CN104782502B - 一种快速得到纤用***再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速得到纤用***再生植株的方法,包括如下步骤:(1)将纤用***种子经无菌处理、播种得到无菌苗;(2)从2‑3天苗龄的无菌苗上撕取子叶,切去叶尖,正置于含噻苯隆和α‑萘乙酸的芽诱导培养基上培养;(3)经步骤(2)培养18‑24天后,待不定芽伸长至1‑2厘米高时,将不定芽切下,转到含有吲哚丁酸的生根培养基上培养生根,培养时间为35‑42天,得到生根小苗。采用本发明,外植体取材方便、快捷,周期短,诱导再生率较高,获得子叶外植体,只需要3天;获得健壮的再生丛芽,只需要18‑24天。并且随时可以播种、获取外植体,不受取材季节、消毒过程等因素的制约,适用于***遗传转化研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速得到纤用***再生植株的方法。
背景技术
***(Cannabis Sativa L.)是***科(Cannabinaceace)***属(Cannabis)一年生草本植物,在我国有数千年的种植利用历史。***浑身是宝,既能生产优质的纺织纤维,在食品、药用和建材工业等方面也有巨大应用价值。***根据其四氢***酚(THC)含量分为毒品***、中间型***和纤用***三种,我国是纤用***种植大国,种植面积占世界的30%左右。
由于上世纪很多国家禁止种植一切***,导致许多珍贵种质资源遗失,对***的研究也远远落后于其他经济作物。而且,***是雌雄异株的常异花授粉作物,种质杂合度高。使用常规的***育种方法进行品种选育和改良进展缓慢。基因工程技术是植物育种中普遍应用的方法,但要获得目标性状改良的转基因植物,建立一个高效的再生体系是前提。
在***再生体系研究中,外植体的选择十分重要。现有技术主要受制于外植体的选择,目前用于***再生的外植体有茎尖、带节茎段、下胚轴、叶片,这些材料的取材周期和便捷性受到限制。选用大田采摘的实生苗的茎尖、茎段等作为外植体,将受到生长季节和消毒程序繁琐的限制〔参见尹品训,杨明,郭鸿彦,刘振博,胡学礼,陈裕,***的离体培养与快速繁殖[J]. 西南农业学报. 2005(04)〕。选用种子消毒后(未去种皮)播种产生的无菌苗的茎尖、下胚轴、带节茎段作为外植体,从播种到无菌苗长大到适宜取材时期,需要15-20天,影响实验周期的紧密性〔参见张利国,宋宪友,房郁妍,郑楠,吴广文.***新品种龙***一号再生体系初探[J]. 中国麻业科学. 2012(03)〕。申请号为200610088353.7的中国专利申请,将种子消毒后接种于培养基,20天后才能获得茎尖外植体,30天后获得侧芽,培养周期较长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,克服现有技术的不足,提供一种周期较短,操作方便的快速得到纤用***再生植株的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是,一种快速得到纤用***再生植株的方法,包括如下步骤:
(1)将纤用***种子经无菌处理、播种得到无菌苗;
参见程超华,李育君,赵立宁,唐蜻,臧巩固,三重处理法获得***种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011(01);
(2)在超净工作台上,将子叶从2天苗龄或3天苗龄的无菌苗上撕下(不宜切下,否则会影响再生频率),切去叶尖,正置于含噻苯隆(TDZ)和α-萘乙酸(NAA)的芽诱导培养基上培养出不定芽;所述芽诱导培养基为MS基础培养基,噻苯隆浓度为0.1-0.2mg/L,α-萘乙酸浓度为0.01-0.05mg/L, 附加蔗糖30g/L,琼脂(6-7)g/L,pH5.5-6.0,光照强度2200-2600lx,光照时间14-16h/d,温度24±2℃,培养时间为18-24天;
(3)经步骤(2)培养18-24天后,待不定芽伸长至1-2厘米高时,将不定芽切下,转到含有吲哚丁酸(IBA)的生根培养基上培养生根,所述生根培养基为1/2MS(即MS营养物质减半)基础培养基,其中吲哚丁酸(IBA)浓度为0.3-0.5mg/L,附加蔗糖30g/L,琼脂(6-7)g/L,pH5.5-6.0,光照强度2200-2600lx,光照时间14-16h/d,温度24±2℃;培养时间为35-42天,得到生根小苗。
所得到的生根小苗按常规方法移植栽培。
进一步,步骤(2)中,所述去尖子叶优选为1/2子叶。
本发明所指“***”,均为纤用***,其四氢***酚(THC)质量含量<0.3%。
本发明的方法特别适用纤用***品种,再生植株诱导率为46%-48%。
本发明基于种子的消毒、剥皮处理,第一次提出用子叶作为外植体建立再生体系,可以便捷、快速地得到再生植株。使用2天苗龄或3天苗龄的无菌苗子叶作为外植体,这些外植体为无菌状态,生长势均一,可在28天内得到大量再生芽,可比原有方法减少实验周期7-14天,这可为将来的遗传转化工作提供很大的便利。
本发明采用2天苗龄或3天苗龄无菌苗的子叶作为外植体,从播种到获得子叶只需要3天时间,子叶再生频率达到46%-48%,可以快速、便捷地得到再生植株。
采用本发明,外植体取材方便、快捷,获得子叶外植体,只需要3天,获得健壮的再生丛芽,只需要18-24天,周期短,并且随时可以播种、获取外植体,不受取材季节、消毒过程等因素的制约,非常适合用于遗传转化研究。
附图说明
图1是本发明实施例1所得3天苗龄的***无菌苗图;
图2是本发明实施例1用作外植体的1/2子叶图;
图3是本发明实施例1子叶基部长出的丛生芽图;
图4是本发明实施例1丛生芽伸长图;
图5是本发明实施例1再生植株生根图;
图6是本发明实施例1再生植株移栽成活图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例之快速得到纤用***再生植株的方法,包括如下步骤:
(1)将纤用***种子经无菌处理、播种得到无菌苗;
参见程超华,李育君,赵立宁,唐蜻,臧巩固,三重处理法获得***种子无菌苗研究[J]. 中国麻业科学. 2011(01);
(2)在超净工作台上,将子叶从3天苗龄的无菌苗上撕下(不宜切下,否则会影响再生频率),切去叶尖,留下1/2子叶,正置于含噻苯隆(TDZ)和α-萘乙酸(NAA)的芽诱导培养基上培养出不定芽;所述芽诱导培养基为MS基础培养基,噻苯隆浓度为0.2mg/L,α-萘乙酸浓度为0.05mg/L, 附加蔗糖30g/L,琼脂6.5g/L,pH5.8,光照强度2300lx,光照时间16h/d,温度24±2℃,培养时间为20天;
(3)经步骤(2)培养20天后,待不定芽伸长至1-2厘米高时,将不定芽切下,转到含有吲哚丁酸(IBA)的生根培养基上培养生根,所述生根培养基为1/2MS(即MS营养物质减半)基础培养基,其中吲哚丁酸(IBA)浓度为0.5mg/L,附加蔗糖30g/L,琼脂6.5g/L,pH5.8,光照强度2300lx,光照时间16h/d,温度24±2℃;培养时间为35天,得到生根小苗。
所得到的生根小苗按常规方法移植栽培。图1是本发明实施例1所得3天苗龄的***无菌苗图;图2是本发明实施例1用作外植体的1/2子叶图;图3是本发明实施例1子叶基部长出丛生芽图;图4是本发明实施例1丛生芽伸长图;图5是本发明实施例1再生植株生根图;图6是本发明实施例1再生植株移栽成活图。说明采用本发明,可以顺利的得到外植体,产生再生植株,并且生根移栽成活。
本实施例中,外植体取材方便、快捷,获得子叶外植体,只需要3天,获得健壮的再生丛芽,只需要20天,周期短,并且随时可以播种、获取外植体,不受取材季节、消毒过程等因素的制约,非常适合用于遗传转化研究。
实施例2
分别选取2天、4天、5天、6天苗龄的无菌苗,将子叶撕下进行处理,其他处理步骤同实施例1。采用2-6天不同苗龄外植体的再生频率结果见表1中。可见采用2天、3天苗龄外植体更适合。
表1 不同苗龄外植体的再生频率
子叶苗龄(天) | 再生频率(%) |
2 | 47.8±5.1 |
3 | 46.7±5.7 |
4 | 36.7±4.9 |
5 | 22.2±3.5 |
6 | 11.9±3.7 |
对照例
分别选取两组3天苗龄的无菌苗,分别将子叶作撕下、切下处理,其他处理步骤同实施例1。采用撕下方法及切下方法所得外植体的再生频率结果见表2中。可见采用撕下更适合。
表2 不同取材方法的3D苗龄外植体再生频率
取材方法 | 再生频率(%) |
撕 | 47.3±4.8 |
切 | 6.2±3.7 |
Claims (2)
1.一种快速得到纤用***再生植株的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将纤用***种子经无菌处理、播种得到无菌苗;
(2)在超净工作台上,将子叶从2天苗龄或3天苗龄的无菌苗上撕下,切去叶尖,正置于含噻苯隆和α-萘乙酸的芽诱导培养基上培养出不定芽;所述芽诱导培养基为MS基础培养基,噻苯隆浓度为0.1-0.2mg/L,α-萘乙酸浓度为0.01-0.05mg/L, 附加蔗糖30g/L,琼脂6-7g/L,pH5.5-6.0,光照强度2200-2600lx,光照时间14-16h/d,温度24±2℃,培养时间为18-24天;
(3)经步骤(2)培养18-24天后,待不定芽伸长至1-2厘米高时,将不定芽切下,转到含有吲哚丁酸的生根培养基上培养生根,所述生根培养基为1/2MS基础培养基,其中吲哚丁酸浓度为0.3-0.5mg/L,附加蔗糖30g/L,琼脂6-7g/L,pH5.5-6.0,光照强度2200-2600lx,光照时间14-16h/d,温度24±2℃;培养时间为35-42天,得到生根小苗。
2.根据权利要求1所述的快速得到纤用***再生植株的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述切去叶尖为切去1/2子叶。
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