CN104762254A - 一种新型细胞培养基质材料及其应用 - Google Patents

Abstract

为了模拟人体内环境的细胞培养基质快速应用于各种药物筛选，本发明提供一种新型细胞培养基质，经常规细胞培养方法获得大量干细胞、新型细胞培养基质材料的制备、与药物进行立体化培养、检测筛选各种药物的方法达到药物快速筛选目地。通过新型细胞培养基质材料培养能获得不同药物浓度下细胞生长状态，为后期临床提供大量实验数据，更快速判断药物的有效性和毒性。药物筛选过程中更易防治病菌污染，能长时间观察细胞生长状态和细胞反应，为后期药物治疗时的副作用提供数据支持。

Description

一种新型细胞培养基质材料及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型细胞培养基质材料的制备及其应用，属于医药生物技术领域。

背景技术

大规模细胞培养技术是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等)，在细胞生物反应器中高密度大量培养细胞用于生产生物制品的技术。目前大规模培养细胞主要采用转瓶培养***和不锈钢罐培养***。转瓶培养存在以下问题：其表面积有限，细胞生长密度低；培养时监测和控制环境条件(pH、溶氧等)不稳定，影响产品质量；劳动强度大，占用空间大，污染率高。不锈钢罐培养存在以下问题：需要复杂的在位清洗(CIP)或在位灭菌(SIP)管路，工艺流程运行之间交叉污染的可能性；每生产批次准备时间长，生产人员劳动强度大；搅拌***剪切力大，细胞损伤严重。

公开号为CN101448932的中国专利介绍了一种三维细胞培养，包括将前脂肪细胞引入到三维支持物基质中，和容许所述细胞在所述支持物基质中体外分化为脂肪细胞。所述基质可以是胶原基质。本方法可以用于研究干细胞的发育，或用于研究脂肪细胞对刺激的响应。本方法提供了这样的***，由此具有与体内的那些类似生物特征的脂肪细胞能够在体外生长。

公开号为CN203429183U的中国专利介绍了一种三维细胞培养板，其包括细胞生长板和储液板，所述的细胞生长板安装于所述储液板的上部；所述细胞生长板的下表面设有生长孔，所述储液板的上表面设有储液孔，所述的生长孔与所述的储液孔相互配合；所述的生长孔中设有进样孔和环状隔离槽，所述的进样孔位于所述生长孔的中心并贯穿其中，所述的环状隔离槽位于所述进样孔的外周。本发明所述的三维细胞培养板，具有成本低廉、操作简单等优点，可方便地应用于倒置培养法中进行三维细胞培养。

公开号为203559059U的中国专利介绍了一种全自动三维细胞培养***，包括基座、电源适配器、培养皿；所述基座内装有旋转马达；所述电源适配器上设有转速表；所述培养皿为培养盘或培养管柱，培养盘或培养管柱背侧均设有硅胶气体交换膜；所述培养皿装在基座上；所述基座与电源适配器连接。本发明中的细胞或组织在生长过程中是以自由落体的状态悬浮，没有搅拌器、气泡等破坏性压力，故组织在培养液中得以自由降落、翻转并与培养液充分混合，其容器内各方向的力量达到平衡，所以细胞或组织不会受到单一方向的力 量影响，可朝任意方向均匀生长，增加细胞增殖速率，减少细胞死亡和有效增加细胞产物分泌的***，解决了三维细胞培养的内生(ingrowth)不足的限制。

公开号为CN102188752A的中国专利介绍了一种制备骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的方法及装置，包括：(1)细胞接种：将供细胞立体培养的管道支架经消毒处理后，吸取第3代骨髓间充质干细胞的细胞悬液，均匀滴加至管道支架外表面，待吸收完全后将管道支架置于注射器内，负压抽吸2～5次；(2)静态培养：将接种后的管道支架置于细胞培养装置中，添加干细胞培养液中静态培养20～30小时；(3)灌流培养：将管道支架置于灌流培养槽中，所述灌流培养槽内径与所述管道支架外径相匹配，轴心位置设置有与所述管道支架中央通道相匹配的实心柱体，管道支架放置于柱体与外壁间的空腔内，空腔底部有供培养液流通的多孔底板；往灌流培养槽中通入干细胞培养液，在0.1～0.3mL/min流速下灌流培养10～15天，制备得到所述骨髓间充质干细胞-管道支架复合物。该发明方法提高了骨髓间充质干细胞在PCL管道支架内的接种效率，并提高了细胞在管道支架外壁内的均匀分布和扩增能力，利用这种方法可获得骨髓间充质干细胞均匀以及高密度分布的复合管道支架，有望应用于临床上管道组织损伤的修复。

公开号为CN102935246A的中国专利介绍了一种三维细胞培养支架及其制备方法和应用，包括：固相磷酸钙含量为50～55％(重量体积比)的料浆的配制；聚甲基丙烯酸甲酯微球的制备；多孔磷酸钙支架的制备；将步骤3制备的多孔磷酸钙支架放入质量百分含量为4～7％的海藻酸钠盐酸溶液中，真空浸泡1-2h，用超纯水反复洗涤三次，即得。该支架具有制备简单，便于操作和运输等优点。本发明还提供该三维培养支架的制备方法和应用。

公开号为CN102517211A的中国专利介绍了一种可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法。是以羧甲基改性的壳聚糖为原料，将其溶解于pH＝5～8的磷酸盐或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，然后加入碳二亚胺活化的二硫代二元酸交联剂，通过羧甲基壳聚糖中氨基与交联剂中羧基间的酰胺化反应形成三维化学交联的水凝胶，最后通过冷冻干燥得到三维多孔载体。该载体材料中的二硫键可被其还原剂迅速还原断裂，实现多孔载体快速解离而溶解，能满足多种体外三维细胞培养和培养结束后需要细胞-载体材料有效分离的特殊需求。本发明的壳聚糖基水凝胶三维细胞培养载体具有原料易得、工艺简单、易生物活性改性，以及载体理化性质、力学性能和降解速率可控等优点，在各种三维细胞培养中具有良好的应用前景。

公开号为CN101626781的中国专利介绍了一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应细胞群的方法，包括将肿瘤与单个核细胞置于三维细胞培养装置中共同培养，以及从获得的培养物中分离扩增具有免疫应答反应的细胞群。本发明还公开了采用本方法获得的具有抗肿瘤免疫 应答反应的细胞群及含有所述细胞群的试剂盒。

公开号为CN101611132的中国专利介绍了一种高效透气装置及培养细胞的方法，包括使用透气培养室，以减少空间的使用，同时维持均匀的培养条件，并且更适合自动液体操作。它们包括将透气材料集成至传统的多层形式以解决培养条件不均匀的问题。它们包括培养装置，其使用由透气材料构成的表面，充有等离子体的硅酮，并且集成传统的附着表面，例如由传统的经组织培养处理的聚苯乙烯构成的那些表面。它们包括集成了透气透液膜的培养装置。这样产生多种优点，包括放大期间更优化的培养条件，以及对存量空间、培养箱空间和处理空间更有效的利用。还有，可以减少工作量和污染风险。

公开号为CN101611133的中国专利介绍了一种高效装置及培养细胞的方法包括使用透气培养室，以减少空间的使用，同时维持均匀的培养条件，并且更适合自动液体操作。它们包括将透气材料集成至传统的多层形式以解决培养条件不均匀的问题。它们包括培养装置，其使用由透气材料构成的表面，充有等离子体的硅酮，并且集成传统的附着表面，例如由传统的经组织培养处理的聚苯乙烯构成的那些表面。它们包括集成了透气透液膜的培养装置。这样产生多种优点，包括放大期间更优化的培养条件，以及对存量空间、培养箱空间和处理空间更有效的利用，还能减少工作量和污染风险。

公开号为CN102166380A的中国专利介绍了一种基于双层硝酸纤维素膜灌流式的生物人工肝反应器，包括箱体和设置在箱体内腔中的细胞支架，其中，箱体上设置进液口、出液口、进气口、排气口；所述的细胞支架为双层硝酸纤维素膜，该双层硝酸纤维素膜的两长边紧贴于箱体的前侧和后侧的内壁上，其两端固定在箱体的左、右两侧的内壁上，将箱体内腔分隔成上、下两个独立空间，培养液在上、下两个独立空间中流动进行物质交换；所述双层硝酸纤维素膜间的间隔空间作为肝细胞的三维生长空间，细胞在间隔空间内生长，能在进行充分的物质传输的同时避免液体流动时剪切力对细胞的伤害，同时也达到免疫隔阻的效果。

公开号为CN101007999的中国专利介绍了一种可透见的三维空间细胞培养***及其在组织细胞和新生器官培养中的应用，包括：容器，在容器内含有细胞培养基及三维细胞培养单元，所述三维细胞培养单元含有可植入细胞并利于细胞黏附和长期生长、分化、成熟的空腔。所述三维空间培养单元是可透见的，可动态观察细胞的黏附、扩伸、移行、增生、分化、成熟、衰老、死亡及发展形成组织或器官。本发明的***可用于长期培养细胞和生产大量细胞作为组织工程的种子细胞，还可在短期内形成再生组织和微器官以供移植治疗。此外，本发明***为肿瘤的体外研究提供了独特的环境，可帮助肿瘤诊断，观察肿瘤侵润和转移，筛选抗肿瘤药物。亦用于离体培养各种细胞，以及用于研究细胞内在的基因程序改变和细胞 外环境变化对细胞的影响等。

公开号为CN103045535A的中国专利介绍了一种人类羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的构建方法，其包括如下步骤：S1：羊膜上皮细胞的分离培养:取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15×15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约1-2mm左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入0.25％胰酶和EDTA各15ml，37℃消化7-8分钟，用PBS液100ml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5％FBS培养液终止消化，1000rpm离心6min收集细胞，接种在含10％FBS的RPMI1640的培养皿中，于37℃含5％CO2的培养箱内培养。S2：原代细胞的纯化:对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，(1)在培养液中加入Ara-C,作用浓度为10-6mol/L，作用时间为36h。(2)更换新鲜培养基继续培养1d。(3)再次向培养皿中加入Ara-C,作用浓度为10-7mol/L，作用时间为12h。(4)更换新鲜培养基继续培养1d。(5)弃培养基，D-Hank清洗细胞2次，0.25％胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/min离心5min，弃上清后全培养基继续培养。S3：原代细胞的鉴定:取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为1×106/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置4℃孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。S4：羊膜细胞丝素蛋白支架复合体的构建:将上述体外培养并经过纯化后的羊膜上皮细胞调整浓度为1×106/ml，将细胞悬液滴在灭菌处理过的丝素蛋白支架上，放入24孔培养板中悬空孵育4小时，待细胞充分吸附在支架上后再加入10％FBS+RPMI1640全培养基，令细胞完全浸没，2到3天半量换液，每天进行倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况。S5：扫描电镜观察:第十天取出支架复合物标本放入2.5％戊二醛固定，PBS冲洗后，常规脱水，临界点干燥喷金在扫描电镜下观察细胞的生长情况。

公开号为CN103589637A的中国专利介绍了一种细胞体外立体培养***，包括平面培养皿，其特征在于：所述培养皿内表面包被有生物基质，生物基质上层接种有支持细胞，支持细胞上层接种有目的细胞。本发明解决了细胞体外培养的立体空间模拟问题，使目的细胞能在近似于其体内的环境中生长，保持了其形态和结构的忠实性，从而有利于其体外各种试验的可靠性。

公开号为CN103849565A的中国专利介绍了一种电刺激模块细胞培养装置，所述的装置包括：静电纺丝电极1、培养皿基底2、电兴奋性细胞3、电刺激模块4、电极连线5。本发明结构简单，可以在基于骨架立体培养的同时加入电刺激，提高可电兴奋性细胞的培养质 量。

公开号为CN201418905的中国专利介绍了一种人工肝用纤维网片叠加式生物反应器，包括反应器外壳，反应器外壳内布置若干纵向叠加的中空纤维网片，中空纤维网片由中空纤维编织而成，若干竖向布置的中空纤维穿过前述中空纤维网片的网格的中心，所述中空纤维均为聚砜中空纤维；反应器外壳的底端设细胞悬液入口和液体入口，顶端设细胞悬液出口和液体出口，侧壁对向设置气体入口和气体出口。本发明具备三维立体培养结构、兼具氧合和免疫阻隔功能、细胞活性和功能佳、易于放大。

CN1563364的中国专利介绍了一种三维立体培养和诱导骨髓间充质干细胞成软骨细胞的方法，包括如下步骤：：(1)将骨髓间充质干细胞在预置有培养基和微载体的悬浮培养装置中悬浮培养，在搅拌下扩增骨髓间充质干细胞；所说的培养基为含有2％～20％体积百分比胎牛血清的α-MEM；所说的微载体为Cytodex3微载体；(2)然后将成软骨细胞诱导培养基加入含收获的Cytodex3微载体以及在其上生长的骨髓间充质干细胞的培养装置中，对骨髓间充质干细胞进行聚团成软骨细胞诱导；成软骨细胞诱导培养基以DMEM为基础，添加浓度为1～10μg/ml的胰岛素、1～20ng/ml的转化生长因子β3、10～150nmol/L的***、10～100mg/ml的抗坏血酸磷酸酯、10～100mg/ml的脯氨酸、0.5～5mmol/L的丙酮酸钠。该发明的方法可在短时间内一次获得大量的软骨细胞，降低了污染几率，减少了细胞损伤，有利于细胞间营养物质的传递。诱导完成后可直接将该复合物移植入体内进行软骨缺损修复实验或为科学研究提供充足的种子细胞来源。

公开号为CN103849566A的中国专利介绍了一种电兴奋性细胞培养方法包括：静电纺丝电极1、培养皿基底2、电兴奋性细胞3、电刺激模块4、电极连线5。本发明结构简单，可以在基于骨架立体培养的同时加入电刺激，提高可电兴奋性细胞的培养质量。

公开号为CN201418901的中国专利介绍了一种人工肝用多孔砖式填充支架型反应器，包括反应器外壳；反应器外壳内部由两个密布网格的隔离板分为三个舱：自下而上为氧合舱、填充支架舱、免疫阻隔舱。本发明采用独特的多孔砖式固定床作为反应器内部主体，通过固定床中互不相通的细长孔柱分割反应器内部成微型独立单元，将反应器内腔化整为零，减小无效腔、死腔、液流阻力，使反应器内部液流均匀。解决支架型反应器缺乏免疫隔离、氧供不充分的问题，又弥补中空纤维型反应器细胞生长空间不足、细胞黏附性差、缺乏三维立体生长环境、易堵塞半透膜的缺陷。兼具氧合、免疫阻隔、三维立体培养功能，综合性能强大，制作工艺简单、成本低、易于放大。

公开号为CN101092606的中国专利介绍了一种神经干细胞三维立体培养体外扩增的 方法，包括：选择具有三维立体环境的多孔微载体；对微载体进行预处理，其特征在于：它还包括以下步骤：(1)将含有40-60ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、40-60ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)和B27的DMEM/F12神经干细胞无血清培养液包被上述的微载体，使促进细胞***的碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子均匀地渗透于微载体内；(2)将上述处理好的微载体放入细胞培养瓶内，加入上述神经干细胞无血清培养液，然后在培养瓶加入1×105-1×106个神经干细胞，混合均匀后，再充入含有5％浓度的二氧化碳气体，并在37℃左右的恒温下进行培养，根据细胞的增殖情况，每5-7天更换神经干细胞无血清培养液；(3)将长满神经干细胞的微载体从培养瓶中取出，放入含有0.05％胰蛋白酶的D-hank’s缓冲液中，在室温下消化10-30分钟，去除微载体，漂洗细胞，得到神经干细胞。与传统的培养方法相比，多孔微载体有助于扩大培养面积，碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子促进了细胞的增殖***，改善细胞生存的微环境，有利于神经干细胞增殖***，达到神经干细胞体外扩增的目的。

公开号为CN101549179的中国专利介绍了一种人工肝用多孔砖式填充支架型反应器，包括反应器外壳；反应器外壳内部由两个密布网格的隔离板分为三个舱：自下而上为氧合舱、填充支架舱、免疫阻隔舱。本发明采用独特的多孔砖式固定床作为反应器内部主体，通过固定床中互不相通的细长孔柱分割反应器内部成微型独立单元，将反应器内腔化整为零，减小了无效腔、死腔、液流阻力，使反应器内部液流均匀。既解决支架型反应器缺乏免疫隔离、氧供不充分的问题，又弥补中空纤维型反应器细胞生长空间不足，细胞黏附性差，缺乏三维立体生长环境，易堵塞半透膜的缺陷。兼具氧合、免疫阻隔、三维立体培养功能，综合性能强大，而制作工艺简单、成本低、易于放大。

从目前文献资料来看，在国内外主要以硬质材料如静电纺丝电极、微载体等提供立体培养载体，但是人体环境主要以软体材料构成，并不能模拟人体内环境，大大减缓了药物筛选的速度，也降低了药物筛选的准确度。

发明内容

在药物筛选过程中，药物与细胞直接混合，所有细胞反应是一致的，但是人体代谢过程中药物在各个细胞周围浓度是不致的，各个细胞反应也不相同，为了更好的模拟人表皮细胞内环境，观察药物对人细胞的影响，为临床提供丰富的实验数据，本发明提供一种新型细胞培养基质材料以及在药物筛选过程中的应用。

本发明在应用于药物筛选时，必须获得大量的细胞液，因此以下举例说明获得细胞过程，但并不是局限于以下细胞：

人表皮干细胞的制备：无菌条件下取引产胎儿背部皮肤约160cm²,轧制成 0.5cm×0.5cm大小的皮块,消毒液洗涤后分为16份,Dispase Ⅱ酶4℃下缓慢搅拌(120r/min)消化,分离真皮和表皮,将表皮剪碎用胰蛋白酶37℃下消化,0.125％Dispase Ⅱ酶冷消化10h、0.1％胰蛋白酶37℃消化30min,分离得到人表皮干细胞，采用干细胞常规传代培养方法获得含大量人表皮干细胞的培养液，用于药物筛选，经800～1000rpm低速离心5-10min得人表皮干细胞；

脐带血干细胞的制备：在新生儿出生以后，取婴儿端3-8cm脐带储两把止血钳结扎、断脐，婴儿被抱走处理，贴近母端止血钳处消毒并将针头***脐静脉，采集脐带血，将其置入4℃的环境下800～1000rpm低速离心5-10min，弃上清后用0.125％Dispase Ⅱ酶冷消化10h、0.1％胰蛋白酶37℃消化30min,使用Ficoll-Hypaque将单个核细胞进行分离，洗涤后将其放入PBS/1％HSA中，获得脐带血干细胞。

本发明提供一种新型细胞培养基质材料的制备方法及其应用，其具体步骤包括：

(1)干细胞培养：通过各种途径获得的干细胞经常规细胞培养液在37℃下进行传代培养，800～1000rpm低速离心5-10min，收集干细胞备用；

(2)新型细胞培养基质材料的制备：将干细胞10mL放入300mL培养瓶中，再加入100mL的0.6％巯基化透明质酸水溶液，搅拌5-10min充分混合均匀后，再加入50mL的8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入2孔板或6孔板或49孔板或96孔板或直径为4～12cm培养皿中，28-32℃静置12-20min，得含有干细胞的立体化培养介质；

(3)与药物立体化共培养：向立体培养基质中加入含不同浓度药物的细胞培养液，在37℃的CO₂培养箱中培养；

(4)镜检观察细胞状态：与不同浓度的药物培养时，每隔2h后直接将培养的人表皮干细胞放入倒置显微镜中观察，确定各种药物在不同浓度下干细胞生长状态；

(5)筛选药物体系建立：根据显微镜观察的细胞生长状态确定各种药物的浓度，取200mL的0.6％巯基化透明质酸水溶液放入500mL培养瓶中，加入步骤(1)所获得的干细胞10mL，搅拌混合5-10min，100mL的8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入96孔板中，30℃静置15min，向96孔板中加入各种药物在37℃的CO₂培养箱中培养，每隔2h后直接将培养的96孔板放入倒置显微镜中观察，快速筛选各种药物的有效性和毒性。

所述8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液和0.6％巯基化透明质酸水溶液，是指质量体积比，用8g高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯用100mLPBS溶液溶解得8％高分子量聚 乙二醇二丙烯酸酯水溶液，将1.2g巯基化透明质酸用200mLPBS溶液溶解得0.6％巯基化透明质酸水溶液，上述各种溶液是经过膜过滤除菌获得无菌溶液。高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯和巯基化透明质酸可以从广州恩轲肽医药科技有限公司购买。

所述干细胞的培养液是采用低糖DMEM培养液进行培养。不同浓度药物的细胞培养液配制：低糖DMEM培养液与不同药物配比组合获得，细胞培养液和基质交联制备都需要在无菌的超净工作台进行，保证无菌状态。

所述PBS溶液是指氯化钠NaCl 0.2～0.6g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.02～0.08g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.1～0.4g、氯化钾KCl 0.005～0.05g、碳酸氢钠NaHCO₃0.1～0.4g用水配成100mL。

所述药物是指小分子有机物、抗生素、多肽蛋白类药物等水溶性或脂溶性药物。

附图说明：

图1.新型细胞培养基质材料成型后外观；

图2.人表皮干细胞与复合材料在100倍光学显微镜下形态图；

图3.人表皮干细胞与复合材料在400倍光学显微镜下形态图；

图4.人表皮干细胞与复合材料培养3周500倍电镜扫描图；

图5.人表皮干细胞与复合材料培养3周3000倍电镜扫描图；

图6.人表皮干细胞与复合材料培养3周，用Hochest33258进行荧光染色后在400倍荧光显微镜下形态图。

技术效果： 

1、通过立体化细胞培养能获得不同药物浓度下细胞生长状态，为后期临床提供大量实验数据，更快速判断药物的有效性和毒性。

2、筛选速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。

3、本发明能建立多种细胞培养模型，更能模拟出人体内环境，完全依靠大分子的交联提供立体状态，同时细胞又能充分利用交联中的透明质酸，方法简单，生产成本低，可批量生产，应用价值高。

4、药物筛选过程中更易防治病菌污染，能长时间观察细胞生长状态和细胞反应，为后期药物治疗时的副作用提供数据支持。

具体实施方式

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1：人表皮干细胞的分离与培养

无菌条件下取引产胎儿背部皮肤约160cm²,轧制成0.5cm×0.5cm大小的皮块,消毒液洗涤后分为16份,Dispase Ⅱ酶4℃下缓慢搅拌(120r/min)消化,分离真皮和表皮,将表皮剪碎用胰蛋白酶37℃下消化,0.125％Dispase Ⅱ酶冷消化10h、0.1％胰蛋白酶37℃消化30min,分离得到人表皮干细胞，采用干细胞常规传代培养方法获得含大量人表皮干细胞的培养液，用于药物筛选，经800～1000rpm低速离心5-10min得人表皮干细胞。

实施例2：新型细胞培养基质材料的制备

称取氯化钠0.4g、磷酸二氢钾0.024g、磷酸氢二钠0.164g、氯化钾0.01g、碳酸氢钠0.3g用水配成100mL，即为PBS溶液。将8g高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)用100mLPBS溶液溶解，形成8％水溶液。将1.2g巯基化透明质酸用200mLPBS溶液溶解，取100mL巯基化透明质酸溶液，放入300mL培养瓶中，加入实施例1所获得的干细胞10mL，搅拌混合8min，再加入50mL的8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入6孔板中，28℃静置20min，逐渐交联形成新型细胞培养基质材料，见图1。

实施例3：脐带血干细胞的分离与培养

在新生儿出生以后，取婴儿端3-8cm脐带储两把止血钳结扎、断脐，婴儿被抱走处理，贴近母端止血钳处消毒并将针头***脐静脉，采集脐带血，将其置入4℃的环境下800～1000rpm低速离心5-10min，弃上清后用0.125％Dispase Ⅱ酶冷消化10h、0.1％胰蛋白酶37℃消化30min,使用Ficoll-Hypaque将单个核细胞进行分离，洗涤后将其放入PBS/1％HSA中，获得脐带血干细胞，采用干细胞常规传代培养方法获得含大量脐带血干细胞的培养液，用于药物筛选，经800～1000rpm低速离心5-10min得大量脐带血干细胞，备用。

实施例4：不同大小的新型细胞培养基质材料的制备

将8g高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)用100mLPBS溶液溶解，形成8％水溶液。将1.2g巯基化透明质酸用200mLPBS溶液溶解，取100mL巯基化透明质酸溶液，放入300mL培养瓶中，加入实施例3所获得的干细胞10mL，搅拌混合8min，再加入50mL的8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入直径为6cm的培养皿中，30℃静置18min，逐渐交联形成立体细胞培养基质。

实施例5：利用立体培养细胞筛选药物

将实施例2所获得6孔板的新型细胞培养基质材料，向其中加入含有不同浓度绿原酸的低糖DMEM细胞培养液，在37℃的CO₂培养箱中培养，每隔2h后直接将培养的6孔板放入倒置显微镜中观察，确定各种药物在不同浓度下细胞生长状态，见图2、图3。根据显微镜观察的细胞生长状态确定各种药物的浓度，取200mL的0.6％巯基化透明质酸水溶液放入500mL培养瓶中，加入实施例2所获得的干细胞10mL，搅拌混合5min，100mL的8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入96孔板中，30℃静置15min，向96孔板中加入各种药物在37℃的CO₂培养箱中培养，每隔2h后直接将培养的96孔板放入倒置显微镜中观察，快速筛选各种药物的有效性和毒性。人表皮干细胞与复合材料培养3周，用Hochest33258进行荧光染色后。培养3周，用Hochest33258进行荧光染色，在400倍荧光显微镜下形态图表明细胞核疏松膨大，无固缩浓染，存活情况良好，见图6。

Claims (4)

1.本发明提供一种新型细胞培养基质材料的制备方法及其应用，其具体步骤包括：

(1)干细胞培养：通过各种途径获得的干细胞经常规细胞培养液在37℃下进行传代培养，800～1000rpm低速离心5-10min，收集干细胞备用；

(2)新型细胞培养基质材料的制备：将干细胞10mL放入300mL培养瓶中，再加入100mL的0.6％巯基化透明质酸水溶液，搅拌5-10min充分混合均匀后，再加入50mL的8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入2孔板或6孔板或49孔板或96孔板或直径为4～12cm培养皿中，28-32℃静置12-20min，得含有干细胞的立体化培养介质；

(3)与药物立体化共培养：向立体培养基质中加入含不同浓度药物的细胞培养液，在37℃的CO₂培养箱中培养；

(4)镜检观察细胞状态：与不同浓度的药物培养时，每隔2h后直接将培养的人表皮干细胞放入倒置显微镜中观察，确定各种药物在不同浓度下干细胞生长状态；

(5)筛选药物体系建立：根据显微镜观察的细胞生长状态确定各种药物的浓度，取200mL的0.6％巯基化透明质酸水溶液放入500mL培养瓶中，加入步骤(1)所获得的干细胞10mL，搅拌混合5-10min，100mL的8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入96孔板中，30℃静置15min，向96孔板中加入各种药物在37℃的CO₂培养箱中培养，每隔2h后直接将培养的96孔板放入倒置显微镜中观察，快速筛选各种药物的有效性和毒性。

2.根据权利要求1的方法，所述8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液和0.6％巯基化透明质酸水溶液，是指质量体积比，用8g高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯用100mLPBS溶液溶解得8％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，将1.2g巯基化透明质酸用200mLPBS溶液溶解得0.6％巯基化透明质酸水溶液，上述各种溶液是经过膜过滤除菌获得无菌溶液。

3.根据权利要求1的方法，所述PBS溶液是指氯化钠NaCl 0.2～0.6g、磷酸二氢钾KH₂PO₄0.02～0.08g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄0.1～0.4g、氯化钾KCl 0.005～0.05g、碳酸氢钠NaHCO₃0.1～0.4g用水配成100mL。

4.根据权利要求1的方法，所述药物是指小分子有机物、抗生素、多肽蛋白类药物等水溶性或脂溶性药物。