CN104771414A - 一种脂肪干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脂肪干细胞制剂及其制备方法。该脂肪干细胞制剂包括：脂肪干细胞、透明质酸、白蛋白和生理盐水。该脂肪干细胞制剂中，脂肪干细胞在透明质酸和白蛋白及生理盐水的保护下，能够维持良好的存活率和活性，且不会启动分化。且本发明提供的脂肪干细胞制剂的制备方法能够避免损伤脂肪干细胞，提高了制剂中脂肪干细胞的存活率。实验表明，本发明提供的脂肪干细胞制剂能够将脂肪干细胞的存活率维持在99％以上，细胞大小均匀、形态均为梭型。0℃～4℃保存72h后，细胞仍保持着良好的形态，没有出现体积变大等异常现象，存活率仍保持在95％以上，且脂肪干细胞仍保持干细胞的特点，没有发生分化。

Description

一种脂肪干细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脂肪干细胞制剂及其制备方法。

背景技术

骨性关节炎(OA)是机械和生物性因素相互作用，使关节软骨细胞、细胞外基质发生病变的慢性致残性疾病；多发生在中老年人，随着年龄的增加患病率明显升高。目前的治疗方法包括手术和药物干预，但患者正常的软骨功能仍难以恢复。因此，软骨损伤修复一直是临床研究中的棘手问题。近年来，人们把骨髓间充质干细胞作为骨关节炎的修复细胞。但要想获取骨髓干细胞，就必须经过穿刺抽取骨髓，进而进行分离纯化提取。此外，骨髓干细胞含量低、致瘤性高，在临床上应用风险不言而喻。脂肪干细胞来源丰富、易获取、致瘤性低，且具有强大的增殖和分化潜力，已成为极具吸引力的软骨替代治疗研究热点。脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞；具有可迅速扩增、不易衰老等特点。研究发现，脂肪干细胞除了分化形成新的软骨组织，还能分泌多种活性因子，如：转化生长因子β1、角质细胞生长素等。近年来的研究结果表明，脂肪干细胞能够用于治疗关节疾病。

然而，脂肪干细胞十分脆弱，将其制成制剂很难保证存活率，而如果制剂中脂肪干细胞的存活率不足则不能发挥很好的药效。因此，进一步提高脂肪干细胞在制剂中的存活率和活性，保证移植的干细胞在体内存活十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种干细胞存活率高的脂肪干细胞制剂及其制备方法。

本发明提供的脂肪干细胞制剂，包括：脂肪干细胞、透明质酸、白蛋白和生理盐水。

在一些实施例中，本发明提供的干细胞制剂中，透明质酸的质量分数为3％～5％。

作为优选，透明质酸的质量分数为3％。

在一些实施例中，本发明提供的干细胞制剂中，白蛋白的质量分数为5％～10％。

作为优选，白蛋白的质量分数为10％。

在一些实施例中，本发明提供的干细胞制剂中，脂肪干细胞的密度为2×10⁷个/mL～5×10⁷个/mL。

作为优选，脂肪干细胞的密度为3×10⁷个/mL。

优选的，本发明提供的干细胞制剂中，透明质酸的质量分数为3％、白蛋白的质量分数为10％，脂肪干细胞的密度为3×10⁷个/mL。

优选的，本发明提供的干细胞制剂中，透明质酸的质量分数为4％、白蛋白的质量分数为5％，脂肪干细胞的密度为2×10⁷个/mL。

优选的，本发明提供的干细胞制剂中，透明质酸的质量分数为5％、白蛋白的质量分数为10％，脂肪干细胞的密度为5×10⁷个/mL。

制剂中，干细胞密度过大则存活率会因营养不足而大幅降低，而干细胞密度过小也不利于存活率的保持，且过小的干细胞密度会导致用所需制剂量的增大。本发明通过实验证实，干细胞密度为2×10⁷个/mL～5×10⁷个/mL时，干细胞存活率最高。

生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。本发明采用的生理盐水是指质量分数为0.9％的氯化钠溶液，其与人体组织的渗透压一致，以其作为溶剂，不会对脂肪干细胞产生损伤。

白蛋白(又称清蛋白，albumin，Alb)是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40％～60％。能够维持血浆胶体渗透压的恒定且承担一定的运输功能。以往的研究中表明，白蛋白可能会诱导干细胞的分化。但本发明通过实验证实，在脂肪干细胞制剂中添加白蛋白可以为脂肪干细胞提供营养，提高脂肪干细胞在制剂中的存活率，且脂肪干细胞制剂在低温保藏一个月后仍未见分化的迹象。在一定范围内，白蛋白的添加量与脂肪干细胞的存活率成正相关。但过高的白蛋白浓度会导致细胞因渗透压失衡而失水变形，反而降低脂肪干细胞的存活率。实验表明，制剂中添加白蛋白的质量分数为5％～10％最有利于提高细胞存活率。

透明质酸又称玻尿酸，是一种高分子的聚合物。是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。透明质酸是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等***的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。按照分子量的大小，透明质酸可分为：大分子量透明质酸、中分子量透明质酸、小分子量透明质酸三类。其中：大分子量透明质酸的分子量为1800000～2200000，主要用于防止脱水，组织细胞再生，紧致肌肤；中分子量透明质酸的分子量为1000000～1800000，主要用于紧致肌肤,长久保湿；小分子量透明质酸的分子量为400000～1000000，主要用于快速与细胞发生水合作用，保持细胞的水分。在脂肪干细胞制剂中添加透明质酸可以为脂肪干细胞提供合适的基质环境，维持脂肪干细胞的存活率，且利于脂肪干细胞在治疗关节疾病的过程中，分化为软骨组织。

在一些实施例中，本发明提供的干细胞制剂中，透明质酸的分子量为400000～1000000。

在一些实施例中，本发明提供的干细胞制剂中，脂肪干细胞为第三代～第五代的脂肪干细胞。

第三代～第五代的脂肪干细胞能够保持干细胞固有的分化潜能，不会出细胞凋亡或衰退的现象，其状态最佳，在适当的条件下，可以迅速增长并分化。

作为优选，第三代～第五代的脂肪干细胞经胰酶酶解后，以生理盐水清洗。

将第三代～第五代的脂肪干细胞经胰酶酶解后，以生理盐水清洗再用于本发明提供的脂肪干细胞制剂能够进一步保证干细胞的存活率。

其中，胰酶酶解具体为：取第三代～第五代(P3-P5)的脂肪干细胞，用PBS清洗两遍后，加入2～3mL 0.25％胰酶-0.02％EDTA；80％脂肪干细胞皱缩变圆时，加入5～8mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。

其中，清洗具体为：把经胰酶酶解的脂肪干细胞悬液转移至50mL离心管中，500～800g离心3～5min。离心结束后倒弃上清液，向细胞沉淀中加入20～40mL的生理盐水重悬细胞，500～800g离心3～5min，弃上清液。

优选的，清洗的次数为2次。

本发明提供的脂肪干细胞制剂的制备方法，包括：将白蛋白、透明质酸与生理盐水混合后，重悬脂肪干细胞，获得脂肪干细胞制剂。

本发明提供的脂肪干细胞制剂的制备方法简单温和，不会损伤干细胞的活性，从而提高脂肪干细胞制剂中干细胞的存活率。

具体的，本发明提供的脂肪干细胞制剂的制备方法包括：将透明质酸与生理盐水混合至透明质酸的终浓度为3％～5％后，重悬脂肪干细胞至脂肪干细胞的密度为2×10⁷个/mL～5×10⁷个/mL。

本发明提供的脂肪干细胞制剂能够很好的维持脂肪干细胞的活性和存活率，在保存期间不会发生分化，因此，本发明提供的脂肪干细胞制剂可以用于制备治疗关节疾病的药物。

本发明提供的脂肪干细胞制剂在制备治疗关节疾病的药物中的应用。

作为优选，关节疾病为骨性关节炎。

本发明提供的脂肪干细胞制剂，包括：脂肪干细胞、透明质酸、白蛋白和生理盐水。本发明提供的脂肪干细胞制剂中，脂肪干细胞在透明质酸和白蛋白及生理盐水的保护下，能够维持良好的存活率和活性，且不会启动分化。且本发明提供的脂肪干细胞制剂的制备方法，能够避免损伤脂肪干细胞，提高了制剂中脂肪干细胞的存活率。实验表明，本发明提供的脂肪干细胞制剂能够将脂肪干细胞的存活率维持在99％以上，细胞大小均匀、形态均为梭型。0℃～4℃保存72h后，细胞仍保持着良好的形态，没有出现体积变大等异常现象，存活率仍保持在95％以上，且经表面抗原检测，脂肪干细胞仍保持干细胞的特点，没有发生分化，具有良好的活性。

附图说明

图1示第三～第五代脂肪干细胞形态图，其中，图1-a示第三代脂肪干细胞放大40倍；图1-b示第三代脂肪干细胞放大100倍；图1-c示第五代脂肪干细胞放大40倍；图1-d示第五代脂肪干细胞放大100倍；

图2示脂肪干细胞体积大小分布图；

图3示本发明实施例4提供的脂肪干细胞制剂制备3h内的台盼蓝染色结果；

图4示本发明实施例2提供的脂肪干细胞制剂的检测结果，其中，图4-a示脂肪干细胞的台盼蓝染色结果；图4-b示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原HLA-DR的检测结果；图4-c示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原CD45的检测结果；

图5示本发明实施例3提供的脂肪干细胞制剂的检测结果，其中，图5-a示脂肪干细胞的台盼蓝染色结果；图5-b示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原HLA-DR的检测结果；图5-c示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原CD45的检测结果；

图6示本发明实施例4提供的脂肪干细胞制剂的检测结果，其中，图6-a示脂肪干细胞的台盼蓝染色结果；图6-b示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原HLA-DR的检测结果；图6-c示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原CD45的检测结果；

图7示本发明对比例1提供的脂肪干细胞制剂的检测结果，其中，图7-a示脂肪干细胞的台盼蓝染色结果；图7-b示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原HLA-DR的检测结果；图7-c示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原CD45的检测结果；

图8示本发明对比例2提供的脂肪干细胞制剂的检测结果，其中，图8-a示脂肪干细胞的台盼蓝染色结果；图8-b示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原HLA-DR的检测结果；图8-c示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原CD45的检测结果；

图9示本发明对比例3提供的脂肪干细胞制剂的检测结果，其中，图9-a示脂肪干细胞的台盼蓝染色结果；图9-b示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原HLA-DR的检测结果；图9-c示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原CD45的检测结果；

图10示本发明对比例4提供的骨髓干细胞制剂的检测结果，其中，图10-a示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原FSC的检测结果；图10-b示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原HLA-DR的检测结果；图10-c示流式细胞仪检测脂肪干细胞表面抗原CD45的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种脂肪干细胞制剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脂肪干细胞的制备

1)分离

体脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL。每管中加入等体积的0.5％Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25％)，充分混匀，封口，转移至恒温空气摇床中，37℃、100R消化1h。每管加入4mL的FBS，终止消化，混匀。离心，1500rpm/min离心5min。弃去上两层液体，每管加入40mL PBS重悬，重悬细胞。离心，1500rpm/min离心5min，弃去上清，获得脂肪干细胞，此干细胞为种子。

2)培养

加入含15％FBS的DMEM-F12培养基重悬细胞，以1×10⁵个/mL接种。轻轻前后摇动培养皿，使细胞悬液均匀分布于瓶底；转移到37℃、5％CO₂、饱和湿度为95％的培养箱中培养。24h后首次换液，弃去悬浮细胞.随后每3天换一次液。在倒置显微镜下观察脂肪干细胞，若细胞融合达85％，则对脂肪干细胞进行传代处理，获得第3～5代的脂肪干细胞。(如图1所示)观察并检测细胞大小。(如图2所示)

如图所示：脂肪干细胞在P3和P5代时，细胞大小均匀、形态均为梭型，融合至85％时呈现漩涡状。脂肪干细胞***增殖速度快，状态良好。从脂肪干细胞形态图上可知，脂肪干细胞在16-22um之间，符合脂肪干细胞体积大小分布，说明了脂肪干细胞并没有出现体积变大等异常现象。

3)酶解

取第三代至第五代(P3-P5)的脂肪干细胞，用PBS清洗两遍后，加入2～3mL 0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置显微镜下观察，80％脂肪干细胞皱缩变圆时，加入5～8mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落，获得酶解后的脂肪干细胞。

4)清洗

把酶解后的脂肪干细胞悬液转移至50mL离心管中，500～800g离心3～5min。离心结束后倒弃上清液，往细胞沉淀中加入20～40mL的生理盐水重悬细胞，500～800g离心3～5min，弃上清液(该步骤重复一次)。清洗后的脂肪干细胞用于制剂的制备。

实施例2～4

把白蛋白和小分子量透明质酸加入到生理盐水中，获得制剂的基质，用基质重悬实施例1制备的清洗后的脂肪干细胞。各实施例中白蛋白、透明质酸、脂肪干细胞的量如表1所示：

表1 实施例2～4

	白蛋白质量分数	透明质酸质量分数	脂肪干细胞个数
				实施例2	5％	4％	2×107个/mL
实施例3	10％	5％	5×107个/mL
				实施例4	10％	3％	3×107个/mL

对比例1～3

把白蛋白和小分子量透明质酸加入到生理盐水中，获得制剂的基质，用基质重悬实施例1制备的清洗后的脂肪干细胞。各实施例中白蛋白、透明质酸、脂肪干细胞的量如表2所示：

表2 对比例1～3

	白蛋白质量分数	透明质酸质量分数	脂肪干细胞个数
				对比例1	0％	4％	2×107个/mL
对比例2	2.5％	5％	5×107个/mL
				对比例3	20％	3％	3×107个/mL

对比例4～6

把白蛋白和小分子量透明质酸加入到生理盐水中，获得制剂的基质，用基质重悬骨髓干细胞。各实施例中白蛋白、透明质酸、骨髓干细胞的量如表3所示：

表3 对比例4～6

	白蛋白质量分数	透明质酸质量分数	脂肪干细胞个数
				实施例2	5％	4％	2×107个/mL
实施例3	10％	5％	5×107个/mL
				实施例4	10％	3％	3×107个/mL

实施例5制剂质量评价

对实施例2～4和对比例1～6制得的干细胞制剂进行质量鉴定。各样品检查3次。方法为：

制剂制成后，3h内对新鲜制得的制剂进行检测，检测内容包括：干细胞形态、存活率、制剂中细菌等的含量。其中，细胞形态检测、细胞活力检测采用台盼蓝染色法。检测结果如表4所示。图3示本发明实施例4提供的脂肪干细胞制剂制备3h内的台盼蓝染色结果；其他实施例制得的脂肪干细胞制剂中，干细胞的形态与此相似。

表4 制剂制成后3h内检测结果

注：A表示细胞大小均匀、呈梭型

B表示细胞体积增大、出现椭圆或不规则等异常形态

*表示具有显著性差异p<0.05

--示未检到

结果表明：在制备3h内，本发明提供的脂肪干细胞制剂内，干细胞大小均匀，存活率高，在台盼蓝检测下，细胞均拒染(死细胞被染成蓝色，活细胞拒染)；说明了脂肪干细胞没有出现死亡，活力好。而对比例1～6制备的干细胞制剂中，干细胞的存活率略低，有的甚至出现了异常形态。

制剂制成后，装入注射器中，0℃～4℃保存72h后再次检测干细胞形态、存活率、表面抗原，制剂中细菌等的含量。其中，细胞形态检测、细胞活力检测采用台盼蓝染色法，表面抗原检测采用流式细胞仪分析。检测结果如表5和图4～10所示。

表5 制剂制成后72h后检测结果

注：A表示细胞大小均匀、呈梭型

B表示细胞体积增大、出现椭圆或不规则等异常形态

*表示具有显著性差异p<0.05

--示未检到

结合表4～5和图4～10，结果表明，在制备72h后，实施例2～4制备的脂肪干细胞制剂中干细胞形态小且均一，存活率显著(p<0.05)高于对比例1～6，折光性强而从流式分析的结果来看，脂肪干细胞高表达CD59和CD90，表达率分别为大于99％；低表达HLA-DR和CD45不足1％。符合干细胞的表面抗原特征，说明了脂肪干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。对比例1～3中也未见干细胞的出现分化现象，但对比例4～6中干细胞却出现了分化现象。

另外，经检测实施例2～4和对比例1～6提供的干细胞制剂在细菌、真菌、内毒素及五大病毒的检测中，均呈阴性。说明了脂肪干细胞制剂的质量合格，可用于机体内的回注，进行骨关节炎疾病的治疗。

实施例6制剂临床效果评价

选取24只兔子，随机取8只为阴性对照组，16只造模形成骨关节炎的模型。造模后，16只兔子随机分成两组，分别为实验组和阳性对照组。

实验组注射实施例4提供的脂肪干细胞制剂，阳性对照组和阳性对照组注射实施例4的制剂基质(包括生理盐水、白蛋白和透明质酸，其中白蛋白的质量分数为10％，透明质酸的质量分数为3％)。

注射方法为：

a.经皮穿刺至骨关节炎骨腔注射。

b.经皮穿刺骨关节炎区局部多点注射。

c.术后静脉滴注低分子右旋糖酐300-600ml，连续3-5d；在首次注射后，第2周进行第二次、第三次介入治疗，3次为一个疗程。在首次注射后，第2周、第1个月、第2个月、第3个月进行评价。

对软骨厚度的检测结果如表6所示：

表6 MRI评价软骨厚度(x±S，n＝3，mm)

	只数	2周	1个月	2个月	3个月
						阴性对照组	8	1.05±0.06	1.05±0.04	1.048±0.03	1.049±0.03
阳性对照组	8	0.54±0.11*	0.58±0.07*	0.64±0.08*	0.73±0.12*
						实验组	8	0.60±0.45*	0.68±0.07*	0.84±0.06*	0.98±0.06

注：*为P<0.05,有显著性差异。

由表6可知，阴性对照组的软骨厚度在三个月内并没有出现大的变化，软骨厚度维持在一个稳定的水平，并厚度并没有出现差异性减少。而阳性对照组，其存在一定的自我修复机制，软骨厚度在3个月内有所增加，但其厚度增厚速度慢，并不能起到明显的改善作用。而实验组在回注制剂后，其软骨厚度经过3个月的修复后，其软骨厚度与对照组显著性差异，说明了脂肪干细胞可用于治疗骨关节炎，且治疗效果良好。

对Mankin病理学评分结果如表7所示：

表7 各治疗组病理学Mankin评分比较(x±S)

	只数	2周	1个月	2个月	3个月
						阴性对照组	8	1.325±0.22	1.26±0.15	4.06±0.17*	1.24±0.31
阳性对照组	8	5.41±0.47	5.34±0.62	5.26±0.55*	5.10±0.46*
						实验组	8	4.50±0.45*	4.06±0.17*	3.53±0.16*	2.66±0.18*

注：*为P<0.05,有显著性差异。

由表7可知，阴性对照组的软骨病理学Mankin评分在三个月内并没有出现大的变化，软骨组织维持在一个稳定的水平，并没有出现病理性变化。而阳性对照组，其存在一定的自我修复机制，软骨病理学Mankin分值在3个月内有所下降，但其改善速度慢，并不能起到明显的改善作用。而实验组在回注制剂后，其软骨厚度经过3个月的修复后，其软骨病理学Mankin分值与对照组虽然存在显著性差异，但仍起到明显的改善作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种脂肪干细胞制剂，其特征在于，包括：脂肪干细胞、透明质酸、白蛋白和生理盐水。

2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，其中所述白蛋白的质量分数为5％～10％。

3.根据权利要求1所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，其中所述透明质酸的质量分数为3％～5％。

4.根据权利要求1所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，其中透明质酸的分子量为400000～1000000。

5.根据权利要求1所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，其中所述脂肪干细胞的密度为2×10⁷个/mL～5×10⁷个/mL。

6.根据权利要求1所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，其中所述脂肪干细胞的密度为3×10⁷个/mL。

7.根据权利要求1所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，其中所述脂肪干细胞为第三代～第五代的脂肪干细胞。

8.根据权利要求4所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，所述第三代～第五代的脂肪干细胞经胰酶酶解后，以生理盐水清洗。

9.权利要求1～8任一项所述的脂肪干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括：将白蛋白、透明质酸与生理盐水混合后，重悬脂肪干细胞，获得脂肪干细胞制剂。

10.如权利要求1～8任一项所述的脂肪干细胞制剂在制备治疗关节疾病的药物中的应用。