CN104761631A

CN104761631A - 多位点引入对硝基苯丙氨酸的人肿瘤坏死因子-α

Info

Publication number: CN104761631A
Application number: CN201510184139.0A
Authority: CN
Inventors: 高向东; 田浤; 陈斗; 姚文兵; 宋潇达
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2015-07-08

Abstract

本发明提供了一种人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)突变蛋白，并揭示其产生或增强针对机体内TNF-α分子的免疫反应的特点。利用遗传密码扩充技术，向hTNF-α中11位或/和87位定点引入非天然氨基酸对硝基苯丙氨酸(p-nitrophenylalanine，pNO₂Phe)，得到hTNF-α突变体蛋白。通过免疫动物，该突变体蛋白能够刺激机体产生交叉抗体，与疾病相关天然炎性因子TNF-α发生免疫反应，从而打破hTNF-α作为一种自体蛋白疫苗的免疫耐受。与原型hTNF-α和单点突变体相比，两位点突变体蛋白的免疫原性有所增强。该突变体蛋白可以作为治疗自身免疫疾病的候选分子。

Description

多位点引入对硝基苯丙氨酸的人肿瘤坏死因子-α

技术领域

本发明属于生物制药和免疫学领域，涉及一种含非天然氨基酸对硝基苯丙氨酸的hTNF-α突变体蛋白的制备，该蛋白能够打破自身免疫耐受，增强hTNF-α的免疫原性，刺激机体产生交叉抗体，成为治疗自身免疫疾病的候选疫苗分子。

背景技术

TNF-α是一种具有复杂生物学活性的细胞因子。但当TNF-α过量表达时，会与其它炎症因子一起引起病理损伤，如自身免疫性疾病、恶液质和感染性疾病等。因此，中和体内过量表达的TNF-α可治疗上述疾病。目前临床上使用的TNF-α拮抗剂有TNF-α单克隆抗体和TNF-α可溶性受体，但这些药物存在用药量大、易引起超敏反应和需长期反复使用等缺陷。疫苗只需少量注射就可以诱发产生抗体，可克服上述缺陷，因此TNF-α疫苗是治疗此类疾病的潜在途径。TNF-α是自体蛋白，存在自身免疫耐受现象，难以诱发相应抗体的形成。因此，如何突破免疫耐受，诱导免疫***产生针对TNF-α的抗体，是疫苗设计与开发中亟待解决的问题。

目前，自体疫苗构建中用于突破免疫耐受的策略主要有三类。融合蛋白疫苗：此类疫苗是通过将外源通用Th表位或能激活免疫***的蛋白与抗原分子融合表达构成的。疫苗分子构建的关键是：融合蛋白分子的合理构建和纯化，以使其可以保持合理的空间构象；具有生产过程简便、成本低的优点。蛋白偶联疫苗：将改构的抗原或筛选出的抗原表位与载体蛋白偶联，可构建蛋白偶联疫苗。此类疫苗无需免疫佐剂，且一个载体分子可以连接多个抗原表位。目前常用的偶联的载体分子有匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serus albumin，BSA)、病毒样颗粒(Virus like particles，VLPs)和破伤风类毒素等。核酸疫苗：携带抗原基因的细胞因子DNA可被机体细胞摄取，随后表达相应的抗原蛋白，这些蛋白被APC经MHC-I或MHC-II类分子途径提呈给CD8+T细胞或CD4+T细胞，诱导细胞免疫或体液免疫。

大量研究已经证实，通过化学修饰的方法引入具有免疫原性的化学基团，可以有效的突破自体蛋白的免疫耐受，诱导机体产生免疫反应。由于缺电子的π***趋于与对抗体结合位点常见的Tyr和Trp侧链相互作用，硝基芳基可作为高免疫原性半抗原。

应用遗传密码扩充技术可向蛋白质中定点引入非天然氨基酸。该项技术包括三个关键组分：(1)正交性氨酰-tRNA/RS；(2)正交性tRNA；(3)含特殊密码子UAG的mRNA。tRNA在正交性氨酰-tRNA合成酶的催化作用下加载非天然氨基酸，识别特殊密码子UAG，使非天然氨基酸***到该位点。该技术实现了蛋白质的定点修饰，以达到改变其生化性质及药理作用的目的。

Grunewald等人在US8318172B2中制备的mTNF-α或hTNF-α突变体蛋白，成功产生或增强了TNF-α的免疫原性。这些突变蛋白均为单个位点引入对硝基苯丙氨酸的突变体，本发明在此基础上，进一步改进了hTNF-α突变体，实现两个位点同时引入对硝基苯丙氨酸的hTNF-α的制备，通过免疫动物，该突变体蛋白能够刺激机体产生交叉抗体，与疾病相关天然炎性因子TNF-α发生免疫反应，从而打破hTNF-α作为一种自体蛋白疫苗的免疫耐受。与原型hTNF-α和单点突变体相比，其免疫原性均有所增强。该突变体蛋白可以作为治疗自身免疫疾病的候选分子。

发明内容

本发明选择TNF-α为靶分子，构建并表达了一种与之结构类似的hTNF-α突变体，谓之非天然免疫原，其可在被动免疫中作为疫苗，刺激机体产生一种TNF-α交叉抗体，从而与靶分子TNF-α结合，发生免疫反应，为自身免疫性疾病的治疗提供新的选择。

本发明解决的第一个问题是通过密码子优化技术，设计并构建能够在大肠杆菌中高效表达的不包含信号肽的hTNF-α及其突变体基因，突变体包括：a pNO₂Phe¹¹-hTNF-α，b pNO₂Phe⁸⁷-hTNF-α，cpNO₂Phe^11，87-hTNF-α，将其连接至原核表达载体pBAD/Myc-His A，得到hTNF-α及其突变体表达质粒。

本发明解决的第二个问题是将突变体hTNF-α表达质粒和正交性pNO₂Phe-tRNA/RS翻译***共转化入表达宿主菌DH10B。

本发明解决的第三个问题是，利用遗传密码扩充技术，实现定点引入非天然氨基酸。将含有突变体hTNF-α的表达质粒和pNO₂Phe-tRNA/RS翻译***的DH10B菌株在M9培养基中扩大培养，添加或不添加非天然氨基酸对硝基苯丙氨酸，经L-arabinose诱导表达20h后，收集菌体，超声破菌上清液经Ni柱纯化，并通过SDS-PAGE和WB鉴定。

本发明解决的第四个问题是，将非天然免疫原hTNF-α突变体注射给实验对象小鼠，刺激产生针对非天然免疫原的抗体，且两点突变体产生抗体滴度高于单点突变体或原型hTNF-α。

附图说明

图1 原型hTNF-α基因Overlap-PCR结果

M：250bp DNA Ladder；

1：原型hTNF-α基因Overlap-PCR

图2 原型hTNF-α双酶切电泳结果

M：250bp DNA Ladder；

1：原型hTNF-α基因双酶切(Nco I和BamH I)

图3 pBAD/Myc-His A双酶切电泳结果

1： pBAD/Myc-His A质粒；

2： pBAD/Myc-His A双酶切结果；

M： 250bp DNA Ladder

图4 pNO₂Phe¹¹-hTNF-α点突变结果

M： 250bp DNA Ladder；

1： pNO₂Phe¹¹-hTNF-α点突变质粒PCR扩增

图5 pNO₂Phe⁸⁷-hTNF-α点突变结果

M： 250bp DNA Ladder；

1： pNO₂Phe⁸⁷-hTNF-α点突变质粒PCR扩增

图6 pNO₂Phe^11，87-hTNF-α点突变结果

1： pNO₂Phe^11，87-hTNF-α点突变质粒PCR扩增；

M： 250bp DNA Ladder

图7 hTNF-α突变体表达Western Blot图

1： pNO₂Phe¹¹-hTNF-α不添加诱导剂；

2： pNO₂Phe¹¹-hTNF-α诱导表达样品；

3： pNO₂Phe^11，87-hTNF-α不添加诱导剂；

4： pNO₂Phe^11，87-hTNF-α诱导表达样品；

M：蛋白分子量预染Marker

图8 hTNF-α突变体纯化后SDS-PAGE图

M：蛋白分子量Marker；

1： pNO₂Phe⁸⁷-hTNF-α纯化后结果；

2： pNO₂Phe^11，87-hTNF-α纯化后结果

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐述本发明，这些实施实例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制。

现代免疫学的一个巨大挑战是找到一种方法来选择性诱导针对自体蛋白的强烈的免疫反应，或是增强外源抗原特异表位的免疫原性，从而产生中和抗体。针对该问题，一些策略是添加佐剂，向嵌合抗原中引入外源辅助肽或是使用DNA疫苗。尽管这些早期实验产生的抗原高度不均一，但化学修饰的免疫原表位确实能够诱导高滴度的交叉反应。并且，T细胞耐受能够被B细胞自体免疫所打破，即通过外源抗原发生交叉免疫反应。

相比于无选择性的化学法修饰蛋白，遗传密码扩充技术可以高度精确地对蛋白质特定位点进行修饰。其中苯丙氨酸的衍生物对硝基苯丙氨酸，可以利用琥珀抑制密码子高保真高效地引入大肠杆菌中表达的蛋白特定位点。硝基基团曾被用作高免疫原性的半抗原，因为它具有缺电子π系从而与Tyr和Trp侧链相互作用，而这两种氨基酸通常是抗体结合位点。正因如此，我们猜想将蛋白质的Phe或Tyr突变为pNO₂Phe，可能会引起免疫反应，从而与自体蛋白发生交叉反应。

我们选择hTNF-α主要因为以下原因：1.TNF-α是一种典型的参与感染、炎症、自身免疫现象的细胞因子；2.该蛋白的生物学特性研究已较深入，包括表达、结构、功能和信号传导机制。

87位Tyr在不同的哺乳动物TNF-α中是一个高度保守的位点，该位点的突变对于蛋白折叠和三级结构的形成没有影响，且会显著降低细胞毒性。

本实例中，非天然氨基酸pNO₂Phe被定点引入hTNF-α中，替代原来的Tyr87。用这种突变蛋白免疫小鼠，结果产生了较高滴度的中和抗体，它能与野生型TNF-α发生交叉反应。这些结果显示，含有特殊基团NO₂的自体蛋白，作为一种高免疫原性的分子，被免疫***识别。由于含NO₂基团的蛋白与天然蛋白具有高度相似的结构，修饰后蛋白所产生的抗体也会与相应的自体蛋白发生交叉反应。因此这种策略为打破自体蛋白和疫苗的免疫耐受提供了新的思路。

实施例一：hTNF-α及其突变体表达质粒的构建

1)原型hTNF-α基因的构建

Overlap PCR引物设计如下：

1 AGCATGCCATGGTGCGTAGCAG 22

2 CGACAACATGCGCCACCGGCTAATCCGACGGGGTACGCGAGCTGCTACGCACCATGGC 58

3 GGTGGCGCATGTTGTCGCGAATCCGCAAGCGGAAGGCCAACTTCAGTGGCTGAATCGT 58

4 CGCAGTTCCACGCCATTCGCCAGCAGCGCATTCGCACGACGATTCAGCCACTGAAGTT 58

5 AATGGCGTGGAACTGCGTGATAATCAGCTGGTGGTGCCGTCTGAAGGCCTGTATCTGA 58

6 TGGACAGCCCTGACCTTTGAACAGCACCTGGCTATAAATCAGATACAGGCCTTCAGAC 58

7 AAAGGTCAGGGCTGTCCAAGTACCCATGTGCTGCTGACCCATACCATTAGTCGTATTG 58

8 GCTAAGCAGATTCACTTTGGTCTGCTAGCTCACCGCAATACGACTAATGGTATGGGTC 58

9 GACCAAAGTGAATCTGCTTAGCGCGATTAAAAGCCCGTGCCAGCGTGAAACCCCGGAA 58

10 CCAAGATAAATCGGTTCATACCACGGTTTCGCTTCCGCACCTTCCGGGGTTTCACGCT 58

11 TGGTATGAACCGATTTATCTTGGCGGCGTGTTTCAGTTGGAAAAAGGCGATCGTTTGA 58

12 CGCAAAATCCAGATAATCCGGACGATTGATTTCTGCGCTCAAACGATCGCCTTTTTCC 58

13 CCGGATTATCTGGATTTTGCGGAAAGCGGCCAGGTCTATTTCGGCATTATTGCGCTGT 58

14 TGACGCGGATCCTGTTACAGCGCAATAATGCCGA 34

第一轮PCR体系：见表1。

表1 第一轮PCR体系

以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR，反应体系见表2。

表2 第二轮PCR体系

条件：

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化，备用。

目的基因及pBAD/Myc-His A载体双酶切，反应体系见表3。

酶切反应条件：37℃，4h以上。

表3 酶切体系

酶切产物连接，反应体系见表4。

连接反应条件：16℃，反应过夜。

表4连接体系

取全量连接子转化E.coli DH5α感受态；转化产物涂布氨苄青霉素抗性平板，37℃静置培养；筛选阳性克隆进行测序鉴定(南京金斯瑞生物科技有限公司)，正确的质粒记为hTNF-α-pBAD。向该重组载体的Nco I位点***His6-tag标签，方便后续的纯化操作。

2)pNO₂Phe¹¹-hTNF-α基因的构建

利用点突变试剂盒Mut Express^TM II Fast Mutagenesis Kit，以hTNF-α-pBAD为模板，将hTNF-α的11位Lys相应密码子突变为TAG，用于引入对硝基苯丙氨酸。突变引物设计如下：

hTNF11-s：5'-ATtagCCGGTGGCGCATGTTGTC-3’

hTNF11-a：5'-ATGCGCCACCGGctaATCCGACGGGGTACGCGA-3’

3)pNO₂Phe⁸⁷-hTNF-α基因的构建

利用点突变试剂盒Mut Express^TM II Fast Mutagenesis Kit，以hTNF-α-pBAD为模板，将hTNF-α的87位Tyr相应密码子突变为TAG，用于引入对硝基苯丙氨酸。突变引物设计如下：

hTNF87-s：5'-TGCGGTGAGCtagCAGACCAAAGTGAATCTGCTTAGCG-3’

hTNF87-a：5'-ACTTTGGTCTGctaGCTCACCGCAATACGACTAATGGTA-3’

4)pNO₂Phe^11，87-hTNF-α基因的构建

利用点突变试剂盒Mut Express^TM II Fast Mutagenesis Kit，以pNO₂Phe¹¹-hTNF-α-pBAD为模板，将其87位Tyr相应密码子突变为TAG，用于引入对硝基苯丙氨酸。突变引物同上hTNF87-s/a。

实施例二：hTNF-α及其突变体的表达

1)含hTNF-α突变体表达质粒的菌种的获得。

将pNO₂Phe¹¹-hTNF-α、pNO₂Phe⁸⁷-hTNF-α及pNO₂Phe^11，87-hTNF-α表达质粒(氨苄青霉素抗性)分别与pNO₂Phe-tRNA/RS质粒(氯霉素抗性)共转化入E.coli DH10B感受态细胞中，涂布氨苄青霉素和氯霉素双抗性平板，以筛选阳性克隆。

2)hTNF-α突变体的表达。

在LB培养基中过夜培养上述菌种的种子液，次日按1∶100扩培到添加非天然氨基酸pNO₂Phe的M9培养基(Na₂HPO₄·H₂O 0.35％(w/v)，KH₂PO₄0.34％(w/v)，NH₄Cl0.27％(w/v)，Na₂SO₄0.07％(w/v)，glycerol1.5％(v/v)，sodium succinate 0.57％(w/v)，0.1M CaCl₂solution 0.1％(v/v)，0.2M MgSO₄solution 0.5％(v/v))中，当OD₆₀₀达到0.6时，取样备用，并加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导表达，然后37℃继续培养20h，取样。8000rpm，10min离心收集菌体沉淀，-20℃保存。

3)hTNF-α突变体表达情况的检测。

前述所取样品通过Western Blot检测蛋白表达情况，一抗为小鼠抗His单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗小鼠单克隆抗体，结果如图7。

实施例三：hTNF-α及其突变体的纯化

1)样品预处理。

所得菌体沉淀按1∶10(m/v)的比例加入Ni-NTA结合缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mMimidazole，pH 8.0)重悬，利用超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)破菌，超声条件为功率60％，总时间15min，3次，每次5s，间隔5s。破菌后进行12000rpm，30min离心收集上清液，并使用0.45μm滤膜过滤。

2)亲和层析柱Ni Sepharose 6Fast Flow纯化。

Ni柱预先用结合缓冲液平衡，上样后，依次用10倍柱体积的结合缓冲液洗脱未结合的杂蛋白，6倍柱体积的漂洗缓冲液(含有50mM imidazole的结合缓冲液)洗脱弱结合的杂蛋白，6倍柱体积的洗脱缓冲液(含有500mM imidazole的结合缓冲液)洗脱目的蛋白。收集最终的纯化样品，利用SDS-PAGE检测(结果如图8)。

Claims

1.一种新型人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)突变蛋白，即定点引入对硝基苯丙氨酸(p-nitrophenylalanine，pNO₂Phe)的hTNF-α突变蛋白。

2.权利要求1所述的hTNF-α突变蛋白，其特征为：第11位或/和第87位突变为对硝基苯丙氨酸：apNO₂Phe¹¹-hTNF-α，b pNO₂Phe⁸⁷-hTNF-α，c pNO₂Phe^11，87-hTNF-α；分别具有氨基酸序列SEQ ID.2，SEQ ID.4，SEQ ID.6；非天然氨基酸残基pNO₂Phe的编号是依据成熟的hTNF-α多肽命名的。

3.编码hTNFα突变体蛋白的基因，分别具有如SEQ ID.1，SEQ ID.3，SEQ ID.5所示基因序列。

4.权利要求1所述的hTNFα突变体蛋白用于增强针对天然TNFα的免疫反应的方法，即：向实验对象体内注射突变体蛋白后，机体产生针对天然TNFα的抗体，该抗体能与机体内天然hTNF-α发生交叉反应，从而产生或增强针对hTNF-α的免疫反应。