CN104777312A - 一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的elisa试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒是以纯化的重组猪传染性胃肠炎病毒N蛋白作为包被抗原的ELISA板条，还包括洗涤液、血清稀释液、底物显色液、羊抗猪酶标二抗、终止液、TGEV阳性血清和TGEV阴性血清。本发明试剂盒用于检测猪传染性胃肠炎病毒的抗体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性均良好，检测准确、操作简便，适合于在临床应用中进行推广，为猪传染性胃肠炎病的快速检测提供了可靠手段。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的ELISA试剂盒。
背景技术
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病，以呕吐、严重水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率为特征。TGE是一种世界范围内流行的疾病，国际兽疫局(OIE)将其列为B类疾病中必检的猪传染病，因此，TGE诊断技术的研究具有重要的意义。
目前对于TGEV的诊断主要是依靠RT-PCR方法，该方法对实验设备和条件要求较高，不适合临床上的大规模快速诊断。应用各种免疫血清学技术对疫病做出准确、迅速的诊断是预防和控制该病的重要措施之一。ELISA法具有简便、快速、特异性强等优点，而且ELISA检测抗体能够评价疫苗的免疫效果，但需要抗原纯度较高且免疫原性良好。TGEV N蛋白分子质量为35～48kDa、磷酸化的核衣壳蛋白，N蛋白是病毒粒子内部的一种蛋白质，主要构成病毒的核蛋白，它包绕基因组RNA，呈螺旋式结构，直径9～16nm，使其易掺入病毒中，体外复制时，N蛋白制备的抗血清能抑制90％的基因RNA的合成。N蛋白含有蛋白水解位点，通过蛋白水解作用和去磷酸化作用，对病 毒粒子的装配起重要作用。N基因可诱导机体产生细胞免疫，而由于核蛋白的高度保守性，对核蛋白作为诊断抗原的研究也受到人们的广泛重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测TGEV抗体的ELISA试剂盒及其应用。该试剂盒成本低廉、操作简便，为TGEV的检测提供了一种快捷易用的血清学诊断方法，市场前景良好。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分：
1)ELISA板条：以猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白作为包被抗原，ELISA板条经5％(M/V)脱脂乳封闭，以包装袋密封包装于4℃保存；
2)洗涤液：含0.05％吐温-20的pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS-T)；
3)血清稀释液：5％(M/V)脱脂乳；
4)底物显色液：已加入H2O2的TMB溶液；
5)羊抗猪酶标二抗：已用血清稀释液稀释至工作浓度1:10000的羊抗猪酶标二抗；
6)终止液：2M H2SO4溶液；
7)TGEV阳性血清；
8)TGEV阴性血清。
本发明所述的猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白通过以下步骤制 备：
1)以猪传染性胃肠炎病毒TGEV的RNA作为材料，通过RT-PCR方法扩增获得其N基因，基因登录号JX827607.1，扩增片段大小为816bp，并以pET-28a质粒作为载体构建重组质粒pET-28a-N，N基因与pET-28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET-28a-N，双酶切鉴定重组质粒；
2)将阳性重组表达质粒pET-28a-N转化BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET-28a-N/BL21；该单克隆于37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后6h的菌体，进行SDS-PAGE鉴定，取诱导表达后6h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定，大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用Ni-TED柱进行纯化，收集1xElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。
本发明所述的ELISA试剂盒具体操作步骤如下：
1)加入血清样品：
用血清稀释液5％(M/V)脱脂乳将待检血清做1:80稀释后，每孔加入100μL，每一血清样品添加两孔，同时设立TGEV阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用30分钟，弃去反应孔中的液体：每个孔用200μL洗涤液充分清洗5次，每次5分钟，每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，充分除去残留的液体；
2)加入羊抗猪酶标二抗：
每孔加入100μL羊抗猪酶标二抗，室温作用30分钟，按步骤(1)中方法洗涤；
3)加入底物显色液：
每孔加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室温下避光作用10分钟；
4)终止反应：
每孔加入100μL 2M H2SO4终止液，终止显色反应；
5)用酶标仪测定OD值：
使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度(OD)值；
6)结果判定：
间接ELISA检测时加入阳性血清、阴性血清，用酶标仪在450nm波长下测定OD值。试验成立的条件是：阳性对照孔OD450值均应该≧1.0且<3.0，阴性对照孔OD450值均应该≦0.2。计算各份血清OD450与阳性对照孔OD450的比值KQ，当样品KQ值≥26.768时为阳性，＜26.768时为阴性。
本发明的有益效果为：本发明ELISA试剂盒，使用猪传染性胃肠炎病病毒(TGEV)重组N蛋白作为包被抗原，该蛋白为TGEV N基因重组pET-28a-N表达载体的原核表达产物，易于制备与纯化，免疫反应性良好，该蛋白纯化后作为包被抗原，其浓度易于确定与控制，有利于该试剂盒的大量生产与成本控制；本发明试剂盒用于检测猪传染性胃肠炎病毒的抗体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性 均良好。该试剂盒检测准确、操作简便，适合于在临床应用中进行推广，为猪传染性胃肠炎病的快速检测提供了可靠手段。
附图说明
图1是pET-28a-N/BL21表达菌阳性单克隆鉴定；M：DS 15000Marker；1：阳性pET-28a-N/BL21菌单克隆；2：阴性pET-28a-N/BL21菌单克隆；
图2是TGEV N蛋白的诱导表达；M：Prestained Peotein Ruler；1：诱导后pET-28a-N/BL21菌液样品；2：未诱导的pET-28a-N/BL21菌液样品；
图3是N蛋白可溶性表达鉴定；M：BlueRay Prestained Peotein ladder；1：超声破碎后上清液样品；2：超声破碎后包涵体样品；
图4是Western Blot鉴定；M：BlueRay Prestained Peotein ladder；1：诱导后pET-28a-N/BL21菌液样品；
图5是N蛋白的纯化；M：BlueRay Prestained Peotein ladder；1：第1mL洗脱液；2：第2mL洗脱液；3：第3mL洗脱液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1试剂盒的制备
1.TGEV N蛋白表达载体的构建
提取猪传染性胃肠炎病毒感染病猪(江苏省洪泽鑫象猪场)肠道病料RNA，扩增获得其N基因(登录号JX827607.1)。N基因连接pMD19-T载体(TaKaRa)，16℃连接过夜。连接产物转化Trans5α感受态细胞(TaKaRa)，并涂布至氨苄青霉素抗性(100mg/ml)的LB平板，37℃培养过夜。挑取单克隆，于氨苄青霉素抗性的LB培养基中振荡培养10h后，提取质粒，酶切鉴定。将初步鉴定为阳性的菌液进行测序。选取测序正确的pMD18-T-N质粒，与pET-28a空质粒(Novagen)，分别使用BamH I与Sal I双酶切。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别切取N基因目的条带与pET-28a载体条带，切胶回收。回收产物16℃连接过夜。连接产物转化Trans5a感受态细胞，常规化选取阳性克隆，提取菌体质粒酶切鉴定，如图1所示，获得pET-28a-N重组质粒。
2.重组表达质粒的诱导表达
重组pET-28a-N质粒转化BL21(DE3)感受态细胞(TaKaRa)，常规化选取阳性克隆，提取菌体质粒酶切鉴定，命名为pET-28a-N/BL21。pET-28a-N/BL21表达菌活化培养，至A600＝0.6，取1ml菌液保存，加入0.1％IPTG进行诱导。诱导后每隔1h取1ml菌液，至诱导后6h。将收集到的菌液4℃、12000r/min离心5min收集沉淀。每管沉淀用40微升的PBS悬起后加入10微升SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，用SDS-PAGE电泳分析。电泳结果如图2所示，参照分子质 量标准，可见诱导表达获得蛋白大小约为45kDa，与预测的N蛋白加his-tag(gehealthcare)大小一致，证明该重组质粒在大肠杆菌中得到了表达。
取1ml诱导5h的菌液，8000rpm离心2min，用300μL PBS重悬菌体。冻融3次，超声破碎，离心分离上清液与包涵体。用300μl PBS重悬包涵体沉淀。各取40μL上清液与包涵体重悬液，加入10微升SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果如图3所示，可见N蛋白在上清液中表达。
3.重组TGEV N蛋白Western Blot实验
取诱导后5h菌液进行SDS-PAGE电泳，如图4所示。将电泳好的SDS-PAGE凝胶，不经染色，直接用转印装置将蛋白以20V电转印到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，转印1.5h。取出NC膜，在TBST中漂洗一下，加入封闭液(含2％脱脂奶粉的TBST)，平放于摇床上缓缓摇动1h。把NC膜放入用封闭液稀释的一抗(TGEV抗体阳性血清)中，平放于摇床上室温作用1h。温育好之后取出NC膜，用TBST洗5遍，每次5min。把NC膜放入用封闭液稀释的二抗(1:5000稀释酶标抗猪IgG二抗)，平放于摇床上室温作用0.5h。温育好之后取出NC膜，用TBST洗5遍，每次5min。把NC膜放入10mL底物液中，避光显色1min～15min，一旦出现条带，立即取出浸入ddH2O中漂洗以终止反应并拍照。
4.重组蛋白的纯化
pET-28a-N/BL21表达菌加入5ml LB培养基，活化培养过夜。取 2ml菌液加入200ml LB培养基中，培养至A600＝0.6，加入0.1％IPTG后，诱导培养5h。收集菌液8000rpm离心10min，弃上清，菌体称重。每克沉淀加10ml LEW溶液重悬，再次8000rpm离心10min，弃上清。
每克沉淀加5ml LEW溶液重悬，超声破碎。10000rpm离心10min，收集上清液，使用0,45μm滤器过滤后，加入到Protino Ni-TED柱进行纯化，收集1ml滤过液。使用8ml LEW洗涤Ni-TED柱，收集1ml洗涤液。用9ml Elution buffer洗脱，每次1ml，洗9次，收集各洗脱液。SDS-PAGE检验，如图5所示可见纯化效果良好，该N蛋白易于制备与纯化。
样品稀释液、洗涤液、终止液的配制：洗涤液为含0.05％吐温-20的0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液：KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000mL，加入0.5mL吐温-20；样品稀释液为含1％(M/V)BSA的洗涤液：1g BSA加入100mL洗涤液中；终止液为2M硫酸溶液：111.2mL浓硫酸，稀释定容至1000mL。
5.抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定
采用方正滴定法确定抗原最适包被浓度和血清最适稀释度。
用包被液将纯化的TGEV重组N蛋白做梯度稀释1:80(390ug/ml)、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1：10240，以100μL/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，组成方阵，4℃包被过夜；弃去抗原液，用洗涤液充分洗涤三次，200μl/孔，5min/次，使用5％的脱脂乳封闭，200μL/孔，37℃封闭1h；弃去封闭液， 用上述的操作方法洗涤，将TGEV阳、阴性血清依次做1:5、1:10稀释到1:640，以每孔100μL的量分别加入到聚苯乙烯微量反应板中，在37℃的条件下作用60min；弃去血清，用上述的操作方法洗涤，加入1:10000稀释的酶标二抗，100μl/孔，在37℃的条件下作用30min；弃去酶标二抗，用上述操作方法洗涤，尽量弃去孔内液体，加入底物显色液100μL/孔，37℃避光显色10min，最后加入终止液终止反应；选取阳性血清OD450nm值在1左右，阴性血清OD450nm低于0.2，且阳性血清OD450nm/阴性血清OD450nm最大时的抗原包被浓度和血清稀释度为最佳工作浓度。
方正滴定结果如表1所示，当重组N蛋白稀释1:2560(0.152μg/mL)包被酶标板，血清稀释1:80时，阳性血清OD值接近2，阴性血清OD值小于0.2，且P/N值为10.06较大。因此确定重组N蛋白的包被最佳浓度为0.152μg/mL，血清最佳稀释度为1:80。
表1ELISA方正滴定结果
6.包被条件的选择
最佳抗原浓度包被酶标板，分别在4℃反应过夜、37℃反应1h加4℃反应过夜、37℃反应1h、37℃反应2h，进行包被。用已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，测定OD450并分析P/N变化情况，评价其包被效果。最终确定最佳包被条件为37℃反应2h。
7.封闭液的选择
最佳抗原浓度包被酶标板，包被结束后洗涤，分别用5％脱脂奶粉、1％BSA、1％明胶作为封闭液，封闭1h。在其他条件相同的情况下，用已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，测定OD450并分析P/N变化情况，评价其封闭效果。最终确定最佳封闭液为5％脱脂乳。
8.封闭条件的确定
在其他条件固定的情况下，用选定的封闭液分别在37℃封闭30、60、120、360min，用已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，测定OD450并分析P/N变化情况，评价其封闭效果。最终确定最佳封闭条件为37℃反应30min。
9.最适抗原抗体反应时间的确定
最佳封闭液封闭，加入最佳稀释度的血清后，37℃分别孵育15、30、45、60min。在其他条件不变的情况下进行ELISA检测，测定OD450值并分析P/N变化情况，评价其效果。最终确定最适抗原抗体反应时间为30min。
10.最适二抗工作浓度的确定
将酶标二抗稀释成1：5000、1：10000、1：15000、1:20000后， 在其他条件不变的情况下进行ELISA检测，根据OD450值和P/N值变化情况，评价其效果。最终确定最适二抗工作浓度为1:10000。
11.最适显色时间的确定
加入TMB后于室温分别作用5、10、15、20min，在其他条件为上述所优化的最佳条件，根据OD450值和P/N值变化情况，确定最佳显色时间。结果如表2所示，最佳显色时间为10min。
表2最适显色时间的确定
12.阴阳性临界值的确定
用已建立的间接ELISA方法检测无TGEV免疫史和感染史80份仔猪血清,读取0D450值，计算出80阴性份血清的0D450值的平均值(X)和标准方差(SD),根据公式(阴阳性临界值＝X+3SD)算出阴阳性临界值。经计算X＝0.149，SD＝0.029，因此ELISA阴阳性临界值＝0.149+3*0.029＝0.236。
为消除每次间接ELISA检测时，实验环境及操作的影响，每次检测时加入标准阴、阳性血清。试验成立的条件是：阳性对照孔的OD450应≧1.0，且<3.0，阴性对照孔的OD450均应该＜0.2.计算样品的KQ值。
若KQ≥26.768，判定为猪传染性胃肠炎病毒抗体阳性；若KQ ＜26.768，判定为猪传染性胃肠炎病毒抗体阴性。
13.ELISA操作程序的确定
按以上各项所确定的最佳操作条件，确定ELISA操作程序为：取出已包被并封闭好的ELISA板条，用血清稀释液将待检血清做1:80稀释，加入酶标板各孔，每孔100μL，每份待检血清与TGE阴性、阳性血清各加2孔，37℃反应30分钟；弃去孔内液体，每孔用200μL洗涤液洗涤5次，每次5分钟，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μL酶标二抗，37℃反应30分钟；弃去孔内液体，每孔用200μL洗涤液洗涤5次，每次5分钟，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μLTMB底物反应液后，室温避光显色10分钟后，加入100μL终止液；用酶标仪在450nm波长读取各孔OD值，计算平均值、KQ值并判定结果。
实施例2特异性实验
按已建立的间接ELISA方法操作，分别检测已知的PEDV、CSFV、PRRSV、PRV、TGEV、FMDV、PCV2阳性血清(IDEXX试剂盒提供)，每份血清做3个平行重复。用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，确定该间接ELISA方法的特异性。
结果表明，PEDV、CSFV、PRRSV、FMDV、PCV2的KQ均小于20，判定为阴性；PRV的OD值为0.386>临界值0.236，KQ为33.84大于20，判定为阳性，但其与阳性对照的比值2.955>2，影响较小。
实施例3敏感性试验
4份TGEV阳性血清分别从1:80开始倍比稀释，按最佳检测条件进行ELISA检测，如表3所示结果表明4份阳性血清分别在1:2560、1:2560、1:2560、1:1280时变为阴性。表明试剂盒具有较好的灵敏性。
表3敏感性检测结果
实施例4重复性试验
1)批内重复实验：
使用同批诱导纯化制备的TGEV N蛋白，按最佳抗原包被浓度包被酶标板，用已建立的ELISA操作方法，在不同时间分别检测8份随机选择的TGE抗体水平不同的血清与标准血清，用酶标仪仪在450nm波长下测定OD值。计算各份血清KQ值，以及KQ值的平均值X，标准差SD，变异系数CV，具体情况见表4。
表4批内重复性实验结果
由表4可知8份血清KQ值的变异系数在0.45％-5.71％之间，同批蛋白抗原在不同时间操作检测结果重复性良好。
2)批间重复实验：
使用不同批次诱导纯化制备的TGEV N蛋白，按最佳抗原包被浓度包被酶标板，用已建立的ELISA操作方法，同时检测8份随机选择的TGE抗体水平不同的血清，用酶标仪仪在450nm波长下测定OD值。计算各份血清KQ值，以及KQ值的平均值X，标准差SD，变异系数CV，具体情况见表5。
表5批间重复性实验结果
由表5可知8份血清OD450的变异系数在1.25-5.55％之间，不同批次抗原检测结果重复性良好。
实施例5临床猪血清检测
用建立的TGEV ELISA对江苏省宿迁市某猪场采集的200份猪血清样品进行检测。其中免疫猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗之前的血样100份，免疫疫苗一个月后采样100份。检测结果显示，疫苗免疫之前TGEV血清阳性率为25％，疫苗免疫后，TGEV血清阳性率达到100％，且猪群健康状况良好。表明本专利建立的TGEV血清抗体ELISA试剂盒可以用来评估疫苗的免疫效果，为猪场TGEV疫情的防控提供技术支撑。
Claims (4)
1.一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包括以下组分：
1)ELISA板条：以猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白作为包被抗原，ELISA板条经5％M/V脱脂乳封闭，以包装袋密封包装于4℃保存；
2)洗涤液：含0.05％吐温-20的pH7.4磷酸盐缓冲液；
3)血清稀释液：5％M/V脱脂乳；
4)底物显色液：已加入H2O2的TMB溶液；
5)羊抗猪酶标二抗：已用血清稀释液稀释至工作浓度1:10000的羊抗猪酶标二抗；
6)终止液：2M H2SO4溶液；
7)TGEV阳性血清；
8)TGEV阴性血清。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白通过以下步骤制备：
1)以猪传染性胃肠炎病毒TGEV的RNA作为材料，通过RT-PCR方法扩增获得其N基因，基因登录号JX827607.1，扩增片段大小为816bp，并以pET-28a质粒作为载体构建重组质粒pET-28a-N，N基因与pET-28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET-28a-N，双酶切鉴定重组质粒；
2)将阳性重组表达质粒pET-28a-N转化BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET-28a-N/BL21；该单克隆于37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后6h的菌体，进行SDS-PAGE鉴定，取诱导表达后6h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定，大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用Ni-TED柱进行纯化，收集1xElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。
3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的ELISA试剂盒具体操作步骤如下：
1)加入血清样品：
用血清稀释液5％M/V脱脂乳将待检血清做1:80稀释后，每孔加入100μL，每一血清样品添加两孔，同时设立TGEV阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用30分钟，弃去反应孔中的液体：每个孔用200μL洗涤液充分清洗5次，每次5分钟，每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，充分除去残留的液体；
2)加入羊抗猪酶标二抗：
每孔加入100μL羊抗猪酶标二抗，室温作用30分钟，按步骤(1)中方法洗涤；
3)加入底物显色液：
每孔加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室温下避光作用10分钟；
4)终止反应：
每孔加入100μL 2M H2SO4终止液，终止显色反应；
5)用酶标仪测定OD值：
使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度OD值；
6)结果判定。
4.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的结果判定具体为：间接ELISA检测时加入阳性血清、阴性血清，用酶标仪在450nm波长下测定OD值；试验成立的条件是：阳性对照孔OD450值均应该≧1.0且<3.0，阴性对照孔OD450值均应该≦0.2；计算各份血清OD450与阳性对照孔OD450的比值KQ，当样品KQ值≥26.768时为阳性，＜26.768时为阴性。
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