％氨基酸序列同一性、或者至少大约82％氨基酸序列同一性、或者至少大约83％氨基酸序列同一性、或者至少大约84％氨基酸序列同一性、或者至少大约85％氨基酸序列同一性、或者至少大约86％氨基酸序列同一性、或者至少大约87％氨基酸序列同一性、或者至少大约88％氨基酸序列同一性、或者至少大约89％氨基酸序列同一性、或者至少大约90％氨基酸序列同一性、或者至少大约91％氨基酸序列同一性、或者至少大约92％氨基酸序列同一性、或者至少大约93％氨基酸序列同一性、或者至少大约94％氨基酸序列同一性、或者至少大约95％氨基酸序列同一性、或者至少大约96％氨基酸序列同一性、或者至少大约97％氨基酸序列同一性、或者至少大约98％氨基酸序列同一性及或者至少大约99％氨基酸序列同一性。
在进一步的方面中，本发明涉及包含如下氨基酸序列的分离的IL-17A/F多肽，所述氨基酸序列与本文所公开ATCC保藏的任何人蛋白质cDNA所编码的氨基酸序列具有至少大约80％氨基酸序列同一性、或者至少大约81％氨基酸序列同一性、或者至少大约82％氨基酸序列同一性、或者至少大约83％氨基酸序列同一性、或者至少大约84％氨基酸序列同一性、或者至少大约85％氨基酸序列同一性、或者至少大约86％氨基酸序列同一性、或者至少大约87％氨基酸序列同一性、或者至少大约88％氨基酸序列同一性、或者至少大约89％氨基酸序列同一性、或者至少大约90％氨基酸序列同一性、或者至少大约91％氨基酸序列同一性、或者至少大约92％氨基酸序列同一性、或者至少大约93％氨基酸序列同一性、或者至少大约94％氨基酸序列同一性、或者至少大约95％氨基酸序列同一性、或者至少大约96％氨基酸序列同一性、或者至少大约97％氨基酸序列同一性、或者至少大约98％氨基酸序列同一性及或者至少大约99％氨基酸序列同一性。
在进一步的方面中，本发明涉及包含如下氨基酸序列的分离的IL-17A/F多肽，所述氨基酸序列在与具有本文所公开全长氨基酸序列、本文所公开缺乏信号肽的氨基酸序列、或本文所公开全长氨基酸序列的任何其它明确确定片段的IL-17A/F多肽的氨基酸序列相比时得分至少大约80％正数(positive)、或者至少大约81％正数、或者至少大约82％正数、或者至少大约83％正数、或者至少大约84％正数、或者至少大约85％正数、或者至少大约86％正数、或者至少大约87％正数、或者至少大约88％正数、或者至少大约89％正数、或者至少大约90％正数、或者至少大约91％正数、或者至少大约92％正数、或者至少大约93％正数、或者至少大约94％正数、或者至少大约95％正数、或者至少大约96％正数、或者至少大约97％正数、或者至少大约98％正数及或者至少大约99％正数。
在一个具体的方面中，本发明提供了如下分离的IL-17A/F多肽，其没有N端信号序列和/或起始甲硫氨酸，并且由编码诸如上文所述的氨基酸序列的核苷酸序列所编码。本文中还描述了用于生成其的方法，其中那些方法包括在适于表达IL-17A/F多肽的条件下培养含有包含合适编码核酸分子的载体的宿主细胞，并自细胞培养物回收IL-17A/F多肽。
在又一个实施方案中，本发明涉及本文所定义天然IL-17A/F多肽的激动剂和拮抗剂。在一个具体的实施方案中，激动剂或拮抗剂是抗IL-17A/F抗体或小分子。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种鉴定IL-17A/F多肽的激动剂或拮抗剂的方法，其包括使IL-17A/F多肽与候选分子接触，并监测由所述IL-17A/F多肽介导的生物学活性。优选地，IL-17A/F多肽是天然IL-17A/F多肽。
在更进一步的实施方案中，本发明涉及包含与载体组合的本文所述IL-17A/F多肽、或IL-17A/F多肽的激动剂或拮抗剂、或抗IL-17A/F抗体的物质组合物。任选地，载体是药学可接受载体。
本发明的另一个实施方案涉及上文所述IL-17A/F多肽、或其激动剂或拮抗剂、或抗IL-17A/F抗体的用途，用于制备可用于治疗响应IL-17A/F多肽、其激动剂或拮抗剂或抗IL-17A/F抗体的疾患的药物。
在本发明的别的实施方案中，本发明提供了包含编码任何本文所述多肽的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌(E.coli)、酵母、或经杆状病毒感染的昆虫细胞。进一步提供了用于生成任何本文所述多肽的方法，其包括在适于表达期望多肽的条件下培养宿主细胞，并自细胞培养物回收期望多肽。
在其它的实施方案中，本发明提供了包含与异源多肽或氨基酸序列融合的任何本文所述多肽的嵌合分子。此类嵌合分子的例子包含与表位标签序列或免疫球蛋白Fc区融合的任何本文所述多肽。
在又一个实施方案中，本发明提供了能特异性结合任何上文或下文所述多肽的抗体。任选地，抗体是单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段或单链抗体。
在其它的实施方案中，本发明提供了对于分离基因组和cDNA核苷酸序列或作为反义探针有用的寡核苷酸探针，其中那些探针可以衍生自任何上文或下文所述核苷酸序列。
本发明涉及下述各项。
1.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的一种或多种能够抑制IL-17A/F多肽中的IL-17A(SEQ ID NO:3)和IL-17F(SEQ ID No:4)两者的拮抗剂。
2.项1的方法，其中所述哺乳动物是人受试者。
3.项2的方法，其包括给所述人受试者施用治疗有效量的IL-17A拮抗剂和IL-17F拮抗剂。
4.项3的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是特异性结合IL-17A(SEQ ID NO:3)的抗体或其片段。
5.项3的方法，其中所述IL-17F拮抗剂是特异性结合IL-17F(SEQ ID NO:4)的抗体或其片段。
6.项3的方法，其中所述IL-17A拮抗剂是特异性结合IL-17A(SEQ ID NO:3)的抗体或其片段，而所述IL-17F拮抗剂是特异性结合IL-17F(SEQ ID NO:4)的抗体或其片段。
7.项2的方法，其中所述拮抗剂是特异性结合IL-17A/F多肽中的IL-17A(SEQ ID NO:3)和IL-17F(SEQ ID NO:4)两者的抗体或其片段。
8.项7的方法，其中所述抗体是识别IL-17A(SEQ ID NO:3)和IL-17F(SEQID NO:4)两者上存在的相同或相似表位的交叉反应性抗体。
9.项7的方法，其中所述抗体是具有IL-17A和IL-17F特异性的双特异性抗体或其片段。
10.项3至9任一项方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
11.项10的方法，其中所述单克隆抗体或抗体片段是嵌合的、人源化的或人的。
12.项11的方法，其中所述免疫相关病症是***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
13.项12的方法，其中所述免疫相关病症是多发性硬化(MS)或类风湿性关节炎(RA)。
14.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括同时靶向所述哺乳动物中的IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的交叉反应性抗体或所述抗体的片段，其中所述抗体识别在IL-17A(一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽)和IL-17F(一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽)两者上存在的相同或相似表位。
15.项14的方法，其中所述免疫相关病症是***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
16.项15的方法，其中所述免疫相关病症是多发性硬化(MS)或类风湿性关节炎(RA)。
17.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括同时靶向所述哺乳动物中的IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由两条臂组成，其中所述抗体的一条臂识别IL-17A，而所述抗体的另一条臂识别IL-17F。
18.项17的方法，其中所述免疫相关病症是***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
19.项18的方法，其中所述免疫相关病症是多发性硬化(MS)或类风湿性关节炎(RA)。
20.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括同时靶向所述哺乳动物中的IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由识别IL-17A的重链和识别IL-17F的轻链组成。
21.项20的方法，其中所述免疫相关病症是***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
22.项21的方法，其中所述免疫相关病症是多发性硬化(MS)或类风湿性关节炎(RA)。
23.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括同时靶向所述哺乳动物中的IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由识别IL-17F的重链和识别IL-17A的轻链组成。
24.项23的方法，其中所述免疫相关病症是***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经***的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。
25.项24的方法，其中所述免疫相关病症是多发性硬化(MS)或类风湿性关节炎(RA)。
附图简述
图1A和1B显示了表达和分离称为IL-17A/F的新的人细胞因子的结果。如图1A和图1B中所示，单独地或组合地用编码人IL-17和IL-17F的cDNA表达载体转染人293肾细胞。如图1A和图1B中所示，利用能够识别IL-17(第1-5道)或IL-17F(第6-10道)的抗体来免疫沉淀(IP)来自经转染细胞的条件化培养基。显示了Western印迹分析，其表明在图1A的第8道中及图1B的第3道中存在二聚体IL-17A/F复合物。二聚体IL-17A/F复合物在大小上与由IL-17的一条多肽链和IL-17F的一条多肽链构成的共价异二聚体种类一致。
图2A-2C显示了重组IL-17A/F的纯化。图2A显示了来自S-Sepharose柱上IL-17A/F初始分级的蛋白质级分的银染色SDS-PAGE的结果。级分31和32含有具有与IL-17A/F一致的大约33kD表观分子量的蛋白质。图2B-1和2B-2显示了使用Vydac C4柱层析进行的进一步IL-17A/F纯化的结果。显示了在214nm和280nm处测量的所洗脱蛋白质的层析图。图2C表明来自Vydac C4纯化柱的纯化的IL-17A/F蛋白级分诱导TK-10细胞中IL-8生成。
图3A-3C显示了IL-17A/F的氨基酸序列分析的结果。图3A显示了纯化的IL-17A/F的非还原性SDS-PAGE分析。将解析后的蛋白质转移至PVDF膜，并用考马斯蓝蛋白质染剂染色。在右侧指示了分子量标志物的位置。图3B显示了分离的IL-17A/F的N端序列分析的结果(自图3A中所示条带的N端序列分析检测的氨基酸残基)。序列分析揭示两种N端序列(序列1称为SEQ IDNO:1，而序列2称为SEQ ID NO:2)。图3C显示了人IL-17的氨基酸序列(在图3C和图8两者中显示，称为SEQ ID NO:3)和人IL-17F的氨基酸序列(在图3C和图10两者中显示，称为SEQ ID NO:4)。IL-17和IL-17F的信号序列标有下划线。对所示IL-17和IL-17F多肽序列以粗体突出显示与IL-17A/F中存在的两种N端肽序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)具有同一性的序列。
图4A至4D-3显示了IL-17A/F的质谱术分析。图4A是显示具有成熟IL-17A/F异二聚体的其链间和链内二硫键的氨基酸序列(SEQ ID NO:77)的示意图。二硫键中牵涉的半胱氨酸以黑点(·)及残基编号指示。二硫键以连接键合半胱氨酸的黑线指示。形成链间二硫键的那些二硫键以粗体黑线突出显示。图4B显示了含有IL-17链和IL-17F链之间的二硫键的IL-17A/F肽片段编号1和编号2的示意图，所述IL-17链和IL-17F链预期通过胰蛋白酶消化IL-17A/F会生成[IL-17A/F二硫键片段编号1称为SEQ ID NO:7；IL-17A/F二硫键片段编号2称为SEQ ID NO:8]。这些片段内包含的氨基酸相对于各自链的起始甲硫氨酸指示并编号。还指示了预期通过质谱术会观察到的这些片段的计算近似分子量。图4C显示了IL-17A/F的基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱术(MALDI-TOF)肽图。所得的肽图含有[M+H]+＝2420.12Da和3410.60Da的峰，这与二硫键连接的肽一致。图4D-1至4D-3表明通过液相层析电喷射离子化离子阱质谱术(LC-ESI-MS)进行的IL-17A/F非还原性样品的进一步表征。离子层析图表示(从头到尾)IL-17A/F二硫键片段编号2[M+2H]2+、及IL-17A/F二硫键片段编号1[M+2H]3+的总离子层析图(total ion chromatogram)、重建离子层析图(reconstructed ion chromatogram,RIC)。观察到与两种异二聚体一致的峰，然而在预期的同二聚体肽质量处没有观察到高于背景化学噪音的峰。
图5A显示了比较由IL-17A/F、IL-17和IL-17F诱导的促炎应答的剂量应答曲线。将指定浓度的IL-17A/F、IL-17和IL-17F与TK-10细胞一起温育24小时。显示了IL-17A/F具有有力的IL-8诱导活性，且在亚nM浓度看到实质性活性。图5B显示了比较由IL-17A/F、IL-17和IL-17F进行的IL-6诱导的剂量应答曲线。将指定浓度的IL-17A/F、IL-17和IL-17F与TK-10细胞一起温育24小时。收集TK-10条件化培养基，并通过IL-6ELISA来分析。
图6显示了重链可变区中包含来自能结合IL-17A/F的Fab的CDR H1-H3的区域的氨基酸序列。显示了34个克隆的预测氨基酸序列(分别是SEQ IDNO:9至SEQ ID NO:42)中编码能够结合IL-17A/F的不同抗体重链序列的区域的比对。三个重链CDR区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)画上阴影。
图7显示了天然序列IL-17cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。
图8显示了自图7中所示SEQ ID NO:5的编码序列推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图9显示了天然序列IL-17F cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。
图10显示了自图9中所示SEQ ID NO:6的编码序列推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图11显示了自经抗CD3/抗CD28活化的人T细胞生成的IL-17A/F的IL-17A/F ELISA测量。
图12显示了IL-17A/F ELISA的特异性，其中显示了平行测定的三个级分即编号31-编号33含有几乎相等数量的IL-17A/F(IL-17A和IL-17F用作对照)。
图13显示了在用IL-6和TGFβ诱导T细胞后IL-17A和IL-17F两者生成水平的升高。
图14描绘了IL-17细胞因子家族及交叠的受体-配体特异性的复杂样式。从左到右，图14表明IL-17配体结合IL-17受体(IL-17R；本文中称为PRO1)；IL-17B配体(PRO1031)结合IL-17RH1受体(PRO5801)；IL-17E配体(PRO10272)结合IL-17RH1受体(PRO5801)；IL-17F配体(PRO20110)结合IL-17受体(IL-17R，本文中称为PRO1)及IL-17RH2受体(PRO20040)两者；IL-17C配体(PRO1122)和IL-17D配体(PRO21175)不与IL-17R、IL-17RH1或IL-17RH2受体相互作用。
图15显示了IL-17F的结构。图15的A小图显示了IL-17F单体的飘带轨迹(ribbon trace)。链是标记的。二硫键以球棍表示法(ball-and-stick representation)显示，其中硫原子染成黄色。别的半胱氨酸的大致位置以橙色球显示。插图显示了规范的结(knot)的卡通表示法(cartoon representation)。图15的B小图以红色和蓝色显示了IL-17F二聚体的飘带轨迹。二硫键与在图15中一样显示。图15的C小图显示了来自NGF-TrkA复合物的NGF的结构(Weismann等,Nature 401:184-188(1999))。无序环连接链2和3。
图16显示了IL-17F与其它IL-17家族成员的序列比对。IL-17和IL-17F之间同一性和保守序列的区域分别以绿色和黄色突出显示。在其它家族成员在这些区域也具有保守的或相同的残基时，它们被同样地着色。半胱氨酸残基以橙色指示。替换规范的结半胱氨酸的保守丝氨酸以白色字母突出显示。预期在所有IL-17中保守的二硫键以连接键合半胱氨酸的黑线指示。在IL-17F中形成链间二硫键的两个半胱氨酸用星号标示。以蓝色箭头(β-链)或圆柱体(α-螺旋)在序列上方显示IL-17F中的二级结构元件。残基编号从成熟序列的起点起。
图17显示了IL-17F(PRO20110)和IL-17分子结构的比较。依照图16中所示IL-17和IL-17F之间的序列保守性，给IL-17F分子表面的两种正交视图即“侧面”(A)和“正面”(B)着色。两种蛋白质间相同的残基表面染成绿色，同源残基染成黄色，而显著不同的残基染成白色。自图15的B小图中的视图旋转大约15°而得到(B)中视图的取向。形成空穴(cavity)的残基是标记的。图17的C小图是图17的B小图中表面的“剖面”(cut-away)视图，其显示了IL-17F任一侧的大空穴如何深深地进入二聚体的主体(body)。
图18显示了IL-17F表面和NGF上TrkA结合位点的比较。图18的A小图和B小图显示了与图17中一样取向的IL-17F分子结构。依照静电表面电势给IL-17F着色：红色，-5kT；白色，0kT；及蓝色，+5kT。空穴的位置以圆圈指示。图18的C小图显示了处于与小图(B)中的IL-17F相同取向的NGF的分子结构；TrkA的结构域5以绿色飘带显示(Weismann等,Nature 401:184-188(1999)；pdb代码1WWW)。
图19和20显示了抗IL-17A/F抗体在胶原诱导的关节炎(CIA)的小鼠模型中的功效。
优选实施方案的详述
I.定义
“天然序列IL-17A/F多肽”包括与衍生自自然界的相应IL-17A/F多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列IL-17A/F多肽可从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列IL-17A/F多肽”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定IL-17A/F多肽(例如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体。在本发明的各种实施方案中，本文中公开的天然序列IL-17A/F多肽是包含附图中所示全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。起始和终止密码子在图中以粗体和下划线显示。然而，尽管附图中公开的IL-17A/F多肽据显示以本文中指派为图中第1位氨基酸的甲硫氨酸残基开始，可以想到且有可能的是，可采用位于图中第1位氨基酸上游或下游的其它甲硫氨酸残基作为IL-17A/F多肽的起始氨基酸残基。
本说明书和/或附图中显示了本文中所公开的各种IL-17A/F多肽的“信号肽”的大致位置。然而，应当注意，信号肽的C-末端边界可以变化，但最有可能的是本文中最初鉴定的信号肽C-末端边界任一侧不超过约5个氨基酸，其中信号肽的C-末端边界可依照本领域常规用于鉴定该种类型氨基酸序列元件的标准来鉴定(例如Nielsen等,Prot.Eng.,10:1-6(1997)及von Heinje等,Nucl.Acids.Res.,14:4683-4690(1986))。此外，还认识到，在有些情况中，从分泌多肽上切除信号序列不是完全统一的，导致超过一种分泌种类。本发明涵盖这些成熟多肽，其中信号肽在本文中所鉴定的信号肽C-末端边界任一侧不超过约5个氨基酸内切除，及编码它们的多核苷酸。
“IL-17A/F多肽变体”意指与本文中所公开的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的IL-17A/F多肽序列、或本文中所公开的全长IL-17A/F多肽序列的任何其它片段具有至少约80％的氨基酸序列同一性的上文或下文所定义的活性IL-17A/F多肽。此类IL-17A/F多肽变体包括例如其中全长天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的IL-17A/F多肽。通常，IL-17A/F多肽变体与本文中所公开的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的IL-17A/F多肽序列、或本文中所公开的全长IL-17A/F多肽序列的任何其它特别限定片段具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约81％的氨基酸序列同一性，或者至少约82％的氨基酸序列同一性，或者至少约83％的氨基酸序列同一性，或者至少约84％的氨基酸序列同一性，或者至少约85％的氨基酸序列同一性，或者至少约86％的氨基酸序列同一性，或者至少约87％的氨基酸序列同一性，或者至少约88％的氨基酸序列同一性，或者至少约89％的氨基酸序列同一性，或者至少约90％的氨基酸序列同一性，或者至少约91％的氨基酸序列同一性，或者至少约92％的氨基酸序列同一性，或者至少约93％的氨基酸序列同一性，或者至少约94％的氨基酸序列同一性，或者至少约95％的氨基酸序列同一性，或者至少约96％的氨基酸序列同一性，或者至少约97％的氨基酸序列同一性，或者至少约98％的氨基酸序列同一性和或者至少约99％的氨基酸序列同一性。通常，IL-17A/F变体多肽至少长约10个氨基酸，或者至少长约20个氨基酸，或者至少长约30个氨基酸，或者至少长约40个氨基酸，或者至少长约50个氨基酸，或者至少长约60个氨基酸，或者至少长约70个氨基酸，或者至少长约80个氨基酸，或者至少长约90个氨基酸，或者至少长约100个氨基酸，或者至少长约150个氨基酸，或者至少长约200个氨基酸，或者至少长约300个氨基酸，或者更多。
关于本文中所鉴定的IL-17A/F多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定IL-17A/F多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作***，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。作为使用这种方法的％氨基酸序列同一性计算的例子，表2和3演示了如何计算指派为“比较蛋白质”的氨基酸序列相对于目的假设多肽的氨基酸序列的％氨基酸序列同一性，“比较蛋白质”代表目的多肽针对其进行比较的多肽的氨基酸序列，而“X”、“Y”和“Z”各自代表不同假设氨基酸残基。
除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。然而，％氨基酸序列同一性值也可使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul等,Methods in Enzymology266:460-480(1996))如下所述获得。大多数WU-BLAST-2检索参数设成缺省值。不设成缺省值的参数，即可调整参数设成如下值：交叠跨度＝1，交叠分数＝0.125，词阈值(T)＝11，和评分矩阵＝BLOSUM62。在采用WU-BLAST-2时，％氨基酸序列同一性值是通过将(a)通过WU-BLAST-2确定的具有衍生自天然多肽的序列的目的多肽氨基酸序列和目的比较氨基酸序列(即目的多肽与之进行比较的序列，它可以是IL-17A/F变体多肽)之间的匹配相同氨基酸残基数除以(b)目的多肽的氨基酸残基总数确定的。例如，在叙述“包含与氨基酸序列B具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”中，氨基酸序列A是目的“比较蛋白质”的比较氨基酸序列，而氨基酸序列B是目的多肽的氨基酸序列。
百分比氨基酸序列同一性也可使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov下载，或者以其它方式从NationalInstitute of Health(Bethesda,MD)获得。NCBI-BLAST2使用几项检索参数，其中所有这些检索参数设成缺省值，包括例如未遮掩＝是，链＝全部，期望发生＝10，最小低复杂性长度＝15/5，多通过e值＝0.01，多通过常数＝25，最终缺口对比的降低(dropoff)＝25，评分矩阵＝BLOSUM62。
在采用NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列对比程序NCBI-BLAST2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
“IL-17A/F变体多核苷酸”或“IL-17A/F变体核酸序列”意指编码下文所定义的活性IL-17A/F多肽且与编码本文中所公开的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、或本文中所公开的全长IL-17A/F多肽序列的任何其它片段的核苷酸序列具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子。通常，IL-17A/F变体多核苷酸与编码本文中所公开的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的全长天然序列IL-17A/F多肽序列、或本文中所公开的全长IL-17A/F多肽序列的任何其它片段的核酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性，或者至少约81％的核酸序列同一性，或者至少约82％的核酸序列同一性，或者至少约83％的核酸序列同一性，或者至少约84％的核酸序列同一性，或者至少约85％的核酸序列同一性，或者至少约86％的核酸序列同一性，或者至少约87％的核酸序列同一性，或者至少约88％的核酸序列同一性，或者至少约89％的核酸序列同一性，或者至少约90％的核酸序列同一性，或者至少约91％的核酸序列同一性，或者至少约92％的核酸序列同一性，或者至少约93％的核酸序列同一性，或者至少约94％的核酸序列同一性，或者至少约95％的核酸序列同一性，或者至少约96％的核酸序列同一性，或者至少约97％的核酸序列同一性，或者至少约98％的核酸序列同一性和或者至少约99％的核酸序列同一性。变体不涵盖天然核苷酸序列。
通常，IL-17A/F变体多核苷酸至少长约30个核苷酸，或者至少长约60个核苷酸，或者至少长约90个核苷酸，或者至少长约120个核苷酸，或者至少长约150个核苷酸，或者至少长约180个核苷酸，或者至少长约210个核苷酸，或者至少长约240个核苷酸，或者至少长约270个核苷酸，或者至少长约300个核苷酸，或者至少长约450个核苷酸，或者至少长约600个核苷酸，或者至少长约900个核苷酸，或者更多。
关于本文中所鉴定的IL-17A/F编码核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与目的IL-17A/F核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比核酸序列同一性目的的对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，为了本发明，％核酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US CopyrightOffice,Washington D.C.,20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作***，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较核酸序列的情况中，给定核酸序列C相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定核酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：
分数W/Z乘100
其中W是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以领会，若核酸序列C的长度与核酸序列D的长度不相等，则C相对于D的％核酸序列同一性将不等于D相对于C的％核酸序列同一性。作为％核酸序列同一性计算的例子，表4和5演示了如何计算指派为“比较DNA”的核酸序列相对于指派为“IL-17A/F-DNA”的核酸序列的％核酸序列同一性，其中“IL-17A/F-DNA”代表目的假设IL-17A/F编码核酸序列，“比较DNA”代表目的“IL-17A/F-DNA”核酸分子针对其进行比较的核酸分子的核苷酸序列，而“N”、“L”和“V”各自代表不同假设核苷酸。
除非另有具体说明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。然而，％核酸序列同一性值也可使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul等,Methods in Enzymology 266:460-480(1996))如下所述获得。大多数WU-BLAST-2检索参数设成缺省值。不设成缺省值的参数，即可调整参数设成如下值：交叠跨度＝1，交叠分数＝0.125，词阈值(T)＝11，和评分矩阵＝BLOSUM62。在采用WU-BLAST-2时，％核酸序列同一性值是通过将(a)通过WU-BLAST-2确定的具有衍生自天然序列IL-17A/F多肽编码核酸的序列的目的IL-17A/F多肽编码核酸分子的核酸序列和目的比较核酸分子(即目的IL-17A/F多肽编码核酸分子与之进行比较的序列，它可以是变体IL-17A/F多核苷酸)之间的匹配相同核苷酸数除以(b)目的IL-17A/F多肽编码核酸分子的核苷酸总数确定的。例如，在叙述“包含与核酸序列B具有至少80％核酸序列同一性的核酸序列A的分离的核酸分子”中，核酸序列A是目的比较核酸分子，而核酸序列B是目的IL-17A/F多肽编码核酸分子的核酸序列。
百分比核酸序列同一性也可使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov下载，或者以其它方式从National Instituteof Health(Bethesda,MD)获得。NCBI-BLAST2使用几项检索参数，其中所有检索参数设成缺省值，包括例如未遮掩＝是，链＝全部，期望发生＝10，最小低复杂性长度＝15/5，多通过e值＝0.01，多通过常数＝25，最终缺口对比的降低＝25，评分矩阵＝BLOSUM62。
在采用NCBI-BLAST2来比较核酸序列的情况中，给定核酸序列C相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定核酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：
分数W/Z乘100
其中W是由序列对比程序NCBI-BLAST2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以领会，若核酸序列C的长度与核酸序列D的长度不相等，则C相对于D的％核酸序列同一性将不等于D相对于C的％核酸序列同一性。
在其它实施方案中，IL-17A/F变体多核苷酸是编码活性IL-17A/F多肽且能够与编码本文中所公开的全长IL-17A/F多肽的核苷酸序列杂交，优选在严格杂交和洗涤条件下杂交的核酸分子。IL-17A/F变体多肽可以是那些由IL-17A/F变体多核苷酸编码的变体多肽。
“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种多肽时，意指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原或还原条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然IL-17A/F多肽天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”IL-17A/F多肽编码核酸或其它多肽编码核酸指已经鉴定且与该多肽编码核酸的天然来源中通常与之相关的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的多肽编码核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的多肽编码核酸分子因此与存在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子有区别。然而，分离的多肽编码核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所包含的多肽编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接”的。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
杂交反应的“严格性”可以容易的由本领域普通技术人员确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的另外细节和解释，参见Ausubel等，《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，1995。
“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴别：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，含750mM氯化钠,75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)于42℃采用50％甲酰胺,5x SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH 6.8),0.1％焦磷酸钠,5x Denhardt氏溶液,超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml),0.1％SDS,和10％硫酸右旋糖苷，以及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中洗涤，接着在含EDTA的0.1xSSC中于55℃进行高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以如Sambrook等，《Molecular Cloning:A LaboratoryManual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989所述鉴别，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含：20％甲酰胺,5x SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH 7.6),5x Denhardt氏溶液,10％硫酸右旋糖苷,和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1xSSC中于约37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“表位标记的”或“带表位标签的”在用于本文时指包含与“标签多肽”融合的IL-17A/F多肽的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得所述抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间(优选在约10个到约20个氨基酸残基之间)。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断、抑制、或中和本文中所公开的天然IL-17A/F多肽的生物学活性的任何分子。类似的，术语“激动剂”以最广义使用，包括模拟本文中所公开的天然IL-17A/F多肽的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子明确包括激动性或拮抗性抗体或抗体片段、天然IL-17A/F多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等。用于鉴定IL-17A/F多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使IL-17A/F多肽接触候选激动剂或拮抗剂分子并测量通常与IL-17A/F多肽有关的一种或多种生物学活性的可检测变化。
“处理”或“治疗”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理疾患或病症。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及倾向于患上病症的受试者或要预防病症的受试者。
“长期”施用指以与短期模式相反的连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长的一段时间。“间歇”施用指并非连续不间断进行的处理，本质上是循环的。
对于治疗而言，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人、家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、家兔等。优选的是，哺乳动物指人。
“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的序贯施用。
“载体”在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖例如单一抗IL-17A/F单克隆抗体(包括激动性、拮抗性和中和性抗体)、具有多表位特异性的抗IL-17A/F抗体组合物(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)、多克隆抗体、单链抗IL-17A/F抗体、及抗IL-17A/F抗体的片段(见下文)，只要它们展现出期望生物学或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。
“分离的抗体”指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种成分不会存在。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常是约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在N端具有一个可变域(VH)，接着是三个(对于α和γ链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定域(CH)。每条轻链在N端具有一个可变域(VL)，接着是其另一端的一个恒定域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定域(CH1)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。成对的一个VH和一个VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如《Basicand Clinical Immunology》，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow编，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定域氨基酸序列，可归入两种截然不同的型之一，这两种型称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。免疫球蛋白有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的次要差异，γ和α类可进一步分为多个亚类，例如人类表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”指可变域中的某些区段在抗体间序列差异很大的实情。V域介导抗原结合和决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变域跨越的110个氨基酸。相反，V区由15-30个氨基酸的、相对不变的区段(称作框架区(FR))及将框架区分开的、每个长度为9-12个氨基酸的、高度变异的较短区域(称作“高变区”)构成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-(折叠)片层构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-(折叠)片层结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，《Sequences of Proteinsof Immunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如VL中大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及VH中大约残基1-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近；Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原性位点。另外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体的优越性体现在它们可以在不受其它抗体污染的情况中合成。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过最初由Kohler等,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)及Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现所需的生物学活性(参见美国专利No.4,816,567及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体。
“完整抗体”指包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一项或多项效应器功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利No.5,641,870，实施例2；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，和一个残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由一条完整轻链及一条重链的可变域(VH)和第一恒定域(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大的F(ab')2片段，它大致相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab'片段因在CH1域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，而与Fab片段有所不同。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为成对Fab'片段生成的，在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区域还是存在于某些类型细胞上的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由非共价紧密结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。自这两个域的折叠结构发散出六个高变环(重链和轻链各3个环)，它们贡献出结合抗原的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成一条多肽链的抗体VH和VL域的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv能够形成抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Pluckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，卷:113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，页:269-315，1994；Borrebaeck 1995,见下文。
术语“双抗体”指通过在VH和VL域之间使用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见上一段)而制得的小型抗体片段，由于接头短，使得V域采取链间而非链内配对，从而生成二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL域存在于不同多肽链上。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097；WO93/11161；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。大体上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通常为两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“物种依赖性抗体”，例如哺乳动物抗人IgE抗体，指对来自第一哺乳动物物种的抗原具有强于该抗原来自第二哺乳动物物种的同系物的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人类抗原(即具有不超过约1x 10-7M，优选不超过约1x 10-8M，最优选不超过约1x 10-9M的结合亲和力(Kd))，但是对该抗原来自第二非人哺乳动物物种的同系物具有比其对人类抗原的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍的结合亲和力。物种依赖性抗体可以是上文定义的各种类型抗体，但是优选人源化抗体或人抗体。
“IL-17A/F结合寡肽”指结合，优选特异性结合本文中所描述的IL-17A/F多肽的寡肽。IL-17A/F结合寡肽可使用已知寡肽合成方法而化学合成，或者可使用重组技术来制备和纯化。IL-17A/F结合寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更多，其中能够结合，优选特异性结合本文所述IL-17A/F多肽的此类IL-17A/F结合寡肽可使用众所周知的技术无需过多实验就得以鉴定。就此而言，应注意用于对寡肽库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域众所周知的(参见例如美国专利No.5,556,762,5,750,373,4,708,871,4,833,092,5,223,409,5,403,484,5,571,689,5,663,143；PCT公开号WO84/03506和WO 84/03564；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:3998-4002(1984)；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:178-182(1985)；Geysen等,于Synthetic Peptides as Antigens,130-149(1986)；Geysen等,J.Immunol.Meth.,102:259-274(1987)；Schoofs等,J.Immunol.,140:611-616(1988)；Cwirla,S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378；Lowman,H.B.等(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等(1991)J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363；及Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.,2:668。
“IL-17A/F结合有机分子”指除了本文中所定义的寡肽或抗体之外，结合，优选特异性结合本文所述IL-17A/F多肽的有机分子。IL-17A/F结合有机分子可使用已知方法来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585)。IL-17A/F结合有机分子的大小通常是小于约2000道尔顿，或者大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中能够结合，优选特异性结合本文所述IL-17A/F多肽的此类有机分子可使用众所周知的技术无需过多实验就得以鉴定。就此而言，应注意用于从有机分子库中筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是本领域众所周知的(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO 00/39585)。
“结合”目的抗原，例如肿瘤相关多肽抗原靶物的抗体、寡肽或其它有机分子，是指以足够亲和力结合该抗原，从而使该抗体、寡肽或其它有机分子可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向表达该抗原的细胞或组织，而且不显著与其它蛋白质发生交叉反应的分子。在此类实施方案中，根据荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的测定，抗体、寡肽或其它有机分子结合“非靶物”蛋白质的程度将小于该抗体、寡肽或其它有机分子对其特定靶物蛋白质的结合的约10％。对于抗体、寡肽或其它有机分子对靶分子的结合，术语“特异结合”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或对其“特异”意味着可测量地不同于非特异相互作用的结合。特异结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来测量，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如，特异结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶物相似，例如过量的未标记靶物。在这种情况中，若经标记靶物与探针的结合受到过量未标记靶物的竞争性抑制，则指示特异结合。术语“特异结合”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或对其“特异”，在用于本文时，可由例如对靶物的Kd为至少约10-4M，或至少约10-5M，或至少约10-6M，或至少约10-7M，或至少约10-8M，或至少约10-9M，或至少约10-10M，或至少约10-11M，或至少约10-12M或更大(greater)的分子来表现。在一个实施方案中，术语“特异结合”指这样的结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。
“抑制表达IL-17A/F多肽的肿瘤细胞生长”的抗体、寡肽或其它有机分子或“生长抑制性”抗体、寡肽或其它有机分子指给表达或过表达适宜IL-17A/F多肽的癌细胞造成可测量的生长抑制的分子。与适宜对照相比，优选的生长抑制性抗IL-17A/F抗体、寡肽或其它有机分子将表达IL-17A/F的肿瘤细胞的生长抑制超过20％，优选约20％至约50％，甚至更优选超过50％(例如约50％至约100％)，所述对照通常是未用所测试抗体、寡肽或其它有机分子处理的肿瘤细胞。在一个实施方案中，可在细胞培养物中在约0.1至30μg/ml或约0.5nM至200nM的抗体浓度下测量生长抑制作用，其中生长抑制作用是在肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测定的。肿瘤细胞体内生长抑制作用可以多种方式测定。若以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗IL-17A/F抗体导致在距首次施用抗体约5天至3个月内，优选约5至30天内肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖降低，则该抗体在体内是生长抑制性的。
“诱导凋亡”的抗体、寡肽或其它有机分子，是指诱导程序性细胞死亡的分子，其中程序性细胞死亡通过膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成来测定。所述细胞通常是过表达IL-17A/F多肽的细胞。优选的是，所述细胞是肿瘤细胞，例如***、***、卵巢、胃、子宫内膜、肺、肾、结肠、膀胱细胞。有多种方法可用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；并且，可通过亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是，诱导凋亡的抗体、寡肽或其它有机分子是如下的分子，在膜联蛋白结合测定法中，它诱导膜联蛋白结合相对于未处理细胞增强约2至50倍，优选约5至50倍，最优选约10至50倍。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。所述抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对必需的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所述。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:652-656(1998)中所公开的。
“Fc受体”或“FcR”描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质域。活化受体FcγRIIA在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR，并执行效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源分离，例如血液。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在补体存在下靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体***第一组分(C1q)结合与其关联抗原结合的(适宜亚型的)抗体引发的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。
词“标记物”在用于本文时指与抗体直接或间接偶联从而产生“经标记”抗体的可检测化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
“固相”意指本发明的抗体可粘附其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利No.4,275,149中所述。
“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物(诸如IL-17A/F多肽或其抗体)的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。
“小分子”在本文中定义为分子量小于约500道尔顿。
术语“调控”指影响(例如上调、下调或以其它方式控制)信号传导途径的水平。在信号转导控制下的细胞过程包括但不限于特定基因的转录、正常细胞功能(诸如代谢、增殖、分化、粘附、凋亡和存活)、以及异常过程(诸如转化、对分化的阻断和转移)。
“有活性的”或“活性”为了本发明的目的指IL-17A/F多肽保留天然或天然存在IL-17A/F多肽的生物学和/或免疫学活性的形式，其中“生物学”活性指由天然或天然存在IL-17A/F多肽引起的，除诱导针对天然或天然存在IL-17A/F多肽所拥有的抗原性表位的抗体生成的能力外的生物学功能(或是抑制性的或是刺激性的)，而“免疫学”活性指诱导针对天然或天然存在IL-17A/F多肽所拥有的抗原性表位的抗体生成的能力。一种优选的生物学活性包括诱导NF-κB活化和刺激促炎趋化因子IL-8和IL-6生成。另一种优选的生物学活性包括刺激外周血单个核细胞或CD4+细胞。另一种优选的生物学活性包括刺激T淋巴细胞增殖。另一种优选的生物学活性包括例如自THP1细胞释放TNF-α。另一种活性包括增强关节软骨中的基质合成。或者，另一种活性包括促进关节软骨基质的分解以及抑制基质合成。另一种优选的生物学活性包括在轻度到重度阶段的炎性肠病期间或在中风期间调控白介素-17信号传导途径的水平。
“免疫学”活性仅指诱导针对天然或天然存在IL-17A/F多肽所拥有的抗原性表位的抗体生成的能力。
“变性软骨病症”指特征主要在于软骨基质遭到破坏的多种病症。别的病理包括氮氧化物(nitric oxide)生成和蛋白聚糖分解升高。此定义所涵盖的例示性病症包括例如关节炎(例如骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎)。
术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中由哺乳动物免疫***成分引起、介导、或以其它方式促成发病的疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。此术语包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷病、瘤形成等。
术语“T细胞介导的疾病”指其中T细胞直接或间接介导或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。T细胞介导的疾病可能与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，甚至与B细胞有关的效应，如果B细胞受到刺激的话，例如受到由T细胞分泌的淋巴因子的刺激。
可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T细胞介导的，包括***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、***性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经***的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。传染病包括病毒性疾病诸如AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、疱疹等，细菌感染，真菌感染，原生动物感染和寄生虫感染。
术语“有效量”指导致具体所述目的得以实现的IL-17A/F多肽和/或激动剂/拮抗剂的浓度或量。IL-17A/F多肽或其激动剂或拮抗剂的“有效量”可凭经验确定。另外，“治疗有效量”指有效实现所述治疗效果的IL-17A/F多肽和/或激动剂/拮抗剂的浓度或量。该量也可凭经验确定。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括阿霉素(adriamycin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(“Ara-C”)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、塞替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、环磷酰胺(cytoxan)、类紫杉醇(taxoids)例如帕利他塞(paclitaxel)(Taxol,Bristol-Myers SquibbOncology,Princeton,NJ)和多西他塞(doxetaxel)(Taxotere,-PoulencRorer,Antony,France)、泰索帝(taxotere)、甲氨蝶呤(methotrexate)、顺铂(cisplatin)、美法仑(melphalan)、长春碱(vinblastine)、博来霉素(bleomycin)、依托泊苷(etoposide)、异磷酰胺(ifosfamide)、丝裂霉素(mitomycin)C、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、卡铂(carboplatin)、替尼泊苷(teniposide)、道诺霉素(daunomycin)、洋红霉素(carminomycin)、氨基喋呤(aminopterin)、放线菌素D(dactinomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、埃斯波霉素(esperamicins)(参见美国专利No.4,675,187)、美法仑(melphalan)和其它相关氮芥。该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如他莫昔芬(tamoxifen)和奥那司酮(onapristone)。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是过表达本文中所鉴定的任何基因的癌细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂是显著降低处于S期的过表达所述基因的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、泰素(taxol)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、***(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecular Basis of Cancer,Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”，Murakami等，WB Saunders，Philadelphia(1995)，尤其是第13页。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠***相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板(衍生)生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；***-I和-II；***(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、或IL-17；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括白血病抑制因子(LIF)和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
表1
表2
％氨基酸序列同一性＝
(两个多肽序列之间由ALIGN-2确定为相同匹配的氨基酸残基数)÷(IL-17A/F蛋白质的氨基酸残基总数)＝
5÷15＝33.3％
表3
％氨基酸序列同一性＝
(两个多肽序列之间由ALIGN-2确定为相同匹配的氨基酸残基数)÷(IL-17A/F蛋白质的氨基酸残基总数)＝
5÷10＝50％
表4
％核酸序列同一性＝
(两个核酸序列之间由ALIGN-2确定为相同匹配的核苷酸数)÷(IL-17A/F-DNA核酸序列的核苷酸总数)＝
6÷14＝42.9％
表5
％核酸序列同一性＝
(两个核酸序列之间由ALIGN-2确定为相同匹配的核苷酸数)÷(IL-17A/F-DNA核酸序列的核苷酸总数)＝
4÷12＝33.3％
II.本发明的组合物和方法
A.全长IL-17A/F多肽
本发明提供了新鉴定并分离的核苷酸序列，其编码本申请中称为IL-17A/F多肽的多肽。具体的说，已经鉴定并分离了编码各种IL-17A/F多肽的cDNA，正如下文实施例进一步详细公开的。
B.IL-17A/F多肽变体
在本文所述全长天然序列IL-17A/F多肽之外，可制备IL-17A/F变体。IL-17A/F变体可通过将适宜的核苷酸变化引入IL-17A/F DNA和/或通过合成期望IL-17A/F多肽来制备。本领域技术人员将领会，氨基酸变化可改变IL-17A/F的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。
可在本文所述天然全长序列IL-17A/F中或在IL-17A/F的各个结构域中进行变异，例如使用例如美国专利No.5,364,934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码IL-17A/F的一个或多个密码子的替代、删除或***，其导致IL-17A/F的氨基酸序列与天然序列IL-17A/F相比的变化。任选的是，变异是通过IL-17A/F的一个或多个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。通过比较IL-17A/F的序列与同源已知蛋白质分子的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列变化的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残基可***、替代或删除而不会对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一个氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。***或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通过在序列中***进行氨基酸***、删除或替代，并对所得变体测试由全长或成熟天然序列展示的活性来确定可容许的变异。
本文提供了IL-17A/F多肽的片段。例如，在与全长天然蛋白质比较时，此类片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺少对于IL-17A/F多肽的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。
IL-17A/F片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化学合成。一种备选方法牵涉通过酶促消化产生IL-17A/F片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA并分离期望片段。还有一种合适的技术牵涉分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望多肽片段的DNA片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5'和3'引物。优选的是，IL-17A/F多肽片段与本文所公开的天然IL-17A/F多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。
在具体实施方案中，感兴趣的保守替代见表6标题“优选替代”下所示。如果此类替代导致生物学活性的变化，那么可引入表6中称为“例示替代”的更实质性变化，或者如下文关于氨基酸类别进一步所述的，并筛选产物。
表6
对IL-17A/F多肽的功能或免疫学身份的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来实现：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是，引入剩余的(非保守)位点。
变异可使用本领域知道的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、和PCR诱变。可对所克隆的DNA进行定点诱变(Carter等,Nucl.Acids Res.13:4331(1986)；Zoller等,Nucl.Acids Res.10:6487(1987))、盒式诱变(Wells等,Gene 34:315(1985))、限制性选择诱变(restriction selectionmutagenesis)(Wells等,Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317:415(1986))或其它已知技术以产生IL-17A/F变体DNA。
还可采用扫描氨基酸分析来鉴定沿着连续(contiguous)序列的一个或多个氨基酸。在优选的扫描用氨基酸中有相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这组中的优选扫描用氨基酸，因为它消除了β-碳上的侧链，而且不大可能改变变体的主链构象(Cunningham和Wells,Science 244:1081-1085(1989))。丙氨酸还因为它是最常见的氨基酸而通常成为优选的。另外，常常在隐蔽位置和暴露位置都发现它(Creighton,The Proteins,W.H.Freeman&Co.,N.Y.；Chothia,J.Mol.Biol.150:1(1976))。如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可使用等排(isoteric)氨基酸。
C.IL-17A/F的修饰
对IL-17A/F的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使IL-17A/F多肽的靶定氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与IL-17A/F的选定侧链或者N-或C-末端残基起反应。用双功能试剂进行的衍生化可用于例如使IL-17A/F与不溶于水的支持基质或表面交联，以用于抗IL-17A/F抗体的纯化方法，反之亦然。常用的交联剂包括例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚氨基酯诸如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷和诸如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙亚氨酸酯(propioimidate)等试剂。
其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。
本发明范围内所包括的对IL-17A/F多肽的另一类共价修饰包括改变多肽的天然糖基化样式。“改变天然糖基化样式”在本文中意图指删除一个或多个在天然序列IL-17A/F中发现的碳水化合物模块(moiety)(或是通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学和/或酶促手段删除糖基化)，和/或添加一个或多个在天然序列IL-17A/F中不存在的糖基化位点。另外，此短语包括天然蛋白质糖基化中的定性改变，牵涉所存在的各种碳水化合物模块的本质和比例的变化。
向IL-17A/F多肽中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列而实现。改变可通过例如向天然序列IL-17A/F中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。可任选通过DNA水平的变化来改变IL-17A/F氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码IL-17A/F多肽的DNA，从而产生会翻译成期望氨基酸的密码子。
增加IL-17A/F多肽上碳水化合物模块的数目的另一种方法是通过使糖苷与多肽化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330及Aplin和Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)。
消除IL-17A/F多肽上存在的碳水化合物模块可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代来实现。化学脱糖基化技术是本领域已知的，而且描述于例如Hakimuddin等,Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)及Edge等,Anal.Biochem.118:131(1981)。酶促切割多肽上的碳水化合物模块可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等,Meth.Enzymol.138:350(1987)所述。
对IL-17A/F的另一类共价修饰包括，以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述方式，将IL-17A/F多肽与多种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯(polyoxyalkylene)。
还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的IL-17A/F，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的IL-17A/F。
在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的IL-17A/F的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于IL-17A/F的氨基或羧基末端。此类带表位标签形式的IL-17A/F的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使IL-17A/F易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等,Mol.Cell.Biol.8:2159-2165(1988))；c-myc标签及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Evan等,Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等,ProteinEngineering 3(6):547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp等,BioTechnology 6:1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin等,Science 255:192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner等,J.Biol.Chem.266:15163-15166(1991))；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6393-6397(1990))。
在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括IL-17A/F与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘附素”)，此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合物优选包含用可溶形式(跨膜结构域删除或失活)的IL-17A/F多肽置换Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的铰链区、CH2区和CH3区，或者铰链区、CH1区、CH2区和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的制备还可参见1995年6月27日公告的美国专利No.5,428,130。
在又一个实施方案中，本发明的IL-17A/F多肽也可以以形成嵌合分子的方式来修饰，所述嵌合分子包含融合有亮氨酸拉链的IL-17A/F多肽。本领域已经记载了多种亮氨酸拉链多肽。参见例如Landschulz等,Science,240:1759(1988)；WO 94/10308；Hoppe等,FEBS Letters,344:1991(1994)；Maniatis等,Nature,341:24(1989)。认为与IL-17A/F多肽融合的亮氨酸拉链的使用可能是帮助可溶性IL-17A/F多肽在溶液中二聚化或三聚化所期望的。本领域技术人员会领会，可以将亮氨酸拉链融合在IL-17A/F分子的N末端或C末端。
D.IL-17A/F的制备
下面的描述主要涉及通过培养经包含IL-17A/F核酸的载体转化或转染的细胞来生成IL-17A/F。当然设想了可采用本领域公知的备选方法来制备IL-17A/F。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成IL-17A/F序列或其部分(参见例如Stewart等,Solid-Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA,1969；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动化合成可例如使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City,CA)依照制造商的说明书来完成。IL-17A/F的各个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成全长IL-17A/F。
1.编码IL-17A/F的DNA的分离
编码IL-17A/F的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为具有所述IL-17A/F mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人的IL-17A/F DNA可以方便地从以人组织制备的cDNA文库获得，诸如实施例中所述。IL-17A/F编码基因也可从基因组文库或通过已知的合成流程(例如自动化核酸合成)获得。
可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如IL-17A/F的抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准流程进行，诸如Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual,New York,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989所述。分离编码IL-17A/F的基因的一种备选方法是使用PCR方法学(Sambrook等,见上文；Dieffenbach等,PCR Primer:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1995)。
下文实施例描述了用于筛选cDNA文库的技术。选作探针的寡核苷酸序列应该足够长且足够明确(unambiguous)，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本领域公知的，包括使用放射性标记物，像32P标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见Sambrook et al,见上文。
在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如GenBank或其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。分子限定区域内的或跨越全长序列的序列同一性(或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上)可使用本领域知道的和本文描述的方法来测定。
具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断氨基酸序列筛选选定cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrook等,见上文所述常规引物延伸流程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间产物。
2.宿主细胞的选择和转化
将宿主细胞用本文所述用于IL-17A/F生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，可以由熟练技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见Mammalian Cell Biotechnology:aPractical Approach,M.Butler编,IRL Press,1991和Sambrook等,见上文。
真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员所知道的，例如CaCl2、CaPO4、脂质体介导的和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook等,见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw等,Gene 23:315(1983)及1989年6月29日公布的WO 89/05859所述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham和van der Eb,Virology 52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主***转染的一般情况参见美国专利No.4,399,216。进入酵母的转化通常依照Van Solingen等,J.Bact.130:946(1977)及Hsiao等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76:3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子例如Polybrene、聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的各种技术见Keown等,Methods in Enzymology 185:527-537(1990)及Mansour等,Nature 336:348-352(1988)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC53,635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组IL-17A/F发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169degP ompT kanr；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169degP ompT rbs7ilvG kanr；大肠杆菌W3110菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6；及具有1990年8月7日公告的美国专利No.4,946,783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。
在原核生物之外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是IL-17A/F编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse,Nature 290:140(1981)；EP139,383,1985年5月2日公布)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利No.4,943,529；Fleer等,Bio/Technology 9:968-975(1991))诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C,CBS683,CBS4574；Louvencourt等,J.Bacteriol.154(2):737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等,Bio/Technology 8:135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和***克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等,J.Basic Microbiol.28:265-278(1988))；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:5259-5263(1979))；许旺酵母属(Schwanniomyces)诸如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)(EP 394,538,1990年10月31日公布)；和丝状真菌诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO91/00357,1991年1月10日公布)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)(Balance等,Biochem.Biophys.Res.Commun.112:284-289(1983)；Tilburn等,Gene 26:205-221(1983)；Yelton等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes,EMBO J.4:475-479(1985))。甲基营养型酵母(Methylotropic yeast)适于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的、选自以下属的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属(Rhodotorula)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可参见C.Anthony,TheBiochemistry of Methylotrophs,269(1982)。
适用于表达糖基化IL-17A/F的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9或夜蛾High 5细胞，以及植物细胞。有用哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更具体的例子包括经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)。认为适宜宿主细胞的选择在本领域技术范围内。
3.复制型载体的选择和使用
可以将编码IL-17A/F的核酸(例如cDNA或基因组DNA)***复制型载体用于克隆(DNA扩增)或表达。多种载体是公众可得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种规程将适宜的核酸序列***载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA***适宜的限制性内切核酸酶位点中。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。
IL-17A/F不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽来生产，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是***载体中的IL-17A/F编码DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导、α因子前导(包括糖酵母和克鲁维酵母的α-因子前导，后者见美国专利No.5,010,182)、或酸性磷酸酶前导、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导(1990年4月4日公布的EP 362,179)、或1990年11月15日公布的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导。
表达和克隆载体都包含使能够载体在一种或多种选定宿主细胞中复制的核酸序列。众所周知多种细菌、酵母、和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达和克隆载体通常会包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予针对抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的选择标志的一个例子是能够鉴定有能力摄取IL-17A/F编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和繁殖如Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980)所述。适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等,Nature 282:39(1979)；Kingsman等,Gene 7:141(1979)；Tschemper等,Gene 10:157(1980))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志(Jones,Genetics 85:12(1977))。
表达和克隆载体通常包含与IL-17A/F编码核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子***(Chang等,Nature 275:615(1978)；Goeddel等,Nature 281:544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子***(Goeddel,Nucleic acids Res.8:4057(1980)；EP 36,776)、和杂合启动子诸如tac启动子(deBoer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983))。用于细菌***的启动子还会包含与编码IL-17A/F的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等,J.Adv.EnzymeReg.7:149(1968)；Holland,Biochemistry 17:4900(1978))的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶。
作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 73,657。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录IL-17A/F受到例如由病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2,211,504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿病毒40(SV40)基因组、由异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞***相容的话。
可通过在载体中***增强子序列来提高高等真核细胞对编码IL-17A/F的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp，作用于启动子以增加转录。现在知道来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中，位于IL-17A/F编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还会包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码IL-17A/F的mRNA的非翻译部分中转录成多腺苷酸化片段的核苷酸区段。
适合在改动后在重组脊椎动物细胞培养物中合成IL-17A/F的其它方法、载体和宿主细胞见Gething等,Nature 293:620-625(1981)；Mantei等,Nature281:40-46(1979)；EP 117,060；及EP 117,058。
4.检测基因扩增/表达
基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列，使用经适当标记的探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链体结合到表面上，从而在双链体在表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。
或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，诸如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可用于免疫组化染色和/或样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列IL-17A/F多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与IL-17A/F DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列来制备抗体。
5.多肽的纯化
可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的IL-17A/F。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促裂解使其从膜中释放出来。IL-17A/F表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。
可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化IL-17A/F。下面的流程是合适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A Sepharose柱以清除污染物诸如IgG；及结合带表位标签形式的IL-17A/F的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher,Methods inEnzymology,182(1990)；Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag,New York(1982)。所选择的纯化步骤将取决于例如所用生成过程的性质和所产生的具体IL-17A/F。
E.IL-17A/F的用途
编码IL-17A/F的核苷酸序列(或其互补序列)在分子生物学领域具有多种应用，包括用作杂交探针，用于染色体和基因作图，及用于生成反义RNA和DNA。IL-17A/F核酸还可用于通过本文所述重组技术来制备IL-17A/F多肽。
全长天然序列IL-17A/F基因或其部分可作为杂交探针用于cDNA文库以分离全长IL-17A/F cDNA或分离与本文所公开的天然IL-17A/F序列具有期望序列同一性的其它cDNA(例如那些编码IL-17A/F的天然存在变体或来自其它物种的IL-17A/F的cDNA)。任选的是，探针的长度为约20个到约50个碱基。杂交探针可衍生自全长天然核苷酸序列的至少部分新的区域，其中那些区域不需要过多实验就可以确定，或者来自包含天然序列IL-17A/F的启动子、增强子元件和内含子的基因组序列。举例来说，筛选方法可包括使用已知DNA序列分离IL-17A/F基因的编码区以合成约40个碱基的选定探针。杂交探针可用多种标记物标记，包括放射性核苷酸，诸如32P或35S，或酶标记物，诸如经由亲合素/生物素偶联***与探针偶联的碱性磷酸酶。具有与本发明IL-17A/F基因的序列互补的序列的经标记探针可用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA文库以确定探针与此类文库的哪些成员杂交。下面的实施例更详细地描述了杂交技术。
使用本文所公开的方法，本申请中公开的任何EST序列可类似地用作探针。
IL-17A/F核酸的其它有用片段包括反义或有义寡核苷酸，包括能够结合靶IL-17A/F mRNA(有义)或IL-17A/F DNA(反义)序列的单链核酸序列(或是RNA或是DNA)。依照本发明，反义或有义寡核苷酸包含IL-17A/F DNA编码区的片段。此类片段通常包含至少约14个核苷酸，优选约14至30个核苷酸。根据编码给定蛋白质的cDNA序列来衍生反义或有义寡核苷酸的能力描述于例如Stein和Cohen,Cancer Res.48:2659,1988及van der Krol等,BioTechniques6:958,1988。
反义或有义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，其通过多种手段之一阻断靶序列的转录或翻译，所述手段包括双链体的降解增强、转录或翻译的过早终止、或其它手段。反义寡核苷酸因此可用于阻断IL-17A/F蛋白质的表达。反义或有义寡核苷酸还包括具有经过修饰的糖-磷酸二酯骨架(或其它糖连接(linkage)，诸如WO 91/06629中所述)的寡核苷酸，且其中此类糖连接对内源核酸酶有抗性。具有抗性糖连接的此类寡核苷酸在体内是稳定的(即能够抵抗酶促降解)，但保留了能够结合靶核苷酸序列的序列特异性。
有义或反义寡核苷酸的其它例子包括那些与有机模块，诸如WO90/10048中描述的那些，及提高寡核苷酸对靶核酸序列的亲和力的其它模块，诸如聚-(L-赖氨酸)共价连接的寡核苷酸。而且，嵌入剂，诸如玫瑰树碱(ellipticine)和烷化剂或金属络合物可附着于有义或反义寡核苷酸以调整反义或有义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
可通过任何基因转移方法将反义或有义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞，包括例如CaPO4介导的DNA转染、电穿孔、或通过使用基因转移载体诸如埃巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)。在一种优选的流程中，将反义或有义寡核苷酸***合适的逆转录病毒载体中。使包含靶核酸序列的细胞在体内或回体接触重组逆转录病毒载体。合适的逆转录病毒载体包括但不限于那些衍生自鼠逆转录病毒M-MuLV，N2(衍生自M-MuLV的逆转录病毒)，或命名为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(见WO 90/13641)的那些。
还可通过与配体结合分子形成偶联物将有义或反义寡核苷酸导入包含靶核苷酸序列的细胞中，如WO 91/04753中所述。合适的配体结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子、或结合细胞表面受体的其它配体。优选的是，与配体结合分子的偶联基本上不干扰所述配体结合分子结合其相应分子或受体的能力，或者基本上不阻断有义或反义寡核苷酸或其偶联物型式进入细胞。
或者，可通过形成寡核苷酸-脂质复合物将有义或反义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞，如WO 90/10448中所述。有义或反义寡核苷酸-脂质复合物优选在细胞内由内源脂肪酶解离。
反义或有义RNA或DNA分子一般至少长约5个碱基、长约10个碱基、长约15个碱基、长约20个碱基、长约25个碱基、长约30个碱基、长约35个碱基、长约40个碱基、长约45个碱基、长约50个碱基、长约55个碱基、长约60个碱基、长约65个碱基、长约70个碱基、长约75个碱基、长约80个碱基、长约85个碱基、长约90个碱基、长约95个碱基、长约100个碱基、或更长。
还可将探针用于PCR技术以产生用于鉴定密切相关的IL-17A/F编码序列的序列池。
编码IL-17A/F的核苷酸序列还可用于构建杂交探针，用于给编码该IL-17A/F的基因作图和用于给患遗传病症的个体作遗传分析。可使用已知技术将本文提供的核苷酸序列定位于染色体和染色体特定区域，诸如原位杂交、针对已知染色体标志的连锁分析、和筛选文库的杂交。
当IL-17A/F的编码序列编码结合另一种蛋白质的蛋白质时(例如当所述蛋白质是受体时)，可以在测定法中使用所述蛋白质以鉴定参与结合相互作用的其它蛋白质或分子。通过此类方法，可鉴定受体/配体结合相互作用的抑制物。参与此类结合相互作用的蛋白质还可用于筛选结合相互作用的肽或小分子抑制物或激动剂。同样，受体蛋白质可用于分离相关配体。可设计筛选测定法以发现模拟天然IL-17A/F或IL-17A/F受体的生物学活性的领先化合物(lead compound)。此类筛选测定法可包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。所涵盖的小分子包括合成的有机或无机化合物。可以多种形式进行测定法，包括本领域已经很好表征的蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。
编码IL-17A/F的核酸或其修饰形式还可用于生成转基因动物或“敲除”动物，它们继而可用于开发和筛选治疗上有用的试剂。转基因动物(例如小鼠或大鼠)指具有包含转基因的细胞的动物，其中将转基因导入动物或产前的动物前体(ancestor)，例如胚胎阶段。转基因指整合到细胞的基因组中的DNA，所述细胞发育成转基因动物的。在一个实施方案中，可依照已建立的技术用编码IL-17A/F的cDNA克隆编码IL-17A/F的基因组DNA，并将该基因组序列用于生成转基因动物，所述转基因动物包含表达编码IL-17A/F的DNA的细胞。用于生成转基因动物，特别是诸如小鼠或大鼠等动物的方法在本领域已经是常规的，描述于例如美国专利No.4,736,866和4,870,009。通常，用组织特异性增强子使IL-17A/F转基因的掺入靶向特定细胞。包含在胚胎阶段导入动物种系的编码IL-17A/F的转基因拷贝的转基因动物可用于检验编码IL-17A/F的DNA表达提高的效果。此类动物可作为测试动物用于测试认为针对例如与其过表达有关的病理状况赋予保护的试剂。依照本发明的这个方面，用制剂处理动物，与携带转基因的未处理动物相比病理状况的发病率下降将表明对该病理状况的潜在治疗性干预。
或者，IL-17A/F的非人同源物可用于构建IL-17A/F“敲除”动物，它由于编码IL-17A/F的内源基因和导入该动物胚胎干细胞中的改变的编码IL-17A/F的基因组DNA之间同源重组而具有缺陷的或改变的编码IL-17A/F的基因。例如，编码IL-17A/F的cDNA可依照已建立的技术用于克隆编码IL-17A/F的基因组DNA。可以将编码IL-17A/F的基因组DNA的一部分删除或用另一基因替换，所述另一基因诸如编码可用于监测整合的选择标志的基因。通常，载体中包含数千碱基未改变的侧翼DNA(5'和3'末端都有)(关于同源重组载体的描述参见例如Thomas和Capecchi,Cell 51:503(1987))。将载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并选择其中所导入DNA与内源DNA发生同源重组的细胞(参见例如Li等,Cell 69:915(1992))。然后将所选择的细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如Bradley,于Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A PracticalApproach,E.J.Robertson编,IRL,Oxford,1987,pp.113-152)。然后可将嵌合胚植入合适的假孕雌性***动物中，并使胚足月产生“敲除”动物。在其生殖细胞中包含同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中动物的所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除动物可以表征例如由于缺乏IL-17A/F多肽而具有抵御某些病理状况的能力和形成了病理状况。
编码IL-17A/F多肽的核酸还可用于基因疗法。在基因疗法应用中，将基因导入细胞中以实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如用于替换缺陷基因。“基因疗法”包括常规基因疗法和施用基因治疗剂两种，前者通过一次处理获得持续的效果，后者涉及一次或反复施用治疗上有效的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于在体内阻断某些基因的表达。已经显示可以将短反义寡核苷酸输入它们在其中起抑制剂作用的细胞中，尽管由于细胞膜对它们的摄取有限，因而它们的胞内浓度低(Zamecnik等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4143-4146(1986))。可以修饰寡核苷酸以提高它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。
有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移到体外的培养细胞中，还是体内的预期宿主的细胞中而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。目前优选的体内基因转移技术包括使用病毒(通常是逆转录病毒)载体的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等,Trends in Biotechnology 11:205-210(1993))。在有些情况中，期望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸来源，所述试剂诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，与胞吞相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中经历内化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位并增强胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞的技术描述于例如Wu等,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)；及Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3410-3414(1990)。关于基因标记和基因疗法方案的综述见Anderson等,Science 256:808-813(1992)。
也可以采用本文所述IL-17A/F多肽作为分子量标志物用于蛋白质电泳目的，而且可以使用分离的核酸序列来重组表达这些标志物。
本文所述编码IL-17A/F多肽的核酸分子或其片段可用于染色体鉴定。在这点上，鉴定新染色体标志的需求在增加，因为根据实际的序列数据，现在只有相对较少的染色体标记试剂可用。本发明的每种IL-17A/F核酸分子都可用作染色体标志。
本发明的IL-17A/F多肽和核酸分子还可在诊断上用于组织分型，其中本发明的IL-17A/F多肽可能在一种组织中与另一种组织相比，优选在患病组织中与相同组织类型的正常组织相比差异表达。IL-17A/F核酸分子可用于生成探针，用于PCR、Northern分析、Southern分析、和Western分析。
本文所述IL-17A/F多肽也可用作为治疗剂。可根据已知方法配制本发明的IL-17A/F多肽来制备药学上有用的组合物，由此本文中的IL-17A/F产物与药学上可接受的载体媒介组合成混合物。通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980))混合，以冻干配制剂或水溶液形式制备治疗性配制剂供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度对于接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
要用于体内施药的配制剂必须是无菌的。这可通过在冻干及重建前后经无菌过滤膜过滤而容易地实现。
本文中的治疗性组合物通常置于具有无菌存取口的容器中，例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶。
施药途径与已知方法相一致，例如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内或病变内途径注射或输注，表面施用，或通过持续释放***。
本发明药物组合物的剂量和期望药物浓度可随所涵盖的特定用途而改变。合适施药剂量或途径的确定完全在普通内科医师的技术范围内。动物实验为确定人治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可根据Mordenti,J.和Chappell,W."The use of interspecies scaling in toxicokinetics"于Toxicokineticsand New Drug Development,Yacobi等编,Pergamon Press,New York,1989,pp.42-96中所列原则进行有效剂量的种间缩放。
当采用IL-17A/F多肽或其激动剂或拮抗剂的体内施用时，取决于施药途径，正常的剂量可在每天约10ng/kg-高达100mg/kg哺乳动物体重或更多的范围内变化，优选约1μg/kg/天-10mg/kg/天。关于具体递送剂量和方法的指导提供于文献中；见例如美国专利No.4,657,760；5,206,344或5,225,212。可以预料不同的配制剂对于不同的治疗用化合物和不同的病症是有效的，即例如靶向一种器官或组织的施药可能必需以一种不同的方式递送至另一器官或组织。
在期望以具有适合于治疗任何需要施用IL-17A/F多肽的疾病或病症的释放特性的配制剂进行IL-17A/F多肽的持续释放施药的情况中，可考虑IL-17A/F多肽的微胶囊化。已成功使用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2和MN rgp120进行了用于持续释放的重组蛋白微囊化。Johnson等,Nat.Med.,2:795-799(1996)；Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993)；Hora等,Bio/Technology,8:755-758(1990)；Cleland,"Design andProduction of Single Immunization Vaccines Using Polylactide PolyglycolideMicrosphere Systems",于Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach,Powell和Newman编,Plenum Press:New York,1995,pp.439-462；WO97/03692,WO 96/40072,WO 96/07399；及美国专利No.5,654,010。
由于其生物相容性和广泛的生物可降解特性，使用乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)开发这些蛋白质的持续释放配制剂。PLGA、乳酸和乙醇酸的降解产物在人体中可快速清除。此外，取决于其分子量和组成，可将所述聚合物的降解性调整成数月到数年。Lewis,"Controlled release of bioactive agents fromlactide/glycolide polymer",于Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems,M.Chasin和R.Langer编,Marcel Dekker:New York,1990,pp.1-41。
本发明涵盖筛选化合物以鉴定那些模拟IL-17A/F多肽(激动剂)或阻止IL-17A/F多肽产生效果(拮抗剂)的化合物的方法。用于拮抗剂药物候选物的筛选测定法设计成鉴定与本文鉴定的基因所编码的IL-17A/F多肽结合或复合，或者以其它方式干扰所编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物。此类筛选测定法可包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使得它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。
可以多种形式进行测定法，包括本领域已经完善表征的蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。
用于拮抗剂的所有测定法的共同之处在于它们需要使药物候选物接触本文鉴定的核酸所编码的IL-17A/F多肽，其条件和时间足以使这两种组分相互作用。
在结合测定法中，相互作用指结合，所形成的复合物可在反应混合物中分离或检测。在一个具体的实施方案中，将本文鉴定的基因所编码的IL-17A/F多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定化在固相上，例如微量滴定板上。非共价附着通常通过用IL-17A/F多肽溶液包被固相表面并干燥来实现。或者，对待固定化的IL-17A/F多肽特异的固定化抗体例如单克隆抗体可用于将它锚定到固相表面上。测定法如下进行，将可以用可检测标记物标记的非固定化组分添加至固定化组分例如包含所锚定组分的经包被表面。在反应完成后，例如通过清洗清除未反应的组分，并检测锚定到固相表面上的复合物。若最初的非固定化组分携带可检测标记物，检测出固定化到表面上的标记物表明发生了复合作用。若最初的非固定化组分不携带标记物，可例如通过使用特异性结合固定化复合物的经标记抗体来检测复合作用。
如果候选化合物与本文鉴定的基因所编码的特定IL-17A/F多肽相互作用但不结合，那么它与该多肽的相互作用可通过用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的公知方法来测定。此类测定法包括传统方法，诸如例如交联、免疫共沉淀、和经由梯度或层析柱的共纯化。另外，可以如Chevray和Nathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5789-5793(1991)所公开的，使用Fields及其同事(Fields和Song,Nature(London)340:245-246(1989)；Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582(1991))描述的基于酵母的遗传***来监测蛋白质-蛋白质相互作用。许多转录激活物，诸如酵母GAL4，由两个物理上离散的模块结构域组成，一个起DNA结合结构域的作用，另一个起转录激活结构域的功能。上述出版物中描述的酵母表达***(通称为“双杂交***”)利用了此特性，采用两种杂合蛋白质，在一个中将靶蛋白质与GAL4的DNA结合结构域融合，而在另一个中将候选激活蛋白质与激活结构域融合。GAL1-lacZ报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于GAL4活性经由蛋白质-蛋白质相互作用的重建。用β-半乳糖苷酶的显色底物检测包含相互作用多肽的菌落。使用双杂交技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)可从Clontech购买。此***还可延伸到对参与特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域的作图以及指出对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
干扰本文鉴定的基因所编码的IL-17A/F多肽与其它胞内或胞外组分相互作用的化合物可如下测试：通常在足以使两种产物相互作用和结合的条件和时间下制备包含基因产物及胞内或胞外组分的反应混合物。为了测试候选化合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化合物时进行反应。另外，可以向第三份反应混合物中加入安慰剂，作为阳性对照。如上所述监测混合物中存在的IL-17A/F多肽和胞内或胞外组分之间的结合(复合物形成)。对照反应中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成复合物表明，测试化合物干扰IL-17A/F多肽与其反应配偶体的相互作用。
为了测定拮抗剂，可将IL-17A/F多肽与要筛选特定活性的化合物一起添加至细胞，在存在IL-17A/F多肽时该化合物抑制目的活性的能力表明，该化合物是IL-17A/F多肽的拮抗剂。或者，可如下检测拮抗剂，将IL-17A/F多肽和潜在的拮抗剂与膜结合的IL-17A/F多肽受体或重组受体在适于竞争性抑制测定法的条件下组合。IL-17A/F多肽可进行标记，诸如通过放射性，使得与受体结合的IL-17A/F多肽分子的数目可用于测定潜在拮抗剂的效力。编码受体的基因可通过本领域技术人员知道的多种方法来鉴定，例如配体淘选和FACS分选。Coligan等,Current Protocols in Immun.1(2):第5章(1991)。优选的是，采用表达克隆，其中从对IL-17A/F多肽有响应的细胞制备多腺苷酸化RNA，将从此RNA构建的cDNA文库分成几个集合，并用于转染COS细胞或对IL-17A/F多肽没有响应的其它细胞。使在载玻片上培养的转染细胞暴露于经过标记的IL-17A/F多肽。可通过多种手段来标记IL-17A/F多肽，包括碘化或包含位点特异性蛋白质激酶的识别位点。固定和温育后，将载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性集合，制备子集，并用相互作用的子集进行再次转染和再次筛选过程，最后产生编码推定受体的单个克隆。
作为受体鉴定的备选方法，可使经标记的IL-17A/F多肽与表达受体分子的细胞膜或提取制备物经光亲和性相连接。通过PAGE解析交联物质并对X-射线胶片曝光。可切下包含受体的标记复合物，解离成肽片段，并进行蛋白质微量测序。从微量测序获得的氨基酸序列可用于设计一组简并寡核苷酸探针，用于筛选cDNA文库以鉴定编码推定受体的基因。
在用于拮抗剂的另一种测定法中，在存在候选化合物时将表达受体的哺乳动物细胞或膜制备物与经过标记的IL-17A/F多肽一起温育。然后测量所述化合物增强或阻断此相互作用的能力。
潜在拮抗剂的更具体的例子包括结合免疫球蛋白与IL-17A/F多肽的融合物的多肽，特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段，单链抗体，抗独特型抗体，和嵌合的或人源化型式的此类抗体或片段，以及人抗体和抗体片段。或者，潜在的拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如识别受体但没有效应，由此竞争性抑制IL-17A/F多肽的作用的突变形式IL-17A/F多肽。
另一种潜在的IL-17A/F多肽拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建物，其中例如反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交并防止蛋白质翻译来起直接阻断mRNA翻译的作用。反义技术可用于通过与反义DNA或RNA形成三股螺旋来控制基因表达，这两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，将编码本文成熟IL-17A/F多肽的多核苷酸序列的5'编码部分用于设计长度为约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。将DNA寡核苷酸设计成与基因中参与转录的区互补(三股螺旋-参见Lee等,Nucl.AcidsRes.6:3073(1979)；Cooney等,Science 241:456(1988)；Dervan等,Science251:1360(1991))，由此防止转录和产生IL-17A/F多肽。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并阻断mRNA分子翻译成为IL-17A/F多肽(反义-Okano,1991,Neurochem.56:560；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors ofGene Expression,CRC Press:Boca Raton,FL,1988)。上述寡核苷酸还可递送至细胞，使得反义RNA或DNA可在体内表达以抑制IL-17A/F多肽的生成。在使用反义DNA时，优选衍生自靶基因核苷酸序列的翻译起始位点(例如约-10到+10位置之间)的寡脱氧核糖核苷酸。
潜在的拮抗剂包括结合IL-17A/F多肽的活性位点、受体结合位点、或生长因子或其它相关结合位点，由此阻断IL-17A/F多肽的正常生物学活性的小分子。小分子的例子包括但不限于小肽或肽样分子，优选可溶性肽，和合成的非肽基有机或无机化合物。
核酶是能够催化对RNA的特异性切割的酶性RNA分子。核酶通过与互补靶RNA发生序列特异性杂交，随后进行内切核酸水解(endonucleolytic)切割来起作用。可通过已知技术来鉴定潜在RNA靶物内的特定核酶切割位点。更多细节参见例如Rossi,Current Biology 4:469-471(1994)及PCT公开号WO97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制转录的三股螺旋形成中的核酸分子应当是单链的且由脱氧核苷酸构成。设计这些寡核苷酸的碱基组成，使得它经由Hoogsteen碱基配对原则促进三股螺旋形成，这通常需要在双链体的一条链上有大段嘌呤或嘧啶。更多细节参见例如PCT公开号WO 97/33551，见上文。
这些小分子可通过上文讨论的一种或多种筛选测定法和/或通过本领域技术人员公知的任何其它筛选技术来鉴定。
本文所公开的分子的诊断和治疗用途也可以基于下文公开和描述的积极功能测定法命中结果(positive functional assay hits)。
F.组织分布
表达IL-17A/F的组织的位置可通过测定各种人组织中的mRNA表达来鉴定。此类基因的定位提供了关于哪些组织最有可能受刺激和抑制IL-17A/F多肽活性影响的信息。基因在特定组织中的定位还为下文讨论的活性阻断测定法提供了样品组织。
如前所述，各种组织中的基因表达可根据本文中提供的序列，使用恰当标记的探针，通过常规Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)、或原位杂交来测量。或者，可采用识别特定双链体，包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体的抗体。
或者，多种组织中的基因表达可通过免疫学方法来测量，诸如组织切片的免疫组化染色及细胞培养物或体液的测定法，以直接对基因产物的表达定量。可用于免疫组化染色和/或样品液测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列IL-17A/F多肽或针对基于编码IL-17A/F多肽的DNA序列的合成肽或针对与编码IL-17A/F多肽的DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列制备抗体。下文提供了用于生成抗体的通用技术及Northern印迹和原位杂交的专用方案。
G.抗体结合研究
IL-17A/F多肽的活性可进一步通过抗体结合研究来验证，其中分别测试抗IL-17A/F抗体抑制IL-17A/F多肽对组织细胞的作用的能力。例示性抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的、和异源偶联的抗体，下文会描述它们的制备。
抗体结合研究可以以任何已知测定法来实施，诸如竞争性结合测定法、直接和间接三明治式测定法、及免疫沉淀测定法。Zola，《MonoclonalAntibodies:A Manual of Techniques》，第147-158页，CRC Press,Inc.，1987。
竞争性结合测定法依赖于经标记标准品与测试样品分析物竞争与有限量的抗体结合的能力。测试样品中靶蛋白质的量与变成与抗体结合的标准品的量成反比。为了便于测定变成结合的标准品的量，优选在竞争之前或之后使抗体不溶解，使得与抗体结合的标准品和分析物可方便地与仍然未结合的标准品和分析物分开。
三明治式测定法牵涉使用两种抗体，每一种都能够结合待检测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在三明治式测定法中，使测试样品分析物受到固定化在固相支持物上的第一抗体的结合，此后使第二抗体结合分析物，如此形成不溶性三元复合物。参见例如美国专利No.4,376,110。第二抗体自身可以是用可检测模块标记的(直接三明治式测定法)，或者可以使用用可检测模块标记的抗免疫球蛋白抗体来测量(间接三明治式测定法)。例如，三明治式测定法的一种类型是ELISA测定法，在这种情况中可检测模块是酶。
对于免疫组化，组织样品可以是新鲜的或冷冻的，或者可以是例如在石蜡中包埋的且用防腐剂诸如***固定的。
H.基于细胞的测定法
免疫相关疾病的动物模型和基于细胞的测定法可用于进一步理解本文中所鉴定的基因和多肽与免疫相关疾病的形成和发病机理之间的关系。
在一种不同的方法中，将已知牵涉特定免疫相关疾病的细胞类型的细胞用本文所述cDNA转染，并分析这些cDNA刺激或抑制免疫功能的能力。合适细胞可用期望基因转染，并监测免疫功能活性。然后此类转染细胞系可用于测试多克隆或单克隆抗体或者抗体组合物抑制或刺激免疫功能，例如调控T细胞增殖或炎性细胞浸润的能力。用本文中所鉴定的基因的编码序列转染的细胞可进一步用于鉴定用于治疗免疫相关疾病的药物候选物。
另外，衍生自转基因动物(如下文所述)的原代培养物可用于本文中的基于细胞的测定法，尽管优选稳定的细胞系。从转基因动物衍生连续细胞系的技术是本领域众所周知的(参见例如Small等,Mol.Cell.Biol.,5:642-648(1985))。
一种合适的基于细胞的测定法是混合淋巴细胞反应(MLR)。《CurrentProtocols in Immunology》，单元3.12，J E Coligan,A M Kruisbeek,D H Marglies,E M Shevach,W Strober编，National Institutes of Health，John Wiley&Sons,Inc.。在此测定法中，测定测试化合物刺激或抑制激活的T细胞增殖的能力。将响应者T细胞的悬浮液与同种异基因刺激物细胞一起培养，并通过氚化胸苷摄取测量T细胞增殖。此测定法是T细胞反应性的通用测量方法。由于大多数T细胞在激活时响应并生成IL-2，因此此测定法中响应度的差异部分反映了响应性细胞的IL-2生成的差异。MLR结果可通过标准淋巴因子(IL-2)检测测定法来验证。《Current Protocols in Immunology》，见上文，3.15，6.3。
MLR测定法中的增殖性T细胞响应可能是由于所测定分子的直接促有丝***特性或外部抗原诱导的激活。还可以通过共刺激测定法来获得对IL-17A/F多肽的T细胞刺激活性的验证。T细胞激活要求经由T细胞受体(TCR)介导的抗原特异信号和经由第二配体结合相互作用例如B7(CD80,CD86)/CD28结合相互作用介导的共刺激信号。CD28交联提高激活的T细胞的淋巴因子分泌。T细胞激活具有正负两种控制，经由具有积极或消极作用的配体的结合来实现。CD28和CTLA-4是Ig超家族中结合B7的相关糖蛋白。结合B7的CD28对T细胞激活具有积极的共刺激效果；相反，结合B7的CTLA-4具有消极的T细胞解激活效果。Chambers,C.A.和Allison,J.P.,Curr.Opin.Immunol.,9:396(1997)；Schwartz,R.H.,Cell,71:1065(1992)；Linsey,P.S.和Ledbetter,J.A.,Annu.Rev.Immunol.,11:191(1993)；June,C.H.等,Immunol.Today,15:321(1994)；Jenkins,M.K.,Immunity,1:405(1994)。在共刺激测定法中，对IL-17A/F多肽测定T细胞共刺激或抑制活性。
IL-17A/F多肽，以及通过例如MLR和共刺激测定法确定为T细胞增殖刺激物(共刺激物)的本发明其它化合物及其激动剂例如激动性抗体，在治疗以免疫功能不良、亚最佳或不足为特征的免疫相关疾病中是有用的。这些疾病通过在哺乳动物中刺激T细胞(及T细胞介导的免疫力)的增殖和激活并增强免疫应答来治疗，其通过施用刺激性化合物诸如刺激性IL-17A/F多肽来实现。刺激性多肽可以是例如IL-17A/F多肽或其激动性抗体。
如在本发明中那样刺激性化合物的直接使用在使用4-1BB糖蛋白的实验中得到验证，4-1BB是肿瘤坏死因子受体家族的成员，结合接触过抗原的(primed)T细胞上表达的配体(4-1BBL)并发出T细胞激活和生长信号。Alderson,M.E.等,J.Immunol.,24:2219(1994)。
激动剂刺激性化合物的使用也已经通过实验得到验证。通过激动性抗4-1BB抗体处理进行的4-1BB激活增强肿瘤的根除。Hellstrom,I.和Hellstrom,K.E.,Crit.Rev.Immunol.,18:1(1998)。下文更详细描述的肿瘤治疗的免疫辅助疗法是本发明刺激性化合物的用途的另一个例子。免疫刺激或增强效应也可以通过拮抗或阻断IL-17A/F的活性来实现，所述IL-17A/F活性在MLR测定法中发现是抑制性的。消除该化合物的抑制活性产生净刺激效应。合适的拮抗剂/阻断性化合物有识别并结合抑制性蛋白质，由此阻断该蛋白质与其受体的有效相互作用并抑制经由该受体的信号传导的抗体或其片段。已经在使用抗CTLA-4抗体进行的实验中证实了此效应，所述抗CTLA-4抗体增强T细胞增殖，大概是通过消除由CTLA-4结合引起的抑制信号来实现的。Walunas,T.L.等,Immunity,1:405(1994)。
或者，免疫刺激或增强效果还可通过施用具有血管通透性增强特性的IL-17A/F多肽来实现。血管通透性增强对可通过局部免疫细胞(例如单核细胞、嗜曙红细胞、PMN)浸润和炎症削弱的病症会是有益的。
另一方面，IL-17A/F多肽，以及作为T细胞增殖/激活、淋巴因子分泌、和/或血管通透性的直接抑制物的本发明的其它化合物，可直接用于遏制免疫应答。这些化合物可用于降低免疫应答的程度和治疗以过度活跃的、超过最佳的或自身免疫性的应答为特征的免疫相关疾病。本发明化合物的此用途已经通过上文所述实验得到验证，其中结合受体B7的CTLA-4使T细胞解激活。本发明的直接抑制性化合物以类似方式发挥功能。遏制血管通透性的化合物的使用会减轻炎症。此类用途在治疗与过度发炎有关的疾患中会是有益的。
或者，结合刺激性IL-17A/F多肽并阻断这些分子的刺激效果的化合物，例如抗体，产生净抑制效果且可通过抑制T细胞增殖/激活和/或淋巴因子分泌而用于遏制T细胞介导的免疫应答。对多肽刺激效果的阻断遏制哺乳动物的免疫应答。此用途已经在使用抗IL-2抗体的实验中得到验证。在这些实验中，抗体结合IL-2并阻断IL-2结合其受体，由此实现T细胞抑制效果。
I.动物模型
基于细胞的体外测定法的结果可进一步使用体内动物模型和T细胞功能的测定法来验证。多种众所周知的动物模型可用于进一步理解本文中所鉴定的基因在免疫相关疾病的形成和发病机理中的作用，及测试候选治疗剂的功效，包括抗体及天然多肽的其它拮抗剂，包括小分子拮抗剂。此类模型的体内本质使得它们能预报在人类患者中的响应。免疫相关疾病的动物模型包括非重组的和重组的(转基因的)这两类动物。非重组动物模型包括例如啮齿类，例如鼠模型。此类模型可使用标准技术，例如皮下注射、尾静脉注射、脾植入、腹膜内植入、肾囊下的植入等，通过将细胞导入同基因小鼠来生成。
移植物抗宿主病在将有免疫能力的细胞移植到免疫遏制或耐受患者中时发生。供体细胞识别并应答宿主抗原。应答可从危及生命的严重炎症至腹泻和体重减轻的轻微病例变化。移植物抗宿主病模型提供了评估针对MHC抗原和次要移植物抗原的T细胞反应性的手段。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元4.3。
皮肤同种异体移植物排斥的动物模型是测试T细胞介导体内组织破坏的手段及其在移植物排斥中的作用的测量方法。最常用的和公认的模型使用鼠尾部皮肤移植物。重复实验显示了皮肤同种异体移植物排斥是由T细胞、辅助T细胞和杀伤-效应T细胞而非抗体介导的。Auchincloss,H.Jr.和Sachs,D.H.，《Fundamental Immunology》，第2版，W.E.Paul编，Raven Press，NY，1989，889-992。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols inImmunology》，见上文，单元4.4。可用于测试本发明化合物的其它移植物排斥模型有异基因心脏移植物模型，记载于Tanabe,M.等,Transplantation,58:23(1994)及Tinubu,S.A.等,J.Immunol.,4330-4338(1994)。
迟发型超敏感性的动物模型同样提供了细胞介导的免疫功能的测定法。迟发型超敏感性反应是T细胞介导的体内免疫应答，特征为在抗原考验后一段时间流逝后才达到峰值的炎症。这些反应也在组织特异性自身免疫病中发生，诸如多发性硬化(MS)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE,MS的一种模型)。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元4.5。
EAE是T细胞介导的自身免疫病，特征为T细胞和单个核细胞炎症和随后中枢神经***中轴突的脱髓鞘。EAE通常认为是人MS的相关动物模型。Bolton,C.,Multiple Sclerosis,1:143(1995)。急性的和复发-缓和型的这两种模型都已开发。本发明的化合物可针对免疫介导的脱髓鞘病测试T细胞刺激性或抑制性活性，使用《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元15.1和15.2中所述方案。还可参见髓磷脂疾病的模型，其中将少突胶质细胞或施旺(Schwann)细胞移植到中枢神经***中，如Duncan,I.D.等,Molec.Med.Today,554-561(1997)所述。
接触超敏感性是细胞介导的免疫功能的一种简单的迟发型超敏感性体内测定法。在此流程中，使皮肤暴露于外源半抗原，它引起迟发型超敏感性反应，对此测量和定量。接触敏感性牵涉初始敏化阶段，随后是引发阶段。引发阶段在T淋巴细胞遭遇它们先前已经接触过的抗原时发生。发生肿胀和发炎，使之成为人过敏性接触性皮炎的卓越模型。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，J.E.Cologan,A.M.Kruisbeek,D.H.Marglies,E.M.Shevach,和W.Strober编，John Wiley&Sons,Inc.，单元4.2(1994)。还可参见Grabbe,S.和Schwarz,T,Immun.Today,19(1):37-44(1998)。
关节炎的动物模型是胶原诱发的关节炎。此模型分享人自身免疫性类风湿性关节炎的临床、组织学和免疫学特征，是人自身免疫性关节炎的公认模型。小鼠和大鼠模型的特征为滑膜炎、对软骨和软骨下骨的侵蚀。本发明的化合物可使用《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元15.5中记载的方案来测试针对自身免疫性关节炎的活性。还可参见使用Issekutz,A.C.等,Immunology,88:569(1996)中记载的CD18和VLA-4整联蛋白的单克隆抗体的模型。
已经记载了一种哮喘模型，其中通过用卵清蛋白使动物敏化，然后用通过气雾剂投递的相同蛋白质考验动物而诱导抗原诱发的气道高反应性、肺嗜曙红细胞增多和炎症。数种动物模型(豚鼠、大鼠、非人灵长类)在用气雾剂抗原考验后显示与人的特应性哮喘相似的症状。鼠模型具有人哮喘的许多特征。测试本发明化合物在治疗哮喘中的活性和效力的合适流程记载于Wolyniec,W.W.等,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,18:777(1998)及其引用的参考文献。
另外，本发明的化合物可在银屑病样疾病的动物模型上测试。有证据提示银屑病的T细胞发病机理。本发明的化合物可在Schon,M.P.等,Nat.Med.,3:183(1997)记载的scid/scid小鼠模型中测试，其中小鼠展示与银屑病类似的组织病理学皮肤损伤。另一种合适的模型是如Nickoloff,B.J.等,Am.J.Path.,146:580(1995)所述制备的人皮肤/scid小鼠嵌合体。
重组(转基因)动物模型可使用用于生成转基因动物的标准技术通过将本文中所鉴定的基因的编码部分导入目的动物的基因组来改造。可充当转基因操作对象的动物包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非人灵长类，例如狒狒、黑猩猩和猴。本领域已知的用于将转基因导入此类动物中的技术包括原核显微注射(pronucleic microinjection)(Hoppe和Wanger,美国专利No.4,873,191)；逆转录病毒介导的基因转移进入种系中(例如Van der Putten等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6148-615(1985))；胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson等,Cell,56:313-321(1989))；胚胎电穿孔(Lo,Mol.Cel.Biol.,3:1803-1814(1983))；***介导的基因转移(Lavitrano等,Cell,57:717-73(1989))。综述参见例如美国专利No.4,736,866。
为了本发明的目的，转基因动物包括那些只在其部分细胞中携带转基因的动物(“镶嵌动物”)。转基因可作为单一转基因或者串联物例如头-头或头-尾串联物整合。还可能如下将转基因选择性导入特定细胞类型中，例如Lasko等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6232-636(1992)的技术。
转基因在转基因动物中的表达可通过标准技术来监测。例如，Southern印迹分析或PCR扩增可用于验证转基因的整合。然后可使用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学的技术分析mRNA表达水平。
动物可进一步检验免疫病病理学的征候，例如通过组织学检验以测定免疫细胞进入特定组织中的浸润。还可进行阻断实验，其中用本发明的化合物处理转基因动物以测定化合物刺激或抑制T细胞增殖的程度。在这些实验中，将如上所述制备的结合IL-17A/F多肽的阻断性抗体施用于动物并测定对免疫功能的效果。
或者，可构建“敲除”动物，它由于编码本文中所鉴定的多肽的内源基因和导入动物胚胎细胞中的改变的编码该多肽的基因组DNA之间的同源重组而具有缺陷的或改变的编码该多肽的基因。例如，可依照已建立的技术用编码特定多肽的cDNA克隆编码该多肽的基因组DNA。可以将编码特定多肽的基因组DNA的一部分删除或用另一基因替换，诸如可用于监测整合的、编码选择标志的基因。通常，载体中包含数千碱基未改变的侧翼DNA(5'和3'末端都有)(关于同源重组载体的描述参见例如Thomas和Capecchi,Cell,51:503(1987))。将载体导入胚胎干细胞系中(例如通过电穿孔)，并选择其中所导入DNA与内源DNA发生了同源重组的细胞(参见例如Li等,Cell,69:915(1992))。然后将所选择的细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如Bradley,在《Teratocarcinomas and Embryonic StemCells:A Practical Approach》中，E.J.Robertson编，IRL，Oxford，1987，第113-152页)。然后可将嵌合胚植入合适的假孕雌性***动物中，并使胚胎足月产生“敲除”动物。在其生殖细胞中包含同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中动物的所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除动物可以在例如由于缺乏该多肽而具有抵御某些病理疾患的能力和形成病理疾患方面进行表征。
J.免疫辅助疗法
在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性化合物可用于肿瘤(癌症)治疗的免疫辅助疗法。现在已经明确确立了T细胞识别人肿瘤特异抗原。由MAGE、BAGE和GAGE基因家族编码的一组肿瘤抗原在所有成人正常组织中是沉默的，但在肿瘤中以显著量表达，诸如黑素瘤、肺肿瘤、头和颈肿瘤、及膀胱癌。DeSmet,C.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7149(1996)。已经显示了T细胞的共刺激在体外和在体内都诱导肿瘤消退和抗肿瘤应答。Melero,I.等,Nature Medicine,3:682(1997)；Kwon,E.D.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:8099(1997)；Lynch,D.H.等,Nature Medicine,3:625(1997)；Finn,O.J.和Lotze,M.T.,J.Immunol.,21:114(1998)。本发明的刺激性化合物可作为佐药单独施用，或者联合生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂，以刺激T细胞增殖/激活和对肿瘤抗原的抗肿瘤应答。生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂可以使用已知施用方案以常规量施用。本发明化合物的免疫刺激活性容许降低生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂的量，由此潜在降低对患者的毒性。
K.药物候选物的筛选测定法
药物候选物的筛选测定法设计成鉴定与本文中所鉴定的基因编码的多肽或其生物学活性片段结合或复合或者以其它方式干扰所编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物。此类筛选测定法可包括可适应化学文库高通量筛选，使之特别适于鉴定小分子药物候选物的测定法。所涵盖的小分子包括合成的有机或无机化合物，包括肽，优选可溶性肽、(多)肽-免疫球蛋白融合物、和特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体、及此类抗体或片段的嵌合的或人源化的型式，以及人抗体和抗体片段。测定法可以多种形式进行，包括蛋白质-蛋白质结合测定法、生化筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法，它们在本领域已全面表征。所有测定法的共同之处在于它们要求使药物候选物接触由本文中所鉴定的核酸编码的多肽，接触的条件和时间足以容许这两种成分相互作用。
在结合测定法中，相互作用指结合，而且可分离或检测反应混合物中形成的复合物。在一个具体的实施方案中，将由本文中所鉴定的基因编码的多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定化在固相上，例如微量滴定板上。非共价附着通常是通过用多肽溶液包被固相表面并干燥来实现的。或者，可将对待固定化多肽特异的固定化抗体，例如单克隆抗体，用于将该多肽锚定至固相表面。测定法如下进行，将非固定化成分(它可以用可检测标记物标记)添加至固定化成分(例如含锚定成分的经包被表面)。当反应完成后，除去未反应成分，例如通过清洗，并检测锚定在固相表面上的复合物。若最初的非固定化成分携带可检测标记物，则固定化在表面上的标记物的检出指示发生了复合。若最初的非固定化成分不携带标记物，则可通过例如使用特异性结合固定化复合物的经标记抗体来检测复合。
如果候选化合物与由本文中所鉴定的基因编码的特定蛋白质相互作用但不结合它，那么与该蛋白质的相互作用可通过众所周知的用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法来测定。此类测定法包括诸如交联、免疫共沉淀、及经由梯度或层析柱的共纯化的传统方法。另外，蛋白质-蛋白质相互作用可通过如Chevray和Nathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5789-5793(1991)所公开的使用Fields及其同事记载的基于酵母的遗传***(Fields和Song,Nature(London),340:245-246(1989)；Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578-9582(1991))来监测。许多转录激活物，诸如酵母GAL4，由两个物理上离散的模块结构域组成，一个起DNA结合结构域的作用，另一个发挥转录激活结构域的功能。前述出版物中记载的酵母表达***(通常称为“双杂交***”)利用了这种特性，采用两种杂合蛋白，在其中之一中靶蛋白质与GAL4的DNA结合结构域融合，在另一中候选活化性蛋白质与激活结构域融合。GAL1-lacZ报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于GAL4活性经蛋白质-蛋白质相互作用的重建。含相互作用多肽的菌落用β-半乳糖苷酶的显色底物来检测。使用双杂交技术来鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)可以从Clontech购得。此***还可延伸至对参与特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域的作图以及指出对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
为了找到干扰本文中所鉴定的基因(的产物)与其它胞内或胞外组分相互作用的化合物，通常在足以容许两种产物相互作用和结合的条件和时间下制备包含基因产物及胞内或胞外组分的反应混合物。为了测试测试化合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化合物时进行反应。另外，可以向第三份反应混合物中加入安慰剂，以充当阳性对照。如上所述监测混合物中存在的基因产物和胞内或胞外组分之间的结合(复合物形成)。对照反应中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成复合物表明，测试化合物干扰基因产物与其反应配偶体的相互作用。
L.用于治疗免疫相关疾病的组合物和方法
可用于治疗免疫相关疾病的组合物包括但不限于抑制或刺激免疫功能，例如T细胞增殖/激活、淋巴因子释放、或免疫细胞浸润的蛋白质、抗体、有机小分子、肽、磷酸肽、反义和核酶分子、三股螺旋分子等。
例如，反义RNA和DNA分子通过与靶mRNA杂交并阻止蛋白质翻译来直接阻断mRNA的翻译而起作用。在使用反义DNA时，优选自翻译起始位点衍生的寡脱氧核糖核苷酸，例如靶基因核苷酸序列的约-10和+10位置之间。
核酶是能够催化RNA特异切割的酶活性RNA分子。核酶通过与互补靶RNA的序列特异性杂交及后续内切核酸切割起作用。潜在RNA靶物内的特定核酶切割位点可通过已知技术来鉴定。进一步细节参见例如Rossi,CurrentBiology 4:469-471(1994)及PCT公开号WO 97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制转录的三股螺旋结构中的核酸分子应当是单链且由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸的碱基组成设计成使其经Hoogsteen碱基配对原则促进三股螺旋形成，这通常要求双链体的一条链上有一长段嘌呤或嘧啶。进一步细节参见例如PCT公开号WO 97/33551，见上文。
这些分子可通过上文讨论的任何筛选测定法或其任意组合和/或通过本领域技术人员众所周知的任何其它筛选技术来鉴定。
M.抗IL-17A/F抗体
在一个实施方案中，本发明提供了可在本文中用作治疗剂和/或诊断剂的抗IL-17A/F抗体。例示性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的、和异源偶联的抗体。
1.多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。将相关抗原(尤其在使用合成肽时)与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。例如，可使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基的偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烃基，将抗原与匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中1/5-1/10初始量的肽或偶联物对动物进行强化免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定的高水平。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
2.单克隆抗体
单克隆抗体可以使用最初由Kohler等,Nature 256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(美国专利No.4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称作融合配偶)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的选择性培养基通常会含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的融合配偶骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体、并对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diege，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤所衍生的细胞系，以及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia，USA)获得的SP-2及衍生物，例如X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；及Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)中记载的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，例如通过将细胞i.p.注射到小鼠中。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离并测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)及Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等,Nature 348:552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等,Nature 352:624-628(1991)及Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nuc.Acids Res.21:2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或通过融合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
3.人抗体和人源化抗体
本发明的抗IL-17A/F抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式指最低限度包含自非人免疫球蛋白衍生的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或家兔的CDR残基替换而得到的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体或所输入的CDR或框架序列中没有发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最好还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。
用于将非人抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法实施(Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR序列替代相应的人抗体序列来进行。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是将人抗体中的一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代而得到的抗体。
当抗体意图在于人类治疗性用途时，用于生成人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)非常重要。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。鉴定与啮齿类最接近的人V结构域序列，并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用自轻链或重链特定亚型的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；Presta等,J.Immunol.151:2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
涵盖人源化抗IL-17A/F抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，任选偶联有一种或多种细胞毒剂以生成免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，诸如完整的IgG1抗体。
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致对内源抗体生成的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列(array)转移到此类种系突变小鼠中会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immuno.7:33(1993)；美国专利No.5,545,806,5,569,825,5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807；及WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature 348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，综述参见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,CurrentOpinion in Structural Biology 3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等,Nature 352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗口恶唑酮抗体。可基本上遵循Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等,EMBO J.12:725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
如上所述，还可通过体外激活B细胞(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。
4.抗体片段
在某些情况中，使用抗体片段而非完整抗体是有利的。片段的体积较小，容许快速清除，并且可导致对实体瘤的接近和进入提高。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992)；及Brennan等,Science 229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段，并通过化学方法偶联以形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点且缺乏恒定区的唯一种类；如此，它们是合适的，因为在体内使用过程中具有降低的非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应物蛋白质位于sFv氨基或羧基末端的融合物。参见《Antibody Engineering》，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
5.双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合本文所述IL-17A/F蛋白的两种不同表位。其它此类抗体可将IL-17A/F结合位点与针对另一种蛋白质的结合位点组合。或者，可以将抗IL-17A/F臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制聚焦和定位于表达IL-17A/F的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达IL-17A/F的细胞。这些抗体拥有IL-17A/F结合臂及结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白(saporin)、抗干扰素-α、长春花生物碱(vinca alkaloid)、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
WO 96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，而美国专利No.5,837,234公开了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。双特异性抗ErbB2/Fcα抗体显示于WO 98/02463。美国专利No.5,821,337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。
用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等,Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker等,EMBO J.10:3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，融合使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA***分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供期望双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率对期望链组合的产量没有显著影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列***同一表达载体。
在本方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等,Methods inEnzymology 121:210(1986)。
依照美国专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小型氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大型氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生大小与大型侧链相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫***细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81(1985)描述了一种规程，其中通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段。将这些片段在存在二硫醇络合剂***的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段变得更加容易，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。每个Fab'片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人***肿瘤靶的溶解活性。还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双抗体(diabody)”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的VH和VL，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
6.异源偶联抗体
异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫***细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；EP03089)。可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利No.4,676,980中所公开的。
7.多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快地受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(不同于IgM类)，其可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达来生成。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体可包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
8.效应器功能的工程改造
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如为了增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)及Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)中。在用于本文时，术语“补救(salvage)受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。
9.免疫偶联物
本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。
本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065，及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。
美登素和美登木素生物碱类
在一个优选的实施方案中，本发明的抗IL-17A/F抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝***抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成美登醇及其衍生物和类似物公开于例如美国专利No.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，明确将其公开内容收入本文作为参考。
美登木素生物碱-抗体偶联物
在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途公开于例如美国专利No.5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP 0425235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低***性细胞毒性。
抗IL-17A/F多肽抗体-美登木素生物碱偶联物(免疫偶联物)
抗IL-17A/F抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗IL-17A/F抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一分子毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利出版物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0425235B1；及Chari等,CancerResearch 52:127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，所述偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等,Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包括偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗IL-17A/F抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都属于美国Cyanamid公司)。可使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等,Cancer Research 53:3336-3342(1993)；Lode等,Cancer Research 58:2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效应。
其它细胞毒剂
可与本发明的抗IL-17A/F抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利No.5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利No.5,877,296)。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还涵盖抗体与具有核酸分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗IL-17A/F抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于诊断时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物中。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal,CRC Press,1989)详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，所述偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗IL-17A/F抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂自循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。
10.免疫脂质体
本文中所公开的抗IL-17A/F抗体还可配制成免疫脂质体。“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物递送药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；美国专利No.4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日公布的WO97/38731中所述。循环时间延长的脂质体披露于美国专利No.5,013,556。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可如Martin等,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)。
N.IL-17A/F结合寡肽
本发明的IL-17A/F结合寡肽指结合(优选特异性结合)本文所述IL-17A/F多肽的寡肽。IL-17A/F结合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法学化学合成，或者可使用重组技术制备和纯化。IL-17A/F结合寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类寡肽能够结合(优选特异性结合)本文所述的IL-17A/F多肽。IL-17A/F结合寡肽无需过多实验就可使用公知技术来鉴定。在这方面，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域公知的(参见例如美国专利No.5,556,762；5,750,373；4,708,871；4,833,092；5,223,409；5,403,484；5,571,689；5,663,143；PCT公开号WO84/03506和WO84/03564；Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81：3998-4002(1984)；Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：178-182(1985)；Geysen等，于Synthetic Peptides as Antigens，130-149(1986)；Geysen等，J.Immunol.Meth.，102：259-274(1987)；Schoofs等，J.Immunol.，140：611-616(1988)；Cwirla，S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378；Lowman，H.B.等(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363；及Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668)。
在这方面，噬菌体展示是一种容许筛选大型寡肽文库来鉴定那些文库中能够特异性结合多肽靶物的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽与外壳蛋白作为融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott,J.K.和Smith,G.P.(1990)Science 249:386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体(或随机克隆cDNA)的大型文库迅速且有效地分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展示肽(Cwirla，S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378)或蛋白质(Lowman，H.B.等(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363)的文库已经用于对数以百万计的多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的(Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.2:668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和繁殖大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集结果的手段。参见美国专利No.5,223,409；5,403,484；5,571,689；和5,663,143。
尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，但是λ样噬菌体展示***(WO 95/34683；US 5,627,024)、T4噬菌体展示***(Ren,Z-J.等(1998)Gene 215:439；Zhu,Z.(1997)CAN 33:534；Jiang,J.等(1997)can 128:44380；Ren,Z-J.等(1997)CAN 127:215644；Ren,Z-J.(1996)Protein Sci.5:1833；Efimov,V.P.等(1995)Virus Genes 10:173)和T7噬菌体展示***(Smith,G.P.和Scott,J.K.(1993)Methods in Enzymology,217,228257；U.S.5,766,905)也是已知的。
现在已经对基础噬菌体展示概念发展出了很多其它改进和变异。这些改进增强了展示***对肽文库筛选与所选择靶分子的结合及展示功能性蛋白质的能力，具有对这些蛋白质筛选期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO 98/14277)，而且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(WO 98/20169；WO 98/20159)和受约束螺旋肽的特性(WO 98/20036)。WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库接触其中配体会结合靶分子的一种溶液和其中亲和配体不会结合靶分子的第二种溶液，以选择性分离能结合的配体。WO 97/46251描述了一种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，随后使用微量板的孔进行微量淘选过程以分离以高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球菌蛋白A作为亲和标签的使用(Li等(1998)Mol Biotech.，9：187)。WO 97/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用组合文库，其可以是噬菌体展示库。WO 97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。美国专利No.5,498,538；5,432,018；和WO 98/15833中描述了选择特异结合的蛋白质的其它方法。
产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利No.5,723,286；5,432,018；5,580,717；5,427,908；5,498,530；5,770,434；5,734,018；5,698,426；5,763,192；和5,723,32。
O.IL-17A/F结合有机分子
IL-17A/F结合有机分子指本文所定义的寡肽或抗体以外，结合、优选特异性结合本文所述IL-17A/F多肽的有机分子。IL-17A/F结合有机分子可以使用已知方法学来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO00/39585)。IL-17A/F结合有机分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者其大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类能够结合、优选特异性结合本文所述IL-17A/F多肽的有机分子无需过多实验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对有机分子文库筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是本领域公知的(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO00/39585)。IL-17A/F结合有机分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲(semicarbazone)、卡巴肼(carbazide)、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯(carbamate)、碳酸酯(carbonate)、缩酮、硫缩酮(thioketal)、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯(aryl sulfonate)、烃基卤、烃基磺酸酯(alkyl sulfonate)、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、口恶唑烷、口恶唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺(sulfonamide)、环氧化物、吖丙啶(aziridine)、异氰酸酯(isocyanate)、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯(acid chloride)等。
P.筛选具有期望特性的抗IL-17A/F抗体、IL-17A/F结合寡肽和 IL-17A/F结合有机分子
上文已经描述了用于产生结合IL-17A/F多肽的抗体、寡肽和有机分子的技术。根据需要，可进一步选择具有某些生物学性质的抗体、寡肽或其它有机分子。
可通过本领域公知的方法，例如使用内源性或在用IL-17A/F基因转染后表达IL-17A/F多肽的细胞，来评估本发明抗IL-17A/F抗体、寡肽或其它有机分子的生长抑制效果。例如，可将适宜的肿瘤细胞系和IL-17A/F转染细胞用不同浓度的本发明抗IL-17A/F单克隆抗体、寡肽或其它有机分子处理几天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比色测定法来分析。测量增殖的另一种方法是通过比较在存在或缺乏本发明的抗IL-17A/F抗体、IL-17A/F结合寡肽或IL-17A/F结合有机分子时所处理细胞的3H-胸苷摄取。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中对掺入DNA中的放射性的量进行测量。适宜的阳性对照包括用已知抑制所选择细胞系生长的生长抑制性抗体处理该细胞系。可以本领域知道的多种方法来测定体内肿瘤细胞的生长抑制。优选的是，肿瘤细胞是过表达IL-17A/F多肽的细胞。优选的是，与未处理的肿瘤细胞相比，抗IL-17A/F抗体、IL-17A/F结合寡肽或IL-17A/F结合有机分子在体外或在体内将表达IL-17A/F的肿瘤细胞的细胞增殖抑制约25-100％，更优选约30-100％，甚更优选约50-100％或70-100％，在一个实施方案中，抗体浓度为约0.5-30μg/ml。可在细胞培养物中在抗体浓度为约0.5-30μg/ml或约0.5nM至200nM时测量生长抑制，其中在使肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测定生长抑制。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗IL-17A/F抗体导致在自首次施用抗体起约5天至3个月内、优选约5至30天内肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖降低，那么该抗体是体内生长抑制性的。
为了选择诱导细胞死亡的抗IL-17A/F抗体、IL-17A/F结合寡肽或IL-17A/F结合有机分子，可相对于对照评估膜完整性的丧失，这由例如碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取来指示。PI摄取测定法可在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将表达IL-17A/F多肽的肿瘤细胞与单独的培养基或含有适宜的抗IL-17A/F抗体(例如约10μg/ml)、IL-17A/F结合寡肽或IL-17A/F结合有机分子的培养基一起温育。将细胞温育3天的时间段。每次处理后，清洗细胞并等分(aliquot)到35mm带滤盖的(strainer-capped)的12x75试管中(每支试管1ml，每个处理组3支试管)用于消除细胞团块。然后向试管中添加PI(10μg/ml)。使用流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可选择那些通过PI摄取确定为诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗IL-17A/F抗体、IL-17A/F结合寡肽或IL-17A/F结合有机分子作为诱导细胞死亡的抗IL-17A/F抗体、IL-17A/F结合寡肽或IL-17A/F结合有机分子。
为了筛选结合IL-17A/F多肽上感兴趣抗体所结合的表位的抗体、寡肽或其它有机分子，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中所描述的。此测定法可用于确定测试抗体、寡肽或其它有机分子是否与已知的抗IL-17A/F抗体结合相同的位点或表位。或者/另外，可通过本领域已知的方法进行表位作图(mapping)。例如，可通过诸如丙氨酸扫描来诱变抗体序列以鉴定接触残基。首先对突变型抗体测试与多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在一种不同的方法中，可在竞争测定法中使用与IL-17A/F多肽不同区对应的肽，其中使用几种测试抗体或者一种测试抗体和一种具有已表征或已知表位的抗体。
Q.药用组合物
本发明的活性IL-17A/F分子(例如IL-17A/F多肽、抗IL-17A/F抗体、和/或各自变体)以及通过上文公开的筛选测定法鉴定的其它分子，可以药用组合物的形式施用以治疗免疫相关疾病。
本发明的活性IL-17A/F分子，优选多肽或抗体的治疗用配制剂如下以冻干剂型或水溶液的形式制备供贮存，即将具有期望纯度的活性分子与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编,1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
通过本文公开的筛选测定法鉴定的化合物可使用本领域众所周知的标准技术以类似方式配制。
脂转染或脂质体也可用于将IL-17A/F分子投递到细胞中。在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小抑制性片段。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留结合靶蛋白质序列的能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术生成(参见例如Marasco等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889-7893(1993))。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。或者/另外，组合物可包含细胞毒剂、细胞因子或生长抑制剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
活性IL-17A/F分子还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递***中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编,1980。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备IL-17A/F分子的持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能变化。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
R.治疗方法
本发明的多肽、抗体和其它活性化合物可用于治疗多种免疫相关疾病和疾患，诸如T细胞介导的疾病，包括那些以炎性细胞浸润进入组织中、刺激T细胞增殖、抑制T细胞增殖、提高或降低血管通透性或其抑制为特征的，诸如自身免疫病。
要用本发明的多肽、抗体和其它化合物治疗的例示性疾患或病症包括但不限于***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、骨关节炎、脊椎关节病、***性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏综合征、***性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经***的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。
在***性红斑狼疮中，疾病的主要介质是生成针对自身蛋白质/组织的自身反应性抗体及随后产生免疫介导的炎症。抗体或是直接或是间接介导组织损伤。尽管T淋巴细胞未显示出直接牵涉组织损伤，然而T淋巴细胞是产生自身反应性抗体所要求的。疾病的发生因此依赖T淋巴细胞。多个器官和***在临床上受到影响，包括肾、肺、肌肉骨骼***、粘膜皮肤、眼、中枢神经***、心血管***、胃肠道、骨髓和血液。
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性***性自身免疫性炎性疾病，主要牵涉多个关节的滑膜，由此导致对关节软骨的损伤。发病机制依赖T淋巴细胞，而且与类风湿因子，针对自身IgG的自身抗体的生成有关，由此导致免疫复合物的形成，其在关节液和血液中达到高水平。关节中的这些复合物可诱发显著的淋巴细胞和单核细胞浸润到滑膜中及随后显著的滑膜变化；关节腔/液受到类似细胞的浸润及添加许多嗜中性粒细胞。受影响的组织主要是关节，常常是对称样式。然而，关节外疾病也存在两种主要形式。一种形式是形成关节外损伤，伴有正在进行的渐进性关节病和肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡的典型损伤。关节外疾病的第二种形式是所谓的费尔提氏(Felty)综合征，它发生在RA病程晚期，有时在关节病已经沉寂后，且牵涉出现嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和脾肿大。这可伴随着多个器官中的血管炎及梗塞、皮肤溃疡和坏疽的形成。患者还常常在受影响关节上面的皮下组织中形成类风湿性节结；晚期的节结具有由混合的炎性细胞浸润物包围的坏死中心。可在RA中出现的其它表现包括：心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴有肺纤维化的间质性肺炎、干燥性角膜结膜炎和类风湿性节结。
幼年型慢性关节炎是一种慢性特发性炎性疾病，常常开始于16岁之前。其表型与RA有些相似；类风湿因子阳性的一些患者归入幼年型类风湿性关节炎。疾病细分为三种主要类别：少数关节的、多关节的和***性的。关节炎可以是严重的，通常是破坏性的，并导致关节僵硬和生长迟缓。其它表现可包括慢性前葡萄膜炎和***性淀粉样变。
脊椎关节病是具有一些普遍临床特征且普遍与HLA-B27基因产物表达有关的一组病症。这些病症包括：强直性脊柱炎、莱特尔氏(Reiter)综合征(反应性关节炎)、与炎性肠病有关的关节炎、与银屑病相关的脊椎炎、幼发型脊椎关节病及无差别(undifferentiated)脊椎关节病。区别性特征包括具有或没有脊椎炎的骶髂关节炎；炎性不对称关节炎；与HLA-B27有关(血清学上定义的MHC I型HLA-B基因座的等位基因)；眼炎症；及与其它类风湿性疾病有关的自身抗体的缺乏。对于诱发疾病来说关键的最相关细胞是CD8+T淋巴细胞，靶向由MHC I型分子呈递的抗原的细胞。CD8+T细胞可与MHC I型等位基因HLA-B27反应，就像它是由MHC I型分子表达的外来肽。已有假设，HLA-B27的表位可能模拟细菌或其它微生物的抗原性表位，如此诱导CD8+T细胞应答。
***性硬化(硬皮病)的病因学未知。疾病的特点是皮肤硬化；这可能是由活性炎性过程诱导的。硬皮病可以是局部的或***性的；血管损伤是普遍的，而且微血管***中的内皮细胞损伤是***性硬化形成中的早期且重要的事件；血管损伤可能由免疫介导。皮肤损伤中存在单个核细胞浸润物及在许多患者中存在抗核抗体暗示免疫学基础。ICAM-1常常在皮肤损伤中成纤维细胞的细胞表面上调，提示T细胞与这些细胞相互作用可能在疾病的发病机理中起作用。牵涉的其它器官包括：胃肠道：平滑肌萎缩和纤维化，导致异常蠕动/运动；肾：同中心内皮下内膜增生，影响小弓形和叶间动脉，从而降低肾皮质血流，导致蛋白尿、氮血症和高血压；骨骼肌：萎缩、间质性纤维化；炎症；肺：间质性肺炎和间质性纤维化；及心：收缩带坏死、疤痕化/纤维化。
特发性炎性肌病，包括皮肌炎、多肌炎和其它，是导致肌肉软弱的未知病因的慢性肌肉炎性病症。肌肉损伤/发炎常常是对称的和渐进的。自身抗体与大多数形式有关。这些肌炎特异性自身抗体针对并抑制牵涉蛋白质合成的成分、蛋白质和RNA的功能。
斯耶格伦氏综合征是由免疫介导的炎症及随后泪腺和唾液腺功能破坏引起的。该病可能与炎性***疾病有关或伴随着炎性***疾病。该病与针对Ro和La抗原的自身抗体生成有关，这两种抗原都是小RNA-蛋白质复合物。损害导致干燥性角膜结膜炎、口干燥、及其它表现或关联，包括胆汁性肝硬化、外周或感觉神经病、和可触知的紫癜。
***性血管炎是这样的疾病，其中原发性损伤是炎症，后续对血管的损伤导致由受影响血管供应的组织缺血/坏死/变性，且在有些情况中最终导致终端器官功能障碍。血管炎病还可作为其它免疫-发炎介导疾病诸如类风湿性关节炎、***性硬化等的继发损伤或后遗症发生，特别是在也与免疫复合物形成有关的疾病中。原发性***性血管炎组中的疾病包括：***性坏死性血管炎：节结性多动脉炎、过敏性血管炎和肉芽肿病、多脉管炎；韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞性动脉炎。各种各样的血管炎病包括：粘膜与皮肤***综合征(MLNS或川畸氏(Kawasaki)病)、分离的CNS血管炎、贝切特氏(Behet)病、血栓闭塞性血管炎(伯格氏(Buerger)病)和皮肤坏死性小静脉炎。所列大多数类型的血管炎的发病机理认为主要是由于免疫球蛋白复合物在血管壁中沉积及随后经ADCC、补体活化或者两者诱导的炎性应答。
节结病是病因学未知，特征在于几乎机体任何组织中都存在上皮样肉芽肿的疾患；最常见的是牵涉肺。发病机理牵涉患病部位持续存在活化的巨噬细胞和淋巴样细胞及随后由这些细胞类型释放局部和***性活性产物而导致的慢性后遗症。
自身免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血、免疫性全血细胞减少症和阵发性夜间血红蛋白尿，是由于生成与红细胞(在有些情况中还有其它血细胞，包括血小板)表面表达的抗原反应的抗体的结果，是经补体介导的溶解和/或ADCC/Fc受体介导的机制清除那些抗体包被细胞的反映。
在自身免疫性血小板减少症，包括血小板减少性紫癜，和其它临床背景中免疫介导的血小板减少症中，由于抗体或补体附着于血小板及随后经补体溶解、ADCC或Fc受体介导的机制进行消除而发生血小板破坏/消除。
甲状腺炎，包括格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，是由于针对甲状腺抗原的自身免疫应答及产生与存在于甲状腺中且通常对甲状腺特异的蛋白质反应的抗体。现有的实验模型包括自发性模型：大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥胖鸡品系)；诱导型模型：用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物。
I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病是胰岛细胞的自身免疫性破坏；该破坏由自身抗体和自身反应性T细胞介导。针对胰岛素或胰岛素受体的抗体也可产生胰岛素不响应的表型。
免疫介导的肾病，包括肾小球肾炎和肾小管间质性肾炎，是由于抗体或T淋巴细胞介导的对肾组织的损伤，或是直接由于生成针对肾抗原的自身反应性抗体或T细胞，或是间接由于针对其它非肾抗原有反应性的抗体和/或免疫复合物在肾中沉积。如此，导致免疫复合物形成的其它免疫介导的疾病也可诱导免疫介导的肾病作为间接后遗症。直接和间接的免疫机制都导致炎性应答，它在肾组织中产生/诱导损伤形成，导致器官功能受损，在有些情况中发展成肾衰竭。体液和细胞两种免疫机制都可牵涉损伤的发病机理。
中枢和周围神经***的脱髓鞘病，包括多发性硬化；特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征；和慢性炎性脱髓鞘多神经病，认为具有自身免疫基础，而且由于对少突胶质细胞或对髓鳞脂直接造成损害而导致神经脱髓鞘。在MS中，有证据提示该病的诱导和进展依赖T淋巴细胞。多发性硬化是依赖T淋巴细胞的脱髓鞘病，而且具有复发－缓和过程或漫长的渐进过程。病因未知；然而，病毒感染、遗传素因、环境和自身免疫性都会起作用。损伤含有主要由T淋巴细胞介导的浸润物、小胶质细胞和浸润的巨噬细胞；CD4+T淋巴细胞是损伤处的主要细胞类型。少突胶质细胞死亡和随后脱髓鞘的机理未知，但是可能是由T淋巴细胞驱动的。
炎性和纤维化肺病，包括嗜曙红细胞性肺炎；特发性肺纤维化和超敏感性肺炎，可能牵涉不受调控的免疫-发炎应答。抑制该应答会具有治疗益处。
自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎，由自身抗体介导，其发生依赖T淋巴细胞。
银屑病是T淋巴细胞介导的炎性疾病。损伤含有T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原加工细胞，及一些嗜中性粒细胞的浸润物。
变应性疾病，包括哮喘；变应性鼻炎；特应性皮炎；食物超敏感性；和荨麻疹，依赖T淋巴细胞。这些疾病主要由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或二者组合介导。
移植相关疾病，包括移植物排斥和移植物抗宿主病(GVHD)，依赖T淋巴细胞；抑制T淋巴细胞功能具有改善作用。
其中干预免疫和/或炎性应答有益的其它疾病有传染病，包括但不限于病毒感染(包括但不限于AIDS、甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎和疱疹)、细菌感染、真菌感染、及原生动物和寄生虫感染(刺激MLR的分子(或衍生物/激动剂)可在治疗上用于增强对传染因子的免疫应答)；免疫缺陷病(刺激MLR的分子/衍生物/激动剂可在治疗上用于增强对遗传性、获得性、感染性诱发的(如在HIV感染中)或医源性(即如源自化疗)免疫缺陷的状况的免疫应答)；和瘤形成。
已经证实，有些人癌症患者形成了针对瘤细胞上抗原的抗体和/或T淋巴细胞应答。还在瘤形成的动物模型中显示了，增强免疫应答可导致该特定瘤的排斥或消退。在MLR中增强T淋巴细胞应答的分子可用于在体内增强针对瘤形成的免疫应答。在MLR中增强T淋巴细胞增殖性应答的分子(或以激动性方式影响相同受体的小分子激动剂或抗体)可在治疗上用于治疗癌症。在MLR中抑制淋巴细胞应答的分子在体内在瘤形成过程中也起到遏制针对瘤的免疫应答的作用；此类分子可以是由瘤细胞自身表达的，或者它们的表达是由瘤在其它细胞中诱导的。此类抑制性分子的拮抗作用(或是用抗体、小分子拮抗剂或是通过其它手段)增强免疫介导的肿瘤排斥。
另外，抑制具有促炎特性的分子在再灌注损伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、急性肺损伤、失血性休克、烧伤、败血病/感染性休克、急性肾小管坏死、子宫内膜异位症、变性关节病和胰腺炎中可能具有治疗效益。
依照已知方法，诸如静脉内施用，如推注或通过持续一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面或吸入(鼻内、肺内)路径，将本发明的化合物例如多肽或抗体施用于哺乳动物，优选人。优选静脉内或吸入施用多肽和抗体。
在免疫辅助疗法中，可将其它治疗方案，诸如施用抗癌药，与施用本发明的蛋白质、抗体或化合物联合。例如，要用本发明的免疫佐药治疗的患者还可接受抗癌药(化疗剂)或放射疗法。此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验决定。此类化疗的制备和剂量给药方案还记载于《Chemotherapy Service》，M.C.Perry编，Williams&Wilkins,Baltimore,MD(1992)。化疗剂可在施用免疫佐药之前或之后，或者可以与它同时给予。另外，抗***化合物诸如他莫昔芬或抗孕酮诸如奥那司酮(参见EP 616812)可以以此类分子知道的剂量给予。
可能希望还施用针对其它免疫疾病相关或肿瘤相关抗原的抗体，诸如结合CD20、CD11a、CD18、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或血管内皮因子(VEGF)的抗体。或者/另外，可将本文中所公开的结合相同或者两种或多种不同抗原的两种或多种抗体共施用于患者。有时，还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。在一个实施方案中，IL-17A/F多肽与生长抑制剂共施用。例如，可首先施用生长抑制剂，后续IL-17A/F多肽。然而，还涵盖同时施用或首先施用。生长抑制剂的合适剂量就是那些目前所使用的，而且可由于生长抑制剂和IL-17A/F多肽的联合作用(协同作用)而降低。
对于免疫相关疾病的治疗或严重程度降低，本发明化合物的适宜剂量可取决于如上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程，施用药剂是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对化合物的响应、及主治医师的判断。将化合物恰当的一次性或通过一系列治疗施用于患者。
例如，根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量是约1mg/kg-15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)多肽或抗体，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。典型日剂量的范围可以是约1mg/kg-100mg/kg或更多，取决于上文所述因素。对于持续数天或更长的重复施用，根据状况，持续治疗直至出现期望的对疾病症状的遏制。然而，其它剂量方案可能是有用的。此疗法的进程易于通过常规技术和测定法监测。
S.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于诊断或治疗上文所述病症的物质(例如，包含IL-17A/F分子)的制品。制品包含容器和用法说明书。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器和试管。容器可以由各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有有效诊断或治疗疾患的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的活性剂通常是本发明的多肽或抗体。容器上或与容器相关的用法说明书或标签指明该组合物用于诊断或治疗所选择的疾患。制品还可包含第二容器，其中装有药学可接受的缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和/或右旋糖溶液。它还可包含商业和使用者立场上所期望的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。
T.免疫相关疾病的诊断和预后
细胞表面蛋白质，诸如在某些免疫相关疾病中过表达的蛋白质，是药物候选物或疾病治疗的卓越靶物。此类蛋白质及由在免疫相关疾病状态中扩增的基因编码的分泌型蛋白质在这些疾病的诊断和预后中找到了额外用途。例如，针对在多发性硬化、类风湿性关节炎、炎性肠病、或其它免疫相关疾病中扩增的基因的蛋白质产物的抗体可用作诊断剂或预后剂。
例如，抗体，包括抗体片段，可用于定性或定量检测由扩增的或过表达的基因编码的蛋白质(“标志物基因产物”)的表达。抗体优选配备有可检测的，例如荧光标记物，而且可通过光学显微镜检术、流式细胞术、荧光测定法或本领域知道的其它技术来监测结合。这些技术是特别合适的，如果过表达的基因编码细胞表面蛋白质的话。此类结合测定法基本上如上文所述进行。
抗体结合标志物基因产物的原位检测可通过例如免疫荧光或免疫电子显微镜检术来进行。为此目的，自患者中取出组织学标本，并对它应用经过标记的抗体，优选将抗体覆盖在生物学样品上。此流程还容许测定标志物基因产物在所检验组织中的分布。对于本领域技术人员显而易见的是，极其多种组织学方法可容易的用于原位检测。
提供下列实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。
在此完整收入本说明书中引用的所有专利和文献作为参考。
实施例
除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实施例和整篇说明书中以ATCC编号所鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA)。
实施例1：鉴定为IL-17A/F的新IL-17细胞因子的重组表达
用编码IL-17和IL-17F的cDNA表达载体进行的人293肾细胞转染
使用磷酸钙沉淀规程用相等量的编码人IL-17、IL-17C和IL-17F基因的质粒转染人293肾细胞。对于每个50％-80％汇合的T-150烧瓶，混合50μg每种质粒以形成沉淀物，用以在细胞上成层。转染后1天，除去含有10％FCS、5mML-谷氨酰胺、青霉素-链霉素的50:50F12:DMEM，并用无血清的PS24培养基更换，并再培养4天。4天后，收集条件化培养基，离心，并无菌过滤，之后纯化。
重组IL-17A/F的纯化
A.初始分级步骤1
浓缩2.5L来自人293肾细胞瞬时培养物的重组IL-17A/F条件化培养基，并使用10kD截留膜针对20mM乙酸钠pH5.0、1mM叠氮化钠(缓冲液A)透析至480ml体积，然后以6ml/min应用至Pharmacia HiLoad S Sepharose 26/10柱。使用速率为1％/min、至100％缓冲液B(20mM乙酸钠、1M NaCl、1mM叠氮化钠pH5.0)的线性梯度以6ml/min的流速洗脱柱，收集12ml级分。对自该柱收集的级分实施SDS PAGE分析。通过银染色来显示蛋白质。为含级分25-37的凝胶标记分子量标志物(图2A-2C)。级分31和32含有具有与IL-17A/F一致的大约33kD表观分子量的蛋白质。
B.IL-17A/F的纯化
将4ml级分32(图2A-2C)用0.1％三氟乙酸酸化，然后以0.5ml/min应用至在0.1％三氟乙酸(缓冲液C)中平衡的Vydac C4柱，并以三步梯度(10分钟里0-35％D，35分钟里35-50％D，10分钟里50-100％D)梯度洗脱至100％缓冲液D(100％乙腈中的0.1％三氟乙酸)。图2A-2C显示了在214nm和280nm处测量的所洗脱蛋白质的层析图。将乙腈步骤梯度覆盖在图谱上。通过氨基酸分析发现级分38的蛋白质浓度是0.536mg/ml。对该级分进行凝胶、印迹(blot)、氨基酸序列和活性测定法。
合并来自HiLoad S Sepharose运行的级分31和剩余体积的级分32，并使用10kD截留膜针对缓冲液A透析8小时，并流经0.2微米滤器。将此材料以1ml/min的流速加载至在缓冲液A中平衡的Mono S柱上，并以三步梯度洗脱至100％缓冲液B(10个柱体积里的0-30％B，45个柱体积里的30-75％B，10个柱体积里的75-100％B)，同时收集1ml/级分。测定级分26-43，并通过氨基酸分析测定蛋白质浓度。级分31、32和33的浓度分别是0.258、0.359和0.291mg/ml。主要对级分32和33进行凝胶、印迹、氨基酸序列、质谱及活性测定法。通过使用Western印迹来对通过层析生成的级分测定IL-17和IL-17F含量。使用1μg/ml针对IL-17或IL-17F的单克隆抗体来检测样品中IL-17或IL-17F的存在。
IL-17A/F的质谱术分析
通过质谱术分析测定了成熟IL-17A/F的氨基酸序列和链间二硫键(参见图4A；所显示的IL-17A/F异二聚体多肽具有链间和链内二硫键)。在IL-17F和IL-17多肽链间检出两个链间二硫键[分别在残基47IL-17F和残基129IL-17之间；及在残基137IL-17F和残基33IL-17之间](图4A中的粗体黑线)。另外，在每条同二聚体多肽链IL-17[在残基102和152之间；及在残基107至154之间]和IL-17F[在残基94和144之间；及在残基99和146之间中形成两个链内二硫键](图4A中的浅黑线)。氨基酸相对于每条前体多肽链中的起始甲硫氨酸编号(图4A)。图4B显示了含有IL-17链和IL-17F链之间的二硫键的IL-17A/F肽片段的示意图，所述IL-17链和IL-17F链预期通过胰蛋白酶消化IL-17A/F会生成[IL-17A/F二硫键片段编号1称为SEQ ID NO:7；IL-17A/F二硫键片段编号2称为SEQ ID NO:8]。这些片段内包含的氨基酸相对于各自链的起始甲硫氨酸指示并编号。
通过质谱术会观察到的这些片段的计算近似分子量在图4B中显示为3410.58Da和2420.05Da[分别为IL-17A/F二硫键片段编号1和编号2]。实施基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱术(MALDI-TOF)肽作图(图4C)。将55pmol在缓冲液400mM NaCl、20mM NaOAC缓冲液pH5中的IL-17A/F在37℃用Promega测序级胰蛋白酶消化过夜。使用2',4',6'-三羟基苯乙酮基质通过阳离子反射模式(positive ion reflectron mode)的延迟提取(delayed extraction)来实施基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱术(MALDI-TOF)。所得的肽图含有片段编号2的[M+H]+＝2420.12Da的峰及片段编号1的3410.60Da的峰，这与二硫键连接的肽一致(图4C)。在用二硫苏糖醇还原二硫键并用碘乙酰胺烷基化硫氢基后在pH8消化第二个样品等分试样。此样品的MALDI-TOF谱缺乏所研究的峰，这支持将它们归为二硫键连接的。通过液相层析电喷射离子化离子阱质谱术(LC-ESI-MS)来进一步表征非还原性样品(图4D-1至4D-3)。离子层析图表示(从顶到底)IL-17A/F二硫键片段编号2[M+2H]2+、及IL-17A/F二硫键片段编号1[M+2H]3+的总离子层析图、重建离子层析图(RIC)。观察到与两种异二聚体一致的峰，然而在预期的同二聚体肽质量处没有观察到高于背景化学噪音的峰，如此指明不存在IL-17或IL-17F的同二聚体。然后通过串联质谱术证实二硫键连接的异二聚体的组成。在m/z 1210.9处双价前体的碰撞诱导解离对应IL-17A/F二硫键片段编号2，而在m/z 1138.0处三价前体对应IL-17A/F二硫键片段编号1。在相应的谱中观察到预测的b和y离子系列片段峰。
针对能结合IL-17A/F的抗体的噬菌体文库筛选
为了鉴定能结合IL-17A/F的抗体，筛选合成Fab抗体的噬菌体文库。鉴定出34个独立的编码不同Fab抗体序列的克隆。其能够介导对IL-17A/F的结合。以与先前所述相似的方式制备人抗体序列的噬菌体文库并筛选抗原特异性Fab(Gerstner,R.B.等,J.Mol.Biol.,321(5):851-62(2002))。简言之，使用人源化单克隆抗体4D5(一种抗HER2抗体)作为支架来构建噬菌体展示的Fab文库。这些Fab通过与可同二聚化的亮氨酸拉链融合而单价地和/或二价地展示在噬菌体上。为了产生文库多样性，我们选择使表面暴露的重链CDR残基随机化，并形成连续的斑(patch)，发现所述表面暴露的重链CDR残基在天然抗体序列的Kabat数据库中也是高度多样性的。此外，我们使用定点诱变以及修改后的简并密码子来在每个CDR位点处产生模拟天然免疫全集的氨基酸多样性。容许重链的前两个CDR即H1和H2具有与赫赛汀(Herceptin)相同长度的有限多样性，而将H3设计成具有高简并性，且长度范围为7-19。自初始文库选择生成的所有抗体具有相同的轻链。可以通过将重链可变域一步克隆入提供期望同种型特异性恒定区序列的载体中而生成全长IgG或Fab。为了进一步改善来自重链文库的结合物的亲和力，可以采用轻链CDR的第二步随机化。图6中显示了重链可变域中包含来自能结合IL-17A/F的Fab的3个CDR[H1-H3]的区域的氨基酸序列。显示了34个Fab克隆的预测氨基酸序列中编码能够结合IL-17A/F的不同抗体重链序列的区域的比对。三个重链CDR区分别指示为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并画上阴影。每个克隆相应的SEQ IDNO如下：
克隆编号1＝SEQ ID NO:9；克隆编号2＝SEQ ID NO:10；克隆编号3＝SEQ IDNO:11；克隆编号4＝SEQ ID NO:12；克隆编号5＝SEQ ID NO:13；克隆编号6＝SEQ ID NO:14；克隆编号7＝SEQ ID NO:15；克隆编号8＝SEQ ID NO:16；克隆编号9＝SEQ ID NO:17；克隆编号10＝SEQ ID NO:18；克隆编号11＝SEQID NO:19；克隆编号12＝SEQ ID NO:20；克隆编号13＝SEQ ID NO:21；克隆编号14＝SEQ ID NO:22；克隆编号15＝SEQ ID NO:23；克隆编号16＝SEQID NO:24；克隆编号17＝SEQ ID NO:25；克隆编号18＝SEQ ID NO:26；克隆编号19＝SEQ ID NO:27；克隆编号20＝SEQ ID NO:28；克隆编号21＝SEQID NO:29；克隆编号22＝SEQ ID NO:30；克隆编号23＝SEQ ID NO:31；克隆编号24＝SEQ ID NO:32；克隆编号25＝SEQ ID NO:33；克隆编号26＝SEQID NO:34；克隆编号27＝SEQ ID NO:35；克隆编号28＝SEQ ID NO:36；克隆编号29＝SEQ ID NO:37；克隆编号30＝SEQ ID NO:38；克隆编号31＝SEQID NO:39；克隆编号32＝SEQ ID NO:40；克隆编号33＝SEQ ID NO:41；克隆编号34＝SEQ ID NO:42。
另外，在下文表7中显示了34个克隆之每一个的相应编码DNA序列(分别是SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:76)。
表7
SEQ ID NO:43:
TTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCATTAGTGATTCCGCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTGGGATTACTCCTTATAGCGGTTATACTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCAAAAGAGGCCCGCGAGGGCTACGACGTCGGCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO:44:
TTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCATTAGTGATTCCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTGAAATTTCTCCTCCTGGCGGCGATACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTCTCTTGTGGTGGTGGGACGGGGCTATGGACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO:45:
TTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCATTACTAATACTTGGATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTGTTATTACTCCTTATGGCGGTGCTACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCAAGAGAGAGTATGTGGAGTAAGTTCGACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO:46:
TTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCATTAATAGTTCTGCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTTATATTACTCCTGATAACGGTGATACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAATAGCTGAGGATACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCGGCCACGGCAACTTCTACGGTACCTGGGCGGCTATGGACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO:47:
TTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCATTAGTGGTTCTGATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTATATTAATCCTTATGGCGGTTCTACTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGCGTACGAGATGTGGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO:48:
TTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCATTACTAATTCCTGGATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTGTTATTACTCCTTCTAGCGGTTCTACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAGGTCTTCCCCGACATCGGGGACTGCAGCAACGCCTACTGCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO:49:
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SEQ ID NO:50:
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SEQ ID NO:70:
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SEQ ID NO:74:
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SEQ ID NO:76:
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基于细胞的测定法——IL-17A/F诱导IL-8和IL-6的生成
对自上文所述Vydac C4纯化步骤分离的级分(图3A-3C)测定IL-17A/F诱导IL-8生成的能力。如下测试级分，即与TK-10细胞一起温育24小时(0.033μl级分/ml细胞培养基)。然后收集条件化培养基，并通过ELISA对每个级分实施IL-8和IL-6浓度测量。发现级分38具有强烈的活性。通过氨基酸分析发现级分38的蛋白质浓度是0.536mg/ml。对此级分进行凝胶、印迹、氨基酸序列及活性测定法(图3A-3C)。或者，合并来自HiLoad S Sepharose运行的级分31和剩余体积的级分32，并使用10kD截留膜针对缓冲液A透析8小时，并流经0.2微米滤器。将此材料以1ml/min的流速加载至在缓冲液A中平衡的Mono S柱上，并以至100％缓冲液B的三步梯度洗脱(10个柱体积里的0-30％B，45个柱体积里的30-75％B，10个柱体积里的75-100％B)，同时收集1ml/级分。测定级分26-43，并通过氨基酸分析测定蛋白质浓度。在级分31-33中鉴定纯的IL-17A/F为具有30-35kD表观分子量的单种蛋白质。级分31、32和33的浓度分别是0.258、0.359和0.291mg/ml。凝胶和蛋白质序列分析显示了此材料与通过C4柱纯化的IL-17A/F(上文)相同。图5A和5B中显示了比较由IL-17A/F、IL-17和IL-17F进行的IL-8和IL-6诱导的剂量应答曲线。将指定浓度的IL-17A/F、IL-17和IL-17F与TK-10细胞一起温育24小时。收集TK-10条件化培养基，并通过IL-8ELISA和IL-6ELISA分析。
讨论
IL-17和IL-17F的mRNA的共表达导致新蛋白质种类的分泌，所述新蛋白质种类能够与能够结合IL-17的某些抗体和能够结合IL-17F的某些抗体两者结合。该新蛋白质种类在本文中称为白介素-17A/F(IL-17A/F)。在使人肾293细胞单独表达IL-17或IL-17F时没有观察到该种类。如图1A和图1B中所示，利用能够识别IL-17(第1-5道)或IL-17F(第6-10道)的抗体来免疫沉淀(IP)来自经转染细胞的条件化培养基。然后通过Western印迹分析来解析免疫沉淀的蛋白质，并用针对IL-17(图1A)或IL-17F(图1B)的抗体印迹。通过与IL-17F形成的二聚体复合物中IL-17的存在而在图1A的第8道中和图1B的第3道中指示IL-17A/F的检出。如通过非还原性SDS-PAGE所测定，该种类的分子量是大约30-35kD，这与由通过共价键连接的一分子IL-17和一分子IL-17F构成的种类相一致。还可以以这样的蛋白质来识别该新种类(IL-17A/F)的存在，所述蛋白质的电泳迁移率与在单独表达IL-17或IL-17F时观察到的电泳迁移率不同。因此，该新种类还可以在不使用抗体的情况下通过使用其它蛋白质检测方法(诸如常规的蛋白质染色技术)来显现。
还可以如下观察到通过IL-17和IL-17F的共表达而生成的新蛋白质种类的存在，即用反相层析来解析条件化培养基中存在的分泌型蛋白质。自共表达IL-17和IL-17F的细胞生成的分泌型蛋白质所观察到的蛋白质级分与以生成IL-17或IL-17F的细胞所观察到的样式的比较揭示别的蛋白质种类的存在。通过柱层析将该蛋白质种类即IL-17A/F纯化并分离至同质(图2A-3C)。
纯化的蛋白质以大约30-35kD的单个条带运行，正如通过非还原性SDS-PAGE所测定的(图3A)。然而，在还原性条件下，揭示了具有大约15-18kD表观分子量的两个明显不同的条带(未显示)。如此，IL-17A/F是共价二聚体。一种评估新蛋白质成分的独立手段，即N端肽序列分析也清楚地指明分离的IL-17A/F包含IL-17和IL-17F肽两者(图3B)。所检测的肽序列与IL-17和IL-17F的N端末端内包含的序列相同(图3C)。Western印迹分析指明该新蛋白质种类还能够与能够结合IL-17的抗体及与能够结合IL-17F的抗体两者相互作用。这些观察结果的每一个及新的分离的蛋白质种类的不同分子量提示分离的蛋白质IL-17A/F是由IL-17和IL-17F的共价结合构成的新蛋白质种类。
通过使用质谱术来进一步表征连接IL-17A/F的IL-17和IL-17F链的二硫键的存在和位置。在示意性图4A中显示了IL-17A/F内二硫键的位置。两个链间二硫键连接IL-17A/F中的IL-17和IL-17F链。预期胰蛋白酶对IL-17A/F的消化会生成两个不同的含有链间二硫键的肽片段(分别为IL-17A/F二硫键片段编号1和编号2；SEQ ID NO:7和8)。示意性显示了(图4B)这些肽及各自的预测分子量。通过基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱术(MALDI-TOF)(图4C)和通过液相层析电喷射离子化离子阱质谱术(LC-ESI-MS)(图4D-1至4D-3)来观察这些肽。没有检出与IL-17或IL-17F的同二聚体对应的肽峰，这指明纯化的IL-17A/F由IL-17和IL-17F链的共价异二聚体构成，而且不包含可检测水平的IL-17或IL-17F同二聚体。
另外，通过筛选合成Fab抗体的噬菌体文库而鉴定出能结合IL-17A/F的抗体。鉴定出编码不同Fab抗体序列的34个独立克隆。其能够介导对IL-17A/F的结合。图6显示了重链可变域中包含来自能结合IL-17A/F的Fab的3个CDR[H1-H3]的区域的氨基酸序列。显示了34个Fab克隆的预测氨基酸序列中编码能够结合IL-17A/F的不同抗体重链序列的区域的比对。三个重链CDR区分别指示为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且以黄色突出显示。34个克隆之任一个的相应氨基酸序列鉴定为SEQ ID NO:9-42。另外，在下文表7中显示了所鉴定的34个克隆之任一个的相应编码DNA序列(分别是SEQ ID NO:43至SEQID NO:76)。如此，鉴定出能选择性结合新的异二聚体复合物IL-17A/F的特异性抗体，其可以发挥调控此新细胞因子活性的作用。
使用TK-10人肾细胞系分析IL-17A/F刺激促炎应答的能力(图5A和5B)。该细胞系通过生成IL-8而应答IL-17和IL-17F两者。IL-17A/F也强烈地诱导该细胞系中IL-8生成(图5A)。有趣的是，观察到IL-17A/F具有与IL-17或IL-17F的效力不同的独特效力。与IL-17和IL-17F的活性差异在每种情况中大致有一个数量级。在该测定法中IL-17A/F的活性实质性大于IL-17F的活性提示IL-17A/F可包含源自IL-17F基因产物的细胞因子活性的关键成分。这种独特的效力可使得分子能够拥有不同范围的体内作用。IL-17A/F还诱导IL-6自该细胞系的生成(图5B)。另外，由于其新的异二聚体组成，IL-17A/F可拥有IL-17或IL-17F中不存在的别的性质，其可改变受体亚基的体内动力学及利用，导致独特的生物学后果。
实施例2：活化的人T细胞中生成的新IL-17细胞因子的鉴定
本文中首次描述了新的人IL-17细胞因子(本文中鉴定为人IL-17A/F)，其是活化的人T淋巴细胞中天然生成的。如下文所阐明的那样，实施人T淋巴细胞的分离及活化，并通过IL-17A/F ELISA来检测并定量测量IL-17A/F生成：
人T细胞的分离及活化
将肝素化(0.5ml/50cc)的、自正常且健康供体新鲜抽出的人血液用生理盐水稀释1:1，然后如制造商(ICN)推荐的那样覆盖在LSM淋巴细胞分离培养基(ICN)上成层并离心。在完全RPMI(RPMI、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(GIBCO))中将回收的单个核淋巴细胞分配(plate)到组织培养瓶中，在37℃温育1小时以消减单核细胞。离心培养物上清液以使剩余细胞沉淀。然后使用CD4+T细胞分离试剂盒(MACS)通过负选择来分离人T淋巴细胞。为了活化分离的T淋巴细胞，用各5ug/ml在PBS中的抗CD3(BD Bioscience)和抗CD28(BD Bioscience)在4℃包被组织培养瓶过夜。在除去包被培养基后，在完全RPMI中以大约2x 106个细胞/ml培养基的密度分配分离的人T淋巴细胞。分配后在各个时间点收集培养基的样品，并通过ELISA测定IL-17A/F。自来自没有用抗CD3和抗CD28包被的***细胞上清液收集未活化的对照上清液。
抗CD3/抗CD28活化的人T细胞中的人IL-17A/F生成的ELISA测量
通过ELISA测量人IL-17A/F水平。将小鼠抗人IL-17在包被缓冲液(0.05M碳酸钠缓冲液，pH9.6)中稀释，并在96孔微量滴定板(Nunc)上在2-8℃包被12-15小时。在室温实施所有的随后步骤。通过将孔倒空并添加封闭缓冲液(PBS、0.5％BSA、10ppm Proclin 300)来封闭非特异性结合。在温育1小时后，用清洗缓冲液(PBS、0.05％Tween 20、10ppm Proclin 300)清洗孔。然后添加在测定缓冲液(PBS、0.5％BSA、0.05％Tween 20、10ppm Proclin 300)中稀释的人IL-17A/F参照标准品和样品。在温育2小时后，用清洗缓冲液清洗孔。添加在测定缓冲液中稀释的生物素化小鼠抗人IL-17F，并容许温育1小时。在用清洗缓冲液清洗平板后，添加测定缓冲液中稀释的链霉亲合素-HRP(辣根过氧化物酶)(Amersham)，并容许温育1小时。在用清洗缓冲液清洗平板后，添加底物溶液即TMB(四甲基联苯胺)-过氧化物酶(R&D Systems)。通过添加2N硫酸来停止显色。在450nm处在微量滴定板读板仪(SLT)上读取平板，以540nm作为扣除空白。使用四参数曲线拟合程序来产生标准曲线，并由通过曲线线性部分的插值来推导样品浓度。在ELISA中包括作为对照的IL-17A和IL-17F以表明对IL-17A/F的测定特异性(图12)。
结果
图11中显示了IL-17A/F生成的ELISA测量结果。这些研究表明与其中没有检出IL-17A/F生成的未活化的人T细胞相比来自抗CD3/抗CD28活化的人T淋巴细胞的新细胞因子IL-17A/F的生成。这些结果首次显示了新细胞因子的天然存在，所述新细胞因子是应答人T淋巴细胞的活化而生成并释放的。另外，通过在平行测定时观察到三个样品(编号31-编号33)中几乎相等数量的IL-17A/F而证明了ELISA测定法的特异性。在此IL-17A/F特异性ELISA中检出可忽略量的IL-17A或IL-17F(图12)。
在本文实施例1和2两者中所述研究确立了重组人IL-17A/F是与人IL-17和IL-17F在蛋白质结构及基于细胞的活性测定法二者中可区分的显然新的细胞因子。通过使用纯化的重组人IL-17A/F作为标准品，开发了人IL-17AF特异性ELISA(图11中所示的)。通过使用此特异性ELISA，检出人IL-17A/F的诱导表达，这证实IL-17A/F是自培养物中活化的人T细胞天然生成的。因此，IL-17A/F是作为分离的活化的人T细胞的天然产物可检测的显然新的细胞因子，其重组形式在蛋白质结构和基于细胞的测定法二者中都已经被表征为与相关细胞因子是不同的且是可区别的。
这种新细胞因子可以发挥在体内调控IL-17活性的作用，充当IL-17或其它相关细胞因子结合位点的竞争性抑制剂。IL-17A/F还可以通过下调自身的结合位点和/或其它相关细胞因子的结合位点来调控其它相关细胞因子的活性。IL-17A/F可以经由胞内衔接物(adapter)或信号传导分子而展现出活性，所述胞内衔接物或信号传导分子发挥影响其自己的信号传导活性或其它相关细胞因子的信号传导活性的作用。IL-17A/F具有影响细胞表面处或胞内隔室内找到的受体和共同受体的配对的能力。
如此，这些研究提供并鉴定了新免疫刺激物(即IL-17A/F)，其可加强免疫***来应答先前可能不曾具有免疫活性的特定抗原。因此，新鉴定的免疫刺激物具有重要的临床应用。已经鉴定了其它已知的免疫刺激物，诸如IL-12。[参见Gubler等,PNAS 88:4143(1991)]。在一项最近的癌症疫苗试验中，来自University of Chicago和Genetics Institute(Cambridge,MA)的研究人员依靠IL-12的免疫刺激活性以治疗黑素瘤。[Peterson等,Journal of ClinicalOncology 21(12):2342-48(2003)]。他们提取了携带一种或多种黑素瘤细胞标志物的循环白血球，分离抗原，并让它们返回患者。通常患者对其自己的人抗原不会具有免疫应答。然后用不同剂量的IL-12(即一种能够诱导已经被树突细胞共刺激的T细胞增殖的免疫刺激物)处理患者。由于IL-12的免疫刺激效应，该处理提供了优于较早工作的结果，在较早的工作中自外周血单个核细胞(PBMC)制备患者自己的树突细胞，用抗原处理，然后体外培养，并返回至患者以刺激抗癌应答。[Thurner等,J.Exp.Med.190(11):1669-78(1999)]。同样地，此新IL-17A/F细胞因子或其激动剂会因此找到作为免疫刺激物的实际效用。相反，抑制IL-17A/F活性的分子(拮抗剂)会在期望抑制免疫应答时找到实际效用，诸如在自身免疫病中。
如此，此新细胞因子的模拟(激动性抗体)或抑制(拮抗性抗体)IL-17A/F免疫活性的抗体会拥有治疗特性。发挥抑制此新细胞因子活性作用的小分子也会具有潜在的治疗用途。
实施例3：IL-17A/F作为杂交探针的使用
以下方法描述了编码IL-17A/F的核苷酸序列作为杂交探针的使用。
使用包含本文中所公开的全长或成熟IL-17A/F的编码序列的DNA作为探针以在人组织cDNA文库或人组织基因组文库中筛选同源DNA(诸如那些编码IL-17A/F的天然存在变体的)。
在如下高严格性条件下实施含有任一文库DNA的滤膜的杂交和清洗。在50％甲酰胺、5x SSC、0.1％SDS、0.1％焦磷酸钠、50mM磷酸钠pH6.8、2x Denhardt氏溶液、及10％硫酸右旋糖苷的溶液中在42℃实施经放射性标记的IL-17A/F衍生的探针对滤膜的杂交长达20小时。在0.1x SSC和0.1％SDS的水溶液中在42℃实施滤膜的清洗。
然后可以使用本领域已知的标准技术来鉴定与编码全长天然序列IL-17A/F的DNA具有期望序列同一性的DNA。
实施例4：IL-17A/F在大肠杆菌中的表达
本实施例说明了通过在大肠杆菌中的重组表达来制备未糖基化形式的IL-17A/F多肽。
首先使用所选择的PCR引物扩增编码IL-17A/F多肽的DNA序列。引物应当包含与所选择的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点。可以采用多种表达载体。合适载体的一个例子是包含氨苄青霉素和四环素抗性基因的pBR322(衍生自大肠杆菌；参见Bolivar等,Gene,2:95(1977))。用限制酶消化载体，并去磷酸。然后将PCR扩增的序列连接入载体中。载体可优选包括编码抗生素抗性基因、trp启动子、多His前导(包括前6个STII密码子、多His序列、及肠激酶切割位点)、IL-17A/F多肽编码区、λ转录终止子、及argU基因的序列。
然后使用Sambrook等,见上文中所述方法，使用连接混合物来转化所选择的大肠杆菌菌株。通过其在LB平板上生长的能力来鉴定转化体，然后选择抗生素抗性菌落。可以分离质粒DNA，并通过限制性分析和DNA测序来证实。
可以将所选择的克隆在液体培养基(诸如补充有抗生素的LB肉汤)中培养过夜。随后可以使用过夜培养物来接种更大规模的培养物。然后将细胞培养至期望的光密度，在此期间开启表达启动子。
将细胞再培养数小时后，可以通过离心来收获细胞。可以使用多种本领域已知的试剂来溶解通过离心而获得的细胞沉淀物，然后可以在容许蛋白质紧密结合的条件下使用金属螯合柱来纯化溶解的IL-17A/F蛋白。
使用如下规程，可以在大肠杆菌中表达加有多His标签形式的IL-17A/F多肽。首先使用所选择的PCR引物扩增编码IL-17A/F多肽的DNA序列。引物可含有与所选择的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点，及其它有用的序列，其提供高效且可靠的翻译起始、金属螯合柱上的快速纯化、及用肠激酶进行的蛋白水解消除。然后将PCR扩增的、加有多His标签的序列连接入表达载体中，该载体用于转化基于菌株52(W3110fuhA(tonA)lon galErpoHts(htpRts)clpP(lacIq))的大肠杆菌宿主。首先将转化体在30℃在摇动情况下在含有50mg/ml羧苄青霉素的LB中培养，直至O.D.600达到3-5。然后将培养物在CRAP培养基(其如下制备，即在500mL水中混合3.57g(NH4)2SO4、0.71g二水合柠檬酸钠、1.07g KCl、5.36g Difco酵母提取物、5.36g Sheffieldhycase SF，以及110mM MPOS pH7.3、0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4)中稀释50-100倍，并在30℃在摇动情况下培养大约20-30小时。取出样品以通过SDS-PAGE分析来检验表达，并将大量的培养物离心以使细胞沉淀。将细胞沉淀物冷冻直至纯化和重折叠。
将来自0.5至1L发酵液的大肠杆菌浆(6-10g沉淀物)以10倍体积(w/v)重悬浮于7M胍，20mM Tris pH8缓冲液中。添加固体亚硫酸钠和连四硫酸钠以分别获得0.1M和0.02M的终浓度，并在4℃搅动溶液过夜。该步骤导致蛋白质变性，其中所有的半胱氨酸残基通过亚硫酸化(sulfitolization)而被封闭。将溶液在Beckman超速离心机中以40,000rpm离心30分钟。将上清液用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍,20mM Tris pH7.4)稀释，并过滤通过0.22微米滤器以澄清。将澄清后的提取物加载至在金属螯合柱缓冲液中平衡的5mlQiagen Ni-NTA金属螯合柱上。用含有50mM咪唑(Calbiochem,Utrol等级)pH7.4的额外缓冲液(additional buffer)清洗该柱。用含有250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。将含有期望蛋白质的级分合并，并贮存在4℃。通过280nm的吸光度来估算蛋白质浓度，其中使用基于其氨基酸序列的计算消光系数。
通过将样品缓慢地稀释至新鲜制备的重折叠缓冲液中而使蛋白质重折叠，所述重折叠缓冲液含20mM Tris pH8.6、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA。选择重折叠体积，使得最终的蛋白质浓度在50至100ug/ml之间。将重折叠溶液在4℃温和搅动12-36小时。通过添加TFA至0.4％的终浓度(pH约3)来淬灭重折叠反应。在进一步纯化蛋白质之前，将溶液过滤通过0.22微米滤器，并添加乙腈至2-10％终浓度。将重折叠的蛋白质在Poros R1/H反相柱上层析，其中使用0.1％TFA的流动缓冲液以及用从10至80％的乙腈梯度洗脱。在SDS-PAGE上分析具有A280吸光度的级分的等分试样，并合并含有同质重折叠蛋白质的级分。一般而言，大部分蛋白质的正确重折叠种类在最低的乙腈浓度洗脱，因为这些种类是最紧密的，保护它们的疏水内部免于与反相树脂相互作用。聚集种类通常在较高的乙腈浓度洗脱。在将错误折叠形式的蛋白质与期望形式分开之外，反相步骤还从样品中清除内毒素。
将含有期望的折叠的IL-17A/F多肽的级分合并，并使用朝向溶液的温和氮气流来除去乙腈。将蛋白质通过透析或通过使用在配制缓冲液中平衡的G25Superfine(Pharmacia)树脂的凝胶过滤而配制至含有0.14M氯化钠和4％甘露醇的20mM Hepes pH6.8中，并无菌过滤。
实施例5：IL-17A/F在哺乳动物细胞中的表达
本实施例说明了通过哺乳动物细胞中的重组表达来制备潜在糖基化形式的IL-17A/F多肽。
采用载体pRK5(参见EP 307,247,1989年3月15日公布)作为表达载体。任选地，使用诸如Sambrook等，见上文所述的连接方法，用容许***IL-17A/FDNA的所选择的限制酶将IL-17A/F DNA连接入pRK5中。所得的载体称为pRK5-IL-17A/F。
在一个实施方案中，所选择的宿主细胞可以是293细胞。在组织培养平板中于培养基(诸如补充有胎牛血清，任选地，营养成分和/或抗生素的DMEM)中将人293细胞(ATCC CCL 1573)培养至汇合。将约10μgpRK5-IL-17A/F DNA与约1μg编码VA RNA基因的DNA[Thimmappaya等,Cell,31:543(1982)]混合，并溶解于500μl 1mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、0.227MCaCl2中。将500μl 50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4逐滴添加至该混合物，并容许沉淀物在25℃形成10分钟。将沉淀物悬浮，并添加至293细胞，并容许在37℃沉降约4小时。吸去培养基，并添加2ml PBS中的20％甘油达30秒。然后用无血清培养基清洗293细胞，添加新鲜培养基，并将细胞温育约5天。
转染后约24小时，除去培养基，并用培养基(单独的)或含有200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml 35S-甲硫氨酸的培养基更换。温育12小时后，收集条件化培养基，在旋转滤器上浓缩，并加载至15％SDS凝胶上。可以将处理后的凝胶干燥，并暴露于胶片达所选择的一段时间以揭示IL-17A/F多肽的存在。含经转染细胞的培养物可以进行进一步的温育(在无血清培养基中)，并在所选择的生物测定法中测试该培养基。
在一种备选的技术中，可以将IL-17A/F瞬时导入293细胞中，其使用Somparyrac等,Proc.Natl.Acad.Sci.,12:7575(1981)所述的硫酸右旋糖苷法进行。将293细胞在旋转烧瓶中培养至最大限度密度，并添加700μgpRK5-IL-17A/F DNA。首先通过离心从旋转烧瓶中浓缩细胞，并用PBS清洗。将DNA-右旋糖苷沉淀物在细胞沉淀物上温育4小时。将细胞用20％甘油处理90秒，用组织培养基清洗，并再次导入装有组织培养基、5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛运铁蛋白的旋转烧瓶中。约4天后，将条件化培养基离心，并过滤以除去细胞和碎片。然后可以将含有所表达的IL-17A/F多肽的样品浓缩，并通过任何所选择的方法(诸如透析和/或柱层析)来纯化。
在另一个实施方案中，可以在CHO细胞中表达IL-17A/F多肽。可以使用已知的试剂(诸如CaPO4或DEAE-右旋糖苷)来将pRK5-IL-17A/F转染入CHO细胞中。如上所述，可以温育细胞培养物，并将培养基用培养基(单独的)或含有放射性标记物(诸如35S-甲硫氨酸)的培养基更换。在确定存在IL-17A/F多肽后，可以用无血清培养基更换培养基。优选地，将培养物温育约6天，然后收获条件化培养基。然后可以将含有所表达的IL-17A/F多肽的培养基浓缩，并通过任何所选择的方法来纯化。
还可以在宿主CHO细胞中表达加有表位标签的IL-17A/F。可以将IL-17A/F从pRK5载体中亚克隆出来。亚克隆***物可以进行PCR，用以以符合读码框的方式与所选择的表位标签(诸如多His标签)融合入杆状病毒表达载体中。然后可以将加有多His标签的IL-17A/F***物亚克隆入SV40驱动的载体中，该载体含有供选择稳定克隆用的选择标志，诸如DHFR。最后，可以用SV40驱动的载体转染CHO细胞(如上文所述)。可以如上文所述的那样实施标记以检验表达。然后可以将含有所表达的加有多His标签的IL-17A/F的培养基浓缩，并通过任何所选择的方法(诸如通过Ni2+-螯合亲和层析)来纯化。
还可以将IL-17A/F多肽通过瞬时表达规程而在CHO和/或COS细胞中表达，或通过另一种稳定表达规程而在CHO细胞中表达。
使用如下规程来实施CHO细胞中的稳定表达。将蛋白质表达为IgG构建体(免疫粘附素)，其中将相应蛋白质的可溶形式(例如胞外结构域)的编码序列融合至含有铰链、CH2和CH2结构域的IgG1恒定区序列和/或是加有多His标签的形式。
PCR扩增后，在CHO表达载体中亚克隆相应DNA，其使用如Ausubel等,Current Protocols of Molecular Biology,单元3.16,John Wiley and Sons(1997)所述的标准技术。构建在感兴趣DNA的5’和3’具有相容限制性位点的CHO表达载体，用以容许cDNA的便利改组。用于CHO细胞中表达的载体如Lucas等,Nucl.Acids Res.,24:9(1774-1779(1996)所述的，并使用SV40早期启动子/增强子以驱动感兴趣cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达容许转染后选择质粒的稳定维持。
使用商品化转染试剂(Quiagen)、或(Boehringer Mannheim)，将12ug期望质粒DNA导入大约10x 106个CHO细胞中。如Lucas等,见上文所述的那样培养细胞。将大约3x 107个细胞冷冻在安瓿中，用于如下文所述那样的进一步培养和生产。
将装有质粒DNA的安瓿通过放置入水浴而融化，并通过涡旋而混合。将内含物吸入装有10ml培养基的离心管中，并在1000rpm离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬浮于10ml选择性培养基(含有5％0.2μm渗滤胎牛血清的0.2μm过滤PS20)。然后将细胞等分至装有90mL选择性培养基的100mL旋转器中。1-2天后，将细胞转移入装有150mL选择性生长培养基的250mL旋转器中，并在37℃温育。再过2-3天后，以3x 105个细胞/mL接种250mL、500mL和2000mL旋转器。通过离心和在生产培养基中重悬浮来用新鲜培养基更换细胞培养基。虽然可以采用任何合适的CHO培养基，但是实际上可以使用1992年6月16日公告的美国专利No.5,122,469所述生产培养基。以1.2x 106个细胞/mL接种3L生产旋转器。第0天，测定细胞数目和pH。第1天，对旋转器取样，并开始喷入经过过滤的空气。第2天，对旋转器取样，将温度变动至33℃，并添加30mL 500g/L葡萄糖和0.6mL 10％消泡剂(例如35％聚二甲基硅氧烷乳剂,Dow Corning 365医学级乳剂)。贯穿整个生产过程，根据需要调节pH以将其保持在约7.2。10天后，或直至生存力下降低于70％时，通过离心并过滤通过0.22μm滤器来收获细胞培养物。将滤出液贮存在4℃，或立即加载至纯化柱上。
对于加有多His标签的构建体，使用Ni-NTA柱(Qiagen)来纯化蛋白质。纯化之前，将咪唑添加至条件化培养基至5mM的浓度。将条件化培养基以4-5ml/min的流速泵至6ml Ni-NTA柱上，该柱已经在含有0.3M NaCl和5mM咪唑的20mM Hepes pH7.4缓冲液中平衡。加载后，用另外的平衡缓冲液清洗该柱，并用含有0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白质。随后将高度纯化的蛋白质用25ml G25Superfine(Pharmacia)柱来脱盐至含有10mM Hepes、0.14MNaCl和4％甘露醇pH6.8的贮存缓冲液中，并贮存在-80℃。
如下从条件化培养基中纯化免疫粘附素(含Fc的)构建体。将条件化培养基泵至5ml蛋白A柱(Pharmacia)上，该蛋白A柱已经在20mM磷酸钠缓冲液pH6.8中平衡。加载后，用平衡缓冲液彻底清洗该柱，之后，用100mM柠檬酸pH3.5洗脱。通过将1ml级分收集入装有275μL 1M Tris缓冲液pH 9的试管中而使洗脱的蛋白质立即中和。随后如上文关于加有多His标签的蛋白质所述那样使高度纯化的蛋白质脱盐至贮存缓冲液中。通过SDS-PAGE并通过以Edman降解进行的N末端氨基酸测序来评估同质性。
实施例6：IL-17A/F在酵母中的表达
以下方法描述了IL-17A/F多肽在酵母中的重组表达。
首先，构建酵母表达载体，用于来自ADH2/GAPDH启动子的IL-17A/F胞内生成或分泌。将编码IL-17A/F多肽的DNA和启动子***所选择质粒中的合适限制酶位点中以指导IL-17A/F多肽的细胞内表达。为了分泌，可以将编码IL-17A/F的DNA连同编码ADH2/GAPDH启动子、天然IL-17A/F信号肽或其它哺乳动物信号肽、或例如酵母α-因子或转化酶分泌信号/前导序列、和接头序列(在需要时)的DNA一起克隆入所选择的质粒中，用于表达IL-17A/F。
然后可以将酵母细胞(诸如酵母菌株AB110)用上文所述表达质粒转化，并在所选择的发酵培养基中培养。可以如下对经转化的酵母上清液进行分析，即用10％三氯乙酸沉淀，并通过SDS-PAGE分离，接着用考马斯蓝染料将凝胶染色。
随后可以如下分离并纯化重组IL-17A/F多肽，即通过离心从发酵培养基中除去酵母细胞，然后使用所选择的筒式过滤器(cartridge filter)来浓缩培养基。可以使用所选择的柱层析树脂来进一步纯化含有IL-17A/F多肽的浓缩液。
实施例7：IL-17A/F在经杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达
以下方法描述了IL-17A/F多肽在经杆状病毒感染的昆虫细胞中的重组表达。
将编码IL-17A/F的序列融合在杆状病毒表达载体内所包含的表位标签的上游。此类表位标签包括多His标签和免疫球蛋白标签(像IgG的Fc区)。可以采用多种质粒，包括自商品化质粒诸如pVL1393(Novagen)衍生的质粒。简言之，使用与5’和3’区互补的引物通过PCR来扩增编码IL-17A/F的序列或IL-17A/F编码序列的期望部分，诸如编码跨膜蛋白的胞外结构域的序列或编码成熟蛋白的序列(若该蛋白质是细胞外的话)。5’引物可以掺入侧翼的(所选择的)限制酶位点。然后将产物用那些所选择的限制酶消化，并亚克隆入表达载体。
使用Lipofectin(购自GIBCO-BRL)通过将上述质粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共转染入草地夜蛾(Spodoptera frugiperda,"Sf9")细胞(ATCC CRL 1711)而产生重组杆状病毒。在28℃温育4-5天后，收获所释放的病毒，并用于进一步扩增。如O'Reilley等,Baculovirus expression vectors:ALaboratory Manual,Oxford:Oxford University Press(1994)所述实施病毒感染和蛋白质表达。
然后可以通过例如Ni2+-螯合亲和层析如下纯化所表达的加有多His标签的IL-17A/F。如Rupert等,Nature,362:175-179(1993)所述的那样从经重组病毒感染的Sf9细胞中制备提取物。简言之，将Sf9细胞清洗，在超声处理缓冲液(25mL Hepes pH7.9、12.5mM MgCl2、0.1mM EDTA、10％甘油、0.1％NP-40、0.4M KCl)中重悬浮，并在冰上超声处理2次达20秒。通过离心来澄清超声处理物，并将上清液在加样缓冲液(50mM磷酸盐、300mM NaCl、10％甘油,pH7.8)中稀释50倍，并通过0.45μm滤器过滤。制备具有5mL柱床体积的Ni2+-NTA琼脂糖柱(购自Qiagen)，用25mL水清洗，并用25mL加样缓冲液平衡。将过滤后的细胞提取物以每分钟0.5mL加载至该柱上。用加样缓冲液将该柱清洗至基线A280，在该点开始收集级分。接着，用第二清洗缓冲液(50mM磷酸盐、300mM NaCl、10％甘油,pH6.0)清洗该柱，其洗脱非特异性结合的蛋白质。再次达到A280基线后，用第二清洗缓冲液中0至500mM咪唑梯度对该柱进行展开(develop)。收集1mL级分，并通过SDS-PAGE和银染色或使用偶联有碱性磷酸酶的Ni2+-NTA(Qiagen)进行的Western印迹来分析。收集含有所洗脱的加有His10标签的IL-17A/F的级分，并针对加样缓冲液透析。
或者，可以使用已知的层析技术(包括例如蛋白A或蛋白G柱层析)来实施加有IgG标签的(或加有Fc标签的)IL-17A/F的纯化。
实施例8：结合IL-17A/F的抗体的制备
本实施例说明了可特异性结合IL-17A/F的单克隆抗体的制备。
用于生产单克隆抗体的技术在本领域中是已知的，并记载于例如Goding,见上文中。可以采用的免疫原包括纯化的IL-17A/F多肽、包含IL-17A/F多肽的融合蛋白、及在细胞表面上表达重组IL-17A/F多肽的细胞。技术人员无需过度实验就可以进行免疫原的选择。
用在完全弗氏佐剂中乳化的IL-17A/F免疫原免疫小鼠(诸如BALB/c)，并以1-100μg的量皮下或腹膜内注射。或者，将免疫原在MPL-TDM佐剂(RibiImmunochemical Research,Hamilton,MT)中乳化，并注射入动物的后足垫中。然后在10至12天后用所选择的佐剂中乳化的额外免疫原加强经免疫的小鼠。此后数周，还可以通过额外的免疫注射来加强小鼠。可以通过眶后放血自小鼠周期性获得血清样品，用于在ELISA测定法中测试以检测抗IL-17A/F抗体。
在检出合适的抗体滴度后，可以给抗体为“阳性的”动物注射最后一次IL-17A/F静脉内注射。3至4天后，处死小鼠，并收获脾细胞。然后将脾细胞与所选择的鼠骨髓瘤细胞系(诸如P3X63AgU.1，获自ATCC，No.CRL 1597)融合(使用35％聚乙二醇)。融合生成杂交瘤细胞，然后可以将其铺在装有HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、及胸苷)的96孔组织培养板中以抑制非融合细胞、骨髓瘤杂合物、及脾细胞杂合物的增殖。
可在ELISA中对杂交瘤细胞筛选针对IL-17A/F的反应性。确定分泌针对IL-17A/F的期望单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞是在本领域技术范围之内的。
可以将阳性杂交瘤细胞腹膜内注射入同基因BALB/c小鼠中以生成含有抗IL-17A/F单克隆抗体的腹水。或者，可以将杂交瘤细胞在组织培养瓶或滚瓶中培养。可以使用硫酸铵沉淀接着通过凝胶排阻层析来实现腹水中生成的单克隆抗体的纯化。或者，可以采用基于抗体对蛋白A或蛋白G的结合的亲和层析。
实施例9：使用特异性抗体进行的IL-17A/F多肽纯化
可以通过蛋白质纯化领域中的多种标准技术来纯化天然或重组IL-17A/F多肽。例如使用对感兴趣IL-17A/F多肽特异性的抗体通过免疫亲和层析来纯化IL-17A/F多肽原(pro-IL-17A/F polypeptide)、成熟IL-17A/F多肽、或IL-17A/F前多肽(pre-IL-17A/F polypeptide)。一般而言，通过将抗IL-17A/F多肽抗体共价偶联至活化的层析树脂而构建免疫亲和柱。
或是通过硫酸铵沉淀或是通过固定化蛋白A(Pharmacia LKBBiotechnology,Piscataway,N.J.)上的纯化来从免疫血清中制备多克隆免疫球蛋白。类似地，通过硫酸铵沉淀或固定化蛋白A上的层析来从小鼠腹水中制备单克隆抗体。将部分纯化的免疫球蛋白共价附着至层析树脂，诸如CnBr活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)。依照制造商的说明书，将抗体偶联至树脂，封闭树脂，并清洗衍生树脂。
通过从含有可溶形式的IL-17A/F多肽的细胞中制备级分而在IL-17A/F多肽的纯化中利用这种免疫亲和柱。通过添加去污剂或通过本领域公知的其它方法来溶解全细胞或经由差速离心获得的亚细胞级分而衍生这种制备物。或者，含有信号序列的可溶性IL-17A/F多肽可以有用数量被分泌至培养细胞的培养基中。
使含有可溶性IL-17A/F多肽的制备物流过免疫亲和柱，并在容许IL-17A/F多肽优先吸附的条件(例如存在去污剂时的高离子强度缓冲液)下清洗该柱。然后，在破坏抗体/IL-17A/F多肽结合的条件(例如低pH缓冲液，诸如大约pH2-3，或高浓度离液剂诸如尿素或硫氰酸根离子)下洗脱柱，并收集IL-17A/F多肽。
实施例10：药物筛选
本发明对于通过使用IL-17A/F多肽或其结合片段以多种药物筛选技术之任一种来筛选化合物是特别有用的。在此类测试中所采用的IL-17A/F多肽或片段可以是在溶液中游离的、附着于固体支持物的、细胞表面上携带的、或位于胞内的。药物筛选的一种方法利用经表达IL-17A/F多肽或片段的重组核酸稳定转化的真核或原核宿主细胞。在竞争性结合测定法中针对此类经转化的细胞筛选药物。可以将可存活形式或固定形式的此类细胞用于标准结合测定法。例如可以测量IL-17A/F多肽或片段与所测试药剂之间的复合物形成。或者，可以检查由所测试药剂引起的IL-17A/F多肽与其靶细胞或靶受体之间复合物形成减少。
如此，本发明提供了筛选可影响IL-17A/F多肽相关疾病或病症的药物或任何其它药剂的方法。这些方法包括使此类药剂与IL-17A/F多肽或其片段接触，并通过本领域中公知的方法来测定(i)所述药剂与IL-17A/F多肽或片段间复合物的存在，或(ii)IL-17A/F多肽或片段与所述细胞间复合物的存在。在此类竞争性结合测定法中，IL-17A/F多肽或片段通常是标记的。在合适的温育后，将游离的IL-17A/F多肽或片段与以结合形式存在的IL-17A/F多肽或片段分开，并且游离的或未复合的标记物的量是具体药剂结合IL-17A/F多肽或干扰IL-17A/F多肽/细胞复合物能力的量度。
用于药物筛选的另一种技术提供了对多肽具有合适的结合亲和力的化合物的高通量筛选，并详细记载于1984年9月13日公布的WO 84/03564中。简言之，在固体基片(诸如塑料针(pin)或一些其它表面)上合成大量的不同小肽测试化合物。在应用于IL-17A/F多肽时，将肽测试化合物与IL-17A/F多肽起反应，并清洗。通过本领域中公知的方法来检测结合的IL-17A/F多肽。也可以将纯化的IL-17A/F多肽直接包被于平板上，用于在上文所述药物筛选技术中使用。另外，可以使用非中和性抗体来捕捉肽，并将其固定化在固体支持物上。
本发明还涵盖竞争性药物筛选测定法的使用，其中能够结合IL-17A/F多肽的中和性抗体与测试化合物特异性竞争对IL-17A/F多肽或其片段的结合。如此，可以使用抗体来检测与IL-17A/F多肽共享一种或多种抗原决定簇的任何肽的存在。
实施例11：理性药物设计
理性药物设计的目的是生成感兴趣的生物学活性多肽(即IL-17A/F多肽)或与其相互作用的小分子(例如激动剂、拮抗剂、或抑制剂)的结构类似物。可以使用这些实施例之任一个来塑造如下的药物，其是更具活性或更稳定形式的IL-17A/F多肽或其在体内增强或干扰IL-17A/F多肽的功能(参见Hodgson,Bio/Technology,9:19-21(1991))。
在一种方法中，通过X射线晶体学、计算机建模(modeling)或(更通常的是)这两种方法的组合来测定IL-17A/F多肽或IL-17A/F多肽-抑制剂复合物的三维结构。必须确定IL-17A/F多肽的形状和电荷两者来阐明结构和确定分子的活性位点。较不常见地，可以通过基于同源蛋白质结构的建模来获得关于IL-17A/F多肽结构的有用信息。在这两种情况中，使用有关的结构信息来设计类似的IL-17A/F多肽样分子或鉴定高效的抑制剂。理性药物设计的有用例子可以包括如下的分子，其如Braxton和Wells,Biochemistry,31:7796-7801(1992)所示具有改善的活性或稳定性或其如Athauda等,J.Biochem.,113:742-746(1993)所示起天然肽的抑制剂、激动剂、或拮抗剂的作用。
还有可能分离通过上文所述功能性测定法所选择的靶物特异性抗体，然后解析其晶体结构。此方法原则上产生药物团(pharmacore)，随后的药物设计可以以其为基础。有可能通过生成功能性的、有药理学活性的抗体的抗独特型抗体(抗id)而完全规避蛋白质晶体学。作为镜像之镜像，抗id的结合位点会是原始受体的类似物。然后可以使用抗id自化学或生物学方法生成的肽库鉴定并分离肽。然后分离的肽会起药物团的作用。
依靠本发明，可以获得足够量的IL-17A/F多肽以实施诸如X射线晶体学的分析研究。另外，本文所提供的IL-17A/F多肽氨基酸序列的知识会对那些替代X射线晶体学或在X射线晶体学外采用计算机建模技术的人提供指导。
实施例12：体内疾病模型
在类风湿性关节炎和多发性硬化的小鼠模型中评估组合抗IL-17A和IL-17F抗体作为自身免疫病治疗性处理的效果。所测试的小鼠模型包括经II型胶原处理以诱导胶原诱发的关节炎(CIA)的小鼠(类风湿性关节炎(RA)的鼠模型)或经髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)处理以诱导实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的小鼠(多发性硬化(MS)的鼠模型)。
(1)CIA
在第0天用100μl完全弗氏佐剂(CFA)中的100μg牛II型胶原免疫7-8周龄的DBA-1J小鼠(Jackson Lab；Bar Harbor,Maine)。(Barck等,Arthritis&Rheumatism,50:3377-3386(2004))。在尾的基部在右侧皮内(i.d.)注射CFA中的II型胶原。在第21天，在尾的左侧皮内注射100μl不完全弗氏佐剂中的100μg牛II型胶原。在第45天，将动物分入以下各组：(1)100μl盐水中的鼠IgG2a同种型对照单抗(MuIgG2a)6mg/kg，皮下(SC)每周3次持续7周(n＝40)；(2)100μl盐水中的鼠TNFRII-Fc(Enbrel的鼠代替物)(MuTNFII-Fc)4mg/kg+100μl盐水中的甲氨蝶呤(MTX)3mg/kg，SC每周2次持续7周(n＝40)；及(3)100μl盐水中的仓鼠-鼠嵌合抗IL-17A(MuAnti-IL17)和仓鼠-鼠嵌合抗IL-17F(MuAnti-IL-17F)单克隆抗体(单抗)6mg/kg，SC每周3次持续7周(n＝40)。
使用标准关节炎评分方法在第33天开始每周2次对动物评分。评分为0-4/爪(其中0意指没有疾病，而4表示整个爪牵涉红斑和水肿)，且每只动物最高分为16分。在第45天基于体重和疾病评分使处理组1-3中的动物随机化。平衡三个处理组以包含相等数目的具有轻度(平均评分0-3；每个处理组22-23只小鼠)、中度(平均评分4-8；每个处理组11-13只小鼠)及重度(平均评分9及以上分；每个处理组4-6只小鼠)疾病的小鼠。在研究终止时即在第81天拍摄关节的微型计算机断层摄影术(MicroCT)(Barck等,Arthritis&Rheumatism,50:3377-3386(2004))图象，并计算关节皮质骨体积(JCBV)。
在经II型胶原处理以诱导胶原诱发的关节炎(CIA)的DBA-1J小鼠中，抗IL-17A和抗IL-17F抗体的组合(第3组)导致在与仅用对照IgG2a处理的小鼠(第1组)在第81天的终末临床得分相比时在第81天的终末临床得分降低(p＝0.02(杜奈特氏(Dunnett)检验；Hsu,J.C.,Multiple Comparisons Theory andMethods,Chapman和Hall(1996))。进一步地，在经II型胶原处理以诱导胶原诱发的关节炎(CIA)的DBA-1J小鼠中，用抗IL-17A和抗IL-17F抗体的组合进行的处理保护小鼠免于骨损伤，正如与用鼠IgG2a同种型对照单抗处理的小鼠中大约3.7的JCBV相比抗IL-17A和IL-17F处理组的更大关节皮质骨体积(JCBV)即大约4.5所测量的(p<0.001；杜奈特氏检验)。
IL-17A和IL-17F抗体的组合在患有CIA的小鼠中降低终末临床疾病得分并在患有CIA的小鼠中阻断骨损伤的能力提示IL-17A和IL-17F的组合可作为自身免疫病(诸如类风湿性关节炎)的治疗靶。
在一项相似的实验中，在研究中增添仅用抗IL17A抗体进行的处理，创建第4组。在图19和20中显示了结果。对照是同种型匹配的抗人豚草IgG2a抗体(Genentech,Inc.)，其在图中列为“豚草”。每只爪的临床得分使用以下标准来决定：
0＝没有红斑和肿胀的证据
1＝限于爪中段(跗)或踝的红斑和轻度肿胀
2＝自踝延伸至爪中段的红斑和轻度肿胀
3＝自踝延伸至跖关节的红斑和轻度肿胀
4＝红斑和严重肿胀涵盖踝、爪及趾
平均评分＝四只爪得分的总和
平均日临床得分＝日平均评分的平均值
终末临床得分＝在研究的最后一天的平均评分
数据显示抗IL17A和抗IL17F抗体的组合以统计学显著方式比仅用抗IL17A进行的处理更有效。
(2)EAE
如下文所述用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导四组小鼠(每组15只小鼠)，另外，各组在用CFA中的MOG35-55肽抗原诱导后每周三次接受下列抗体剂量：(1)(第1组)鼠IgG2a同种型对照单抗(抗GP120抗体)，100μl盐水中的6mg/kg，经由腹膜内注射(IP)；(2)(第2组)仓鼠-鼠嵌合抗IL-17A(MuAnti-IL17)单抗，100μl盐水中的6mg/kg，经由IP；(3)(第3组)仓鼠-鼠嵌合抗IL-17F(MuAnti-IL17F)单抗，100μl盐水中的6mg/kg，经由IP；和(4)(第4组)仓鼠-鼠嵌合抗IL-17A(MuAnti-IL17)单抗，100μl盐水中的6mg/kg，经由IP，及仓鼠-鼠嵌合抗IL-17F(MuAnti-IL17F)单抗，100μl盐水中的6mg/kg，经由IP。
在用MOG进行诱导前一天(第-1天)，施用上文所述抗体剂量作为第一剂。在用MOG进行诱导当天(第0天)，用200μl在100μl PBS和100μl CFA中含有200μg MOG35-55肽(Liu等,Nat.Med.,4(1):78-83(1998)；Suen等,J.Exp.Med.,186(8):1233-40(1997))的乳剂皮内免疫小鼠，所述CFA是通过将不完全弗氏佐剂(IFA)与结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37A(死的且干燥的)混合至CFA中结核分枝杆菌的浓度为2mg/ml(每只小鼠200μg结核分枝杆菌)而制备的。经由IP给小鼠进一步注射200ng在100μl PBS中的百日咳毒素。
在第2天，经由IP给小鼠进一步注射200ng在100μl PBX中的百日咳毒素。
对于研究的剩余时间，每周三次给小鼠施用上文所述抗体剂量。
在第1天开始，使用多发性硬化评分方法(下文所述的)每周至少三次对小鼠评估临床疾病。进一步地，每天评估达到疾病等级4的小鼠(若等级4的动物在5天中没有缓和至等级3或更小，则将动物处以安乐死)。更进一步地，在研究结束时评估脊髓和脑中的淋巴细胞。使用如下分级***来评估多发性硬化评分方法：(1)等级0表示没有明显疾病征候的正常小鼠；(2)等级1表示尾软弱无力(limpl)(在挑选小鼠时尾软弱无力描述为尾的完全肌肉松弛(flaccidity)及尾尖端卷曲缺乏)或后肢虚弱(后肢虚弱描述为蹒跚步态，客观征候是在爬行中小鼠后肢跌入钢丝笼顶部)，但不是两者同时存在；(3)等级2表示尾软弱无力及后肢虚弱；(4)等级3表示部分的后肢麻痹(部分的后肢麻痹描述为小鼠不能使用后肢来维持臀部姿势或爬行，但仍可以一定程度移动一肢或两肢)；(5)等级4表示完全的后肢麻痹(完全的后肢麻痹描述为后肢完全丧失运动，小鼠仅依靠其前肢拖拽自身)；和(6)等级5表示EAE引起的濒死状态和死亡(出于人道原因处以安乐死)。
在患有髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱发的实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的小鼠中，抗IL-17A和抗IL-17F抗体的组合(第4组)导致在与用gp120处理的小鼠(第1组)在第34天的终末临床得分相比时在第34天的终末临床得分降低(p<0.01；杜奈特氏检验)。单独的抗IL-17A(第2组)或抗IL-17F(第3组)在降低临床得分上不如组合的抗IL-17A和抗IL-17F有效。来自MOA和CIA模型的结果提示自身免疫病(诸如类风湿性关节炎(RA)和多发性硬化(MS))的治疗可要求组合地阻断IL-17A和IL-17F二者途径。
IL-17A抗体和IL-17F抗体的组合在患有MOG诱发的EAE的小鼠中降低终末临床疾病得分的能力提示IL-17A和IL-17F的组合可成为自身免疫病(多发性硬化)的治疗靶。靶向IL-17A和IL-17F的联合疗法可包括双重特异性/交叉反应性抗体(识别基于序列同源性或如实施例15中所述结构域同源性的、在IL-17A和IL-17F两者上都存在的相同或相似表位的抗体)、双特异性抗体(改造成识别IL-17A和IL-17F两者的抗体，例如抗体的一条臂识别IL-17A而同一抗体的另一条臂识别IL-17F，或抗体的重链识别IL-17A而同一抗体的轻链识别IL-17F)及联合施用的IL-17A抗体+IL-17F抗体(两种抗体，一种识别IL-17A而一种识别IL-17F)。
实施例13：体外T细胞活化
T辅助细胞谱系ThIL-17(其不同于Th1和Th2(参见10/29/03提交的US2004/0156849，和美国申请No.10/697,599)，而且其生成IL-17)受IL-23(Hunter等,Nat.Rev.Immunol.,5:521-531(2005)；Holscher等,Curr.Opin.Invest.Drugs,6:489-495(2005))以及其它细胞因子诸如IL-6和TNFβ(Veldhoen M等,Immunity,24:179-89(2006))的刺激。为了测定ThIL-17细胞中IL-17A和IL-17F的生成水平，用IL6和TGFβ活化T细胞，并通过PCR分析来定量IL-17A和IL-17F的水平。关于ThIL-17细胞的新出现数据提示此T细胞子集能够诱导组织炎症及自身免疫，如此在自身免疫病中发挥重要作用(Bettelli等,Nat Immunol,8:345-350(2007))。
将经FACS纯化的未免疫的CD4+CD62L+CD25-CD44hi(大于99％纯度)T细胞(未免疫的CD4+T细胞群体)在经αCD3(抗CD3抗体)包被的平板上温育48小时。在以下各组中于溶液中如下添加细胞因子(包括IL-6、IL-27及TGFβ)和αCD28(抗CD28抗体)：(1)没有细胞因子，(2)IL-6，(3)IL-27，(4)IL-6+IL-27，(5)IL-6+TGFβ，或(6)IL-6+TGFβ+IL-27。通过定量PCR分析来测定IL-23R、IL-17A、及IL-17F的表达，并相对于rpl19标准化。(什么是rp119？)通过将表达相对于在刺激前在经FACS纯化的细胞中测量的表达标准化来计算倍数诱导。
由IL-6和TGFβ进行的体外T细胞活化导致在与没有处理进行的活化(第1组)、仅用IL-6进行的活化(第2组)、仅用IL-27进行的活化(第3组)、用IL-6+IL-27进行的活化(第4组)、及用IL-6+TGFβ+IL-27进行的活化(第6组)相比时升高的IL-17A(大约18,000倍数诱导)及IL-17F(大约300,000倍数诱导)生成(第5组)(图13)。
IL-6和TGF-β诱导IL-17A和IL-17F两者生成的结果与来自实施例12的体内结果的组合提示通过阻断ThIL-17细胞的功能而进行的自身免疫病(诸如类风湿性关节炎和多发性硬化)的有效治疗可以包括对IL-17A和IL-17F两者的抑制。靶向IL-17A和IL-17F的联合疗法可包括双重特异性/交叉反应性抗体(识别基于序列同源性或如实施例15中所述结构域同源性的、在IL-17A和IL-17F两者上都存在的相同或相似表位的抗体)、双特异性抗体(改造成识别IL-17A和IL-17F两者的抗体，例如抗体的一条臂识别IL-17A而同一抗体的另一条臂识别IL-17F，或抗体的重链识别IL-17A而同一抗体的轻链识别IL-17F)及联合施用的IL-17A抗体+IL-17F抗体(两种抗体，一种识别IL-17A而一种识别IL-17F)。
实施例14：受体/配体相互作用的鉴定——用于鉴定受体/配体相互作用的PRO多肽的筛选测定法的综述
在本测定法中，为了鉴定受体/配体相互作用的目的对多种PRO多肽测试了对一组潜在的受体或配体分子的结合能力。已知受体的配体、已知配体的受体或新受体/配体对的鉴定对于多种指征(indication)是有用的，包括例如将生物活性分子(连接有配体或受体的)靶向已知表达受体或配体的细胞；使用受体或配体作为试剂以检测配体或受体在怀疑含有其的组合物中的存在，其中所述组合物可以包含怀疑表达配体或受体的细胞；调控已知表达或应答受体或配体的细胞的生长或另一种生物学或免疫学活性；调控表达受体或配体的细胞的免疫应答或针对表达受体或配体的细胞的免疫应答；容许制备针对受体或配体的激动剂、拮抗剂和/或抗体，其会调控表达受体或配体的细胞的生长或生物学或免疫学活性；及对于普通技术人员显而易见的各种其它指征。
一般而言，如下实施测定法。将怀疑是受体的配体的本发明PRO多肽以包含人IgG的Fc结构域的融合蛋白(免疫粘附素)表达。如下检测受体-配体结合，即容许免疫粘附素多肽与表达候选PRO多肽受体的细胞(例如Cos细胞)相互作用，用针对Fc融合结构域的荧光试剂显现所结合的免疫粘附素，并通过显微镜来检查。通过平行地瞬时转染编码可发挥受体分子功能的PRO多肽的cDNA表达载体的文库的确定子集来生成表达候选受体的细胞。然后将细胞在所测试的PRO多肽免疫粘附素的存在下温育1小时以实现可能的受体结合。然后清洗细胞，并用低聚甲醛固定。然后将细胞与荧光偶联的针对PRO多肽免疫粘附素的Fc部分的抗体(例如FITC偶联的山羊抗人Fc抗体)一起温育。然后再次清洗细胞，并通过显微镜来检查。根据经编码具体PRO多肽受体或受体集合的cDNA转染的细胞的荧光标记的存在及类似制备的经其它cDNA或cDNA集合转染的细胞的类似荧光标记的缺乏来判断阳性相互作用。若断定cDNA表达载体的确定集合对于与PRO多肽免疫粘附素的相互作用是阳性的，则个别地测试构成集合的cDNA种类个体(将集合“分拆”("broken down"))以确定编码能够与PRO多肽免疫粘附素相互作用的受体的特定cDNA。
在本测定法的另一个实施方案中，容许加有表位标签的潜在配体PRO多肽(例如8组氨酸"His"标签)与一组如下的潜在受体PRO多肽分子相互作用，所述潜在受体PRO多肽分子已经以与人IgG的Fc结构域的融合物(免疫粘附素)表达。在与加有表位标签的PRO多肽共温育1小时后，用蛋白A珠免疫沉淀每种候选受体，并清洗珠子。通过用针对表位标签的抗体进行的免疫沉淀复合物的Western印迹分析来测定潜在的配体相互作用。若在用候选受体进行的Western印迹分析中观察到加有表位标签的蛋白质的预期分子量的条带，则判断发生了相互作用，但用潜在受体组的其它成员时未观察到发生相互作用。
使用上文所述测定法，本文中鉴定出下列受体/配体相互作用：
(1)PRO1031(本文中称为人IL-17B配体)结合PRO5801(本文中称为人IL-17RH1受体)。
(2)PRO10272(本文中称为人IL-17E配体)结合PRO5801(本文中称为人IL-17RH1受体)。
(3)PRO20110(本文中称为人IL-17F配体)结合人IL-17受体(IL-17R)[(Yao等,Cytokine,9(11):794-800(1997)；本文中也称为PRO1]和PRO20040(本文中称为人IL-17RH2受体)。
(4)PRO1031(IL-17B配体)和PRO1122(IL-17C配体)不结合人IL-17受体(Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),97(2):773-778(2000))。
实施例15：IL-17F受体结合；IL-17F结构测定
A.方法
(1)结合测量
通过在Pharmacia BIAcore 1000仪(Phamacia Biosensor,Piscataway NJ)上进行的SPR测量来测定IL-17、IL-17E(PRO10272)、或IL-17F(PRO20110)结合IL-17R或IL-17RH1(PRO5801)的动力学和亲和力。通过使用制造商开发的方案将IL-17配体或受体经由随机偶联至氨基(即N-羟基琥珀酰亚胺化学)而固定化至CM5传感器芯片的流动池上。对IL-17R、IL-17RH1、及IL-17F获得大约500个响应单位(RU)的固定化水平，而IL-17和IL-17E的固定化水平分别是1200和1500RU。对IL-17R结合固定化IL-17获得强信号。然而，在IL-17R固定化时，对IL-17结合仅获得弱信号，这提示受体固定化灭活了结合位点。在用乙醇胺封闭未反应的位点后，使用25μL/min的流速实施结合测量。获得一系列6个两倍连续稀释的蛋白质溶液的传感图。所使用的最高浓度是1000或500nM蛋白质，并且溶液是在运行缓冲液即含有0.05％Tween-20的PBS中制备的。通过注射25μL等分试样的0.1M乙酸、0.2M NaCl pH3来洗脱非共价结合的蛋白质而在结合循环之间再生传感器芯片表面。使用制造商提供的软件通过非线性回归分析依照1:1结合模型评估传感图。在分开的、测量IL-17变体间受体结合竞争的实验中，将固定浓度的受体与不同浓度的IL-17蛋白一起温育，接着将该混合物注射至具有固定化IL-17蛋白的流动池上。自结合阶段完成后所获得的共振信号测定所结合的受体的量。
(2)晶体学
IL-17F在悬滴中在含有1.0M硫酸锂、0.5M硫酸铵、1％乙醇、及100mM柠檬酸钠pH5.6的孔溶液上于19℃结晶为六方形片状体。将晶体收获至由没有乙醇的所述孔溶液组成的人工母液中。在收集数据前，将晶体浸没于含20％甘油的人工母液中，并在液氮中瞬间冷却。在内部(in-house)旋转阳极发生器上用CuKα辐射收集初始数据，并发现空间群是P61或P65，且两个二聚体在不对称单元中。为了相位调整(phasing)，通过在补充有2mM Thimersol的人工母液中浸泡6小时来使晶体衍生化。在斯坦福同步加速器辐射实验室在光束线(beam line)9-2处收集本地数据集(native data set)和三波长Hg MAD(多波长异常衍射)实验。使用HKL软件包中的程序来处理数据集(Otwinowski,Z.和Minor,W.,Methods Enzymol.,176:307-326(1997))。使用CCP4程序套件来实施结构测定(CCP4,Acta Cryst.,D50:760-763(1994))。Patterson图像指示数个良序Hg原子的存在，所述良序Hg原子的位置使用程序Rantan来测定。用MLPHARE来实施相位精修(phase refinement)。DM改良图像的检查指示空间群是P65，并揭示非晶体学对称性(NCS)算子(operator)。每个原聚体(protomer)在等同的NCS相关位点处结合单个Thimerosal。
将初始结构建成四重NCS平均的(four-fold NCS-averaged)且溶剂展平的(solvent flattened)实验图像，并使用如Molecular Simulations,Inc.改良的程序REFMAC_4.0(CCP4,Acta Cryst.,D50:760-763(1994))及Brünger,A.T.(1992),X-PLOR手册,第3.1版(New Haven,Connecticut:Yale University)来精修。在薄分辨率壳层(thin resolution shell)中选择为计算自由R值隔离的反射(reflection)。在位置精修、模拟退火、及各向同性温度因子精修过程中使用最大似然目标函数(maximum likelihood target function)、总体各向异性校正(overall anisotropic correction)、及实空间大量溶剂校正(real-space bulk-solventcorrection)。针对2.65Δ远程数据集(remote data set)进行初始的精修，但Hg位点周围的无序证明难以建立模型，因此使用自由R反射的相同集合，针对2.85Δ本地数据集实施最终的精修。在最终的模型中，4个载体衍生的残基、残基1至8、及残基128-133在原聚体A、B和X中是无序的，而残基1-6及130-133在原聚体Y中是无序的。在XY二聚体中，内部环(残基X20-X23和Y20-Y25)是无序的；此相同的环在AB单体中是低度有序的(poorly ordered)。拉马钱德兰图(Ramachandran plot)显示了所有非甘氨酸、非脯氨酸残基的90％在最有利区(most favored region)中，9.2％在别的容许区(additional allowed region)中，0.7％(3个残基)在宽大容许区(generously allowed region)中，而没有残基在不容许区(disallowed region)中。数据收集和精修统计在表8中。IL-17F的坐标已经存储于蛋白质数据库(Protein Data Bank)中，但是还未分配存取码。使用程序Areaimol和Resarea(CCP4,Acta Cryst.,D50:760-763(1994))来进行可及表面积计算。使用程序Molscript(Kraulis,P.J.,J.Appl.Cryst.,103:1345-1352(1999))；Raster3D(Merrit,E.A.和Murphy,M.E.P.,Acta Cryst.,D50:869-873(1994))；Insight97(MSI)和Grasp(Nichols等,Proteins,11:281-296(1991))来分析并制作图15、17和18。
B.结果与讨论
(1)受体结合
使用表面等离振子共振(SPR)来测定IL-17F(PRO20110)是否结合据报道结合IL-17蛋白的两种受体即IL-17R(称为PRO1)和IL-17RH1(PRO5801)之任一种的胞外结构域(ECD)。然而，没有观察到IL-17R或IL-17RH1(分别高至1和0.5μM)对固定化IL-17F的结合。比较而言，IL-17R以适中的结合亲和力结合固定化IL-17(参见下文表8)，这与先前关于此相互作用的亲和力的报道相一致(Yao等,Cytokine,9:794-800(1997))。类似地，IL-17RH1显示对IL-17E的高亲和力结合(表7)，这与对自细胞诱导IL-8释放观察到的效力相一致(Lee等,J.Biol.Chem.,276:1660-1664(2001))。此外，如预期的那样在IL-17RH1和IL-17间及IL-17E和IL-17R间没有观察到结合(Shi等,J.Biol.Chem.,275:19167-19176(2000)；Lee等,J.Biol.Chem.,276:1660-1664(2001))。
为了测试IL-17R或IL-17RH1结合IL-17F的缺乏是否可能是固定化相关活化的结果，在竞争实验中测试IL-17F/受体结合。在这些实验中，将固定浓度的IL-17R(500nM)或IL-17RH1(31nM)与不同浓度的配体一起温育，然后注射在IL-17或IL-17E表面上。虽然可溶性IL-17可以有效地阻断IL-17R对固定化IL-17的结合，但是使用2μM IL-17F时没有观察到竞争。此外，1.3μM IL-17F不可阻断IL-17RH1对固定化IL-17E的结合，虽然结合被可溶性IL-17E完全抑制。这些结果指明IL-17F不以高亲和力结合IL-17R或IL-17RH1的纯化的单体ECD。如实施例14中所示(图14)，显示了IL-17F配体结合新的IL-17RH2受体(PRO20040)。
虽然IL-17F表现出具有与IL-17的活性相关的活性，但是IL-17F在体外不以高亲和力结合IL-17R。然而，可以检出IL-17F对经IL-17R转染的Cos细胞的结合增强(未显示)，这提示IL-17F可能能够利用IL-17R，但仅在与另外的、尚未鉴定的成分组合以形成高亲和力信号传导复合物时。对IL-17假定了类似的机制以解释受体亲和力和其生物学活性效力之间的矛盾(Yao等,Cytokine,9:794-800(1997))。本文中所提出的结果提示，不管所牵涉的受体，IL-17F信号传导导致与IL-17刺激IL-17R类似的下游活性。
表8
受体结合固定化IL-17和IL-17E的动力学和亲和力
(2)IL-17F的结构测定
通过多波长Hg异常衍射方法来解析人IL-17F的结构，并以2.85Δ分辨率精修至28.8％的Rfree和23.3％的Rcryst(参见下文表9)。IL-17F原聚体的核心是由两对反向平行的β-链组成的；一对包括链1(残基52-59)和2(残基66-73和77-79)，而另一对包括链3(89-103)和4(110-125)。链2被一小段不规则β-结构所中断。两个二硫桥(Cys72/Cys122和Cys77/Cys124)连接链2和4。第3个二硫桥(Cys17/Cys107)连接一个原聚体的链3和4之间的环至邻近原聚体的N端延伸物，形成广泛的二聚体接触(如下文所讨论的)。此N端延伸物也包含β-链(链0，残基25-32)(其与另一个原聚体上的链3'形成氢键)，及小的α-螺旋(残基43-48)。在Asn53处观察到额外的电子密度，这与根据纯化的蛋白质的序列分析和表征所预期的此残基的糖基化相一致。
此结构揭示IL-17F是胱氨酸结蛋白质家族的远缘同系物(McDonald,N.Q.和Hendrickson,W.A.,Cell,73:421-424(1993))，所述胱氨酸结蛋白质家族以其不寻常的胱氨酸连接方式命名(图15)。胱氨酸结的特征在于两套由链2和4之间的二硫键连接的成对β-链(链1和2及链3和4)(图15A，插图)。第3个二硫桥穿过此大环而连接链1和3。比较而言，IL-17F仅包含给予该家族其名称的三个特殊胱氨酸连接中的两个。在IL-17F中，Cys72/Cys122和Cys77/Cys124二硫键形成典型胱氨酸结的大环。不存在会通过穿过此大环来形成“结”的第3个二硫键；替代地，残基50和89(其与胱氨酸结蛋白质中的第3个二硫键位于相同的三维空间中)是IL-17F中的丝氨酸。虽然Ser50与结蛋白质中的相应半胱氨酸处于相同的构象，但是Ser89则不然。值得注意的是，丝氨酸在所有IL-17家族成员中的这些位置中都是保守的(参见图16)，尽管事实上结构提示第3个二硫键可被容纳。
表9
晶体学统计
数据收集和MAD相位调整
a括弧中的数值指最高的分辨率壳层。
b Rsym＝3*I-<I*/3I.<I>是独特反射的对称性相关观察的平均强度。
c在Hg统计中Bijvoet反射保持独立。
d相位调整统计针对F>2σ的反射。
e R＝3*Fo-Fc*/3Fo
(3)二聚化
IL-17F以与神经生长因子(NGF)和其它神经营养因子(neutrophin)类似的平行方式二聚化(McDonald等,Nature,354:411-414(1991))。然而，二聚体界面是异常大的，与NGF的总计3400Δ2(每个单体大约1700Δ2)相比其埋藏(bury)总计6800Δ2(或每个单体大约3400Δ2)(PDB代码1WWW；Weismann等,Nature,401:184-188(1999))。大约1/3的界面是通过一个单体的链3和4与另一个单体中的相同链之间的相互作用来形成的，这与在神经营养因子中看到的二聚体界面类似。只有IL-17F才有的是通过相互作用而埋藏的大量表面积，其牵涉每个原聚体的N端延伸物(残基8-48)伸过规范的二聚体界面，并相对于另一原聚体的各部分包装(packing)。
IL-17F二聚体的总体主链结构可以描述为外衣(garment)，其中片层1/2和1'/2'形成袖子，胱氨酸结二硫键给衣领做衬里，而片层3/4和3'/4'连同N端延伸物形成主体，其以在底部形成下摆的两个三链片层(其牵涉链4/3/0'和0/3'/4')结束，(图15的B小图；尺度65Δx 25Δx 30Δ)。分子表面上的显著特征是位于二聚体界面处的异常大的空穴(18Δx 10Δx 10Δ深)，其在外衣中基本上像口袋那样定位。空穴的基底是由链3和3'中的残基(来自两条链的Gln95、Glu96、Thr97、及Leu98)及链4和4'中的残基(Lys115'、Val118、及Val120')形成的。N端中的残基给空穴的一边衬里(残基Arg37、Val38、Met40)，而另一边是由来自链1(Tyr54)、链2(Val68、Glu66)、及这些链之间的转角(Tyr63和Pro64)的残基衬里的。Tyr63和Pro64之间的肽键处于不寻常的顺式构象。因为此脯氨酸在所有IL-17序列中是保守的且前面始终是大的疏水残基(参见图16)，因此此肽键在所有IL-17家族成员中都处于顺式构象是不可能的。含汞化合物Thimerosal(其用于使结构调整相位)在此空穴的较低末端中结合(如图17中所取向的)，占据30％的空间。
上文所讨论的结构特征表明IL-17同系物(IL-17F)是胱氨酸结折叠超家族的成员，并与NGF亚家族的成员类似地二聚化。IL-17蛋白与超家族的其它成员共享很小的序列相似性。例如，IL-17F与NGF的基于结构的序列比对揭示仅10个残基的同一性，包括胱氨酸结基序中保守的4个半胱氨酸(未显示)。有限的序列保守性对于胱氨酸结折叠超家族是典型的(McDonald,N.Q.和Hendrickson,W.A.,Cell,73:421-424(1993))。
IL-17F的结构容许推广至其它IL-17家族成员。包括β-片层和大环二硫键的位置的胱氨酸结折叠应当保持在所有IL-17同系物中(图16)。具体地，IL-17与IL-17F是如此类似(它们共享几乎50％的序列同一性)以致有可能预测IL-17和IL-17F在何处会共享表面特征及它们在何处会分歧。图17显示了依照与IL-17的序列同一性着色的IL-17F的分子表面。IL-17F表面上仅有的广泛的保守斑在每个原聚体的平坦表面上(图17的B小图)和在空穴“上方”的区域上(图17的A小图)。原聚体面上的保守区可代表维持结构所需的保守特征或潜在识别共同结合配偶体所需的保守特征。如此，IL-17F表面中的大空穴也存在于IL-17中，但会由保守残基和可变残基两者构成。
比较而言，IL-17B、IL-17C、及IL-17E的序列与IL-17F和IL-17的序列显著不同，尤其在辅助性胱氨酸连接的数目和位置及N端延伸物的长度和序列上。尽管有此差异，有可能进行数个关于二硫键连接方式和其会对其它家族成员中的N端延伸物具有的效应的预测。例如，IL-17B以非共价二聚体分泌(自CHO或自昆虫细胞(Shi等,J.Biol.Chem.,275:19167-19176(2000)且数据未显示)，指明所有8个半胱氨酸残基在二聚体的单链内配对。IL-17B中的两个额外半胱氨酸之一(Cys 103)位于链2中牵涉大环的两个半胱氨酸之间，而第2个额外的半胱氨酸在链3和4之间的转角中(图16和图15)。基于胱氨酸结折叠在所有IL-17同系物中都是保守的假设，IL-17B的链2中的额外半胱氨酸(Cys 103)定位太远以致不能与链3/4环中的任一个半胱氨酸成键。因此，IL-17B的Cys 103必须与N端延伸物中的Cys 64形成二硫键，留下链3/4环中的两个半胱氨酸彼此成键。为了发生这些相互作用，IL-17B中的N端延伸物必须处于与IL-17F中根本不同的构象。这是合理的，因为这部分结构中的序列在家族内不是保守的，形成很小的规则二级结构，并主要在分子的***上包装(pack)。基于此分析，链2中也拥有额外半胱氨酸的IL-17C和IL-17E也有可能具有构象与IL-17F和IL-17显著不同的N端。基于N端的二硫键样式，此分析将家族分成两类。
IL-17F结构的给人深刻印象的特征是由二聚体界面中的残基形成的异常大的空穴(图18)，其提示可能结合另一个分子的区域。空穴(每个二聚体两个)由严格保守的或总是拥有相似化学特性的残基(Tyr54、Tyr63、Pro64、Val120)，以及在IL-17家族成员中极端可变的其它残基(Arg37、Val38、Met40、Ala 95)的组合构成，这提供了给分子间相互作用赋予特异性的潜力。空穴不具有明显的静电表面特征，但是替代地，其由疏水的、极性的、及带电荷的残基的组合形成(参见图17的A小图和图18的A小图)。基于序列分析，预期类似的空穴会存在于其它IL-17家族成员中；然而考虑到N端延伸物可能的不同构象，空穴的具体特性在IL-17B、IL-17C、和IL-17E中可能是相当不同的。
NGF在与IL-17F中空穴的定位类似的位置中结合其高亲和力受体TrkA。图18的B小图和C小图显示了相同取向的IL-17F和NGF，突出显示了空穴和TrkA结合位点的定位(预期被所有神经营养因子/Trk复合物所利用；Weismann等,Nature,401:184-188(1999))。神经营养因子同二聚体(NGF、NT3、NT4)的已知结构在其表面上在此位置还具有凹入(indentation)，但是其比IL-17F中的空穴小得多且更适度(McDonald等,Nature,354:411-414(1991)；Butte等,Biochemistry,37:16846-16852(1998)；Robinson等,Protein Sci.,8:2589-2597(1999))。Trk家族成员是经由其近膜的胞外Ig样结构域与神经营养因子相互作用的受体酪氨酸激酶。虽然预期IL-17R或IL-17RH1的结构不包含Ig样折叠，但是IL-17蛋白和神经营养因子可以在其表面上采用相似区域来结合其受体。
神经营养因子不仅结合特定Trk受体，而且还可以同时结合p75NTR，即所有神经营养因子共同的第二受体。p75NTR经由富含半胱氨酸的胞外结构域来结合其神经营养因子配体，预期所述富含半胱氨酸的胞外结构域类似于肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)或死亡受体5的结构(Banner等,Cell,73:431-445(1993)；Hymowitz等,Mol.Cell,4:563-571(1999)；Mongkolsapaya等,Nat.Struc.Biol.,6:1048-1053(1999))。根据诱变数据提出了NGF:p75NTR相互作用的模型(Weismann,C和de Vos,A.M.,Cell.Mol.Life Sci.,58:1-12(2001))，其提示配体二聚体任一末端的环以及每个原聚体上的平坦表面与p75NTR相互作用。IL-17R和IL-17RH1的序列不与p75NTR类似，而且预期不采用TNFR1样折叠。然而，鉴于IL-17折叠和神经营养因子折叠的相似性，与神经营养因子***类似，IL-17有第二受体成分的可能性的考虑是合理的。
进一步地，还提示了蛋白质采用神经营养因子折叠(Mizuguchi等,TIBS,23:239-242(1998))，而且在遗传上(尽管不是通过直接结合实验)显示为果蝇Toll受体的受体(Morisato等,Cell,76:677-688(1994))。因为IL-17以与IL-1和Toll受体(它们的胞内结构域共享共同折叠，尽管它们的胞外结构域是很不同的)所使用的途径类似的途径经由NF-κB发信号，因此预期IL-17受体的胞内或胞外结构域(包括其它作为信号传导复合物的尚不知晓成分的)可能在结构上类似于这些受体的各部分是合理的。然而，不管受体结构如何，IL-17配体和受体之间的相互作用模式最有可能会牵涉IL-17二聚体结构侧面中的深空穴。

Claims (5)

1.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的一种或多种能够抑制IL-17A/F多肽中的IL-17A(SEQ ID NO:3)和IL-17F(SEQ ID No:4)两者的拮抗剂。
2.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括同时靶向所述哺乳动物中的IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的交叉反应性抗体或所述抗体的片段，其中所述抗体识别在IL-17A(一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽)和IL-17F(一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽)两者上存在的相同或相似表位。
3.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括同时靶向所述哺乳动物中的IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由两条臂组成，其中所述抗体的一条臂识别IL-17A，而所述抗体的另一条臂识别IL-17F。
4.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括同时靶向所述哺乳动物中的IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由识别IL-17A的重链和识别IL-17F的轻链组成。
5.一种在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关病症的方法，其包括同时靶向所述哺乳动物中的IL-17A和IL-17F，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体由识别IL-17F的重链和识别IL-17A的轻链组成。
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