CN104781396A

CN104781396A - 用于体细胞核重编程的先天免疫激活

Info

Publication number: CN104781396A
Application number: CN201380011433.0A
Authority: CN
Inventors: J·P·库克; 李知垠; N·赛耶德
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2015-07-15
Also published as: WO2013109763A2; WO2013109763A3; US20130202649A1

Abstract

本发明显示体细胞中先天免疫反应的激活极大地促进了体细胞通过非整合因子的核重编程。激活先天免疫的方法包括激活toll样受体，例如TLR3。先天免疫反应被激活的体细胞可被重编程为诱导性多能细胞或转分化细胞。

Description

用于体细胞核重编程的先天免疫激活

政府权利

本发明是在政府支持下根据国家卫生研究所授予的合同HL100397和HL103400完成的。政府对本发明享有某些权利。

发明背景

Yamanaka和同事进行的开创性研究显示某些转录因子的异位表达可能会诱导体细胞的多能性。这些诱导性多能干细胞(iPSC)自我更新并且分化成多种细胞类型，从而使其成为用于疾病和患者特定性再生医学疗法的一种有吸引力的选择。它们已被用于成功地模型化人类疾病并且具有极大的用于药物筛选和患者特定性细胞疗法的潜能。此外，从患病细胞产生的iPSC可充当适用于研究疾病机制和潜在疗法的工具。然而，仍应对有关体细胞重编程为iPSC的潜在机制有更多了解，并且要关注在没有机制性深入理解的情况下的潜在临床应用。

用于重编程为多能细胞的因子(RF)组包括Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog。Oct3/4和Sox2是在胚胎干(ES)细胞中保持多能性的转录因子，而Klf4和c-Myc被认为是提高iPSC产生效率的转录因子。据信转录因子c-Myc修饰染色质结构以允许Oct3/4和Sox2较有效地接近为重编程所必需的基因，而Klf4通过Oct3/4和Sox2增强某些基因的激活。Nanog(像Oct3/4和Sox2一样)是在ES细胞中保持多能性的转录因子，而Lin28是被认为影响在分化期间特异性mRNA的转译或稳定性的mRNA结合蛋白。最近，已证实Oct3/4和Sox2的逆转录病毒表达与丙戊酸、染色质去稳定剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的共施用一起足以使成纤维细胞重编程为iPSC。

为从体细胞产生iPSC，已使用病毒载体或质粒来过表达这些重编程因子的一些组合。然而，这些方法产生低重编程效率并且未能提供对重编程过程的精确控制。此外，这些用于核重编程的方法固有地引起关于由DNA整合所引起的潜在致瘤性和基因沉默突变的担忧。因逆转录病毒感染造成的外来DNA整合到宿主基因组中引起对外来DNA可使必需基因沉默或诱导这些基因调节异常的担忧。虽然Cre-LoxP位点基因递送或PiggyBac转座子途径已用于在基因递送之后从宿主基因组上去除外来DNA，但没有一种策略消除诱变的危险，因为其留下小的残余外来DNA***物。

作为基因修饰的替代方案，已产生用于无整合核重编程的细胞穿透蛋白(CPP)，其中重编程因子融合到为蛋白质膜运输到核中而提供的结构域中。已通过使用纯化重组蛋白在鼠胚胎成纤维细胞中实现成功重编程为多能细胞。尽管已使用来自胚胎干细胞(ESC)以及过表达四种转录因子的HEK293细胞的细胞提取物重编程人类细胞，但尚未使用纯化CPP重编程人类细胞。并且甚至在小鼠细胞情况下，使用CPP的重编程效率(约0.001％)比使用逆转录病毒载体实现的重编程效率(0.1％-1％)低大于10倍。

用于iPSC产生或转分化成不同体细胞类型的基于CPP和/或小分子的途径避免了关于外来DNA整合的所有担忧，并且提供对浓度、时间和因子刺激顺序的较大控制，然而此类方法在实际操作中仍存在重大问题。本发明解决了这个问题。

发明概述

提供用于使用非整合方法有效产生诱导性多能细胞或转分化细胞的组合物和方法。在本发明的方法中，需要重编程为多能细胞或转分化的体细胞与有效剂量的toll样受体(TLR)激动剂接触，所述TLR包括但不限于TLR3。接触步骤可在细胞与非整合重编程因子接触之前、与其同时或在其之后进行，通常同时进行。非整合重编程因子是核作用多肽或改变转录的小分子，并且其可诱导靶细胞重编程。在一些实施方案中，重编程因子是融合到多肽穿透结构域中的多肽，例如如本领域中已知的九精氨酸、tat等。在一些实施方案中，重编程因子是Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog中的一者或多者。

在一些实施方案中，提供重编程细胞群，其中初始体细胞群重编程为诱导性多能或转分化细胞群。此类细胞在本领域中已知的各种方法(包括药物筛选、自体或异体移植治疗性细胞施用等)中获得应用。重编程细胞群因不存在整合遗传因子而提供优势。

在其它实施方案中，提供用于体细胞核重编程的试剂盒。此类试剂盒可包含先天免疫激活剂，例如一种或多种TLR激动剂，包括但不限于双链核酸，诸如聚I:C。此类试剂盒可进一步包含用于多能细胞的非整合诱导的试剂，例如一种细胞穿透蛋白(例如SOX2、OCT4、Nanog、KLF4、cMYC等)或其混合物。此类试剂盒可作为另外一种选择或以组合形式提供一种适用于将细胞转分化为所关注谱系的因子或其混合物。举例来说，内皮细胞转分化试剂盒可包含BMP4、VEGF、bFGF、8-Br-cAMP、SB431542等中的一者或多者。此类试剂盒可进一步包含为进行本发明方法所必需的适合的缓冲剂、细胞生长培养基、说明书等。

还提供用于体内使用本发明方法的试剂盒和方法，其中治疗剂包含先天免疫激活剂，并且体内施用一种或多种细胞穿透肽和/或小分子用于治疗性调节细胞和/或组织表型。

附图简述

图1：由病毒载体表达或以细胞穿透肽形式递送的重编程因子诱导的基因表达的不同模式：(A)经逆转录病毒表达载体(红线)或细胞穿透肽(蓝线)感染之后Nanog的倍数表达。与病毒载体pMX-Sox2相比，细胞穿透CPP-SOX2引起下游目标和多能性基因的迟延表达。基因表达的相对倍数变化是在每天用200nM CPPSOX2处理之后或在第0天单一pMXSox2感染之后测定。所有数据以平均值±标准偏差表示，n＝3，*P<0.005。(B)因为各处理条件下所选基因(Jarid2、Zic2、bMyb、Oct4、Sox2和Nanog)的时间表达模式显著类似，所以其随时间推移的倍数表达的变化以所有六种基因的平均倍数增加显示。注意到与Sox2以CPP形式存在时相比，当Sox2以病毒载体形式存在时，目标基因表达快速增加。(C)与病毒载体pMXOct4相比，细胞穿透CPPOCT4引起下游目标和多能性基因的迟延表达。Nanog基因表达是此不同基因时间表达模式的代表。基因表达的相对倍数变化是在每天用200nM CPPOCT4处理之后或在第0天单一pMOct4感染之后测定。所有数据以平均值±标准偏差表示，n＝3，*P<0.005。(D)显示各条件下所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和Oct4)随时间推移的平均倍数变化的概括图。注意到与Oct4以CPP形式存在时相比，当Oct4以病毒载体形式存在时，目标基因表达快速增加。

图2：不相关逆转录病毒载体促进CPP诱导的基因表达：(A)在pMX-Sox2(红线)、CPP-SOX2(蓝线)或pMX-GFP+CPP-SOX2(绿线)处理之后，Nanog基因表达水平的相对倍数变化。(B)显示各条件下所选基因(即Jarid2、Zic2、bMyb、Oct4、Sox2和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。当Sox2以CPP形式提供时，下游目标基因的激活延迟。然而，在不相关逆转录病毒载体存在下，目标基因表达快速增加，并且与pMX-Sox2相似。(C)在pMX-Oct4、CPP-OCT4或pMX-GFP+CPP-OCT4处理之后Nanog的基因表达水平的相对倍数变化。(D)显示各条件下所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和Oct4)随时间推移的平均倍数变化的概括图。所有数据以平均值±标准偏差表示，n＝3，*P<0.005。

图3：TLR3途径的基因敲低抑制编码Oct4的逆转录病毒载体的作用：(A)在用TRIF-抑制肽(肽抑制剂-TRIF)处理的成纤维细胞中，在逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后，Oct4的基因表达降低。下方图显示在四种条件下，所选多能基因(Oct4、Sox2和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。(B)在TRIF shRNA基因敲低成纤维细胞中，在逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后Oct4的基因表达降低。下方图显示在四种条件下，所选多能基因(Oct4、Sox2和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。(C)在TLR3shRNA-基因敲低成纤维细胞中，在逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后Oct4的基因表达降低。下方图(D-F)显示在四种条件下，所选多能基因(Oct4、Sox2和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。所有数据以平均值±标准偏差表示，n＝3，*P<0.005。

图4：TLR3-TRIF基因敲低成纤维细胞展现削弱的核重编程：(A)用于使用以逆转录病毒载体形式递送的重编程因子产生iPSC的方案。(B)在错义、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞的逆转录病毒核重编程起始之后第30天iPSC的代表性图像。在TLR3信号传导途径的元件被基因敲低的成纤维细胞(即TRIF shRNA或TLR3shRNA细胞系)中，人类iPSC集落的发展显著延迟。相比之下，在所有其它TLR的衔接子被基因敲低的成纤维细胞(MyD88shRNA)中，或在用错义shRNA处理的成纤维细胞中，未注意到hiPSC发展延迟。(C)在由通过逆转录病毒转染递送的重编程因子转导的错义、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞系中，第35天hiPSC集落的总数目。hiPSC集落的产量因TLR3信号传导途径的基因敲低元件而降低。*P<0.05；错义细胞与TRIF或TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞相比较。(D)第35天在错义、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞中，Oct4基因表达的倍数变化。

图5：聚I:C促进CPP诱导的目标基因表达：(A)在pMX-Sox2(红线)、CPP-SOX2(蓝线)或聚I:C+CPPSOX2(绿线)处理之后Jarid2的基因表达水平的相对倍数变化。(B)这些所选基因(即Jarid2、Zic2、bMyb、Oct4、Sox2和Nanog)在各处理之后展现平均基因时间表达模式的概括图。聚I:C使CPPSOX2对下游基因的表达显著增强。(C)在pMX-Oct4、CPPOCT4或聚I:C+CPPOCT4处理之后Nanog的基因表达水平的相对倍数变化。(D)这些所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和Oct4)在各处理之后展现基因时间表达模式的概括图。聚I:C使CPPOct4对下游基因的表达显著增强。所有数据以平均值±标准偏差表示，n＝3，*P<0.005。

图6.TLR3激活使强力霉素诱导型***中的重编程增强：(A)在暴露于强力霉素4周后，显示从表达编码四种重编程因子的dox诱导型多顺反子转基因构筑体的MEF衍生的iPSC集落的SSEA-1活染。在一些孔中，MEF还暴露于编码GFP的逆转录病毒构筑体或聚I:C。(B)显示第2周和第3周原始培养板中的SSEA-1+集落的直方图。聚I:C或编码GFP的逆转录病毒构筑体的共施用使强力霉素诱导的重编程的产量显著增加。(C)聚I:C或编码GFP的逆转录病毒构筑体的共施用促进Oct4和Sox2的基因表达。

图7.TLR3激活刺激CPP诱导的人类成纤维细胞重编程：(A)用于使用四种CPP-TF(OCT4-R11、SOX2-R11、KLF4-R11和cMYC-R11)产生人类iPSC的方案。(B)在第30-45天，聚I:C的共施用使Oct4的基因表达增加。(C)在第30天和第40天，在存在和不存在聚I:C的情况下数到的TRA-1-81阳性集落。聚I:C的共施用使CPP诱导的重编程的产量显著增加。(D)CPP诱导的反式激活在第32天的ES样集落形成(10倍)

图8.由从病毒载体表达或以细胞穿透肽形式递送的个别重编程因子诱导的下游基因表达模式的差异：(A)显示与媒介物相比，在逆转录病毒或CPP-SOX2处理之后，所选多能基因(Sox2、Oct4、Nanog)和Sox2相关基因(Jarid2、Zic2、bMyb)随时间推移(第0-6天)的表达强度的热图。媒介物或不相关逆转录病毒构筑体(pMX-GFP)对基因表达无影响。逆转录病毒Sox2使得六种基因中每一者的表达早期增加随后降低。CPP-SOX2使得基因表达增加延迟。(B)显示所选多能基因(Sox2、Oct4、Nanog)和Oct4相关基因(Tcf4、GAP43)随时间推移(第0-6天)的表达强度的热图。

图9.不相关逆转录病毒载体促进CPP诱导的基因表达：(A-B)在pMX-Sox2(红线)、CPP-SOX2(蓝线)或pMX-GFP+CPP-SOX2(绿线)处理之后，Jarid2和Zic2的基因表达水平的相对倍数变化。(C)显示在各条件下所选基因随时间推移的平均倍数变化的概括图。(D-E)在pMX-Oct4、CPP-OCT4或pMX-GFP+CPP-OCT4处理之后，Tcf4和GAP43的基因表达水平的相对倍数变化。

图10.非整合pMX-GFP促进CPP-OCT4诱导的基因表达：(A)经pMX-GFP突变体(上)或pMX-GFP wt(下)感染的BJ成纤维细胞的免疫荧光图像。(B-E)在pMX-GFP(红线)，pMX-GFP+CPP-OCT4(蓝线)，pMX-GFP突变体(绿线)或pMX-GFP突变体+CPP-OCT4(紫线)处理之后，Oct4、Sox2、Nanog和TLR3的基因表达水平的相对倍数变化。

图11.逆转录病毒GFP/OCT4/SOX2感染刺激先天免疫。在pMX-Oct4、pMX-Sox2、pMX-GFP、pMX-GFP+CPP-OCT4、pMX-GFP+CPP-SOX2、CPP-OCT4或CPP-SOX2之后，先天免疫相关基因STAT1、STAT2、IFNβ、NF-κB、TLR3和TLR4的基因表达水平的相对倍数变化。

图12.TLR3信号传导的基因敲低使多能基因表达降低(与图3相关)：(A)在用TRIF-抑制肽(肽抑制剂-TRIF)处理的成纤维细胞中，在逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后，Tcf4、NF-κB或TLR3的基因表达降低。(B)在TRIF shRNA基因敲低成纤维细胞中，在pMX-Oct4感染之后，Tcf4、NF-κB或TLR3的基因表达降低。(C)在TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞中，在pMX-Oct4感染之后，Tcf4、NF-κB或TLR3的基因表达降低。

图13.MyD88的抑制不影响pMX-Oct4诱导的基因表达：(A)在用MyD88-抑制肽(肽抑制剂-MyD88)处理的成纤维细胞中，在逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后，Oct4、Tcf4、NF-κB或TLR3的基因表达保持不变。(B)在MyD88 shRNA基因敲低成纤维细胞中，在pMX-Oct4感染之后，Oct4、Tcf4、NF-κB或TLR3的基因表达保持不变。

图14.聚I:C使先天免疫基因的表达增强。在聚I:C、聚I:C+CPP-OCT4或聚I:C+CPP-SOX2之后，先天免疫相关基因STAT1、STAT2、IFNβ、NF-κB、TLR3和TLR4的基因表达水平的相对倍数变化。

图15.聚I:C通过TLR3使CPP诱导的基因表达增强：(A-B)在pMX-Sox2(红线)、CPP-SOX2(蓝线)或聚I:C+CPP-SOX2(绿线)处理之后，Zic2和Nanog的基因表达水平的相对倍数变化。(C)显示在各条件下所选基因随时间推移的平均倍数变化的概括图。(D、E)在pMX-Oct4、CPPOCT4或聚I:C+CPP-OCT4处理之后，Tcf4和GAP43的基因表达水平的相对倍数变化。

图16.在强力霉素诱导的次级MEF***中的重编程。强力霉素处理的MEF的形态变化。聚I:C以及pMX-GFP促进在第3天孔中聚集小而紧密的圆形细胞的变化。用pMX-GFP感染促进集落形成，因为在病毒粒子感染组中第7天观察到许多小集落。在第14天，典型mES样集落出现，其中许多具有激活的SSEA-1。

图17.聚I:C/病毒粒子早期促进表观遗传修饰(第2天)：(A)用于评估在暴露于各种处理条件第2天Oct4启动子的H3K4me3的芯片分析。用pMX-GFP或用聚I:C刺激TLR3没有效果，CPP-SOX2也没有效果。然而，与pMX-GFP或与聚I:C组合，细胞穿透肽CPP-SOX2与逆转录病毒Sox2(pMX-Sox2)的效果相似。(B)用于评估在暴露于各种处理条件的第2天Oct4启动子的H3K9me3的芯片分析，数据以平均值±标准偏差表示，n＝2(*P<0.005，**P<0.02)(C)显示HDAC1蛋白质表达的免疫印迹证实聚I:C诱导早期(第2天)并且持续(到第6天)的HDAC1表达抑制。HP-1α的表达未受影响(尽管其是重分布的，参见图S11A-C)

图18.聚I:C/病毒粒子促进表观遗传修饰(时间过程，第2-6天)：(A)用于评估在暴露于各种处理条件第2、4和6天Oct4启动子的H3K4me3的芯片分析。(B)用于评估在暴露于各种处理条件第2、4和6天Oct4启动子的H3K9me3的芯片分析。(C)用于评估在暴露于各种处理条件第2、4和6天Sox2启动子的H3K4me3的芯片分析。(D)用于评估在暴露于各种处理条件第2、4和6天Sox2启动子的H3K9me3的芯片分析。

图19.共焦显微镜图像分析：(A)在CPP-Sox2加上pMX-GFP或聚I:C存在下HP1α阳性斑点的尺寸增加。(B)HP1α-阳性斑点的数目减少，表明在CPP-Sox2加上pMX-GFP或聚I:C存在下HP1α位置的重排。(C)HP1α的共焦显微镜分析。(D)随时间过程推移HP-1α表达的蛋白质印迹(第2、4和6天)

图20.聚I:C通过TLR3-TRIF信号传导激活NF-κB：(A)TLR3和NF-κB响应于聚I:C的转录表达。(B)-(C)NF-κB活性的荧光素酶分析显示聚I:C(而非CPP-SOX2)使NF-κB活性基本上增加，此效果受到TLR3信号传导途径的基因敲低元件的抑制。

图21：人类成纤维细胞通过先天免疫激活和微环境诱因直接重编程为功能性内皮细胞：(A)用于使人类BJ成纤维细胞直接重编程为内皮细胞的方案。该图描述了时间过程和不同介质的连续处理：在含有DMEM/FBS的分化培养基I和7.5％无血清替代物(KSR)中用聚I:C(30ng/ml)处理人类成纤维细胞7天。7天之后，培养基变为含有DMEM/FBS的分化培养基II和含有20ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF和20ng/ml bFGF的10％KSR。再7天后，将培养基用含有50ng/mlVEGF、20ng/ml bFGF和0.1mM8-Br-cAMP的内皮细胞培养基(EGM2)替换再持续14天。每2-3天更换培养基。接着，用CD31或VE钙粘蛋白将细胞FAC分选并且接着在含有SB431542(一种特异性TGFβ受体抑制剂)的EGM2培养基中扩增。(B)使用CD31+抗体测定iEC数量所获得的荧光激活细胞分选(FACs)数据曲线。(左侧图)-媒介物对照；(中间图)-聚I:C和(右侧图)-具有CD31抗体的iEC的富集。(C-D)实时RT-PCR和内皮细胞标记CD31、CD144、eNOS和温韦伯氏因子(von Willebrand factor)的iEC免疫荧光染色。(E-F)iEC吸收乙酰基化LDL并且在基质胶上形成毛细管样网状结构。

图22：通过iEC移植获得的缺血后肢中的血液灌注的改善和毛细管密度。(A)激光多普勒灌注成像(laser Doppler perfusion imaging)的代表性图像。(B)在处理后第0天和第7天灌注比(缺血肢体的值除以非缺血肢体的值)的概括数据。(C)来自用iEC或媒介物处理的小鼠的缺血组织的免疫荧光CD31染色。(D)缺血肢体中总毛细管密度的定量。(E)设盲观测者所获得的后肢缺血得分。

图23：TLR3信号传导使人类成纤维细胞能够有效转分化为功能性内皮细胞：(A)用于使人类BJ成纤维细胞在TLR3基因敲低细胞(上文所描述)中直接重编程为内皮细胞的方案。(B)使用CD144+抗体测定iEC数量所获得的荧光激活细胞分选(FAC)数据曲线。(左侧图)-用媒介物对照处理的错义细胞；(中间图)-用聚I:C处理的错义细胞和(右侧图)-用聚I:C处理的TLR3-KD细胞。(C-D)衍生自TLR3-KD细胞的iEC具有降低的吸收乙酰基化LDL的能力并且未能在基质胶上形成毛细管样网状结构。

具体实施方式

已显示体细胞中先天免疫反应的激活极大地促进了在非整合编程因子下使体细胞重编程为诱导性多能干细胞或转分化细胞。激活先天免疫的方法包括激活toll样受体，例如TLR3。

定义

应了解，本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属以及试剂，因此可有所变化。还应了解，本文所用的术语是仅用于描述特定实施方案的目的，而不意在限制本发明的范围，本发明的范围将仅受限于随附权利要求书。

除非上下文明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个(一种)”、“和”、和“所述”包括复数指示物。因此，举例来说，提到“一个细胞”包括多个此类细胞并且提到“所述蛋白质”包括提到一种或多种蛋白质和其本领域技术人员已知的等效物等等。除非明确指明，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常所理解相同的含意。

先天免疫。先天免疫***是一种原始细胞反应，其为细胞针对病原体抗原提供防御。先天免疫***对这些抗原的识别可产生以诸如TNF、IL-1、IL-6和IL-8的细胞因子的产生；以及尤其ICAM-1和E-选择素的基因激活为特征的炎症反应。

广泛类别的病原体(例如病毒、细菌和真菌)可组成性地表达一组称为病原体相关分子模式(PAMP)的类别特异性抗突变分子。这些微生物分子标记可由蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和/或其组合组成，并且可位于内部或外部。实例包括内毒素脂多糖(LPS)、单链或双链RNA等。

典型地，PAMP受体(PRR)是非克隆的(即在给定类型的所有细胞上表达)并且由生殖细胞系编码，或与免疫记忆无关。一旦结合，PRR倾向于使其它细胞外和细胞内蛋白质聚集、募集成复合物，并且引发信号传导级联反应，从而最终影响转录。另外，PRR响应病原体检测参与补充、凝结、吞噬、发炎和细胞凋亡功能的激活。存在若干类型的PRR，包括补体受体、葡聚糖受体、甘露糖受体、清道夫受体和toll样受体，各自具有特异性PAMP配体、表达模式、信号传导途径和抗病原体反应。

Toll样受体是I型跨膜(TM)PRR，其具有不同数目的细胞外N端富含亮氨酸重复(LRR)基序，继之以富含半胱氨酸区域、TM结构域和细胞内Toll/IL-1R(TIR)基序。LLR结构域对配体结合和相关信号传导来说是重要的并且是PRR的共同特征。TIR结构域在蛋白-蛋白相互作用中是重要的并且典型地与先天免疫有关。TIR结构域还合并成一个较大的IL-1R/TLR超家族，它由三个亚群组成。人类TLR家族由至少10个成员(TLR1到TLR10)组成。各TLR在其表达模式和PAMP敏感性方面具特异性。

Toll样受体3(TLR3)识别双链RNA(dsRNA)和其拟似物(与病毒感染有关的分子模式)。其位于染色体4q35并且其序列编码具有24个N端LRR并且计算的分子量为97kDa的推定904aa蛋白。TLR3与TLR5、TLR7和TLR8最紧密相关，各自具有26％总aa序列一致性。在暴露于革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)之后TLR3mRNA提高并且响应于革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)达到甚至更大的程度。

TLR3具体地说识别双链RNA(dsRNA)并且诱导多个负责针对许多病毒感染的先天抗病毒免疫的细胞内事件。预期904-氨基酸TLR3蛋白含有特征性Toll基序：细胞外富含亮氨酸重复(LRR)结构域和细胞质白介素-1受体样区域。

暴露于双链RNA(dsRNA)或聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I:C))(一种合成dsRNA类似物)诱导干扰素α和β产生并且通过经过TLR3进行信号传导激活NFκB。IRF3具体地说是通过刺激TLR3或TLR4来诱导，其介导负责先天抗病毒反应的特异性基因程序。TRIF为NFΚB的TLR3依赖性激活所必需的。其充当连接RIP1和TLR3的衔接蛋白以介导TLR3诱导的NFΚB激活。

RIG-1(视黄酸诱导型基因1)是一种RIG-I样受体dsRNA解旋酶，其(在人类中)由DDX58基因编码。RIG-I是RIG-I样受体(RLR)家族的一部分，RIG-I样受体家族还包括MDA5和LGP2，并且充当作为病毒传感器的模式识别受体。RIG-I典型地识别短(＜4000nt)的5′三磷酸dsRNA。RIG-I和MDA5参与激活MAVS并且触发抗病毒反应。人类RIG1基因可以基因库NM_014314.3存取并且蛋白质以基因库NP_055129.2存取。

Toll样受体4是一种在人类中由TLR4基因编码的蛋白质。其检测来自革兰氏阴性菌的脂多糖并且因此在先天免疫***的激活中是重要的。此受体在胎盘中和在白细胞的粒单核细胞亚群中表达最丰富。人类TLR4基因可以基因库NM_003266.3存取并且蛋白质以基因库NP_003257.1存取。

TLR4的激活导致下游包括TNF-α和白介素-1的炎症调节剂的释放。激动剂包括***、羟可酮(oxycodone)、芬太尼(fentanyl)、***(methadone)、脂多糖(LPS)、卡马西平(carbamazepine)、奥卡西平(oxcarbazepine)等。

TLR激动剂。TLR激动剂激活TLR，包括但不限于TLR3、TLR4和RIG1。TLR激动剂的实例包括病原体相关分子模式(PAMP)和其拟似物。如本领域中已知，这些微生物分子标记可由蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和/或其组合组成，并且可位于内部或外部。实例包括LPS、酵母聚糖、肽葡聚糖、鞭毛蛋白、合成TLR2激动剂Pam3cys、Pam3CSK4、MALP-2、咪喹莫特(Imiquimod)、CpG ODN等。

TLR3激动剂包括双链RNA；聚(I:C)、聚(A.U)等，其中此类核酸的大小通常为至少约10bp，至少约20bp，至少约50bp并且可具有约1到约20kb、通常不超过约50到100kb的高分子量。替代TLR3激动剂可直接结合于蛋白质，例如选择性结合于并且激活TLR3的抗体或小分子。其它TLR3激动剂包括逆转录病毒，例如被工程化到缺乏整合到基因组中的能力的逆转录病毒。

在本发明方法中有效的激动剂剂量是使细胞或细胞群的重编程效率相对于相同群在不存在TLR激动剂的情况下增加的剂量。如此处所用的术语“重编程”意味着体外或体内，体细胞核重编程为多能细胞(例如成纤维细胞到诱导性多能细胞)或体细胞核重编程为实质上不同的体细胞(例如成纤维细胞到内皮细胞)。后一过程也称为转分化。

方便地，可评估TLR激活的标记以测定适合的剂量，包括用于重编程的NFκB在所关注的体细胞中的激活、干扰素α和β的产生等。举例来说，其中聚I:C或其类似物的TLR激动剂，有效剂量可以是至少约10ng/ml，至少约50ng/ml，至少约100ng/ml，至少约250ng/ml，至少约500ng/ml。培养基中聚I:C的最佳化浓度为至少10ng/ml并且不超过3000ng/ml，包括在20ng/ml到300ng/ml并且尤其25ng/ml到150ng/ml范围内，例如为约30ng/ml。除聚I:C外的TLR激动剂的剂量可基于等效于最佳化聚I:C剂量的活性提供来计算。

“多能性”和多能干细胞意味着此类细胞具有分化成有机体中所有类型的细胞的能力。术语“诱导性多能干细胞”涵盖可经长时间培养同时保持分化成有机体中所有类型的细胞的能力(像胚胎干(ES)细胞)但衍生自分化体细胞(不像ES细胞(其衍生自胚囊的内细胞团))的多能细胞，即具有窄的较大规定潜能并且在不存在实验操作的情况下不能产生有机体中所有类型的细胞的细胞。“具有变成iPS细胞的潜能”意味着分化体细胞可被诱导变成(即可重编程以变成)iPS细胞换言之，体细胞可被诱导以再分化，从而形成细胞具有多能细胞的形态特征、生长能力和多能性的体细胞。iPS细胞具有hESC样形态，以具有大核质比、清晰边界和突起的核的平面集落形式生长。此外，iPS细胞表达本领域技术人员已知的一种或多种主要多能性标记，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42。此外，iPS细胞能够形成畸胎瘤。此外，其能够形成或贡献于活生物中的外胚层、中胚层或内胚层组织。

术语“原代细胞”，“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用，用于指已衍生自受试者并且允许培养物体外生长有限代数(即***)的细胞和细胞培养物。举例来说，原代培养物是培养物可能已传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次，但次数不足以经历危机期。

起始细胞群。如本文所用，“起始细胞群”或“初始细胞群”是指体细胞，通常为原代或非转型体细胞，其通过本发明方法经历了核重编程。起始细胞群可属于任何哺乳动物物种，但尤其包括人类细胞。起始细胞群的来源包括需要细胞疗法的个体、具有研究所关注的遗传缺陷的个体等。

在一些实施方案中，获自用于核重编程目的的受试者的人类细胞可选自任何人类细胞类型，包括成纤维细胞、脂肪组织细胞、间充质细胞、骨髓细胞、胃细胞、肝细胞、上皮细胞、鼻上皮细胞、粘膜上皮细胞、滤泡细胞、***细胞、肌细胞、骨细胞、软骨细胞、胃肠细胞、脾细胞、肾细胞、肺细胞、睾丸细胞、神经组织细胞等。在一些实施方案中，人类细胞类型是成纤维细胞，其可方便地通过钻取活检获自受试者。在某些实施方案中，细胞是获自已知或怀疑具有所关注基因的拷贝数变异(CNV)或突变的受试者。在其它实施方案中，细胞是来自具有特发/偶发疾病形式的患者。在其它实施方案中，细胞是来自非人类受试者。细胞接着重编程，并且可转分化以走上特异性细胞的道路，诸如内胚层细胞、神经元细胞，例如多巴胺能、胆碱能、血清素能、GABA能或谷氨酸盐能神经元细胞；胰腺细胞(例如胰岛细胞)、肌细胞(包括但不限于心肌细胞)、造血细胞等。

术语“重编程效率”可用于指当与重编程因子接触时细胞产生iPS细胞集落的能力。展示增强的重编程为多能细胞的效率的体细胞当与重编程因子接触时将相对于对照展示增强的产生iPS细胞的能力。术语“重编程效率”还可指体细胞重编程为实质上不同的体细胞类型(一种称为转分化的过程)的能力。本发明方法的重编程效率随体细胞的特定组合、引入重编程因子的方法和诱导重编程之后的培养方法而变化。

重编程因子如本文所用是指一种作用于细胞以改变转录并且在表达后将体细胞重编程为不同细胞类型或多潜能细胞或多能细胞的生物活性多肽或小分子或其混合物。出于本发明的目的，需要重编程因子是非整合的，即以不引起外源性DNA整合到受体细胞的基因组中的形式提供给受体细胞。因此，除核酸以外的试剂(例如蛋白质和小分子)往往为优选的。

出于本发明的目的，重编程因子通常融合到穿透结构域中以允许多肽穿过细胞膜并且穿过核膜进入。重编程因子可属于任何适合的哺乳动物物种，例如人类、鼠、猪、马、犬、羊、猫、猿等。人类多肽特别受关注。

在一些实施方案中，重编程因子是转录因子，包括但不限于Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；和Nanog。作为重编程因子同样受关注的是Lin28，其为一种被认为影响在分化期间特异性mRNA的转译或稳定性的mRNA结合蛋白。

所关注的重编程因子还包括适用于转分化的因子，其中体细胞重编程为不同的体细胞。出于使一种体细胞转分化为另一种实质上不同的体细胞类型的目的，可使用不同组的重编程因子。举例来说，为使成纤维细胞转分化为心肌细胞，可使用细胞穿透肽Gata4、Mef2c和Tbx5(Leda等使用病毒载体将成纤维细胞转化为心肌细胞；Cell,第142卷,第3期,375-386,2010年8月6日，具体地说以引用的方式并入本文中。)

重编程因子可以具生物活性的分离多肽组合物形式(即以无细胞形式)提供。生物活性可如实施例中所描述通过特异性DNA结合分析；或通过测定因子在改变细胞转录中的有效性来测定。本发明的组合物可提供一种或多种生物活性重编程因子。所述组合物可包含至少约50μg/ml、至少约100μg/ml；至少约150μg/ml、至少约200μg/ml、至少约250μg/ml、至少约300μg/ml或更多可溶性重编程因子。

Klf4多肽是一种包含与人类Klf4(即Kruppel样因子4，其序列可见于基因库登录号NP_004226和NM_004235)的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。Klf4多肽(例如那些与基因库登录号NM_004235中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应用。

c-Myc多肽是一种包含与人类c-Myc(即骨髓细胞癌病毒致癌基因同系物，其序列可见于基因库登录号NP_002458和NM_002467)的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。c-Myc多肽(例如那些与基因库登录号NM_002467中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应用。

Nanog多肽是一种包含与人类Nanog(即Nanog同源框，其序列可见于基因库登录号NP_079141和NM_024865)的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。Nanog多肽(例如那些与基因库登录号NM_024865中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应用。

Lin-28多肽是一种包含与人类Lin-28(即秀丽隐杆线虫(C.elegans)的Lin-28同系物，其序列可见于基因库登录号NP_078950和NM_024674)的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。Lin-28多肽(例如那些与基因库登录号NM_024674中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应用。

Oct3/4多肽是一种包含与人类Oct3/4(也称为智人POU第5类同源框1(POU5F1)，其序列可见于基因库登录号NP_002692和NM_002701)的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。Oct3/4多肽(例如那些与基因库登录号NM_002701中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应用。

Sox2多肽是一种包含与人类Sox2(即性别决定区Y-框2蛋白，其序列可见于基因库登录号NP_003097和NM_003106)的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。Sox2多肽(例如那些与基因库登录号NM_003106中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应用。

已描述小分子适用于重编程细胞，所述小分子包括但不限于丙戊酸、异羟肟酸、曲古霉素A、辛二酰苯胺异羟肟酸、BIX-01294和BayK8644(参见Shi等(2008)Cell Stem Cell6；3(5):568-574和Huangfu等(2008)Nature Biotechnology26:795-797，各自具体地说以引用的方式并入本文中)。

术语“处理”等在本文中用于泛指获得所要药理和/或生理效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或可归因于所述疾病的有害作用而言可以是治疗性的。如本文所用的“处理”涵盖对哺乳动物(尤其人类)的疾病的任何处理，并且包括：(a)预防疾病或症状在预先倾向于具有所述疾病或症状但尚未诊断为具有所述疾病或症状的受试者中出现；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)减轻疾病症状，即使疾病或症状退去。

术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且指需要诊断、处理或治疗的任何哺乳动物受试者，尤其人类。

穿透结构域。许多穿透结构域是本领域中已知的并且可用于本发明中，包括肽、拟肽类物质和非肽载体。在一个实施方案中，穿透肽衍生自称为穿膜肽(penetratin)的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)转录因子触角足蛋白(Antennapaedia)的第三α螺旋，其包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK。在另一个实施方案中，穿透肽包含HIV-1tat碱性区域氨基酸序列，其可包括例如天然存在的tat蛋白的氨基酸49-57。其它穿透结构域包括聚精氨酸基序，例如HIV-1rev蛋白的氨基酸34-56的区域、九精氨酸、八精氨酸等。(参见例如Futaki等(2003)Curr Protein Pept Sci.2003年4月；4(2):87-96；和Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A2000年11月21日；97(24):13003-8；公开的美国专利申请20030220334；20030083256；20030032593；和20030022831，具体地说以引用的方式并入本文中用于教示肽和类肽的移位)。九精氨酸(R9)序列是已表征(Wender等2000；Uemura等2002)的较有效PTD中的一者。

体外诱导多能性的方法

在用有效剂量的先天免疫激活剂(例如TLR激动剂)激活体细胞之前、同时或之后，使起始体细胞群与呈足以使细胞重编程为具有多能性的组合和量的如上文所定义的重编程因子接触。在本发明的一个实施方案中，TLR是TLR3。在一些实施方案中，TLR激动剂是双链RNA或其类似物。重编程因子可个别地或以单一组合物形式(即以重编程因子的预混组合物形式)提供给体细胞。

在一些实施方案中，使起始细胞群与呈在功能上等效于5ng/ml到3000ng/ml聚I:C的剂量的有效剂量的TLR激动剂(例如LPS、dsRNA等)接触，并且在此类激动剂存在下在培养物中维持约4到约18天(例如约5到约10天并且可为约6到8天)的时间。

重编程因子可同时或在不同时间连续地添加到受试者细胞中，并且可与先天免疫激活剂组合添加。在一些实施方案中，添加一组至少三种纯化重编程因子，例如Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4、c-myc、nanog或lin28多肽。在一些实施方案中，向细胞中提供一组四种纯化重编程因子，例如Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽；或Oct3/4多肽、Sox2多肽、lin28多肽和nanog多肽。

用于将重编程因子引入体细胞的方法包括提供具有纯化蛋白因子的细胞。典型地，重编程因子多肽将包含融合到多肽穿透结构域中的重编程因子的多肽序列。许多穿透结构域是本领域中已知的并且可用于本发明的核作用非整合多肽，包括肽、拟肽类物质和非肽载体。举例来说，穿透肽可衍生自称为穿膜肽的黑腹果蝇转录因子触角足蛋白的第三α螺旋，其包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK。作为另一个实例，穿透肽包含HIV-1tat碱性区域氨基酸序列，其可包括例如天然存在的tat蛋白的氨基酸49-57。其它穿透结构域包括聚精氨酸基序，例如HIV-1rev蛋白的氨基酸34-56的区域、九精氨酸、八精氨酸等。(参见例如Futaki等(2003)Curr Protein Pept Sci.2003年4月；4(2):87-96；和Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A2000年11月21日；97(24):13003-8；公开的美国专利申请20030220334；20030083256；20030032593；和20030022831，具体地说以引用的方式并入本文中用于教示肽和类肽的移位)。九精氨酸(R9)序列是已表征(Wender等2000；Uemura等2002)的较有效PTD中的一者。

在此类实施方案中，细胞在纯化重编程因子多肽存在下孵育约30分钟到约72小时，例如2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或约30分钟到约72小时的任何其它时间。典型地，四次将重编程因子提供到受试者细胞中，并且使细胞与重编程因子一起孵育48小时，所述时间之后将介质替换为新鲜介质并且进一步培养细胞(参见例如Zhou等人(2009)Cell Stem Cells4(5)；381-384)。重编程因子可提供到受试者细胞中约一周到约4周，例如约两周到约3周。

重编程因子的剂量将随细胞的性质、因子、培养条件等而变化。在一些实施方案中，各因子的剂量将为约1nM到约1μM，更通常为约10nM到约500nM或约100到200nM左右。在暴露于重编程作用物期间细胞最初宜暴露于TLR激动剂至少约1天、至少约2天、至少约4天、至少约6天或一周，并且可暴露整个重编程过程或更短时间。剂量将视具体激动剂而定，但可为约1ng/ml到约1μg/ml、约10ng/ml到约500ng/ml。可在各次提供之后与重组因子一起进行两次16-24小时孵育，其后将介质替换为新鲜介质并且进一步培养细胞。

在一些实施方案中，使用不整合到体细胞基因组中的载体。适用于将外源性基因转化到目标哺乳动物细胞中的许多载体是可获得的。载体可保持游离，例如呈质粒、病毒衍生载体(诸如巨细胞病毒、腺病毒)等形式。用于以核酸形式提供重编程因子到受试者细胞中的载体将典型地包含适合的启动子，用于驱使重编程因子核酸的表达，即转录激活。其可包括泛作用启动子，例如CMV-β-肌动蛋白启动子或诱导型启动子，诸如在特定细胞群中具活性或对诸如四环素的药物的存在有响应的启动子。通过转录激活，意在使靶细胞中的转录将增至高于基础水平至少约10倍、至少约100倍、更通常至少约1000倍。

在引入重编程因子之后，体细胞可维持在包含饲养层细胞的常规培养基中或可在不存在饲养层(即缺乏除那些诱导为多能细胞的体细胞外的体细胞)的情况下培养。无饲养层培养物可使用蛋白质涂布表面，例如基质胶等。

通过本发明的方法诱导变成此类细胞的iPS细胞具有hESC样形态，以具有大核质比、清晰边界和突起的核的平面集落形式生长。此外，iPS细胞可表达一种或多种本领域技术人员已知的主要多能细胞标记，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42。此外，iPS细胞能够形成畸胎瘤。此外，其能够形成或有助于形式活生物中的外胚层、中胚层或内胚层组织。

基因可出于各种目的引入体细胞或由其衍生的iPS细胞中，例如用于替换具有功能丧失型突变的基因、提供标记基因等。作为另外一种选择，引入表达反义mRNA或核糖酶的载体，从而阻断不合希望的基因的表达。其它基因治疗方法是引入耐药基因以使正常祖细胞能够具有优势并且经受选择压力，例如多重耐药基因(MDR)或抗细胞凋亡基因，诸如bcl-2。如上文所论述，可使用本领域中已知的各种技术来将核酸引入靶细胞中，例如电穿孔、钙沉淀DNA、融合、转染、脂质体转染、感染等。引入DNA的具体方式对本发明的实施来说并不关键。

通过以上方法产生的iPS细胞可用于重建或补充接受者中正分化或已分化的细胞。诱导的细胞可分化成各种谱系的细胞类型。分化细胞的实例包括来自外胚层(例如神经元和成纤维细胞)、中胚层(例如心肌细胞)或内胚层(例如胰腺细胞)谱系的任何分化细胞。分化细胞可为一种或多种：胰腺β细胞、神经干细胞、神经元(例如多巴胺能神经元)、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、肝细胞、肝干细胞、星形胶质细胞、肌细胞、造血细胞或心肌细胞。

存在许多将诱导细胞分化成更特化细胞类型的方法。分化诱导细胞的方法可类似于那些用于分化干细胞(尤其ES细胞、MSC、MAPC、MIAMI、造血干细胞(HSC))的方法。在一些情况下，分化离体进行；在一些情况下，分化体内进行。

诱导细胞或从诱导细胞分化的细胞可用作治疗疾病(例如遗传缺陷)的疗法。所述疗法可针对治疗病因；或者所述疗法可治疗疾病或病状的结果。诱导细胞可转化到或接近于受试者的损伤部位；或可以允许细胞迁移或驻留在损伤部位的方式将细胞引入受试者。经转化的细胞可有利地替换损坏或损伤细胞并且使受试者的总体病状改善。在一些情况下，经转化的细胞可刺激组织再生或修复。

经转化的细胞可以是从诱导细胞分化的细胞。经转化的细胞还可以是从诱导细胞分化的多能干细胞。在一些情况下，经转化的细胞可以是尚未分化的诱导细胞。

向受试者施用治疗的次数可变化。将诱导和/或分化细胞引入受试者可为一次事件；但在某些情况下，此类治疗可在有限时间引起改善并且需要持续的一系列重复治疗。在其它情况下，观测到效果之前可能需要多次施用细胞。确切方案视疾病或病状、疾病的阶段和所治疗的个别受试者的参数而定。

可通过以下途径中的任一者将细胞引入受试者：非肠道、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、气管内、腹膜内或脊髓液内。

iPS细胞可以任何生理学上可接受的方法施用。其可单独或与适合的底物或基质(例如用于支持其生长和/或其所移植的组织中的构造)一起提供。通常，将施用至少1×10⁵个细胞，优选地1×10⁶个或更多。细胞可通过注射、导管等引入。细胞可在液氮温度下冷冻并且长时间储存，解冻后能够使用。若冷冻，则通常将细胞储存在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI1640培养基中。一旦解冻，细胞可通过使用与祖细胞增殖和分化有关的生长因子和/或基质细胞扩增。

可提供试剂盒，其中所述试剂盒将包含有效剂量的TLR激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR3激动剂，例如双链RNA或其类似物。试剂盒可进一步包含一种或多种例如呈融合到穿透结构域中的蛋白质形式的重编程因子。

诱导体外或体内转分化的方法

如上文所定义的转分化是使体细胞核重编程为实质上不同的体细胞，例如不同谱系的体细胞。转分化的实例包括但不限于：成纤维细胞→肌细胞；成纤维细胞→内皮细胞；成纤维细胞→神经细胞；成纤维细胞→胰岛细胞；成纤维细胞→造血细胞；等；脂肪组织细胞到以下中的任一者：肌细胞、内皮细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞等；等。适合作为起始群的细胞上文已定义。此方法可提供一致性和在再生医学中的实际应用。

出于转分化的目的，将使用不同组的因子和对所衍生的细胞表型具特异性的介质。典型地，将在细胞已暴露于聚I:C足以诱导先天免疫的时间之后将分化因子提供到受试者细胞中。在一些实施方案中，在不存在分化因子的情况下，细胞暴露于先天免疫激活剂。在一些实施方案中，使起始细胞群与呈在功能上等效于5ng/ml到3000ng/ml聚I:C的剂量的有效剂量的TLR激动剂(例如LPS、dsRNA等)接触，并且在此类激动剂存在下在培养物中维持约4到约18天(例如约5到约10天并且可为约6到8天)的时间。通过此方法诱导先天免疫之后，细胞暴露于一种分化因子或其混合物。

举例来说，在以有效剂量进行TLR激动剂治疗约一周之后，通过使细胞再暴露于分化因子一到四周来使细胞转分化。培养基可替换为补充有对所衍生的细胞具特异性的生长因子的新鲜培养基。通过绘制剂量反应曲线来测定所需因子的适当浓度。类似地，用包括基因表达、形态和函数分析的一系列标准二级分析来表征转分化细胞。在许多实施方案中，用于从多能细胞群(例如ES细胞、iPS细胞等)分化体细胞类型的培养方案可应用于转分化。换句话说，已暴露于培养物中的TLR激动剂足以诱导先天免疫的时间的细胞可接着暴露于常规用于谱系特异性分化因子组。

细胞可分化成各种谱系的细胞类型。转分化细胞的实例包括来自外胚层(例如神经元和成纤维细胞)、中胚层(例如心肌细胞)或内胚层(例如内胚层细胞、胰腺细胞)谱系的任何分化细胞。转分化细胞可为一种或多种：胰腺β细胞、神经干细胞、神经元(例如多巴胺能神经元)、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、肝细胞、肝干细胞、星形胶质细胞、肌细胞、造血细胞、内胚层细胞或心肌细胞等。

转分化细胞可以是末端分化细胞，或其可能能够产生特定谱系的细胞。举例来说，细胞可以分化成各种多能细胞类型，例如神经干细胞、心干细胞或肝干细胞。干细胞可接着进一步分化成新的细胞类型，例如神经干细胞可分化成神经元；心干细胞可分化成心肌细胞；并且肝干细胞可分化成肝细胞。

在一些实施方案中，例如使用本文中实施例2中所阐述的方案使TLR激动剂处理的细胞分化成内皮细胞。用聚I:C处理之后，在包含有效剂量的BMP4、VEGF和bFGF的培养基中培养细胞。再5-10天之后，将培养基替换为包含有效剂量的VEGF、bFGF和8-Br-cAMP的内皮细胞培养基再持续10-20天。所得内皮细胞可按原样使用或可在培养物中(例如在包含有效剂量的TGFβ受体抑制剂的培养基存在下)进一步扩增。

任何已知从ES细胞产生神经干细胞的方法均可用于从TLR激动剂处理的细胞产生神经干细胞。参见例如Reubinoff等,(2001),Nat,Biotechnol.,19(12):1134-40。举例来说，可通过在头蛋白或其它骨形态发生蛋白拮抗剂存在下培养呈浮动聚集物形式的TLR激动剂处理的细胞来产生神经干细胞，参见例如Itsykson等,(2005),Mol CellNeurosci.,30(1):24-36。在另一个实例中，可通过在生长因子存在下以悬浮液形式培养TLR激动剂处理的细胞以形成聚集物来产生神经干细胞，例如FGF-2,Zhang等,(2001),Nat.Biotech.,(19):1129-1133。在一些情况下，聚集物是在含有FGF-2的不含血清的培养基中培养。在另一个实例中，TLR激动剂处理的细胞与小鼠基质细胞系(例如PA6)在包含FGF-2的不含血清的培养基存在下一起培养。在另一个实例中，TLR激动剂处理的细胞直接转移到含有FGF-2的不含血清的培养基中以直接诱导分化。

衍生自TLR激动剂处理的细胞的神经干细胞可分化成神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞。通常，用于产生神经干细胞的条件也可以用于产生神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞。

多巴胺能神经元在帕金森氏病(Parkinson's Disease)和其它神经退行性疾病中起关键作用并且因此受到特别关注。为促进分化为多巴胺能神经元，可将TLR激动剂处理的细胞与PA6小鼠基质细胞系在不含血清条件下一起共培养，参见例如Kawasaki等,(2000)Neuron,28(1):3140。也已描述其它方法，参见例如Pomp等,(2005),Stem Cells23(7):923-30；美国专利No.6,395,546，例如Lee等人,(2000),NatureBiotechnol.,18:675-679。

少突胶质细胞也可以产生自诱导细胞。诱导细胞分化为少突胶质细胞可通过已知用于使ES细胞或神经干细胞分化成少突胶质细胞的方法来实现。举例来说，可通过将诱导细胞或神经干细胞与基质细胞一起共培养来产生少突胶质细胞，例如Hermann等(2004),J Cell Sci.117(Pt19):4411-22。在另一个实例中，可通过在融合蛋白存在下培养诱导细胞或神经干细胞来产生少突胶质细胞，其中白介素(IL)-6受体或衍生物连接至IL-6细胞因子或其衍生物。还可以通过本领域中已知的其它方法从诱导细胞产生少突胶质细胞，参见例如Kang等,(2007)Stem Cells25,419-424。

星形胶质细胞也可以由TLR激动剂处理的细胞产生。可通过在神经原培养基存在下将TLR激动剂处理的细胞或神经干细胞与bFGF和EGF一起培养来产生星形胶质细胞，参见例如Brustle等,(1999),Science,285:754-756。

TLR激动剂处理的细胞可通过本领域中已知的方法分化成胰腺β细胞，例如Lumelsky等,(2001)Science,292:1389-1394；Assady等,(2001),Diabetes,50:1691-1697；D'Amour等,(2006),Nat.Biotechnol.,24:1392-1401；D'Amour等,(2005),Nat.Biotechnol.23:1534-1541。所述方法可包括在补充有激活素A的不含血清的培养基中培养TLR激动剂处理的细胞，随后在补充有全反视黄酸的不含血清的培养基存在下培养，随后在补充有bFGF和烟酰胺的不含血清的培养基存在下培养，例如Jiang等,(2007),Cell Res.,4:333-444。在其它实例中，所述方法包括在不含血清的培养基、激活素A和Wnt蛋白存在下将TLR激动剂处理的细胞培养约0.5到约6天，例如约0.5、1、2、3、4、5、6天；随后在约0.1％到约2％(例如0.2％)FBS和激活素A存在下培养约1到约4天，例如约1、2、3或4天；随后在2％FBS、FGF-10和KAAD-环巴胺(酮基-N-氨基乙基氨基己酰基二氢肉桂酰基环巴胺)和视黄酸存在下培养约1到约5天，例如1、2、3、4或5天；随后与1％B27、γ分泌酶抑制剂和促胰岛素分泌素-4(extendin-4)一起培养约1到约4天，例如1、2、3或4天；并且最后在1％B27、促胰岛素分泌素-4、IGF-1和HGF存在下培养约1到约4天，例如1、2、3或4天。

可从TLR激动剂处理的细胞分化肝细胞或肝干细胞。举例来说，在丁酸钠存在下培养TLR激动剂处理的细胞可产生肝细胞，参见例如Rambhatla等,(2003),Cell Transplant,12:1-11。在另一个实例中，可通过在不含血清的培养基中在激活素A存在下培养TLR激动剂处理的细胞，随后在成纤维细胞生长因子-4和骨形态发生蛋白-2中培养所述细胞来产生肝细胞，例如Cai等,(2007),Hepatology,45(5):1229-39。在一个示例性实施方案中，TLR激动剂处理的细胞如下分化成肝细胞或肝干细胞：通过在激活素A存在下将TLR激动剂处理的细胞培养约2到约6天，例如约2、约3、约4、约5或约6天，并且接着在肝细胞生长因子(HGF)存在下将诱导细胞培养约5天到约10天，例如约5、约6、约7、约8、约9或约10天。

TLR激动剂处理的细胞还可以分化成心肌细胞。骨形态发生蛋白(BMP)信号传导受抑制可引起心肌细胞的产生，参见例如Yuasa等,(2005),Nat.Biotechnol.,23(5):607-11。可通过在白血病抑制因子(LIF)存在下培养TLR激动剂处理的细胞或通过使其经受本领域中已知用于从ES细胞产生心肌细胞的其它方法来产生心肌细胞，例如Bader等,(2000),Circ.Res.,86:787-794；Kehat等,(2001),J.Clin.Invest.,108:407-414；Mummery等,(2003),Circulation,107:2733-2740。

用于从TLR激动剂处理的细胞产生其它细胞类型的方法的实例包括：(1)培养诱导细胞在视黄酸、白血病抑制因子(LIF)、甲状腺激素(T3)和胰岛素存在下以产生脂肪细胞，例如Dani等,(1997),J.CellSci.,110:1279-1285；(2)在BMP-2或BMP4存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生软骨细胞，例如Kramer等,(2000),Mech.Dev.,92:193-205；(3)在各条件下培养TLR激动剂处理的细胞以产生平滑肌，例如Yamashita等,(2000),Nature,408:92-96；(4)在β-1整合素存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生角化细胞，例如Bagutti等,(1996),Dev.Biol.,179:184-196；(5)在白介素-3(IL-3)和巨噬细胞集落刺激因子存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生巨噬细胞，例如Lieschke和Dunn(1995),Exp.Hemat.,23:328-334；(6)在IL-3和干细胞因子存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生肥大细胞，例如Tsai等,(2000),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:9186-9190；(7)在***(dexamethasone)和基质细胞层、青灰因子存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生黑色素细胞，例如Yamane等,(1999),Dev.Dyn.,216:450-458；(8)在***、视黄酸、抗坏血酸、β-甘油磷酸酯存在下将TLR激动剂处理的细胞与胎鼠成骨细胞一起共培养以产生成骨细胞，例如Buttery等,(2001),Tissue Eng.,7:89-99；(9)在成骨因子存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生成骨细胞，例如Sottile等,(2003),Cloning Stem Cells,5:149-155；(10)使***-2在TLR激动剂处理的细胞中过表达并且在二甲基亚砜存在下培养细胞以产生骨骼肌细胞，例如Prelle等,(2000),Biochem.Biophys.Res.Commun.,277:631-638；(11)使TLR激动剂处理的细胞经受多种条件用于产生白血球；或(12)在BMP4和以下中的一者或多者存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生造血祖细胞：SCF、FLT3、IL-3、IL-6和GCSF，例如Chadwick等,(2003),Blood,102:906-915。

在一些情况下，可将转分化体细胞的亚群纯化或分离。在一些情况下，将一种或多种对所要细胞类型具特异性的单克隆抗体与细胞群一起孵育并且将那些结合细胞者分离。在其它情况下，所要细胞亚群表达受细胞类型特异性启动子控制的报告基因。

转分化细胞可用作一种疗法来治疗疾病，例如遗传缺陷。所述疗法可针对治疗病因；或者所述疗法可治疗疾病或病状的结果。转分化细胞可转化到或接近于受试者的损伤部位；或可以允许细胞迁移或驻留到损伤部位的方式将细胞引入受试者。经转化的细胞可有利地替换损坏或损伤细胞并且使受试者的总体病状改善。在一些情况下，经转化的细胞可刺激组织再生或修复。

转分化细胞可转化到忍受广泛范围疾病或病症的受试者中。忍受神经疾病或病症的受试者可尤其受益于细胞疗法。在一些途径中，转分化细胞是移植到损伤部位的神经干细胞或神经细胞以治疗神经病状，例如阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、多发性硬化、脑梗死、脊髓损伤或其它中枢神经***病症，参见例如Morizane等,(2008),Cell Tissue Res.,331(1):323-326；Coutts和Keirstead(2008),Exp.Neurol.,209(2):368-377；Goswami和Rao(2007),Drugs,10(10):713-719。

为治疗帕金森氏病，可使诱导细胞分化成多巴胺作用神经元并且接着移植到帕金森氏病受试者的纹状体中。为治疗多发性硬化，可使神经干细胞分化成少突胶质细胞或少突胶质细胞祖细胞，其接着转化到忍受MS的受试者中。

诸如缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷的退行性心脏疾病可受益于干细胞疗法，参见例如Janssens等,(2006),Lancet,367:113-121。

内皮细胞适用于改善脉管结构和功能，增强血管形成并且改善灌注，例如在外周动脉疾病中。

胰岛细胞(或郎格罕氏岛(islet of Langerhans)的原代细胞)可移植到忍受糖尿病(例如1型糖尿病)的受试者中，参见例如Burns等,(2006)Curr.Stem Cell Res.Ther.,2:255-266。在一些实施方案中，衍生自本发明细胞方法的胰腺β细胞可移植到忍受糖尿病(例如1型糖尿病)的受试者中。

在其它实例中，衍生自诱导细胞的肝细胞或肝干细胞移植到忍受肝病(例如肝炎、肝硬化或肝功能衰竭)的受试者中。

造血细胞或造血干细胞(HSC)可移植到忍受血癌或其它血液或免疫病症的受试者中。可能通过造血细胞或HSC治疗的血癌的实例包括：急性成淋巴细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病(CML)、何杰金氏病(Hodgkin's disease)、多发性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤。往往，忍受此类疾病的受试者必须经历放射线和/或化学疗法治疗以快速杀死***的血细胞。将衍生自本发明方法的HSC引入这些受试者可帮助重新填充耗尽的细胞储层。

在一些情况下，通过转分化衍生的造血细胞或HSC还可以直接用于对抗癌症。举例来说，异体HSC的移植在治疗肾癌方面已展现前景，参见例如Childs等,(2000),N.Engl.J.Med.,343:750-758。在一些实施方案中，可将衍生自诱导细胞的异体或甚至自体HSC引入受试者以治疗肾癌或其它癌症。还可以将衍生自诱导细胞的造血细胞或HSC引入受试者以产生或修复除血细胞以外的细胞或组织，例如肌肉、血管或骨胳。此类治疗可适用于许多病症。

应了解，本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属、构筑体和试剂，因此当然可变化。还应了解，本文所用的术语是仅出于描述特定实施方案的目的，并且不打算限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所描述类似或等效的任何方法、装置和材料均可用于本发明的实施或测试，但现描述优选的方法、装置和材料。

本文所提到所有出版物均出于描述和公开的目的以引用的方式并入本文中，例如所述出版物中所描述并且可结合本发明使用的试剂、细胞、构筑体和方法。提供上文所论述并且在本文通篇中的出版物仅仅针对其在本申请提交日之前的公开内容。本文中所有内容均不应视为承认本发明人无权凭借现有发明而先于此类公开内容。

公布以下实施例以便为本领域技术人员提供对如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不打算限制什么被视为本发明的范围。已努力确保所用数值(如量、温度、浓度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有陈述，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度计，压力是大气压或接近大气压。

实验

实施例1

非整合核重编程中先天免疫的激活

重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的逆转录病毒过表达可产生诱导性多能干细胞(iPSC)。然而，外来DNA的整合可诱导基因组调节异常。克服此限制的一种途径是表达呈细胞穿透蛋白(CPP)形式的因子。迄今为止，已证明此途径是困难的，并且尚未使用纯化CPP重编程人类体细胞。我们发现由基于病毒与基于蛋白质递送的重编程因子诱导的基因表达模式差异显著，表明有效核重编程所需的信号传导途径由逆转录病毒而非CPP途径激活。在功能获得与功能丧失研究两者中，我们发现toll样受体3(TLR3)的激活在核重编程效率方面发挥作用。TLR3的刺激引起在染色质重塑情况下表观遗传修饰剂的表达的快速改变和有利于诱导多能性的基因表达的改变。

在设法研发通过引入CPP有效重编程人类细胞的方案过程中，我们偶然观察到与基于蛋白质的方法相对比在通过病毒诱导的基因表达的模式中的有趣差异。通过将CPP与编码非相关基因的逆转录病毒粒子组合或更实际上通过将CPP与toll样受体(TLR)激动剂组合概括得到在逆转录病毒方法情况下观察到的基因表达的诱导更快速。我们进一步观察到TLR3介导的信号传导的诱导促进为有效重编程所需的表观遗传重塑。对先天免疫在核重编程中的作用和其定向操纵的认识提供可促进我们了解先天免疫与重编程两者的关键理解，并且增加我们对在诱导性多能性中起作用的遗传和表观遗传途径的了解。

结果

相对于细胞穿透肽通过病毒编码转录诱导的基因表达的不同模式如先前所描述，我们的CPP是融合肽，各自具有重编程因子、连接子和细胞转导结构域。如同样所描述，这些CPP展现同源DNA结合活性、快速移位穿过细胞质和核膜、均匀转导所处理孔中的几乎所有细胞并且对已知的下游目标基因施加转录控制。然而，在用各种实验方案作出多次尝试之后，我们未能使用由我们小组或商业供应商产生的CPP从人类成纤维细胞产生iPSC细胞系。

在努力理解并且克服此失败的过程中，我们检验了响应于逆转录病毒构筑体(pMX-Sox2)相较于相应CPP(CPP-SOX2)的目标基因表达的时间序列。我们将注意力集中于Sox2激活的基因的经验证的下游目标，诸如Jarid2、Zic2和bMyb，以及已知在核重编程中起作用的下游基因，即Nanog、Sox2和Oct4。通过血清饥饿法使人类成纤维细胞同步并且接着使其单次感染pMX-Sox2或每天用CPP-SOX2处理，并且在6天内分析基因表达。我们使用我们先前已证实能够相较于Sox2而解救经shRNA处理的人类iPSC的CPP-SOX2日剂量(200nM)。

观测到基因表达模式中的有趣差异。早在pMX-Sox2转染的第1天，人类BJ成纤维细胞已显示多能细胞(例如Nanog)和目标基因的表达增加(图1A和图8)。相比之下，尽管CPP-SOX2快速进入所处理细胞的细胞质和核(2h内)，但其直至若干天后仍不显示相应的目标基因表达增多(图1A)。因为各处理条件下所选基因(Jarid2、Zic2、bMyb、Oct4、Sox2和Nanog)的时间表达模式显著类似，所以其随时间推移的倍数表达变化以平均值形式显示于图1B中。

为排除目标基因表达延迟是单一CPP设计的函数的可能性，我们重复这些比较CPP与针对Oct4的病毒载体(pMX-Oct4)的实验，评估其对下游目标(Tcf4和GAP43)和多能性基因的影响。与用pMX-Oct4转染的细胞相比，在用CPPOCT4处理的细胞中我们观察到类似的延迟基因表达模式(图1C-D)。又，因为各处理条件下所选基因(Tcf4、GAP43、Oct4、Sox2和Nanog)的时间表达模式显著类似，所以其随时间推移的倍数表达的变化以组平均值显示于图1D中。这些数据显示与暴露于呈纯化CPP形式的重编程因子的人类成纤维细胞相比，暴露于在逆转录病毒载体中的重编程因子的人类成纤维细胞的基因表达模式之间的极大差异。

病毒粒子促进CPP-TF诱导的基因表达我们假设病毒粒子(独立于所编码的基因)的内在特征可影响重编程过程。为验证这一假设，我们评估了CPP单独或在编码不参与重编程的基因的逆转录病毒存在下的效果。pMX-GFP对照载体不影响目标基因表达(图8)。然而，当pMX-GFP载体与CPP-SOX2组合时，下游基因的表达基本上增强，从而再现由逆转录病毒表达载体pMX-Sox2诱导的基因表达的模式(图2A-B和图S2A-C)。我们用CPP-OCT4重复了这些研究(图2和图S2D-E)。当pMX-GFP载体与CPP-OCT4组合时，再次促进下游基因的时间表达，与在病毒载体pMX-Oct4情况下观察到的效果相似(图2C-D)。这些研究表明病毒粒子本身的一些内在特征对重编程因子对基因表达的影响有贡献。

为获得对逆转录病毒粒子可促进核重编程的机制的更深入理解，我们在逆转录病毒的pol编码区域附近引入移码突变代替pMX-GFP的非整合突变。此突变可进入保持逆转录酶活性的完好病毒粒子的细胞直接合成，但不能将新合成的病毒DNA整合到宿主基因组中。然而，pMX-GFP非整合突变完全能够促进CPP-OCT4诱导的基因表达(图10)。因此，外来DNA整合到宿主基因组中不是CPP与其相应病毒载体之间的基因表达差异所需要的。病毒感染借助于与Toll样受体(TLR)相互作用激活先天免疫。TLR识别与病毒蛋白、脂多糖、DNA或RNA有关的病原体相关分子模式(PAMP)。我们假定先天免疫通过TLR激活可真正涉及基因表达差异，我们观察到我们的逆转录病毒载体(而非CPP)激活炎症(先天免疫反应)基因，包括toll样受体3(TLR3)、NF-κB、IFN-β、Stat1和Stat2(图11)。

TLR3信号传导的基因敲低使由编码Oct4的病毒载体诱导的多能基因表达降低。TLR信号传导途径由两条不同的途径组成：骨髓分化初级反应基因(MyD)88依赖性途径，和MyD88非依赖性途径。MyD88依赖性途径是所有TLR共有的，除了TLR3。为辨别哪一TLR信号传导途径可涉及载体情况下的核重编程，我们使用抑制肽或对准MyD88依赖性和非依赖性途径的元件的shRNA基因敲低。TLR3途径由病毒dsRNA激活，并且独立于MyD88。TLR3的衔接子是TRIF(含TIR结构域的衔接子诱导的干扰素β)。

因此，为探索此途径在病毒构筑体对基因表达的影响中的作用，我们将TLR3或TRIF基因敲低。此外，我们使用TRIF的细胞可穿透肽抑制剂。正如所料，TRIF衔接子分子的肽抑制或通过TRIF或TLR3的shRNA进行的基因敲低使pMX-Oct4引起的免疫应答基因的激活显著降低(图12)。值得注意地，TLR信号传导的这些基因敲低也使由pMX-Oct4诱导的目标和多能基因表达降低。TRIF的肽抑制剂(肽抑制剂-TRIF)使pMX-Oct4诱导Oct4表达(图3A)以及其它所选基因的表达(图3D)的效果减弱。类似地，TRIF的shRNA基因敲低(图3B和3E)，以及TLR3的shRNA基因敲低(图3C和3F)也使pMX-Oct4诱导所选基因表达的效果减弱。相比之下，抑制肽(图13A)或稳定shRNA基因敲低(图13B)对MyD88的抑制对由pMX-Oct4诱导的目标和多能基因表达没有影响。总而言之，这些研究表明TLR3(而非其它TLR途径)是逆转录病毒表达载体完全诱导目标基因表达所需要的。

TLR3信号传导是有效产生人类iPSC所需要的为确定TLR3信号传导是否为有效产生人类iPSC所必需，我们使人类BJ成纤维细胞暴露于编码OSKM到BJ成纤维细胞中的逆转录病毒载体，所述BJ成纤维细胞事先用错义shRNA或shRNA处理以抑制(KD)TLR3、TRIF或MyD88的表达(图4A)。转导后六天，将细胞在丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上接种，并且第二天，将培养基用iPSC培养基(含有8ng/ml碱性FGF)替换。约第25天，我们在错义-KD和MyD88-KD细胞中观察到小集落；相比之下，在TRIF-KD或TLR3-KD细胞中未观察到集落。在第30天，在含有错义-KD细胞和MyD88-KD细胞的盘中注意到清晰的具有典型iPSC集落形态的集落(图4B)。此时，TRIF-KD和TLR3-KD细胞仅显示小颗粒状集落。TRIF和TLR3-KD细胞又用了9天来产生形态清晰的iPSC集落。我们人工计算了具有典型形态特征的各清晰集落，以及那些第30天到第39天出现的较小的颗粒状集落(在由对处理组设盲的观察者进行的两个独立实验中)。如图4C所示，在早期时间点处TRIF-KD和TLR3-KD细胞与错义-KD和MyD88-KD细胞相比产生显著较少的集落。此外，我们比较了第30天这些集落之间的基因表达值。Oct4(图4D)、Sox2和Nanog的表达当与TRIF-KD和TLR3-KD iPSC相比时上调大于10倍。这些发现提供第一证据表明：TLR3激活为使用最初由Yamanaka描述的方法有效诱导多能基因和产生人类iPSC集落所必需的。

TLR3激动剂促进CPP诱导的目标基因表达若TLR3激活在基于病毒的重编程的效率中起作用，则添加TLR3激动剂预期将增强CPP诱导的重编程。聚肌苷聚胞苷酸(聚I:C)是dsRNA的合成类似物，其具体地说由TLR3识别并且其诱导参与先天免疫的基因的表达(图14)。因此，我们评估了CPP单独或在聚I:C存在下的效果。目标基因的表达不受单独聚I:C的影响。然而，当聚I:C(300ng/ml)与CPP-SOX2组合时，促进下游基因的表达，从而再现由pMX-Sox2诱导的基因表达的时间过程(图5A-B；和图15A-C)。我们用CPP-OCT4重复了这些研究。当聚I:C与CPP-OCT4组合时，再次促进下游基因的时间表达，与病毒载体pMX-Oct4情况下所观察的效果相似(图5C-D；和图15D-E)。这些研究提供了对TLR3信号传导为重编程因子有效诱导目标基因所需的假设的进一步支持。

TLR3激活使强力霉素诱导型***产生iPSC的效率提高为进一步验证TLR3激活为有效重编程所需的假设，我们从鼠胚胎分离表达编码四种重编程因子的强力霉素(Dox)诱导型多顺反子转基因构筑体的MEF。为产生iPSC，将6孔板中每孔10⁵个MEF用Dox处理。在一些孔中，在重编程过程的起初6天还添加聚I:C。在其它孔中，在Dox处理的第一天用pMX-GFP感染细胞。聚I:C或pMX-GFP各促进Oct4和Sox2的表达(图6A)。聚I:C以及pMX-GFP促进在第3天孔中聚集的小而紧密的圆形细胞的MEF的形态变化(图16)。类似地，用pMX-GFP感染似乎促进集落形成，因为在病毒粒子感染组中在第7天观察到许多小集落(图16)。在第14天，典型mES样集落出现，其中许多具有激活的SSEA-1。此时间点，在暴露于病毒粒子或聚I:C的孔中典型SSEA-1⁺集落的数目增加7-8倍(图6B)。在第21-28天集落数进一步增加(图6B和6C)。这些研究证实TLR3激活使核重编程为多能细胞增强。

TLR3激活使CPP诱导产生人类iPSC增强已知重编程因子的持续表达(约2周)是使用病毒载体产生小鼠iPSC所需要的。然而，甚至在连续暴露于CPP6-30天之后我们仍未能产生人类iPSC。我们假设TLR3途径的激活可促进为CPP的完全转录效果所需的表观遗传变化。我们还试图通过在6天后降低CPP的剂量来模拟以病毒载体形式引入的重编程因子的双相效果。因此，我们使人类成纤维细胞在第1-6天存在或不存在聚I:C(300ng/ml)的情况下暴露于四种CPP-转录因子(Oct4-R11、Sox2-R11、Klf4-R11和cMyc-R11)(第1-6天以200nM的剂量，并且第7-21天以100nM的剂量)(图7A)。在第26天将培养物转化到饲养细胞(去活化MEF)中。在聚I:C存在下，Oct4表达得以促进(图7B)。此外，聚I:C促进iPSC产生(图7C-D)。第21天观察到小集落并且第30天出现ES样集落，其中许多如活细胞染色所指示表达TRA-1-81。相比之下，在不暴露于聚I:C的人类成纤维细胞中，直到第30天仍未观察到集落。第40天，在暴露于聚I:C的细胞中，集落数增加大于4倍(图7C)。我们关于TLR3信号传导在核重编程中的作用的理解的应用使我们成功地使用CPP重编程人类成纤维细胞为多能细胞。

TLR3激活引起有利于重编程的表观遗传变化我们假设TLR3激活可通过诱导开放染色质状态从而允许重编程因子诱导ESC特异性基因表达模式来使早期转录激活增强。因此，我们进行了芯片分析，以检测组蛋白H3在第4位赖氨酸处的三甲基化(H3K4me3)。此表观遗传修饰标记转录活性基因。在聚I:C或pMXGFP存在下用pMXSox2或用CPPSox2处理人类成纤维细胞。在处理的第2天，单独pMXSox2(而非CPPSox2)诱导在Oct4启动子处的H3K4三甲基化(图8A)。然而，在病毒载体或聚I:C存在下，在第2天CPPSox2诱导H3K4三甲基化的变化(图17)。尽管单独CPPSox2可诱导H3K4三甲基化(图18A)，但仅是在一段时间滞后以后，这反映了其对目标基因表达的延迟作用。类似地，在CPP处理的成纤维细胞中，聚I:C或编码GFP的逆转录病毒载体促进在Sox2启动子处的H3K4三甲基化(图18C)。以类似方式，我们评估了Oct4和Sox2启动子中第9位赖氨酸处的组蛋白H3(H3K9me3)。此表观遗传修饰标记转录沉默基因。在处理的第2天，单独pMXSox2(而非CPPSox2)使Oct4启动子处的H3K9三甲基化完全逆转(图17)。聚I:C或pMXGFP使第2天由CPPSox2诱导的H3K9三甲基化增强(图17)。尽管单独CPPSox2可使Oct4启动子处的H3K9三甲基化完全逆转(图18B)，但仅是在一段时间滞后以后，这反映其对目标基因表达的延迟作用。类似地，在CPP处理的成纤维细胞中，聚I:C或编码GFP的逆转录病毒载体促进在Sox2启动子处的H3K9三甲基化的损失(图18D)。这些研究提供一种表观遗传机制，用以解释TLR3激活增强核重编程的作用。

TLR3激活调节表观遗传机构：NF-κB的作用组蛋白乙酰基化状态影响染色质的折叠和功能状态并且调节DNA对用于基因表达的转录机构的可及性。组蛋白去乙酰基化通常与闭合染色质状态有关，并且使用组蛋白去乙酰基化酶(HDAC)抑制剂(诸如丙戊酸)来增强核重编程。因此，应注意，聚I:C下调一套HDAC基因在CPP处理的人类成纤维细胞中的表达。聚I:C对HDAC1表达的下调是通过蛋白质印迹分析确认(图17)。在上文所描述的dox诱导型MEF中并且在图6中注意到类似的聚I:C对HDAC家族的下调。

聚I:C显著影响其它表观遗传修饰剂的表达。此外，由TLR3激活促进的Oct4和Sox2启动子的甲基化状态的变化还与被促进的异染色质蛋白1(HP1；图19A和19B)的再分配有关。结合于甲基化H3K9的HP1补充甲基化酶Suv39h，从而引起H3K9的进一步甲基化，以便巩固抑制状态。由聚I:C诱导的HP1再分配与由TLR3激活诱导的全基因组表观遗传变化一致。组蛋白乙酰基化喜欢由含有组蛋白乙酰基转移酶(HAT)结构域的蛋白质(诸如p300和CBP)所维持的开放染色质状态。NF-κB是TLR3激活的转录效应因子，并且与CBP/p300相互作用以正向调节基因表达。我们使用荧光素酶报告子分析***来证明单独聚I:C(而非CPP)诱导的NF-κB激活(图20)。此效应由TLR3介导，因为TLR3或其衔接蛋白TRIF1的shRNA基因敲低使聚I:C对NF-κB激活的影响降低(图20)。类似地，逆转录病毒构筑体以及聚I:C诱导NF-κB和TLR3的表达的持续增加，而CPP-SOX2并不如此(图20)。这些研究表明TLR3激活诱导表观遗传机制的基因表达的变化的效应可部分由NF-κB介导。

在使用细胞穿透肽(CPP)的同时设法诱导多能性的过程中，我们偶然发现先天免疫信号传导在有效核重编程中的作用。我们的突出观察结果是：1.)在暴露于呈逆转录病毒载体与CPP形式的重编程因子的细胞之间观察到基因表达的时间特征的一致差异；2.)当使用逆转录病毒载体来过表达重编程因子时，TLR3基因敲低抑制下游目标基因的激活，并且使产生人类iPSC的效率和产量降低；3.)TLR3激活促进使用CPP的下游目标基因的表达；使dox诱导型***中产生miPSC的效率和产量提高；并且当使用呈CPP形式的重编程因子时使产生人类iPSC的效率和产量提高，并且4.)TLR3激活诱导表观遗传变化，包括Oct4和Sox2启动子的甲基化状态的变化，以及表观遗传效应因子的表达的变化，其促进开放染色质构型。此报告首次在多能细胞诱导中的核重编程效率与炎症途径之间建立直接联系。

未被了解的TLR3活性在重编程中的作用。TLR3识别由逆转录病毒产生的双链RNA(dsRNA)。TLR信号传导对有效核重编程的重要性尚未被了解。我们证实肽抑制剂情况下途径的基因敲低或TLR3或其衔接蛋白TRIF的shRNA基因敲低使得使用逆转录病毒载体产生人类iPSC的效率和产量降低。我们证实了TLR信号传导在使用经基因工程化以表达编码重编程因子的强力霉素诱导型盒的鼠胚胎成纤维细胞的无病毒***中的重要性。在此***中，TLR3激动剂聚I:C共施用使鼠iPSC的效率和产量增加(图6)。值得注意地，在共施用编码GFP的逆转录病毒情况下观察到相同效果，所述逆转录病毒预期将激活TLR3，而不以其它方式影响核重编程过程。我们的研究表明用于诱导多能性的逆转录病毒载体不只是用于递送重编程因子的媒介物，并且对重编程过程有积极贡献。

TLR3激活增强重编程。先天免疫反应激活影响核重编程的认识允许我们提高使用呈CPP形式的重编程因子的人类iPSC的效率和产量。迄今为止，尚未使用纯化CPP将人类体细胞重编程为多能细胞。已使用衍生自过表达Yamanaka因子的HEK细胞的提取物产生人类iPSC。然而，有可能这些细胞提取物含有可触发炎症途径的因子(例如病毒DNA)。即便如此，我们仍了解到有可能用单独CPP实现核重编程。此成功仅在我们修改我们的实验方案以便模拟在重编程因子的逆转录病毒施用情况下观察到的双相基因表达模式之后实现(即我们第6天开始降低所施用CPP的剂量)。

TLR3和表观遗传修饰。TLR3激活提高产生人类iPSC的产量和效率的效果似乎部分归因于其对表观遗传修饰剂的表达或分配的调节。我们使用cDNA分型来检验TLR3激活的效果。我们观察到组蛋白去乙酰基酶家族的抑制，其中HDAC1、2、5和7的表达显著降低。我们还观察到甲基转移酶SMYD1、PRMT2、6和8；组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶ASH1l；和丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶Nek6的下调。与表观遗传修饰剂的表达的变化相关联，我们观察到在Oct4和Sox2启动子区域上与开放染色质构型一致的组蛋白修饰(图17、18)。然而，值得注意地，在单独TLR3激活情况下未观察到这些启动子的H3K4三甲基化的增加和H3K9三甲基化的减少。仅在CPP存在下，聚I:C诱导这些甲基化标记的变化。此观测结果显示，尽管TLR3激活引起可促进多能细胞基因的开放染色质构型的表观遗传修饰剂的表达的普遍变化，重编程蛋白质可能是将表观遗传修饰剂引导到适当启动子序列中所必需的。此观点还由HP1α分配的共焦图像(图S19A-C)支持。

异染色质蛋白-1(HP1)与闭合染色质构象有关。尽管我们未看到HP1表达的表达水平的变化(图19D)，但当CPP-SOX2与聚I:C一起或与编码GFP的逆转录病毒载体一起共施用时我们观察到其分配的显著变化。然而，在不存在CPP的情况下，不存在可观察到的由聚I:C或逆转录病毒载体单独诱导的HP1再分配。五类病原体识别受体(PRR)中的任一者均已显示以类似于TLR3的方式进行信号传导，并且预期可促进核重编程。当前研究暗示TRIF信号传导的事实可能与逆转录病毒RNA提供足够TLR3信号传导以触发NF-κB、IRF3和IFN的事实一致。虽然TLR3模拟逆转录病毒载体的信号传导，但其它TLR激动剂以及NOD样受体、RIG-I样受体、胞质DNA传感器和C型凝集素受体的激动剂驱动集中于NF-κB、IRF-3和IFNβ的类似炎症反应。

总之，我们的观测结果突出了先前未被识别的先天免疫激活在核重编程中的作用。用于诱导多能性的载体不只是仅用于重编程因子的媒介物。其对TLR3受体的刺激诱导表观遗传激活，这会促进重编程因子对其下游目标基因的作用。对先天免疫信号传导在核重编程中的作用的认识可产生提高重编程的效率和质量并且改进iPSC的治疗应用的见解。

实验程序

将衍生自***的细胞BJ人类成纤维细胞(Stemgent)在具有10％FBS和1％青霉素/链霉素(pen-strep)抗菌素的DMEM中在湿润的5％CO₂孵育器中在37℃下培养。关于MEF分离，在第E13.5天从获自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)的来自Col1a1基因座的表达loxP侧翼dox诱导型多顺反子4F2A盒(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的单基因转基因R26_rtTA；Col1a1_2lox-4F2A小鼠分离嵌合胚。在移除头部和内部器官之后，将其余组织物理地分离并且在胰蛋白酶中在37℃下孵育20分钟，其后将细胞再悬浮于含有嘌呤霉素(2μg/ml)的MEF介质中并且扩增两代，然后冷冻。

病毒制剂和感染HEK293FT细胞以每个T225烧瓶6×10₆个细胞进行涂铺并且孵育过夜。用10μg VSV-G(包膜蛋白)、15μg pUMVC(包装质粒)和10μg所关注基因(Sox2或Oct4)与脂质体一起转染细胞。转染后48小时，收集转染体的上清液并且通过0.45μm过滤器过滤。以17,100rpm旋转2小时20分钟之后，将病毒团块再悬浮以制备100倍储备溶液。在6孔盘中以每孔5×10₄个细胞接种人类成纤维细胞，一天后转导。将培养基用补充有8μg/ml凝聚胺的含病毒上清液替换，并且孵育24小时。

在60-70％融合时进行处理，使用1％血清对BJ成纤维细胞进行血清饥饿处理以诱导G1细胞周期停止。接着，使经同步的BJ成纤维细胞经受逆转录病毒构筑体单一感染或每天用200nM CPP(CPP-SOX2或CPP-OCT4)处理。将聚I:C(300ng/ml)与CPP同时添加到细胞中。对于涉及肽抑制剂的实验，将细胞在40μM下用MyD88抑制肽(肽抑制剂-MyD)或TRIF抑制肽(肽抑制剂-TRIF)预处理6h，随后进行CPP处理。

用RNeasy试剂盒将基因表达和微阵列分析RNA分离。用oligo(dT)引物起始第一链cDNA并且用来自Applied Biosystems的引物组进行qPCR。制备RNA探针并且杂交到伊鲁米那人HT-12v4表达微珠芯片(Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChip)微阵列中。

短发夹RNA设计短发夹RNA是获自Invivogen。目标序列：MyD88shRNA，AACTGGAACAGACAAACTATC；TRIF shRNA，AAGACCAGACGCCACTCCAAC和TLR3shRNA，GCTTGGCTTCCACAACTAGAA

如先前所描述进行染色质免疫沉淀和ChIP-qPCR qChIP(Lim等,2009；Peng等,2009)。对于qChIP和qRT-PCR，误差估计值是标准偏差。用免疫沉淀物中的拷贝数与输入对照值的比率计算以输入百分比表示的基因组DNA的回收率。Oct4和Sox2启动子的引物购自CellSignaling。

iPSC的产生逆转录病毒-iPSC：如先前所描述(Takahashi等,2007；Takahashi和Yamanaka,2006)，将事先用MyD88、TRIF、TLR3或错义shRNA处理的人类成纤维细胞用pMX-Oct4、Sox2、Klf4和cMyc逆转录病毒转导并且在iPSC培养基中在经丝裂霉素处理的MEF上培养。随时间推移计算集落的数目，并且将其收获用于RNA分离、关于多能基因表达的qPCR分析。

蛋白质-iPSC：在C端含有十一精氨酸膜渗透结构域的重组Oct4、Sox2、Klf4和cMyc人类蛋白(CPP)获自Stemgent。将人类成纤维细胞用编码重编程因子的CPP(CPP-Oct4、CPP-Sox2、CPP-Klf4和CPP-Myc)处理，每天用200nM CPP持续6天，随后从第7天到第20天每天用100nM CPP处理。同时添加聚I:C(300ng/ml)或媒介物到细胞中仅到第6天。在第30天将细胞传代到MEF饲养细胞上。在CPP处理20天后，仔细扫描各孔的集落。

强力霉素诱导的iPSC：如先前所描述(Wernig等,2008)，分离来自第E13.5天的嵌合胚的MEF。在六孔板中每孔涂铺4×10₄个次级MEF(#4代)并且用强力霉素(2μg/mL)±聚I:C(300ng/ml)处理。每天监测iPSC集落的产生并且在第14天和第21天进行打分。

NF-κB荧光素酶分析将BJ成纤维细胞(3×10₅)在6孔板中接种并且使其在存在或不存在聚IC(300ng/ml)的情况下经受pMX-GFP感染、CPP-SOX2处理。使用脂质体2000(Lipofectamine2000)将细胞用作为阳性对照质粒的pNF-κB-Luc和pFC-MEKK转染。转染后二十四小时，收集细胞以便使用光度计通过Bright-Glo^TM荧光素酶分析***测量荧光素酶活性。

活细胞的免疫染色为检测活细胞中的SSEA-1或TRA-1-81，将原始Ab(抗小鼠SSEA-1，抗人TRA-1-81，Stemgent)稀释到于新鲜细胞培养基中2.5到5μg/ml的最终浓度并且在37℃和5％CO₂下与细胞一起孵育30分钟。温和洗涤之后，在荧光显微镜下检验细胞。

蛋白质印迹法通过将细胞溶解于含有1倍蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中来从BJ成纤维细胞中提取蛋白质。装载25μg总蛋白并且在SDS聚丙烯酰胺凝胶上溶解，转移到PVDF膜上并且用以下第一抗体作探针：抗HP1α和抗HDAC(Cell Signaling)以及β-肌动蛋白(Sigma，A5441)。用高级化学发光试剂使免疫印迹显影。

实施例2

成纤维细胞直接重编程为功能性内皮细胞(EC)：

如上文所公开，已证实EC可衍生自ESC或iPSC，并且这些多能干细胞衍生的EC可增强鼠PAD模型中的肢体灌注和血管形成。然而，分化细胞的其它来源(诸如自体EC)也非常合乎需要。尤其对于临床应用来说，需要发展涉及最小程度使用遗传操纵(即非整合因子)的策略。先天免疫(例如通过toll样受体)途径在核重编程中起重要作用，并且重要地，当被激活时，可引起表观遗传修饰剂的表达的快速和总体变化以增强染色质重塑。

在认可先天免疫在核重编程中的作用和其定向操纵喜欢开放染色质状态的情况下，我们假设TLR3的激活与驱动EC特异化的外部微环境诱因一起可诱导成纤维细胞转分化成EC。

为确定人类成纤维细胞是否可通过先天免疫激活转化成EC，将人类***成纤维细胞(BJ)用聚I:C(30ng/ml)处理并且在成纤维细胞培养基和所规定的不含血清的生长培养基的混合物中培养(图1A)。培养7天后，将培养基变为补充有bFGF(20ng/ml)、VEGF(50ng/ml)和BMP4(20ng/ml)的分化诱导培养基，其已知促进内皮细胞谱系的诱导。为进一步增加内皮细胞转分化的效率，我们添加8-Br-cAMP(一种环AMP依赖性蛋白激酶激动剂)到我们的方案中，因为其增强内皮细胞特异化。分化28天后，将细胞分离并且通过荧光激活细胞分选(FACS)针对EC特异性标记VE-钙粘蛋白或CD31进行纯化。相对于媒介物对照，约2％细胞表达CD31(图21B)。为进一步增强诱导内皮细胞(iEC)的扩增，我们添加SB431542(一种特异性TGFβ受体抑制剂)，其促进ESC衍生的内皮细胞生长并且形成薄片。扩增之后，将iEC针对VE-钙粘蛋白或CD31进行分选，显示77％纯度(图21B)。

扩增之后，iEC形成典型“鹅卵石”单层，并且持续表达内皮细胞标记，包括CD31、VE-钙粘蛋白、KDR、温韦伯氏因子(vWF)和eNOS。类似地，免疫荧光染色显示这些iEC对EC标记(诸如CD31、VE-钙粘蛋白和vWF)呈阳性(图21C)。此外，这些iEC能够并入乙酰基化LDL并且在基质胶上形成管状结构网状物(图21D-E)。此外，这些iEC显示当将其放置于基质胶中并且添加生长因子VEGF后进行皮下注射时形成毛细管的能力(图21F)。

iEC在外周动脉疾病模型中的治疗性潜力：(iEC在小鼠外周动脉疾病模型中改善血液灌注)。为在功能上表征iEC并且测定其脉管再生能力，我们使用小鼠的后肢缺血模型，其中缺血是通过结扎NODSCID小鼠的股动脉来诱导。接着将小鼠分配以接受iEC、人类EC或媒介物肌肉注射(到达腓肠肌)。为分析皮下后肢灌注，进行激光多普勒灌注成像分析以确定在缺血后肢上移植iEC的效果。与媒介物处理的小鼠相比，在iEC处理的小鼠中后肢灌注比(缺血后肢/对照后肢)显著提高(图22A-B)。为确认激光多普勒数据，在第18天将缺血后肢的部分通过免疫荧光染色用小鼠CD31抗体染色以评估毛细管密度。与对照组相比，在iEC组中小鼠CD31阳性毛细管密度显著较大(图22C和D)。此外，由设盲观察者评估后肢缺血以获得后肢缺血得分，其显示在iEC处理的小鼠中血液灌注和再生显著改善(图22E)。

先天免疫(TLR3信号传导)使成纤维细胞能够有效转分化为EC：为测定TLR3信号传导是否为人类成纤维细胞有效转分化所必需的，我们评估了事先用错义shRNA或shRNA处理以抑制(KD)TLR3表达的BJ成纤维细胞的直接分化。在用聚I:C(30ng/ml)和化学上定义的分化培养基处理之后，将细胞在补充有生长因子(bFGF、VEGF和BMP4)的EC特异性培养基中培养。分化28天后，将细胞分离并且针对VE-钙粘蛋白进行FAC分选(图23A)。如图23B所示，当用聚I:C处理时，与TLR3-KD细胞相比错义处理的细胞产生显著较多的iEC。尽管当与错义细胞相比时从TLR3KD细胞产生的iEC仅显示EC标记的基因和蛋白质表达适度降低，但其显示其吸收乙酰基化LDL的能力显著降低(图23C)并且在基质胶上形成管状结构网状物(图24D)。为进一步阐明涉及转分化的TLR3信号传导元件，我们抑制了下游效应因子NFκB的作用。NF-κB是TLR3激活的转录效应因子并且与CBP/p300相互作用以正向调节基因表达。我们发现聚I:C使成纤维细胞转分化为iEC显著增强。此聚I:C增强转分化(图23E)的作用因添加p65诱饵而显著降低，表明TLR3诱导的NFkB激活参与直接重编程。

Huang,N.F.等Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology30,984-991。Rufaihah,A.J.等Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascular Biology31,e72-e79,(2011)。Margariti,A.等Proceedings of theNational Academy of Sciences109,13793-13798,(2012)。Yamamizu,K.,Kawasaki,K.,Katayama,S.,Watabe,T.和Yamashita,J.K.Blood 114,3707-3716,(2009)。Watabe,T.等The Journal of Cell Biology 163,1303-1311,(2003)。

Claims

1.一种对哺乳动物体细胞进行核重编程的方法，所述方法包括：

使哺乳动物体细胞干细胞群体与(a)有效剂量的先天免疫反应激活剂和(b)非整合重编程或分化因子的混合物接触足以使所述哺乳动物体细胞重编程或转分化成所关注的理想细胞类型的时间。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述先天免疫反应激活剂和非整合重编程因子的混合物是同时提供的。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述先天免疫反应激活剂和分化因子是相继提供的。

4.如权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述先天免疫反应激活剂是Toll样受体(TLR)激动剂。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述Toll样受体是TLR3。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述激动剂是双链RNA或其类似物。

7.如权利要求6所述的方法，其中双链RNA或其类似物的有效剂量是10ng/ml到3000ng/ml。

8.如权利要求4所述的方法，其中所述Toll样受体是TLR4。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述激动剂是脂多糖。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞是人类细胞。

11.如权利要求2所述的方法，其中所述重编程因子混合物包含细胞穿透肽Oct4、Sox2、Lin28和Nanog，并且所述细胞被重编程为多能细胞。

12.如权利要求2所述的方法，其中所述重编程因子混合物包含细胞穿透肽Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，并且所述细胞被重编程为多能细胞。

13.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞被转分化成实质上不同的体细胞类型。

14.如权利要求8所述的方法，其中所述实质上不同的体细胞类型是内皮细胞。

15.如权利要求2所述的方法，其中所述重编程因子是作为细胞穿透蛋白提供。

16.一种诱导性哺乳动物多能干细胞群体，其是通过如权利要求2所述的方法产生。

17.如权利要求16所述的诱导性多能干细胞群体，其中所述体细胞是人类细胞。

18.一种转分化体细胞群体，其是通过如权利要求3所述的方法产生。

19.如权利要求18所述的转分化体细胞群体，其中所述细胞是人类细胞。

20.一种试剂盒，其是用于实施如权利要求1所述的方法。

21.一种包含先天免疫激活剂和一种或多种细胞穿透肽和/或小分子的治疗剂，其用于体内施用以对细胞和/或组织表型进行治疗性调节。