CN104745519A - 一种筛选异化铁还原细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选异化铁还原细菌的方法，包括：(1)利用逐步提高液体培养基中Fe(Ⅲ)浓度的方式对沉积物污泥进行富集培养；(2)从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌，以及重金属耐受能力和耐盐能力的梯度驯化步骤。所述异化铁还原细菌的筛选方法简便易行且筛选周期短，筛选过程中无需厌氧操作***等昂贵的分离设备，有效降低了筛选成本，获得的纯化菌株具有较强的Fe(Ⅲ)还原能力。另外，通过对纯化菌株的重金属耐受能力和耐盐能力的梯度驯化能够快速、简便地获得对Cr(Ⅵ)重金属以及不同盐浓度环境具有耐受能力的异化铁还原菌株，为重金属、盐域等环境下的生物修复提供种质资源。

Description

一种筛选异化铁还原细菌的方法
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种筛选异化铁还原细菌的方法。
背景技术
铁是一种变价金属，铁的生物氧化还原涉及多种元素的生物地球化学循环。以Fe(Ⅲ)和Fe(Ⅱ)为主导的铁循环过程是调控重金属迁移转化的关键因子之一，而微生物介导的异化铁还原过程能够同时实现有机污染物在厌氧条件下的氧化分解。因此，微生物介导铁还原过程在生态环境及生物修复中具有重要作用。
由于现代工业的快速发展，环境中有机污染物逐步的累积，导致许多被污染的环境提供了一种厌氧或缺氧的条件。而在厌氧环境下，Fe(Ⅲ)成为了有机物氧化最重要的电子受体。异化铁还原细菌不是一个分类学上的概念，它实际上是具有Fe(Ⅲ)还原功能的一类微生物的总称。具有异化铁还原能力的微生物在细菌和古细菌域中都有发现(Lee and Newman,Microbial iron respiration:impacts on corrosion processes.Applied and EnvironmentalMicrobiology,2003,62:134-138)。迄今为止，已经在细菌域的9个门，15个纲，27个目，37个科，65个属及古细菌域2个门，5个纲，7个目，7个科，10个属中发现有异化铁还原微生物的分布，表1是有关沉积物中部分异化铁还原微生物及其来源(Lovley,Bioremediation of organicand metal contaminants withdissimilatory metalreduction.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,1995,14:85-93)。
表1部分沉积物中异化铁还原细菌及其来源
异化铁还原细菌在污染环境修复中具有较明显优势：(1)转移重金属，除了Fe(Ⅲ)外，异化铁还原细菌还可以利用其它金属如：Mn(Ⅳ)、U(Ⅵ)和Cr(Ⅵ)作为电子受体，有效还原有害重金属，降低毒性；(2)分解有机物，铁氧化物在生态***中的含量十分丰富，在无定形铁氧化物含量更丰富的深海区域，异化铁还原对有机物分解的贡献可达75％；(3)降解有机污染物，异化铁还原细菌能够利用许多有机污染物，如苯和芳香族化合物作为电子供体。
微生物介导的异化铁还原过程在厌氧或兼性厌氧条件下能够充分进行，因此筛选具有厌氧性质的异化铁还原细菌是研究者们形成的共识。然而，常规的厌氧操作***分离方法不仅设备昂贵，而且筛选周期长，阻碍了异化铁还原细菌的筛选工作的进程。因此，提供一种廉价、实用且筛选周期短的异化铁还原微生物的筛选方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选异化铁还原细菌的方法，该筛选方法具有简便、快速且成本低的特点，通过该筛选方法能够快速筛选到异化铁还原细菌，为利用微生物异化铁还原过程治理重金属污染提供种质资源。
本发明的技术方案中异化铁还原细菌的筛选方法包括如下步骤：
(1)利用逐步提高液体培养基中Fe(Ⅲ)浓度的方式对沉积物污泥进行富集培养；
(2)从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌；
所述步骤(1)中对沉积物污泥进行富集培养的方法可以为本领域现有的任何方法，优选逐渐提高培养基中Fe(Ⅲ)浓度的方式进行富集培养；用于接种的所述沉积物污泥可选取本领域常用的厌氧环境下的沉积物污泥，优选各种水域中的沉积物底泥。具体方法如下：将污泥样品加入含Fe(Ⅲ)的液体培养基中，充氮气厌氧培养，液体培养基中Fe(Ⅲ)的初始浓度为5～10mmol/L，培养过程中将Fe(Ⅲ)还原能力较强的菌群逐步转接至Fe(Ⅲ)浓度更高的液体培养基中，每次转接将Fe(Ⅲ)的浓度提高5～10mmol/L，直至提高到50mmol/L。所述Fe(Ⅲ)还原能力较强的菌群是指在每次提高Fe(Ⅲ)浓度后，经过一段时间的培养，能够使液体培养基中OD600值≥0.500且Fe(Ⅱ)浓度≥1mmol/L的菌群。本领域的技术人员应当了解，液体培养基的OD600值反映了细菌的生长状态，通常情况下，当OD600值处于0.300～0.600之间时，OD600值越高表明细菌生长状态越好，细胞密度越大，处于该状态下的菌群或菌株适于进行分解代谢能力的比较；当OD600值低于0.300时，表明细菌的生长状态较差，缺乏对相应环境的耐受能力。因此，本步骤以及后续所有步骤中对Fe(Ⅱ)和Cr(Ⅵ)浓度的测定均选择液体培养基中OD600值≥0.500的菌群或菌株，为了便于比较，测定前统一调整液体培养基的OD600值至0.500±0.02。
所述步骤(2)从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌的方法如下：采用平板划线法对由步骤(1)获得的具有较明显的铁还原能力的菌群进行分离纯化。具体过程如下：将经过步骤(1)富集培养后的泥浆悬液离心，取上清菌液稀释后划线接种于含Fe(Ⅲ)(浓度为10～50mmol/L)的固体培养基上，待菌液完全被固体培养基吸收后再倾倒一层相同的固体培养基以保证菌液与空气隔绝，待上层的固体培养基凝固后，再倾倒一层液体石蜡加以封盖，以确保菌落的厌氧培养环境；将此三层平板培养24～72h后挑取单菌落，接种于含Fe(Ⅲ)(浓度为10～50mmol/L)的液体培养基中，充氮气厌氧培养24～72h后测定液体培养基中Fe(Ⅱ)的浓度，选取积累Fe(Ⅱ)浓度最高的菌株，再次接种于所述三层平板中进行培养和分离，重复上述过程，直至获得纯化菌株。
由于在工业废水等污染较为严重的水环境中往往含有大量的重金属离子和较高的盐度，为了使异化铁还原细菌能够在上述极端环境下存活且保持较强的异化铁还原能力，本发明所述异化铁还原细菌的筛选方法还可包括后续进行的重金属及高盐度耐受能力的梯度驯化步骤，以获得对环境适应能力更强、应用性能更好的菌株。
本发明技术方案采用逐步提高培养基中Cr(Ⅵ)的浓度进行异化铁还原细菌重金属耐受能力的梯度驯化。具体方法如下：将步骤(2)获得的纯化菌株接种于含Fe(Ⅲ)(浓度为10～50mmol/L)的液体培养基中，充氮气厌氧培养。培养过程中将重金属耐受能力及Fe(Ⅲ)还原能力较强的菌株逐步转接至Cr(Ⅵ)浓度更高的液体培养基中，所述液体培养基中Cr(Ⅵ)的最高浓度不超过2.5mmol/L，Fe(Ⅲ)的浓度保持不变。所述重金属耐受能力及Fe(Ⅲ)还原能力较强的菌株是指每次提高Cr(Ⅵ)浓度后，经过一段时间的培养，能够使液体培养基中OD600值≥0.500且Fe(Ⅱ)浓度≥1mmol/L的菌株。
为了使异化铁还原细菌能够在较高盐浓度的环境下存活且保持较强的异化铁还原能力，本发明技术方案采用逐步提高培养基中盐浓度的方法对由所述步骤(2)获得的菌株进行高盐度耐受能力的梯度驯化，具体方法如下：将步骤(2)获得的纯化菌株接种于含Fe(Ⅲ)(浓度为10～50mmol/L)的液体培养基中充氮气厌氧培养。培养过程中将耐盐能力及Fe(Ⅲ)还原能力较强菌株逐步转接至NaCl浓度更高的液体培养基中，所述液体培养基中NaCl的最高浓度不超过60g/L，Fe(Ⅲ)的浓度保持不变。所述耐盐能力及Fe(Ⅲ)还原能力较强菌株是指每次提高NaCl浓度后，经过一段时间的培养，能够使液体培养基中OD600值≥0.500且Fe(Ⅱ)浓度≥1mmol/L的菌株。
本发明技术方案各步骤(包括所述步骤(1)、步骤(2)以及重金属和高盐度耐受能力的梯度驯化步骤)所使用的所述含Fe(Ⅲ)的液体培养基为加入了Fe(Ⅲ)，且含有微生物生长必需营养物质(包括碳源、氮源、能源、生长因子以及无机盐等)的普通液体培养基，优选柠檬酸铁液体培养基；所述步骤(2)中使用的含Fe(Ⅲ)的固体培养基为加入了Fe(Ⅲ)，且含有微生物生长必需营养物质普通固体培养基，优选柠檬酸铁固体培养基。上述所有培养基的酸碱度均保持在：pH6.0～9.0，相应的培养温度均为：20～40℃。
针对取自海洋等盐域环境中的沉积物污泥，所述步骤(1)、步骤(2)以及重金属耐受能力的梯度驯化步骤中所使用的培养基中还添加有NaCl，NaCl的浓度与沉积物污泥所处自然环境中的盐浓度基本一致。相应地，本领域的技术人员应当理解，在对海洋等盐域环境来源的菌株进行高盐度耐受能力的梯度驯化时，培养基中NaCl浓度的提高是在菌株原有的盐度耐受能力基础上进行的。
所述充氮气厌氧培养的具体方法为：将液体培养基置于培养容器中，通入氮气使培养容器内的空气完全排出，之后密封容器进行培养。
采用本发明所述异化铁还原细菌的筛选方法简便易行且筛选周期短，筛选过程中无需厌氧操作***等昂贵的分离设备，有效降低了筛选成本，获得的纯化菌株具有较强的Fe(Ⅲ)还原能力。另外，通过对纯化菌株的重金属和高盐度耐受能力的梯度驯化能够快速、简便地获得对Cr(Ⅵ)重金属以及不同盐浓度环境具有耐受能力的异化铁还原菌株，为重金属、盐域等环境下的生物修复提供种质资源。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述异化铁还原细菌的筛选方法以及筛选后进一步的重金属和高盐度耐受能力的梯度驯化方法进行详细说明。
实施例1
(1)利用逐步提高液体培养基中Fe(Ⅲ)浓度的方式对沉积物污泥进行富集培养：用于接种的沉积物污泥选自淡水河流底泥。接种时，将适量泥样加入Fe(Ⅲ)初始浓度为10mmol/L的柠檬酸铁液体培养基中，于血清瓶中充氮气厌氧培养，厌氧培养前，向培养基中充氮气至血清瓶内空气完全排出后再进行密封培养,培养48h后，测定液体培养基中OD600值和Fe(Ⅱ)浓度，选择OD600值≥0.500且Fe(Ⅱ)浓度≥1mmol/L的液体培养基，将其中的上清菌液按1％的接种量转接至Fe(Ⅲ)浓度为20mmol/L的柠檬酸铁液体培养基中,培养48h后选择OD600值≥0.500且Fe(Ⅱ)浓度≥1mmol/L的液体培养基中的上清菌液，再次转接至Fe(Ⅲ)浓度为30mmol/L的柠檬酸铁液体培养基中，重复上述操作，每次操作使培养基中的Fe(Ⅲ)浓度提高10mmol/L，直至提高到50mmol/L。富集过程中培养条件为：pH7.0，温度26℃。富集培养结束后测得培养基中Fe(Ⅱ)的浓度为12mmol/L，表明泥样内菌群具有较明显的铁还原能力。
(2)从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌：将经过步骤(1)富集培养后的泥浆悬液于1000rpm离心5min，取上清菌液稀释100倍，之后取100μL稀释后的菌液划线接种于Fe(Ⅲ)浓度为50mmol/L的固体培养基上，待菌液完全被固体培养基吸收后再倾倒一层相同的固体培养基以保证菌液与空气隔绝，待上层的固体培养基凝固后，再倾倒一层液体石蜡加以封盖，以确保菌落的厌氧培养环境；将此三层平板培养48h，培养条件为pH7.0，温度26℃；之后挑取单菌落，接种于Fe(Ⅲ)浓度为50mmol/L的液体培养基中，于血清瓶中厌氧培养24h，培养条件为pH7.0，温度26℃；培养结束后测定液体培养基中Fe(Ⅱ)的浓度，选取Fe(Ⅱ)浓度最高的液体培养基，将其中的菌液再次接种于所述三层平板中进行培养和分离，重复此过程5次，获得纯化菌株，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到18.5mmol/L。
重金属耐受能力的梯度驯化：将步骤(2)获得的菌株按1％的接种量接种于含Fe(Ⅲ)(浓度为50mmol/L)的液体培养基，于血清瓶中厌氧培养。培养24h后将菌株按1％的接种量转接到Cr(Ⅵ)浓度为0.5mmol/L的液体培养基中，培养一周后测定培养基中OD600值和Fe(Ⅱ)的浓度，选取OD600值≥0.500、Fe(Ⅱ)浓度≥10mmol/L的培养基，将其中的菌株按1％的接种量转接到Cr(Ⅵ)浓度为1.0mmol/L的液体培养基中，重复上述操作，每次操作使培养基中Cr(Ⅵ)浓度提高0.5mmol/L，直至Cr(Ⅵ)浓度提高至2.0mmol/L。通过上述梯度驯化获得的菌株能够耐受的Cr(Ⅵ)的浓度达到1.5mmol/L，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到6.7mmol/L。本步骤中用于添加Cr(Ⅵ)的液体培养基也均为含Fe(Ⅲ)(浓度为50mmol/L)的液体培养基，培养条件均为：pH7.0，温度26℃。
高盐度耐受能力的梯度驯化：将步骤(2)获得的纯化菌株按1％的接种量接种于含Fe(Ⅲ)(浓度为50mmol/L)的液体培养基中，于血清瓶中厌氧培养。初始培养时，培养基中不添加NaCl，培养一周后，将菌株按1％的接种量转接到NaCl浓度为5g/L的液体培养基中，培养一周后测定培养基OD600值和Fe(Ⅱ)的浓度，选取OD600值≥0.500且Fe(Ⅱ)浓度≥10mmol/L的培养基，将其中的菌株按1％的接种量转接到NaCl浓度为10g/L的液体培养基中，重复上述操作，每次操作使液体培养基中NaCl浓度提高5g/L，直至NaCl浓度提高至20g/L。通过上述梯度驯化获得的菌株耐受NaCl浓度达到20g/L，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到9.8mmol/L。本步骤中用于添加NaCl的液体培养基也均为含Fe(Ⅲ)(浓度为50mmol/L)的液体培养基，培养条件均为：pH7.0，温度26℃。
实施例2
(1)利用逐步提高液体培养基中Fe(Ⅲ)浓度的方式对沉积物污泥进行富集培养：用于接种的沉积物污泥选自海洋近岸的潮间带底泥。除富集培养条件外，本步骤与实施例1步骤(1)中对淡水河流底泥的富集培养方式完全相同，本步骤中富集培养条件为：pH8.0，温度35℃，NaCl浓度为25g/L。富集培养结束后测得培养基中Fe(Ⅱ)的浓度为5.5mmol/L，表明泥样内菌群具有较明显的铁还原能力。
(2)从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌：本步骤与实施例1步骤(2)中分离纯化异化铁还原细菌的方式基本相同，不同之处在于本步骤中所采用的固体培养基和液体培养基中Fe(Ⅲ)的浓度均为10mmol/L，在三层平板和液体培养基中的培时间均为48h，相应培养条件均为pH8.0，温度35℃，NaCl浓度为25g/L。反复经过6次培养和分离，获得纯化菌株，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到8.2mmol/L。
重金属耐受能力的梯度驯化：将步骤(2)获得的菌株按1％的接种量接种于Fe(Ⅲ)浓度为10mmol/L的液体培养基，于血清瓶中厌氧培养24h后将菌株按1％的接种量转接到Cr(Ⅵ)浓度为0.5mmol/L的液体培养基中，培养一周后测定培养基中OD600值和Fe(Ⅱ)的浓度，选取OD600值≥0.500、Fe(Ⅱ)浓度≥2mmol/L的液体培养基，将其中的菌株按1％的接种量转接到Cr(Ⅵ)浓度为1.0mmol/L的液体培养基中，重复上述操作，每次操作使培养基中Cr(Ⅵ)浓度提高0.5mmol/L，直至Cr(Ⅵ)浓度提高至2.5mmol/L。通过上述梯度驯化获得的菌株能够耐受的Cr(Ⅵ)的浓度达到2.0mmol/L，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到3.6mmol/L。本步骤中用于添加Cr(Ⅵ)的液体培养基也均为含Fe(Ⅲ)(浓度为10mmol/L)的液体培养基，培养条件均为：pH8.0，温度35℃，NaCl浓度为25g/L。
高盐度耐受能力的梯度驯化：将步骤(2)获得的纯化菌株按1％的接种量接种于含Fe(Ⅲ)(浓度为50mmol/L)的液体培养基中，于血清瓶中厌氧培养。培养基中NaCl的初始浓度为25g/L，培养一周后，将菌株按1％的接种量转接到NaCl浓度为30g/L的液体培养基中，培养一周后测定培养基OD600值和Fe(Ⅱ)的浓度，选取OD600值≥0.500且Fe(Ⅱ)浓度≥2mmol/L的培养基，将其中的菌株按1％的接种量转接到NaCl浓度为35g/L的液体培养基中，重复上述操作，每次操作使液体培养基中NaCl浓度提高5g/L，直至NaCl浓度提高至60g/L。通过上述梯度驯化获得的菌株耐受NaCl浓度达到60g/L，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到2.6mmol/L。本步骤中用于添加NaCl的液体培养基也均为含Fe(Ⅲ)(浓度为10mmol/L)的液体培养基，培养条件均为：pH8.0，温度35℃。
实施例3
(1)利用逐步提高液体培养基中Fe(Ⅲ)浓度的方式对沉积物污泥进行富集培养：用于接种的沉积物污泥选自海洋沉积物底泥。除富集培养条件外，本步骤与实施例1步骤(1)中对淡水河流底泥的富集培养方式完全相同，本步骤中富集培养条件为：pH8.0，温度21℃，NaCl浓度为30g/L。富集培养结束后测得培养基中Fe(Ⅱ)的浓度为6mmol/L。，表明泥样内菌群具有较明显的铁还原能力。
(2)从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌：本步骤与实施例1步骤(2)中分离纯化异化铁还原细菌的方式基本相同，不同之处在于本步骤中所采用的固体培养基和液体培养基中Fe(Ⅲ)的浓度均为30mmol/L，在三层平板和液体培养基中的培时间均为48h，相应培养条件均为：pH8.0，温度21℃，NaCl浓度为30g/L。反复经过5次培养和分离，获得纯化菌株，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到24.3mmol/L。
重金属耐受能力的梯度驯化：将步骤(2)获得的菌株按1％的接种量接种于Fe(Ⅲ)浓度为30mmol/L的液体培养基中，于血清瓶中厌氧培养24h后将菌株按1％的接种量转接到Cr(Ⅵ)浓度为0.5mmol/L的液体培养基中，培养一周后测定培养基中OD600值和Fe(Ⅱ)的浓度，选取OD600值≥0.500、Fe(Ⅱ)浓度≥5mmol/L的液体培养基，将其中的菌株按1％的接种量转接到Cr(Ⅵ)浓度为1.0mmol/L的液体培养基中，重复上述操作，每次操作使培养基中Cr(Ⅵ)浓度提高0.5mmol/L，直至Cr(Ⅵ)浓度提高至2.5mmol/L。通过上述梯度驯化获得的菌株能够耐受的Cr(Ⅵ)的浓度达到2.0mmol/L，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到23.5mmol/L。本步骤中用于添加Cr(Ⅵ)的液体培养基也均为含Fe(Ⅲ)(浓度为10mmol/L)的液体培养基，培养条件均为：pH8.0，温度21℃，NaCl浓度为30g/L。
高盐度耐受能力的梯度驯化：将步骤(2)获得的纯化菌株按1％的接种量接种于Fe(Ⅲ)浓度为30mmol/L的液体培养基中，于血清瓶中厌氧培养。初始培养时，培养基中NaCl的初始浓度为30g/L，培养一周后，将菌株按1％的接种量转接到NaCl浓度为35g/L的液体培养基中，培养一周后测定培养基OD600值和Fe(Ⅱ)的浓度，选取OD600值≥0.500且Fe(Ⅱ)浓度≥5mmol/L的培养基，将其中的菌株按1％的接种量转接到NaCl浓度为40g/L的液体培养基中，重复上述操作，每次操作使液体培养基中NaCl浓度提高5g/L，直至NaCl浓度提高至60g/L。通过上述梯度驯化获得的菌株耐受NaCl浓度达到60g/L，相应地，测得液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度达到11.5mmol/L。本步骤中用于添加NaCl的液体培养基也均为含Fe(Ⅲ)(浓度为10mmol/L)的液体培养基，培养条件均为：pH8.0，温度21℃。

Claims (4)

1.一种筛选异化铁还原细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)利用逐步提高液体培养基中Fe(Ⅲ)浓度的方式对沉积物污泥进行富集培养：将污泥样品加入含Fe(Ⅲ)的液体培养基中，充氮气厌氧培养，所述液体培养基中Fe(Ⅲ)的初始浓度为5～10mmol/L，培养过程中将Fe(Ⅲ)还原能力较强的菌群逐步转接至Fe(Ⅲ)浓度更高的液体培养基中，每次转接将Fe(Ⅲ)的浓度提高5～10mmol/L，直至提高到50mmol/L；
(2)从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌：将经过步骤(1)富集培养后的泥浆悬液离心，取上清菌液稀释后划线接种于Fe(Ⅲ)浓度为10～50mmol/L的固体培养基上，待菌液完全被固体培养基吸收后再倾倒一层相同的固体培养基，待上层的固体培养基凝固后，再倾倒一层液体石蜡加以封盖；将此三层平板培养24～72h后挑取单菌落，接种于Fe(Ⅲ)浓度为10～50mmol/L的液体培养基中，充氮气厌氧培养24～72h后测定液体培养基中Fe(Ⅱ)浓度，选取积累Fe(Ⅱ)浓度最高的菌株，再次接种于所述三层平板中进行培养和分离，重复上述过程，直至获得纯化菌株；
所述步骤(1)、(2)中培养基的酸碱度均保持在：pH6.0～9.0；对应的培养温度均为：20～40℃。
2.根据权利要求1所述的筛选异化铁还原细菌的方法，其特征在于：在所述步骤(2)之后还包括重金属耐受能力或高盐度耐受能力的梯度驯化步骤；所述重金属耐受能力的梯度驯化步骤采取如下方法：将步骤(2)获得的纯化菌株接种于Fe(Ⅲ)浓度为10～50mmol/L的液体培养基中，充氮气厌氧培养；培养过程中将重金属耐受能力及Fe(Ⅲ)还原能力较强的菌株逐步转接至Cr(Ⅵ)浓度更高的液体培养基中，液体培养基中Cr(Ⅵ)的最高浓度不超过2.5mmol/L，Fe(Ⅲ)的浓度保持不变，培养基酸碱度均保持在：pH6.0～9.0；对应的培养温度均为：20～40℃；
所述高盐度耐受能力的梯度驯化步骤采取如下方法：将步骤(2)获得的纯化菌株接种于Fe(Ⅲ)浓度为10～50mmol/L的液体培养基中充氮气厌氧培养，培养过程中将耐盐能力及Fe(Ⅲ)还原能力较强菌株逐步转接至NaCl浓度更高的液体培养基中，液体培养基中NaCl的最高浓度不超过60g/L，Fe(Ⅲ)的浓度保持不变，培养基酸碱度均保持在：pH6.0～9.0；对应的培养温度均为：20～40℃。
3.根据权利要求1或2所述的筛选异化铁还原细菌的方法，其特征在于：在所述步骤(1)、(2)、重金属耐受能力以及高盐度耐受能力的梯度驯化步骤中使用的含Fe(Ⅲ)的液体培养基为柠檬酸铁培养基；所述步骤(2)中使用的含Fe(Ⅲ)的固体培养基为柠檬酸铁固体培养基。
4.根据权利要求1或2所述的筛选异化铁还原细菌的方法，其特征在于：在所述步骤(1)、(2)、重金属耐受能力以及高盐度耐受能力的梯度驯化步骤中，充氮气厌氧培养的方法为：将液体培养基置于培养容器中，通入氮气使培养容器内的空气完全排出，之后密封容器进行培养。
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