CN104780919A

CN104780919A - 包含顺式环(l-亮氨酸-l-脯氨酸)或顺式环(l-苯丙氨酸-l-脯氨酸)的抗菌及抗病毒用组合物及其制造方法

Info

Publication number: CN104780919A
Application number: CN201380052609.7A
Authority: CN
Inventors: 姜思旭; 郭珉逵; 刘芮; 权俊吾
Original assignee: SNU R&DB Foundation
Current assignee: SNU R&DB Foundation
Priority date: 2012-10-08
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: WO2014058114A1; KR20140045075A; CN104780919B; KR101782656B1

Abstract

本发明提供一种将顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分，并对链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属具有特殊抗菌活性的抗菌组合物、农药组合物及抗菌剂的制造方法。本发明组合物对链球菌属或志贺氏菌具有突出的抗菌活性作用，因此适用于需要去除或预防链球菌属、志贺氏菌的各种工业领域。由于少量的本发明组合物也能发挥出突出的抗菌活性作用，所以具有极高的经济效益。此外，本发明是含有顺式环(L-Leu-L-Pro)或顺式环(L-Phe-L-Pro)的抗病毒组合物。

Description

包含顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)或顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)的抗菌及抗病毒用组合物及其制造方法

技术领域

本发明涉及顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)的新用途。进一步说明即是，本发明是将顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)用作有效成分的抗链球菌或抗链球菌组合物的技术。

本发明涉及顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)及顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)新用途的技术。进一步说明即是，本发明是将顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)或顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)用作有效成分的抗病毒组合物的技术。

背景技术

通常而言，乳酸发酵功效主要依赖于有机酸的积累和基质氧化。^[1,2,3]乙醛、二乙酰化合物、过氧化氢及二氧化碳等代谢产物，能有效控制细菌、病菌及腐败菌的生长。^[1,2,3]另据研究报告，非蛋白质基质还能有效遏制革兰阳性菌、发霉菌及革兰阴性菌的滋长。^[4]

最初，低分子量的乳酸杆菌(Reutericyclin)抗生素是从发酵面包所含有的乳酸菌LTH2584(Lactobacillus reuteri LTH2584)中提炼而成的。乳酸杆菌对革兰阳性菌、革兰阴性菌、酵母菌、霉菌等微生物比较敏感。^[5]长期以来，乳酸杆菌或乳酸菌(Lactic acid bacteria:LAB)被用作人类及动物的食物，正如酵母一样，在食品发酵及储藏时起到了极为重要的作用。^[1,2,3]

通常而言，LAB会分泌出细胞外的拮抗剂化合物，以对抗诸多的微生物，并通过内源性代谢产物变化细胞外环境。^[6]在通过LAB***出来的化合物中，各种抗菌代谢物可分类成1000以下低分子量的化合物和被评估为拥有1000以下分子量的细菌素(bacteriocins)^[7]。至今为止，关于LAB抗菌活性作用的研究课题主要集中在对细菌素的研究。从LAB中生成的细菌素，在活性、作用方式、分子量、遗传源及生化特性方面，属于具有光谱差异的抗菌肽和蛋白质的异类(heterogeneous)组之一，[8,9]而此类肽和蛋白质在成熟肽及前导肽(prepeptide)的基础上分为三种类型。^{[10,11,12,13]}片球菌素是滋生于戊糖片球菌(Pediococcus pentecostals)的细菌素之一种，^[14]大部分与此相同的化合物中均含有阳离子高分子和小基质。[^15]此外，这种化合物还被用于杀灭芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、李斯特菌(Listeria species)、金黄色葡萄球菌菌株(Staphylococcus aureus)等革兰氏阳性球菌和病原性球菌。[^16,17,18]此外，有些细菌素还可以杀灭大肠菌(Escherichia coli)和沙门氏菌一样的食品病原性球菌。[^19]至今为止，主要对含脯氨酸环二肽的2,5-环缩二胺酸(Proline-containing 2,5-diketopiperazine)进行了集中研究和调查。^{[6,20,22,23,24,25,26,27]}一直以来，这种环肽或环二肽被认为在生物学中起到基质的作用，^{[22,23,24,25,26]}尤其这样的环二肽在潜在的治疗及预防功效方面，具有对抗细菌、霉菌、病毒及癌细胞的抗菌活性作用。^{[6,23,26,27,28]}此外，这种抗菌活性环二肽是在培养酵母、地衣类植物及霉时得以确认的。^[20,29]另据有关资料，从链霉菌中分离出环二肽(1-亮氨酰-1-丙烷基)和环二肽(1-苯丙氨酰基-1-脯氨酰基)。^{[20,24,25,29]}在自然界的任何地方都能找到抗菌活性作用肽，并对有助于人类生存的生物靶标具有极其重要的影响。^[22,23,25]

因此，迫切需要研发出具有对于多种细菌，尤其是对于链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属菌具有卓越抗菌活性作用的新型物质。

本说明书参考并引用了许多论文及专利文献的内容。此外，本说明书中引用的论文及专利文献内容，其目的在于更详细说明本发明所属的技术领域及其内容。

发明内容

本发明的技术课题

本发明旨在研发出各种细菌，尤其是对于链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属具有卓越抗菌活性作用的新型物质。据本发明的研究结果，二肽中的顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))对链球菌属或志贺氏菌属具有特殊的抗菌活性作用。

本发明的目的在于，提供一种将顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)用作有效成分，并对链球菌属或志贺氏菌属具有抗菌活性作用的组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种将顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)用作有效成分，并对链球菌属或志贺氏菌属具有抗菌活性作用的农药组合物。

此外，本发明还旨在提供一种对链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属具有抗菌作用的抗菌剂的制造方法。

下面将通过对本发明的详细说明、权利要求及图纸，进一步说明有关本发明的其它目的及优点。

技术课题的解决方案

本发明将提供一种将顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分，并对链球菌属或志贺氏菌属具有特殊抗菌活性作用的抗菌组合物。

本发明对链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属具有卓越的抗菌活性作用。

本说明书中采用的“抗菌”一词代表遏制细菌的生长、增殖以及杀灭作用，并且与本说明中的“抗细菌”是同一个意思。

本发明中被用作有效成分的顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)包含自然界中的顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)。此外，有关顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)的化学结构式如本发明附图21所示。

如本发明实施例所示，在本发明中被用作有效成分的顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)是从明串珠菌属(Leuconostoc)菌中分离出来的顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)

本发明中被用作有效成分的顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)在从明串珠菌属中分离时的明串珠菌属中，包含在由肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、冷明串珠菌(Leuconostoc gelidum)组成的菌群中选定的一个以上的明串珠菌属。此外，从明串珠菌属分离出在本发明中被用作有效成分的顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)时，明串珠菌属是肠膜状明串珠菌。

本发明中的顺式环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)对链球菌具有抗菌活性作用

根据本发明实施例，本发明中的链球菌属是从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)组成的菌群中选定一个以上的链球菌。更为正确的是从肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌组成的菌群中选定一个以上的链球菌属，最为正确的是牛链球菌。

此外，本发明对链球菌具有特殊的抗菌活性作用

另据本发明实施例，本发明中的链球菌属是从索氏志贺菌(Shigella sonnei)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)组成的菌群中选定一个以上的链球菌。更为正确的是从痢疾志贺菌、索氏志贺菌组成的菌群中选定一个以上的链球菌，最为正确的是痢疾志贺菌。

根据本发明的另一种样式，本发明将顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分，并提供对链球菌(Streptococcus)或志贺氏菌(Shigella)具有特殊抗菌活性作用的农药组合物。

此外，本发明提供的组合物是一种含有上述顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)农药有效成分的农药组合物。

本发明提供的农药组合物是从顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)的农药有效成分以及(b)在农药学上认可的溶剂、载体、乳化剂及分散剂组成的群中选定一个以上成分或添加物的农药组合物。本说明中的术语“农药有效成分”是指对上述顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)链球菌(Streptococcus)或志贺氏菌(Shigella)的抗菌功效或达到活性的充足量。

在将本发明中的组合物制成农药组合物时，本发明的农药组合物中将含有在农药学上认可的溶剂。此外，上述溶剂中含有水、芳香族溶剂(例如，芳烃油溶剂(Solvesso))产品、二甲苯、石蜡(例如，矿物油分馏物质质)、酒精(例如，甲醇、乙醇、戊醇,甲苯九郡)、酮(例如，环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP、NOP)、醋酸纤维(乙二醇醋酸纤维)、乙二醇、脂肪酸二甲氨基、脂肪酸及脂肪酸酯(原则上讲，还可以利用溶剂混合物)。

此外，在将本发明中的组合物制成农药组合物时，本发明的农药组合物中含有在农药学上认可的载体。例如，上述载体中包括粉碎的天然矿物质(例如，高岭土、粘土、滑石、白垩)及粉碎的合成矿物(例如，高分散的二氧化硅、硅酸盐)。

此外，在将本发明中的组合物制成农药组合物时，本发明的农药组合物含农药学上认可的乳化剂。例如，上述乳化剂包括非离子性及阴离子性乳化剂(例如，聚氧乙烯脂肪酒精醚、烷基矿酸盐、芳基矿酸盐)。

此外，在将本发明中的组合物制成农药组合物时，本发明的农药组合物中含有在农药学上认可的分散剂。例如，上述分散剂包括Lignin sulfite废液、甲基纤维素。

本发明是含有包含于抗菌用组合物中的顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))有效成分的农药组合物。为了避免在本说明中过多重复说明，从而省略了关于这两种成分的相同内容。

根据本发明的另一实施例，利用本发明组合物，制造对链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属具有抗菌作用的抗菌剂的方法分为如下两个阶段：即，(a)培养乳酸菌后制造乳酸菌培养液的阶段；(b)将上述培养液中的顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))浓缩成适合抗菌浓度的阶段。

在本发明的(a)阶段，将明串珠菌属用作乳酸菌时，上述明串珠菌属是在肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、冷明串珠菌(Leuconostocgelidum)、类肠系膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、Leuconostoc holzapfelii组成的菌群中选定一个以上的明串珠菌属乳酸菌。更为正确的是，上述明串珠菌属是肠膜状明串珠菌。

在本发明的(a)阶段制造乳酸菌培养液时，可以利用能在本行业中所采用的培养基组成物及添加物。

本发明的(b)浓缩阶段，还包括从培养液中分离和精炼顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)的阶段或浓缩含有顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)的培养液的阶段。

在本发明的阶段(b)，分离并提炼顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)时，可采用已被公认的各种方法。

例如，上述让水通过具有一定分子量CUT-OFF值的超过滤膜，以获取分离成分的方法；通过各种色谱法(大小、电解、疏水性或亲和性制作)进行分离出来的各种提炼方法。

本发明中“按有效浓度浓缩”的表现方式是指含有顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸或顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)的乳酸菌培养液对链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属的抗菌活性浓度。

例如，是指包含于上述顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)或培养液中的顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)对链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属的最小抗菌活性浓度为2.65mg(37.86mM)。

本发明是关于含有包含于上述抗菌用组合物中的顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)的抗菌剂制造方法。因此，为了避免在本说明中过多重复说明，从而省略了关于这两种成分的相同内容。

在本发明的另一实施例中，本发明组合物是将顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))或顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分的抗病毒组合物。但并非局限于上述顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)，也可以是从明串珠菌属(Leuconostoc)中分离出来的抗病毒组合物。上述明串珠菌属可以从肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、冷明串珠菌(Leuconostocgelidum)、类肠系膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)及Leuconostoc holzapfelii组成的菌群中选定一种菌属。但并非局限于针对上述病毒的抗病毒组合物，也可以是针对流感A病毒(H₃N₂)的抗病毒用组合物。

此外，在本发明的另一实施例中，本发明组合物是将顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))或顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分，并对流感A病毒(H₃N₂)具有特殊抗菌活性作用的医药组合物。

此外，在本发明的另一实施例中，本发明中制造对流感A病毒(H₃N₂)的具有抗菌作用的抗病毒剂的方法分为如下两个阶段：即，(a)培养乳酸菌后制造乳酸菌培养液的阶段；(b)将上述培养液中的顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))或顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))浓缩成适合抗菌浓度的阶段。

发明效果

下面将简单说明本发明的特点及优点：

(ⅱ)此外，本发明提供一种将顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro)用作有效成分，并对链球菌(Streptococcus)属或志贺氏菌(Shigella)属具有特殊抗菌活性的抗菌组合物、农药组合物及抗菌剂的制造方法。

(ⅱ)本发明组合物对链球菌属或志贺氏菌具有突出的抗菌活性作用，因此适用于需要去除或预防链球菌属、志贺氏菌的各种工业领域。由于少量的本发明组合物也能发挥出突出的抗菌活性作用，所以具有极高的经济效益。

(ⅱ)此外，本发明是含有顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)或顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)的抗病毒组合物，因此还可用于多种病毒的治疗当中。

(iv)本发明还为利用二肽的农药行业及医药行业提供一种关于顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)或顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)的农药及医药方面的基础资料。

附图说明

图1是关于在植物提取物中的抗菌活性比较图。在进行比较实验时，我们准备了含有培养液的一些圆盘。1号圆盘中含有魏斯氏乳酸菌(W.cibaria)LBP-B06培养液，2号圆盘中含有清酒乳杆菌(L.sakei)LBP-S02培养液，3号圆盘中含有乳酸菌泡菜(L.kimchii)LBP-B02培养液，4号圆盘中含有植物乳杆菌(Lb.plantarum)LBP-K10培养液，5号圆盘中含有乳酸菌嗜柠檬酸明串珠菌LBP-K11(L.citreum LBP-K11)培养液，6号圆盘中含有肠膜状明串珠菌LBP-K06(L.mesenteroides LBP-K06)培养液。如图所示，左侧面板利用了芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的指标菌，而右侧面板利用了大肠菌(Escherichia coli)的指标菌。在此，所有的实验均独立进行了三次。

图2是通过600nm吸光度和pH变化，体现植物乳杆菌LBP-K10的正常生长示意图表。在经过28个小时后，进行了两周时间的pH(闭合环状)和600(开放环状)后，有以pH 3.8左右(左侧面板)的程度进行了pH处理。此外，在植物乳杆菌LBP-K10正常生长过程中，采用纸片扩散法(disk diffusion assay)对抗菌活性变化进行了观察(右侧面板)，并且在培养一天时间后，又进行了一周时间的pH(闭合环状)和抗菌活性(开放环状)处理。

图3是遏制病原性菌生长的能力示意图。在琼脂板上，利用培养液对带有革兰阳性菌(B.subtilis、L.monocytogens及S.aureus)、革兰阴性菌(S.typhimurium、S.sonnei及E.coli)和机会性真菌病原性的白色念珠菌属(C.albicans7)的抑制环进行了观察。

图4是在植物乳杆菌LBP-K10培养液中，提炼出的引出的非蛋白性抗菌物质的热稳定性能示意图。通过纸片扩散法的生长抑制剂的直径观察得知，非蛋白性物质对革兰阳性菌(B.subtilis)和革兰阴性菌(E.coli)的抗菌活性类似于经过热处理的培养液。

图5是在对蛋白分解酶进行处理时，具有非蛋白性抗菌物质功效的培养液的特点示意图。在此，对多种蛋白分解酶进行处理后，对其抗菌活性进行了观察。如下述实施例所示，将蛋白酶K和胰凝乳蛋白酶处理到培养液当中，并以1000分子量为标准，将培养液分成YM-1cutoff(YM1C)和YM-1上清液(YM1S)、对照群后进行了实验。

图6是利用CH₂Cl₂，提取植物乳杆菌LBP-K10培养液的示意图。图6中的a是利用CH₂Cl₂(二氯甲烷)，提取植物乳杆菌LBP-K10培养液后的上清液的抗菌活性示意图；b是不含CH₂Cl₂的培养上清液抗菌活性示意图；c是利用CH₂Cl₂(二氯甲烷)提取的下层液抗菌活性示意图。

图7是利用ZORBAX C18十八烷基硅疏水性树脂，对植物乳杆菌LBP-K10进行制备色谱HPLC分析的结果示意图。此时，通过液体对液体的提取法搜集了分馏物质质质，在210、260及280nm的紫外线波长条件下，记录了上述分析内容。所有的分馏物质质质均可分为10余个，并按下述实施例所示的那样，对上述10个分馏物质质质进行了搜集和浓缩。

图8是利用最低浓度培养基的方法，对从戊糖片球菌(P.pentecostals)中分离出来的试料进行抗菌活性实验的结果示意图。在此，利用CH₂Cl₂提取了所有的培养液，并利用稀释法，将指标菌置于每个试料的6孔板板上，然后利用最低浓度培养基的方法进行实验的结果，在革兰阳性菌和革兰阴性菌中同时发现了抗菌活性效果。此时，将为实施最低浓度培养基的方法，而未被分离出来的培养液的CH₂Cl₂下层液用作对照群。此外，在革兰阳性菌的芽孢杆菌(Bacillus subtils)中。观察了从戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)中分离出来的分离试料的抗菌活性。据对6a、6b、7a、7b、8、9、10分离试料的抗菌活性进行观察分析的结果表明，在7b和8及10分离试料中的抗菌活性最为明显。利用最低浓度培养基的方法对7b和8及10分离试料的最低浓度进行检测结果，分别是1.45mg(20.71mM)、1.37mg(19.6mM)、2.35mg(33.57mM)。

图9是利用最低浓度培养基的方法，对植物乳杆菌LBP-K10分离试料的抗菌活性进行观察分析的结果示意图。此时，利用革兰阳性菌芽孢杆菌(Bacillus subtils)，分析了植物乳杆菌LBP-K10分离试料的抗菌活性。此外，在每6孔板中分别分离出3.0x 106CFU(colonyforming unit)的分离试料后，针对芽孢杆菌(Bacillus subtils)进行了检测。据对2、3、4、5、7、8、9、10分离试料的抗菌活性进行观察分析的结果表明，在7b、8及10分离试料中的抗菌活性最为明显。利用最低浓度培养基的方法对7b和8及10分离试料的最低浓度进行检测结果，分别是1.30mg(20.62mM)、1.25mg(17.86mM)、2.35mg(33.57mM)。

图10利用最低浓度培养基的方法，对肠膜状明串珠菌LBP-K06分离试料抗菌活性的抗菌活性进行观察分析的结果示意图。此时，利用革兰阳性菌的芽孢杆菌(Bacillus subtils)，分析了肠膜状明串珠菌LBP-K06分离试料的抗菌活性。据对3、4、5、6a、6b、7a、7b、8、9、10分离试料的抗菌活性进行观察分析的结果表明，在7b、和10分离试料中的抗菌活性最为明显。利用最低浓度培养基的方法对7b、10分离试料的最低浓度进行检测结果，分别是1.43mg(20.43mM)、5.50mg(78.6mM)。

图11是对戊糖片球菌、植物乳杆菌LBP-K10、肠膜状明串珠菌LBP-K06分离试料抗菌活性的抗菌活性进行观察分析的结果色谱图。在此，所有的菌株均采用CH₂Cl₂提取法进行了分离处理。

图12是各种乳酸菌分馏物质质质的色谱图。即，是关于利用CH₂Cl₂提取法提取的各种乳酸菌制备色谱HPLC的色谱分析图。在该实验中，采用了戊糖片球菌MCPP(Pediococcuspentosaceus MCPP)、肠膜状明串珠菌LBP-K06(Leuconostoc mesenteroides LBP-K06)、植物乳杆菌LBP-K10(Lactobacillus plantarum LBP-K10)、魏斯氏乳酸菌LBP-K15(Weissella cibariaLBP-K15)、魏斯氏菌LBP-K16(Weissella confusa LBP-K16)、清酒乳杆菌LBP-S01(L.sakeiLBP-S01)、植物乳杆菌/潘托斯LBP-S02(Lactobacillus plantarum/pentos LBP-S02)、乳酸乳球菌LBP-S03(Lactococcus lactis LBP-S03)、乳酸乳球菌LBP-S06(Lactococcus lactis LBP-S06)、松鼠葡萄球菌LBP-S07(Staphylococcus sciuri LBP-S07)等菌株。

图13是利用戊糖片球菌MCPP分离P8的电子轰击离子化法(electron ionization、EI)进行观察分析的结果示意图。

图14是利用戊糖片球菌MCPP分离P8的化学离子化法(chemical ionization、CI)进行观察分析的结果示意图。

图15是对戊糖片球菌MCPP分离P8¹的H-核磁共振法(500MHz、100％DMSO)的观察分析结果示意图。

图16是对戊糖片球菌MCP分离P8¹的H-核磁共振法(含有500MHz、10％D₂O的DMSO)的观察分析结果示意图。

图17是对戊糖片球菌MCPP分离P8的¹³C-核磁共振法(500MHz、100％DMSO)的观察分析结果示意图。

图18是对戊糖片球菌MCPP分离P8的¹³C-核磁共振法(含有500MHz、10％D₂O的DMSO)的观察分析结果示意图。

图19是利用X-线折现方法，从戊糖片球菌MCPP分离出来的P8的预计结构式。

图20是利用X-线折线方法，从戊糖片球菌MCPP分离出来的P8的结构式。

图21是从戊糖片球菌MCPP分离出来的P8的最终结构示意图。据观察分析结果表明，分离出来的抗菌物质是具有C₁₁H₁₈O₂N₂分子式的顺式环(L-Leu-L-Pro)(顺式环(L-Leu-L-Pro)。

图22分离化合物的抗病毒效果图。在此，抗病毒的活性实验采用了源自可卡犬肾脏(Madin-Darby、canine kidney)的类上皮细胞。在实验过程中，给类上皮细胞感染了为期三天的流感A病毒(H3N2)。将植物乳杆菌LBP-K10的制备色谱HPLC分流物资混入到0.7％的最低要素培养基(complete minimalessential medium、MEM agarose)当中，并将其投入到被流感A病毒(H₃N₂)感染的可卡犬上皮细胞(MDCK)上。此时，所有的抗病毒活性实验群均采用了菌斑(plaque)分析法。(A)对照区；(B)病毒对照区；(C)第8分馏物质质、5.0mM顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)；(D)8分馏物质质、10.0mM顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)；(E)第10分馏物质质、5.0mM顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)；(F)第10分馏物质质、10.0mM顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)。

图23是利用植物乳杆菌LBP K-10分离N10的电子轰击离子化法(electronionization、EI)进行观察分析的结果示意图。

图24是利用植物乳杆菌LBP K-10分离N10的化学离子化方法(chemical ionization、CI)进行观察分析的结果示意图。

图25是对植物乳杆菌LBP K-10分离N10¹的H-核磁共振法(600MHz、100％DMSO)的分析结果图。

图26是对植物乳杆菌LBP K-10分离N10的2D HSQC根据¹H/¹³C NMR(600MHz、in100％MeOD)的分析结果图。

图27是对植物乳杆菌LBP K-10分离N10的2D COSY根据¹H/¹³H NMR(600MHz、in100％DMSO(左侧)及10％D₂O包含DMSO(右侧))的光谱示意图。

图28是利用X-线折线方法，从植物乳杆菌LBP K-10中分离出来的N10的结构。

图29是利用X-线折线方法，从植物乳杆菌LBP K-10分离出来的N10的结构。

图30是从植物乳杆菌LBP K-10分离出来的N10的最终结构示意图。据观察分析结果表明，分离出来的抗菌物质是具有C₁₄H₁₆O₂N₂分子式的L-亮氨酸-L脯氨酸。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明进行更详细的说明。但事先声明，下述的实施例仅仅是为了更详细地说明本发明技术，根据本发明宗旨，本发明的范围并非局限于下述的实施例。

<实施例1>从植物中分离、鉴定的LAB(lactic acid bacteria)。

在本说明书中，在无另行说明的鉴定下，为了体现特定物质的浓度而采用的“％“，分别代表固体/固体(重量/重量)％、固体/液体(重量/体积)％、液体/液体(体积/体积)％。

材料及方法

实验菌株及乳酸菌的分离

首先，从芥菜泡菜和垂盆草泡菜、白菜泡菜分别分离出了各种乳酸菌，并利用搅拌器将已准备好的各种材料进行了搅拌，且在芥菜泡菜和垂盆草泡菜中分别添加了5％的NaCl，又准备了未添加5％NaCl的芥菜泡菜和垂盆草泡菜，并分别在4℃、22℃、30℃的的温度条件下予以了储藏。然后，在1个月时间内，每隔24个小时对所有的植物实验群进行了检测，并利用进行灭菌处理的蒸馏水稀释了每个实验群的浓度后，涂抹在乳酸菌分离培养基的MRS(de Mann Rogosa Sharpe)固体培养基上，并在30℃的温度条件下培养了2-3天时间。在完全培养结束后，筛选出分离效果较好的一些菌体，进行了16srDNA碱基序列处理，并为与介质信息进行比较，而在液体MRS培养基中进行了重新培养。

分离的乳酸菌鉴定

在本实验中，为了鉴定从发酵植物中分离出来的乳酸菌，而通过16S rDNA碱基序列法对乳酸菌进行了鉴定。为进行PCR(多聚酶链式反应)，而采用了一般性真细菌类引物的27F(5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’(序列号1)和1492R(5’-GGYTAC CTT GTTACG ACT T-3’(序列号2))。此外，为进行PCR反应，而在94℃的温度条件下经过5分钟时间的预变性(pre-denaturation)过程后，又在94℃的温度条件下进行了1分钟时间的变性(denaturation)处理，并在55℃的温度条件下进行1分钟时间的退火(annealing)处理，且在72℃的温度条件下经过1分钟时间、30次的拓展(extention)过程，最终在72℃的温度条件下经过7分钟时间的追加拓展(extra-extention)过程，并在4℃的温度条件下予以储藏。在经过多聚酶链式反应后，确认因0.7％琼脂糖凝胶电泳而增幅的16S rDNA，并在分离出DNA后，进行了碱基序列分析。此外，利用NCBI的核苷酸BLAST图表，对筛选出的菌株的6S rDNA碱基序列同族关系进行了比较。(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

满足抗菌活性试验及培养条件所需的标准细菌菌株、多剂耐性革兰-阳性及革兰-阴性细菌菌株

本发明在分离的乳酸菌菌株当中，主要采用了植物乳杆菌LBP-K10。在此，本发明中含有植物乳杆菌LBP-K10的所有分馏乳酸菌菌株采用了变形的MRS(mMRS)培养基或1.7％固体培养基(Difco laboratory、Detroit,MI)。在本发明中，为了找到通过LAB生成的抗菌物质，而采用了从韩国传统发酵食物中分离出来的Pediococcus pentosaceus、Lactobacillus plantarum及Leuconostoc mesenteroides等乳酸菌菌株。此外，为了检测抗菌活性，本发明将B.subtilis、S.areus、L.innocua、S.pneumoniae等***对照菌及E.coli、S.typhimurium、S.sonnei等革兰氏阴性细菌对照菌用作抗菌指标菌株。此外在本发明中，还将韩国国立保健医院的源自人类19A脑脊髓液，并具有青霉素、红霉素、四环素、克林霉素中为抵抗性的Streptococcus pneumonia 14596、韩国国立保健医院的源自人类B大便，并具有ACSSuT、H1:1及H2:1.2中抵抗性的Salmonella typhimurium 12219、对新青二(MEC A+)具有抵抗性的甲氧西林-抵抗性金黄色葡萄球菌菌株(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)；MRSA)11471这三种多剂耐性细菌用于抗细菌化合物的最低溶解浓度(MIC)当中。除了李斯特菌(Listeria spp.)以外，大部分病原性菌株均在液体培养基(Luria-Bertani:LB)broth(1％tryptone、0.5％yeastextract、1％NaCl)中进行了培养，而李斯特菌(Listeria spp.)则在脑心浸液(brain heart infusion)培养液(Difco、Laboratories、Detroit、MI)中进行了培养。此外，所有的细菌细胞均在MRS中进行了培养，并在没有搅拌或摇晃的条件下，在30℃温度中对0.1～0.2％的接种菌剂(seeding inoculum)进行了3天时间的培养。此外，还通过离心分离的方式，在8000rpm条件下，经15分钟时间，对生长的细胞进行了两次培养。将培养上清(Culturesupernatant；CS)用于抗菌活性分析。

抗菌活性评估

为了了解抗菌活性，而进行了培养基稀释法(broth microdilution test)、纸片扩散法(diskdiffusion assay)及拮抗作用法(antagonism test)的实验

上述各种实验方法如下。

在培养基稀释法的实验中，对浓缩的培养上清液进行连续稀释后，观察了微生物指标菌株是否带有活性。此外，在拮抗作用法的实验中，为了观察抗菌活性，而使经过24个小时培养的LAB细胞达到OD₆₀₀＝1.0的最佳状态，并以的单位点滴在MRS板上，然后在30℃的温度条件下进行了24个小时的培养。此后，将事先培养3～5个小时的指标菌株置于点滴有LAB细胞的MRS板上，并在30℃的温度条件下，培养一天时间后，对生长区域的直径(mm)进行了计算。

在纸片扩散法的实验中，将培养上清液(CS)或抗病毒物质点滴在6mm的纸盘(Toyo Roshikaisha、ltd)上，然后将事先培养经3～5个小时的指标菌株接种在1％的琼脂板。待琼脂板凝固后，将已定位的圆盘纸(disk paper)置于琼脂板上，并在适当的的温度条件下，进行了24个小时的培养，然后计算遏制生长环的直径(mm)，以测量抗菌活性。

根据LAB生长的pH和抗菌活性变化

以1.0％为单位，将培养一夜的植物乳杆菌LBP-K10接种于变形MRS培养基上，然后在30℃的温度条件下进行静置培养。接种结束后直至进入静止期(stationary phase)，在600mm条件下，每4个小时测量一次吸光度，且在离心分离后获取上清液，并测量了pH和抗菌活性。利用上述培养基稀释法(broth microdilution test)、纸片扩散法(disk diffusion assay)、拮抗作用法(antagonism test)进行接种后，在一个星期内，每24个小时测量一次抗菌活性。

对蛋白质分解酶的效果分析

在37℃的温度条件下，对蛋白酶K(proteinase K,Sigma-Aldrich、Inc.、USA)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin、Boehringer MannheimGmbH.、Germany)、蛋白酶K(proteinaseK,Sigma-Aldrich、Inc.、USA)、胰蛋白酶(trypsin、Sigma-Aldrich、Inc.、USA)进行一个小时的孵化处理后，除了蛋白酶K以外，在常温(25℃)条件下，将其它蛋白酶的最终浓度调至后，观察了除细胞以外的蛋白物质及非-蛋白物质是否对病原性微生物具有活性以及对于CS(利用醋酸纤维膜YM-1进行过滤，分子量在1000以下及1000以上)蛋白质分解酶的敏感度。经适当时间进行恒温反应后，对混合物进行变性处理，并为对这些蛋白酶进行非活性化处理，而在95℃的温度条件下，进行5分钟时间的热处理。如上所述，利用纸片扩散法，确定了抗菌活性。

对抗菌物质的热处理

为了确认温度对抗菌物质的活性造成的影响，而在100℃的水浴(water bath)中，经60分钟、120分钟时间，对CS进行热处理，又在121℃温度条件下，利用高压蒸气灭菌器(autoclave)，对对CS进行15分钟时间的热处理。在对样品进行活性分析之前，将CS置于常温条件下。此时，将CS用作对照群。此外，在进行高温处理后，通过纸片扩散法测量了剩余的抗菌活性。

抗细菌物质的分离准备

为在分离的Lb.plantarum LBP-K10中，利用变形的MRS(mCS)，从CS中提炼出抗菌性化合物，并阐明其特性而确定了如下的组成要素。mMRS中包括如下的组成要素：

每升含有10g蛋白胨、2g柠檬酸铵、5g钠醋酸纤维、0.1g镁硫酸、0.05g锰硫酸、2g磷酸钾、5g酵母菌提取物及20g葡萄糖。

在将D-葡萄糖与其它供应源混合之前，分别进行了灭菌处理。从在mMR中培养三天的Lb.plantarum LBPK-10中提取CS(在P.pentosaceus及Lc.Mesenteroides中也是如此)，并如上所述，在8000rpm条件下进行了30分钟时间离心分离处理，然后将Lb.plantarumLBPK-10菌株浓缩10倍后，进行冷冻干燥(freeze-drying)处理，并根据液体-液体提取法，利用分液漏斗(separating funnel)，提取一天时间的二氯甲烷(CH₂Cl₂)，并在55℃的温度条件下，利用蒸发器进行了脱水处理。然后，获取分离有机相(organic phase)，并利用蒸汽去除了有机溶剂。此外，为比较水基相(aqueous phase)与有机相及CS的活性而只提取了水基相(aqueous phase)。使洗脱液(eluent)通过C18SPE墨盒(WatersSep-pak C18plus cartridge、Millipore Corp.、Marlborou、MA)后，让溢出的样品置于SPE墨盒上，并采用了100％的甲醇溶剂(isocratic flow)。在将样品置于SPE上之前，对墨盒进行活性化处理，并利用15ml的MeOH及15ml的流水进行了100％的清洗后，将样品置于SPE上，并用谁进行了100％的清洗。通过墨盒及100％MeOH，完成了样品的最终溢出。此外，为继续收集溢出的样品以及清除剩余的有机溶剂而进行了蒸发处理。为了实施下述HPLC过程，而利用适当进行灭菌处理的TDW，对每个浓缩的样品进行了溶解处理。

通过高性能液体色谱法(HPLC)分析的抗病毒物质分离

利用适量的蒸馏水溶解已提取的物质，并利用0.22μm的醋酸纤维素膜进行了过滤处理。过滤的样品通过采用ODS C-18垂直轴(octadedosyl-C18hydrophobic semi-preparativecolumn)(9.4×250mm,Agilent,USA)的HPLC(High Performance Liquid Chromatography(semi-prep HPLC system,Agilent1200series,USA))***进行了分析和分离处理。此外，在将垂直轴的温度固定在40℃后，35分钟内的流动相中，67％是水、3％是乙腈(ACN)、30％是乙醇，而此时的流速为1.5ml/分钟。此外，利用UV多重波张感应***(UV multi-wavelengthdetector system)，在波长分别为210nm、260nm、280nm的条件下进行了观察。为了获取每个粉末样品，而通过蒸发及冻结的方式，对每个分离(fraction)进行了收集和浓缩处理。

利用最低抑菌浓度法(MIC)测量抗菌活性

利用HPLC搜集分馏物质质质(fractionation)后，如引用文献[Mathur et al.、2005；Messens et al.,2002]所述那样，通过最低抑菌浓度法(minimum inhibitory concentration；MIC)，对每个获取样品的活性进行了检测。通过相同的方法，在如此分离的样品中，追加提炼具有最高活性的适当峰值的分离(fraction)，然后又获取了单一化合物。对此，还可通过GC/MS、元素分析(elemental analysis)、NMR光谱法及X光散射技术(X-ray crystallography)等多种分析法进行追加分析。

细胞培养及病毒菌株、培养基及培养条件

DMEM(v/v)培养基的完全组成成分如下：即，76.5％的DMEM(高葡萄糖、HycloneLaboratories、USA)、1.0％的青霉素链霉素(Gibco、USA)、2.5％的1.0MHEPES缓冲溶液、杜尔贝科的磷酸-缓冲生理食盐水(7.5％DPBS)内牛血清灭菌、BioXtra、适合细胞培养的2.5％的蛋白溶液(Sigma,USA)及10.0％牛胎血清(FBS)(NOVA、USA)。

此外，VIM由94.0％的DMEM(高葡萄糖)(Hyclone Laboratories、USA)、1.0％的青霉素/链霉素(Gibco、USA)、2.5％1.0M HEPES缓冲液(Gibco,USA)、杜尔贝科的磷酸-缓冲生理食盐水(7.5％DPBS)内进行牛血清灭菌处理的BioXtra、适合细胞培养的2.5％的蛋白溶液(Sigma、USA)及10.0％牛胎血清(FBS)(NOVA、USA)、0.1％的进行甲苯矿酰氯甲基酮-处理的胰蛋白酶(tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin(TPCK-treatedtrypsin)(2μg/ml)组成。为了进行齿菌斑分析，而将VIM琼脂糖附加到2X VIM中，并从1.4％的琼脂糖SEG(TNT research、Korea)中，被最终用作0.7％的VIM琼脂糖。

抗病毒活性测试-齿菌斑分析法

a.MDCK细胞培养条件

如上述研究一样，以齿菌斑(plaque)为系数进行了抗病毒测试。[Gaush et al.、1968；Huprikar et al.、1980；Chapel et al.、2006；Chapel et al.,2007；Furuta et al.、2009]在本发明实施例中，为了观察抗病毒活性，而将Madin-Darby犬肾(Madin Darby canine kidney；MDCK)的上皮细胞用作抗病毒指标。在本发明中，针对每个齿菌斑-精炼的每个野生型流感病毒细胞，采用了5pfu的单层5x10⁵细胞内的MDCK细胞。[Gaush et al.1968；Huprikar etal.1980；Chapel et al.2006；Chapel et al.2007；Furuta et al.2009]在上述DMEM中培养了MDCK细胞。最初，是在37℃的水槽中缓速融化了MDCK细胞，并为去除细胞内所含有的二甲亚砜(DMSO)，而用10倍以上的完全DMEM进行了轻柔混合处理，且在12,000rpm条件下，进行了3分钟时间的离心分离处理，然后去除上清液，以防止MDCK细胞浮游。在此，反复进行了三次上述过程。利用DMEM培养基清洗MDCK细胞后，让MDCK细胞悬浮在10ml的完全DMEM培养基上，并通过轻轻搅拌，使得MDCK细胞分散于细胞培养盘中，然后转移至将100Π细胞培养盘上。此后，在37℃温度的5％CO₂孵化器内，对MDCK细胞进行了72个小时的培养。利用如此方法，反复培养了MDCK细胞(细胞培养盘的90～95％)。在倒掉DMEM培养基后，利用1.5ml的PCK-胰蛋白酶对培养的MDCK细胞(2x105)进行处理，并在37℃温度的5％CO₂孵化器内，对MDCK细胞进行了10-15分钟时间的培养。此外，利用10倍的DMEM培养基混合分离出来的MDCK细胞，为了防止生长细胞的保留，并将上述混合物移送至经过灭菌处理的50ml锥形管内，然后进行3分钟时间的离心分离处理，并利用磷酸缓冲生理食盐水(PBS)清洗了三次。利用PBS清洗结束后，添加10ml的完全DMEM培养基，并继续添加了30ml的完全DMEM培养基。然后，将每个10ml的MDCK细胞移送至10Π细胞培养盘中，并在37℃温度的5％CO₂孵化器内，进行了48个小时培养。

b.抗病毒活性的齿菌斑分析法

如上述说明(Gaush et al.1968；Huprikar et al.1980；Chapel et al.2006；Chapel etal.2007；Furuta et al.2009)，做好了齿菌斑的分析准备。将生长至细胞培养盘90～95％的MDCK细胞移送到了6孔板细胞盘中，再将生长至细胞培养盘80％的MDCK细胞，并利用PBS清洗两次，然后将含有病毒感染培养基(virus infection media；VIM)的多种单一化合物投入到MDCK细胞当中。在34℃温度条件下进行90分钟恒温培养期间，每15分钟轻轻摇动感染病毒6孔板盘。此后，去除感染病毒的培养基，并将0.7％DMEM琼脂糖(1:1)放置到各自的孔板中，然后在34℃温度的5％CO₂保育箱内进行72个小时的培养，以观察齿菌斑的生成鉴定。

通过采用GS-MS的电子轰击电离法(electron ionization:EI)和化学离子化法(chemicalionization:CI)的分析

在本发明中，采用具备7679系列自动液体采样器，并由Agilent 6890系列GC(AgilentTechnologies、Waldron、Germany)组成的色谱图***。质量分析法中利用了高分辨率质量分析仪(JEOLJMS-700、Tokyo,Japan)，以在Lb.plantarum中进行电子离子化及化合物离子化研究，并采用气体色谱图***及高分辨率质量分析仪(JEOLJMS-700、Tokyo、Japan)实施了实验。此外，还通过JMS-700M Station software[T、2006；Ahi et al.、2008]，对气相色谱***及高分辨率质量分析仪进行了调整。

¹H、¹³C、HSQC和2D-COSY核磁共振分析

在Lb.plantarum中，利用NMR光谱法，对在D₂O及DMSO中提炼出的样品(1.0mg)进行了处理，以进行氢离子及碳分配、结合及测序。利用在300K的条件下具备XWIN-NMR3.5软件[Reynolds et al.2002；Lu et al.2004；Baranovskii et al.2007]CryoProbe16的BrukerAVANCE-500光谱仪，记录了NMR光谱。所有2-D NMR实验均利用Bruker提供的标准脉冲序列(standard pulse sequence)予以了实施。在PC(Windows Professional 2000、Microsoft)上，利用XWIN-NMR 3.5software packages(Karlsruhe、Germany)对NMR数据进行了处理。在AVANCE 500光谱仪(Bruker-Biospin)上，利用500.13及125.77MHz的频率，对¹H及13C的NMR光谱进行了记录，并在实验当中采用了具备Z轴倾斜仪(Z gradient)的宽带反探测器(broadband inverse detector；BBI)。此外，在D₂O及含有D₂O的DMSO溶液中，对[Pateletal.2010]293K样品温度的光谱进行了记录。

分离单一化合物的元素分析(Elemental analysis；EA)

为决定Lt、plantarum LBp-K10内分馏物质质质的元素成分，而采用元素分析仪，并利用该元素分析仪，对C、H、N及O的元素进行了分析。(CE Instruments EA1110、EA1112)[Yuet al.2008；Okada et al.2009].在评估***物时，通常采用了氧平衡(Oxygen balance；OB)模式。此外，还利用C/H/O/N的元素比例对OB进行了计算。

利用X线折射的分馏物质质质的结构晶体

为了决定从Lt.plantarum LBP-K10分离的单一化合物的结构，而采用了X-射线晶体结构分析法。在35％的乙醇及65％二氯甲烷(CH₂Cl₂)混浊液混合物中，对单一化合物的晶体进行了培养，并利用Bruker Proteum 300CCD，在Pohang Light Source(Kim et al.2005)光束线(beamline)6B中获取了(Angstrom)数据组(data set)。

实验结果

鉴定植物中的乳酸菌

从韩国各种植物材料及芥菜泡菜、垂盆草泡菜及白菜泡菜中分离出了各种乳酸菌，并从这三种植物供应源分离出400个以上的LAB，然后通过拮抗作用测试法，筛选出成为大部分抗菌活性根源的200个LAB。此外，利用16s DNA测序法，并通过PCR的增幅及比较，对筛选出的LAB进行了鉴定。最终而言，在本发明中鉴定了Leuconostoc spp.、Lactobacillusspp.、Lactococcus spp.及Weisella spp(表1)。在上述三种植物中，主要分离出了Leuconostoc spp.和Lactobacillus spp。此外，还在垂盆草泡菜中分离并鉴定了Lactococcus lactis。为了培养上述发酵物质，在培养过程中的初始发酵阶段(1～2天)，对Leuconostoc spp.进行了经常性的观察，而在培养后期(2-3天)，Leuconostoc spp.则成了主要的细菌菌株。

表1

[表1]

分离并鉴定乳酸菌的抗菌活性比较

在LAB的生长期间，细胞会根据各自的需要，生成许多2次代谢物质。因此，为对LAB及抗菌作用进行追加研究，而持续通过拮抗作用试验及稀释法实验，对分离并鉴定出的LAB的抗菌活性进行了广泛的观察和比较分析。分离菌株的抗菌活性如表2所示。此外，在上述乳酸细菌的菌株中，通过与分离出的其它LAB进行比较，并利用纸片扩散法，对具有较强抗菌活性的W.cibaria LBP-B06,L.sakei LBP-S01、L.kimchii LBP-B02、Lb.plantarumLBP-K10、L.citreum LBP-K11及L.mesenteroides LBP-K06进行了观察。在本发明中，将B.subtilis(格兰阳性)及大肠杆菌(格兰阴性)用作指标菌株(indicator)。如图1所示，在经过检测的LAB中，Lb.plantarum LBP-K10菌株的抗菌活性远高于其它多种细菌菌株。据此，本发明主要将Lb.plantarum LBP-K10菌株用作植物物质的抗菌物质。

表2

[表2]

a代表抗菌活性范围的直径(制表菌株：稻草芽孢杆菌)。+代表直径<15mm，++代表直径<22mm,+++代表直径≥22㎜。

b代表最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration:MIC)。

c代表最小抑菌浓度的倍数。+代表1倍、++代表0.5倍，+++代表0.25倍。(指标菌株:稻草芽孢杆菌)。

<实施例3>Lb.plantarum LBP-K10的抗菌活性分析

据Lb.plantarum LBP-K10的16S rDNA序列与NCBI核苷酸BLAST程序进行比较的结果发现，与Lb.plantarum菌株IMAU10173100％相同。按照实施例的说明，对已鉴定的Lb.plantarum LBP-K10进行了培养，然后经28个小时观察了在600nm的吸光度、培养细胞之间的相应pH轮廓以及Lb.plantarum正常生长期间的pH值得关注的变化(图2A，左侧板)。据LAB细胞生长以及相应CS的pH分析结果显示，吸光度与pH成反比关系，并从8个小时开始，进入对数生长期(logarithmic phase),并从28个小时后进入停滞期。在28个小时停滞期后，吸光度及pH几乎处于固定不变的状态。(图2A，左侧板)为了解随着时间的变化，对抗菌活性带来的影响，而以1天为单位，经3天采集培养液实施了实验。据实验结果显示，第1天开始生成活性，第2天处于持续增加的状态，而第3天的抗菌活性处于最高状态，并维持了约两周时间(图2右侧板)。pH在正常生长期间呈持续减少状态，而在停滞期前后，pH值达到4.1左右，之后的时间处于维持上述数值状态。此外，抗菌活性在培养两天后处于增加趋势，且在第3天达到最高值。(图2A，右侧板)为了解植物乳杆菌LBP-K10是否对病原性细菌具有抗菌活性，而按照上述方法，通过纸片扩散法，对各种菌株进行了抗菌活性检测(图28)。在此，利用纸片扩散法，共对植物乳杆菌LBP-K10的培养液实施了3次单独实验，并通过计算抑制生长环(mm)，对每个菌株的抗菌活性进行了测量。据观察分析显示，植物乳杆菌LBP-K10培养液对稻草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)等革兰氏阳性菌及鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimuruium)、索氏志贺菌(Shigella sonnei)等革兰氏阴性菌、白色念珠菌(Candida albicans)等机会感染医院真菌类也具有抗菌活性(图2B)。

此外，为了解抗菌物质是否对热具有稳定性，而在多种条件下对其进行加热处理后，对培养液进行了抗菌活性实验(图2C)。据实验结果显示，经过热处理后的培养液无任何抗菌活性变化。在将革兰氏阳性菌的稻草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌的鼠伤寒沙门氏杆菌用作指标菌株后，对培养液的抗菌活性进行观察分析的结果，经过热处理后的实验群与未经热处理的对照群进行比较时，其状态几乎与对照群相似。此外，在121℃温度的灭菌器中加热15分钟时，实验群的抗菌活性仍维持原样。据上述实验结果表明，具有抗菌活性的物质不会因受热而变性，对热具有稳定性。(图2C)

为阐明抑制CS的物质特性，而指定了蛋白质分解酶(proteinase)的功效，并对多种蛋白质分解酶进行了实验(蛋白激酶K,胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶)(图20)。为了实施本发明实验，而对CS进行了72个小时的培养，并为防止CS溶液的分子量高于或低于1000，而利用YM-1醋酸膜(Amicon,USA),将CS分为蛋白质(proteinous)及非蛋白质两个部分。此外，还准备了YM1S(分子量在1000以上的CS溶液)及YM1C(分子量在1000以下的CS溶液)的CS对照群，并将蛋白质分解酶的浓度调整为1mg/ml[Pangsomboon,2009]。在调整蛋白质分解酶的浓度后，在CS及YM1S两个实验样品溶液中，对抑制生长根源的枯草芽孢杆菌及大肠杆菌的抗菌活性均有所减少(图20)。在枯草芽孢杆菌中，胰蛋白酶在对照群CS中降至10.5％，而胰凝乳蛋白酶则降至6.5％，但是，蛋白激酶K的抗菌活性几乎未发生变化。与枯草芽孢杆菌相比，大肠杆菌在蛋白激酶K及胰蛋白酶中减少了7.0％(图20)。由于按1000的分子量，将醋酸膜分为3个部分，因此抗菌活性功效可能会依赖于CS及YM1S蛋白质。相比在1000以下的分子量中，未能改变抗菌活性的YM1C，CS及YM1S的整体抗菌特性稍微有所减少，但仍保留了大部分的抗菌活性。根据热及蛋白质分解稳定性的实验判断，非蛋白质的物质抗菌活性更强。据此断定，在Lb.plantarum LBP-K10中，培养上清液的大部分抗病毒活性均源自非蛋白质类物质(图2C,2D)。

抗菌或抗病毒物质的分离及特性

在上述多种实验结果的基础上，采用经3天培养的上清液，实施了植物乳杆菌分离抗病毒物质的实验。在分离过程中，通过液体-液体提取法，利用CH₂Cl₂从培养液中分离抗菌物质后，再利用制备色谱(semi-prep)用HPLC进行分馏、搜集，并通过HPLC色谱图观察了分馏结果(图6及图7)。在本实验中，为实施上述实验，而在分离抗病毒物质过程中，通过液体-液体提取法，对利用CH₂Cl₂提取的下层培养液、利用CH₂Cl₂的上层培养液以及未利用CH₂Cl₂提取的培养液的抗菌活性进行比较，以去除部分多余的酸性杂质D-乳酸或醋酸，并将其适用于之后的实验当中。(图6)

通过该实验，从培养液的所有抗菌物质中提取CH₂Cl₂后，利用下层液实施了此后的实验(图6)。也就是说，通过上述方法，利用培养液中提取CH₂Cl₂的上层液和下层液以及未提取CH₂Cl₂的浓缩培养液，实施抗菌活性实验的结果显示，提取CH₂Cl₂的上层液和下层液和未提取CH₂Cl₂的浓缩培养液的抗菌活性相似，而且下层液的抗菌活性远高于其它两种实验群(图6)。据此断定，利用提取CH₂Cl₂的下层液分离抗菌物质更为有效(图6)。

在通过上述前处理过程准备的实验群中，对在制备色谱HPLC色谱图中的分馏物质质进行适量浓缩处理后，实施了抗菌活性实验。据实验结果，在植物乳杆菌色谱图中发现10多个分馏物质质。在此，分离、收集了每个时间段的峰值，并对每个分馏进行了抗菌活性检测(图7及表3)。然后，利用最小抑菌浓度(MIC)，对2,7,8及10号分馏物质质的抗菌活性进行了检测(图8～图10)。据上述实验发现，8号分馏物质质的抗菌活性最高(图8～图10)。

表3

[表3]

a代表最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration:MIC)。+代表1倍，++代表0.5倍，+++代表0.25倍。

通过最小抑菌浓度法实施实验的结果显示，在戊糖片球菌、植物乳杆菌、短乳杆菌的所有分馏物质质中，相同色谱图对每个菌株的分馏物质质P8、N8、M8的抗菌活性最高(图8、图9、图10及表3)。其中，除了在色谱图的前面部分分馏的酸性物质以外，每个分馏物质质的pH几乎都接近于中性pH(表4)，而这一结果在戊糖片球菌、植物乳杆菌、短乳杆菌中，也显示出了类似的倾向(图8、图9及图10)。

表4

[表4]

此外，基于通过最小抑菌浓度法实施实验的结果，本实验中利用已鉴定的多各种乳酸菌，并通过HPLC对分析色谱图进行比较的结果显示，在戊糖片球菌、植物乳杆菌及假肠膜明串珠菌中，分馏物质质的分布几乎相似(图11)。此外，在其它乳酸菌菌株的色谱图中，也显示出类似于戊糖片球菌、植物乳杆菌及假肠膜明串珠菌的分馏倾向(图12)。据此断定，乳酸菌在生长过程中，会生成抗菌物质，而且生成的代谢产物几乎相似(图11及图12)。

抗病毒活性分析

在抗病毒活性实验中，采用了源自可卡犬肾脏(Madin-Darby、caninekidney)的类上皮细胞。在实验过程中，给类上皮细胞感染了为期三天的流感A病毒(H₃N₂)。将植物乳杆菌LBP-K10的制备色谱HPLC分馏物质质混入到0.7％的完整最小必需培养基(completeminimalessential medium、MEM agarose)当中，并将其投入到被流感A病毒(H₃N₂)感染的可卡犬上皮细胞(MDCK)上。此时，所有的抗病毒活性实验群均采用了菌斑(plaque)分析法。如图22中，每个英文符号的意义如下：即，(A)对照区；(B)病毒对照区；(C)第8分馏物质质、5.0mM顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)；(D)第8分馏物质质、10.0mM顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)；(E)第10分馏物质质、5.0mM顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)；(F)第10分馏物质质、10.0mM顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)。如图22所示，第8分馏物质，10.0mM顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)和第10分馏物质、10.0mM顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)，在血小板分析中显示出了抗病毒活性。尤其第10分馏物质、10.0mM顺式环(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)，显示出了极高的抗病毒活性。

抗菌及抗病毒物质的结构分析

为了分析抗菌及抗病毒物质的结构，而利用冻结干燥器，将从HPLC分离出来的戊糖片球菌、植物乳杆菌、短乳杆菌的第8及第10分馏物质制成粉末状。如上所述，在实验材料及方法上，利用直插式探针(DIP、Direct Insertion Probe；DIP)及色谱法质量分析仪(Agilent6890series GC、Agilent Technologies、Waldron、Germany；high-resolutionmassspectrometer、JEOL JMS-700、Tokyo、Japan)(GC-MS)，对分子量进行了分析(图13、图14、图23及图24)。此外，还通过电子轰击离子化法(electron ionization、EI)和化学离子化法(chemical ionization、CI)进行了分析，并掌握了与参考值间的连贯性。据检测结果显示，第8及第10分馏物质分子量的参考值各分子量分别为210及244。另据电子离子化方法(electron ionization、EI)和化学离子化方法(chemical ionization、CI)分析结果显示，戊糖片球菌及植物乳杆菌的第8分馏物质均为210，而第10分馏物质则均为244(图13及图14)。

为了掌握更准确的分子结构，并通过电子轰击离子化法(electronionization、EI)和化学离子化方法(chemical ionization、CI)的先行实验进行分析和比较，而利用500MHz磁共振，对第8分馏物质和第10分馏物质的结构进行了观察和分析(图15)。此外，还利用采用1H核磁共振法和13C核磁共振法，对经过100％DMSO处理的P8和10％重水(D₂0)与DMSO混合的第8和第10分馏物质进行了分析。(图15～图18，图25～图27)。据分析结果显示，经过100％DMSO处理的P8，在8.0ppm中显示出典型的氮-氢峰值(图15)，而含有10％D₂0的P8，则在氮-氢峰值中被置换成重水，而8.0ppm的峰值则消失殆尽(图16)。通过第8及第10分馏物质通过13C核磁共振法处理的化学移动(Chemical shift)，在含有DMSO和10％重水的DMSO试料中，第8分馏物质和第10分馏物质显示为分别拥有11个碳素和14个碳素的物质(图17,18，图25至27)。

另据利用X线折射的晶体结构分析结果和通过各种结构分析的结果显示，戊糖片球菌、短乳杆菌LBP-K06、植物乳杆菌LBP-K10的第8分馏物质为具有C₁₁H₁₈O₂N₂结构的顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(L-Leu-L-Pro)(图21)，该最终结构如图21所示。

ESI-CID质谱m/z 211[MH]⁺标准峰，195[MH-O]⁺，154[MH-C₄H₉]⁺

¹H NMR(DMSO-d₆)δ0.83及0.85(6H at C-12和C-13,d,J＝6.49Hz和6.45Hz),1.34-1.36(1H at C-5,m),1.73-1.76(1H at C-5,m),1.801.87(3H at C-4和C-10,m),2.10-2.13(1H atC-10,m),3.31-3.34(2H at C-3,m),3.98-4.02(1H at C-6,m),4.16-4.19(1H at C-9,m),8.02(1H atN-8,s).

¹³C NMR(DMSO-d₆)δ170.8(C-1),167.0(C-7),58.8(C-9),52.9(C-6),45.2(C-3),37.9(C-5)、27.7(C-10),24.4(C-4),23.0(C-11),22.7及22.2(C-12和C-13).

另据分析确认，戊糖片球菌、短乳杆菌LBP-K06及植物乳杆菌LBP-K10的第10分馏物质为具有C₁₄H₁₆O₂N₂结构的顺式环(L-苯丙氨酸-L脯氨酸)(图28至图30)。

ESI-CID质谱m/z 245[MH]⁺标准峰、153[MH-C₇H₈]⁺、125[MH-C₇H₈-CO]⁺

¹H NMR(DMSO-d 6)1.41-1.45(1H at C-5,m)、1.69-1.74(2H at C-4,m)、1.98-2.03(1H atC-5,m)、3.01-3.08(2H at C-10,m)、3.24-3.42(2H at C-3,m)、4.05-4.08(1H at C-6,m)、4.33-4.35(1H at C-9,m)、7.17-7.27(5H at phenyl group,m)7.98(1Hat N-8,s)。

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Claims

1.一种抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物是将顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分，并对链球菌属(Streptococcus)或志贺氏菌属(Shigella)具有特殊抗菌活性的抗菌组合物。

2.根据权利要求1所述的抗菌组合物，其特征在于，所述顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(L-Leu-L-Pro)是从明串珠菌(Leuconostoc)中分离出来的顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)。

3.根据权利要求2所述的抗菌组合物，其特征在于，所述明串珠菌是在肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、冷明串珠菌(Leuconostocgelidum)、类肠系膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostocholzapfelii)中选定一个以上菌种组成的明串珠菌。

4.根据权利要求1所述的抗菌组合物，其特征在于，所述链球菌是在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、牛链球菌(Streptococcusbovis)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)中选定一个以上菌种组成的链球菌。

5.根据权利要求1所述的抗菌用组合物，其特征在于，所述志贺氏菌是在索氏志贺菌(Shigellasonnei)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)及福福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)中选定一个以上菌种组成的志贺氏菌。

6.一种农药组合物，其特征在于，所述农药组合物是将顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分，并对链球菌属(Streptococcus)或志贺氏菌属(Shigella)具有特殊抗菌活性的农药组合物。

7.根据权利要求6所述的抗菌农药组合物，其特征在于，所述农药组合物是在从溶剂、运输体、乳化剂及分散剂组成的群中选定一个以上成分或追加添加物的农药组合物。

8.一种对链球菌属(Streptococcus)或志贺氏菌属(Shigella)具有特殊抗菌活性的抗菌剂的制作方法，其特征在于所述制作方法分为如下两个阶段：(a)培养乳酸菌后制造乳酸菌培养液的阶段；(b)将上述培养液中的顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))浓缩成适合抗菌浓度的阶段。

9.一种抗病毒组合物，其特征在于，所述抗病毒组合物是将顺式环(L-苯丙氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))用作有效成分的抗病毒组合物。

10.根据权利要求9所述的抗病毒组合物，其特征在于，所述顺式环(L-苯丙氨酸-L脯氨酸)是从明串珠菌(Leuconostoc)分离出来的顺式环(L-苯丙氨酸-L脯氨酸)。

11.根据权利要求10所述的的抗病毒组合物，其特征在于，所述明串珠菌是在肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、冷明串珠菌(Leuconostocgelidum)、类肠系膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostocholzapfelii)中选定一个以上菌种组成的明串珠菌。

12.根据权利要求9所述的抗病毒组合物，其特征在于，所述病毒为流感A病毒(H3N2)。

13.一种医药组合物，其特征在于，所述医药组合物是将顺式环(L-苯丙氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))用作有效成分，并对流感A病毒(H3N2)具有特殊抗菌活性的医药组合物。

14.一种对流感A病毒(H3N2)具有抗病毒作用的抗病毒剂的制作方法，其特征在于，所述制作方法分为如下两个阶段：(a)培养乳酸，以制造乳酸菌培养液的阶段；(b)在上述培养液内，将顺式环(L-苯丙氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))浓缩成有效抗病毒浓度的阶段。

15.一种抗病毒组合物，其特征在于，所述抗病毒组合物是将顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分的抗病毒组合物。

16.根据权利要求15所述的抗病毒组合物，其特征在于，所述顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)是从明串珠菌分离出来的顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)。

17.根据权利要求16所述的抗病毒组合物，其特征在于，所述明串珠菌是肠膜状明串珠菌(Leuconostoc、mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、冷明串珠菌(Leuconostocgelidum)、类肠系膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostocholzapfelii)中选定一个以上菌种组成的明串珠菌。

18.根据权利要求17所述的抗病毒组合物，其特征在于，所述病毒为流感A病毒(H3N2)。

19.一种医药组合物，其特征在于，所述医药组合物是将顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))用作有效成分，并对流感A病毒(H3N2)具有特殊抗菌活性的医药组合物。

20.一种对流感A病毒(H3N2)具有抗病毒作用的抗病毒剂的制作方法，其特征在于，所述制作方法分为如下两个阶段：(a)培养乳酸，以制造乳酸菌培养液的阶段；(b)在上述培养液内，将顺式环(L-亮氨酸-L脯氨酸)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))浓缩成有效抗病毒浓度的阶段。