CN104745510A - 一种发酵乳杆菌及其在植物真菌病害防治中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵乳杆菌及其在植物真菌病害防治中的应用，属于生防制剂领域。该菌菌株是从番茄下种植的土壤中分离得到，其分类命名为发酵乳杆菌，菌种的拉丁学名是：Lactobacillus fermentum，参据的微生物：NJHYHWGY20130877，保藏日期是2014年01月17日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.8735。发酵乳杆菌经发酵培养得到发酵液，然后将发酵液浓缩制备得乳酸菌素浓缩液，再将其稀释喷洒于农作物叶面；该菌株在抑制农作物真菌病害方面效果良好，同时具有促进农作物生长的功能，符合生态农业要求。
Description
技术领域
本发明属于生防制剂领域，具体涉及一种乳酸菌及其在植物真菌病害防治中的应用。
技术背景
当今社会，农业可持续发展已成为世界大多数国家主导潮流。农业问题作为经济社会发展首要问题，已提上各国议程。中国作为一个农业大国，农业安全生产事关国计民生与社会和谐稳定。大量使用化肥、农药等农用化学品虽然可以使农产品大幅度增产,但也带来了诸多不利影响。针对这个问题，我国相继出现了绿色生态友好的生物农药，与传统农用化学品相比，具有毒性低、选择性强、高效、低残留、易分解等优点。主要包括昆虫天敌、植物源农药、微生物农药、转基因生物、生物化学农药及抗生素农药。
乳杆菌又称乳酸杆菌，是乳酸菌的一属。细胞通常呈规则长杆状，0.5～1.2μm×1.0～10.0μm，有时为球状，成短链。革兰氏阳性，不生孢，细胞罕见以周生鞭毛运动。兼性厌氧，有时微好氧，营养琼脂上菌落凸起、全缘、无色，直径2～5mm。化能异养菌，需要营养丰富的培养基。发酵分解糖代谢，终产物中50％以上为乳酸。不发酵乳酸盐，不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性，罕见致病。最适温度30～40℃，耐酸性强，最适pH5.5～6.0，pH3.0～4.5条件下仍能生存。
乳酸菌广泛分布于环境中，特别是动物、蔬菜和食品中，通常栖息于鸟和脊椎动物的消化道，以及哺乳动物的尿道中。在植物体表、土壤、乳制品、肉制品、啤酒、葡萄酒、果汁、麦芽汁、污水以及人畜粪便中，均可分离到。由于乳酸菌在发酵代谢中可产生大量抑菌物质，包括有机酸、酶类、乳酸菌素、过氧化氢、二氧化碳、双乙酰等，因此能有效抑制腐败菌和致病菌的生长，并具有促生长作用。此外，乳酸菌具有丰富的物种多样性，不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，而且在农牧业、工业、食品和医药等领域具有极高的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提出一株发酵乳杆菌，本发明的另一目的是提供上述的发酵方法，本发明还有一目的是提供发酵乳杆菌在植物真菌病害抑制方面的应用。
本发明的技术方案如为：一株乳酸菌，其分类命名为发酵乳杆菌，菌种的拉丁学名是：Lactobacillus fermentum，参据的微生物：NJHYHWGY20130877，保藏日期是2014年01月17日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.8735。
本发明还提供了上述发酵乳杆菌的发酵方法，其具体步骤如下：将发酵乳杆菌CGMCC No.8735接种于固体培养基中，30～40℃培养12～24h；在固体培养基中选取一个菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，控制转速为100～180r/min，30～40℃条件下培养10～22h得发酵乳杆菌种子液；取种子液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，控制转速为120～160r/min，30～40℃条件下培养24～36h得发酵液。
优选上述固体培养基的组分为：蛋白胨9～11g/L，牛肉膏9～11g/L，酵母膏4.5～5.5g/L，柠檬酸氢二钠1.5～2.5g/L，葡萄糖18～22g/L，乙酸钠4.5～5.5g/L，磷酸氢二钾1.5～2.5g/L，硫酸镁0.5～0.6g/L，硫酸锰0.2～0.3g/L，琼脂15～25g/L。
优选上述种子液培养基的组分为：蛋白胨9～12g/L，牛肉膏8～12g/L，酵母膏4～6g/L，葡萄糖16～24g/L，柠檬酸氢二钠1.5～2.5g/L，乙酸钠4～6g/L，磷酸氢二钾1.5～2.5g/L，硫酸镁0.5～0.6g/L，硫酸锰0.2～0.3g/L。
优选上述发酵培养基的组分为：蔗糖20～30g/L，酵母膏15～25g/L，KCl0.6～1.0g/L，柠檬酸氢二钠1.5～2.5g/L，乙酸钠4～6g/L，磷酸氢二钾1.5～2.5g/L，pH 5.5～6.5。
优选上述种子液培养基的装液量为种子液培养基体积占锥形瓶容量的16～40％；发酵培养基的装液量为发酵培养基体积占锥形瓶容量的16～40％，种子液与发酵培养基的体积比为1：(10～100)。
本发明还提供了上述发酵乳杆菌在植物真菌病害防治中的应用，其中植物真菌病害菌株优选棉花黄萎病、番茄灰霉病或水稻纹枯病；其应用方法为制备乳酸菌素浓缩液，将所述乳酸菌素浓缩液稀释1000～1500倍，喷洒于农作物叶面；
其中，所述乳酸菌素浓缩液制备方法具体步骤为，将上述发酵所得发酵液在8000～12000r/min条件下，离心20～40min，弃去下层菌泥，得发酵上清液备用；将发酵上清液在真空条件下浓缩得到浓缩液，其中体积浓缩倍数为10～20倍；向浓缩液中加入硫酸铵溶液，漩涡震荡1～2h，其中溶液中硫酸铵质量饱和度为40～50％；18000～20000r/min条件下离心25～40min，去除上清液，取下层沉淀溶于pH为4.0～5.0的柠檬酸缓冲液中，得到乳酸菌素的浓缩液，其中沉淀与柠檬酸缓冲液的比例为1：(100～1000)。
所述抑菌验证为，采用牛津杯法测乳酸菌素浓缩液抑制病原菌的抑菌直径，计算抑菌率；用接种环挑取病原菌菌丝体于离心管中，漩涡震荡破碎得病原菌菌丝体液，移取菌丝体液，均匀涂布于PDA培养基上，其中平板规格为，直径90mm，高16mm；在含病原菌的平板上等距离放置牛津杯4个，静置5～10min后，向每个牛津杯中加入100～200μL乳酸菌素浓缩液，其中牛津杯规格为，内径6.0±0.1mm，外径8.0±0.1mm，高10.0±0.1mm；28℃培养24h后测抑菌圈直径。计算病原菌抑制率，其中抑菌率计算公式为：
病原菌生长抑制率(％)＝(抑菌圈直径－杯碟直径)/(对照菌落直径－杯碟直径)×100％
上述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum参据的微生物：NJHYHWGY20130877，是由实验组从种植番茄的土壤中分离得到。
CGMCC No.8735菌株具有下述性质：
1、形态与培养特征
在MRS培养基上培养，菌落扁平、圆形或不规则到粗糙，常常透明、无色素；革兰氏阳性菌，杆状，不产芽孢，大小为0.4～1.0×2.5～3.0μm，成对或成链，不运动；异型发酵，从葡萄糖产酸产气；发酵乳杆菌兼性厌氧，其菌体生长及代谢产物生成都要合适条件：生长温度为15～45℃，最适温度为34～40℃，喜偏酸性，pH5.5～7.0，最适pH 6.0～6.8。
2、生理生化特征：
发酵乳杆菌CGMCC No.8735菌株的主要生理生化特征见表1：
表1 菌株的生理生化特征
注：+：阳性或生长；—：阴性或不生长
有益效果：
本发明公开了一株发酵乳杆菌CGMCC No.8735及其在农作物植物真菌病害防治方面的应用，其中对棉花黄萎病有明显抑制作用，对番茄灰霉病或水稻纹枯病具有抑制作用。
保藏信息
上述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum参据的微生物：NJHYHWGY20130877是由本实验室选育并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.8735，保藏日期是：2014年01月17日。
具体实施方式
本发明提供一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC No.8735及其在真菌病害抑制方面的应用，下面列举实例予以进一步说明。
实例一：
(1)菌株培养
将发酵乳杆菌CGMCC No.8735接种于固体培养基中，30℃培养12h。从固体培养基上选取一个菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的250mL锥形瓶中，其中种子液培养基体积为锥形瓶容量的16％(250mL锥形瓶中装入40mL种子液培养基)，转速100r/min，30℃条件下培养10h得种子液；取种子液接入装有发酵培养基的250mL锥形瓶中，其中发酵培养基体积为锥形瓶容量的16％(250mL锥形瓶中装入40mL种子液培养基)，种子液与发酵培养基的体积比为1：100，转速120r/min，30℃条件下培养28h得发酵液。
上述固体培养基组分为(g/L)：蛋白胨9，牛肉膏9，酵母膏4.5，葡萄糖18，柠檬酸氢二钠1.5，乙酸钠4.5，磷酸氢二钾1.5，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2，琼脂15。
种子培养基组分为(g/L)：蛋白胨9，牛肉膏8，酵母膏4，葡萄糖16，柠檬酸氢二钠1.5，乙酸钠4，磷酸氢二钾1.5，硫酸镁0.5，硫酸锰0.2。
发酵培养基组分为(g/L)：酵母膏15，蔗糖20，柠檬酸氢二钠1.5，乙酸钠4，磷酸氢二钾1.5，KCl 0.6，pH5.5。
(2)发酵上清液制备
将发酵液在8000r/min条件下，离心20min，弃去下层菌泥，取发酵上清液备用。
(3)乳酸菌素浓缩液制备
将发酵上清液在真空条件下浓缩得到浓缩液，其中体积浓缩倍数为10倍；向浓缩液中加入硫酸铵溶液，漩涡震荡1h，其中溶液中硫酸铵饱和度为40％；18000r/min条件下离心25min，去除上清液，取下层沉淀溶于pH为4.0的柠檬酸缓冲液中，得到乳酸菌素的浓缩液，其中沉淀与柠檬酸缓冲液的比例为1：100。
(4)抑菌率计算
采用牛津杯法测乳酸菌素浓缩液抑制病原菌的抑菌直径，计算抑菌率。用接种环挑取病原菌菌丝体于1.5mL离心管中，漩涡震荡破碎的病原菌菌丝体液，移取菌丝体液，均匀涂布于PDA培养基上；在含病原菌的平板上等距离放置4个牛津杯，静置5min后，向每个牛津杯中加入100μL乳酸菌素浓缩液；28℃培养24h后测抑菌圈直径。计算病原菌抑制率：
上述病原菌生长抑制率(％)＝(抑菌圈直径－杯碟直径)/(对照菌落直径－杯碟直径)×100％
平板规格为(mm)：直径90，高16。
平板中倒入PDA培养基的量为(mL)：25。
牛津杯规格为(mm)：内径6.0±0.1，外径8.0±0.1，高10.0±0.1。
具体结果见表1：
表1 对不同真菌病害的抑菌率
注：多菌灵与腐霉利浓度均为10μg/mL
由表1可知发酵乳杆菌CGMCC No.8735菌发酵液可以有效抑制棉花黄萎病、番茄灰霉病或水稻纹枯病原菌。其中对棉花黄萎病的抑制效果最好，抑制率为59.14％。
实例二：
(1)菌株培养
将发酵乳杆菌CGMCC No.8735接种于固体培养基中，36℃培养18h。从固体培养基上选取一个菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的250mL锥形瓶中，其中种子液培养基体积为锥形瓶容量的32％，转速140r/min，36℃条件下培养16h得种子液；取种子液接入装有发酵培养基的250mL锥形瓶中，其中发酵培养基体积为锥形瓶容量的32％，种子液与发酵培养基的体积比为1：20，转速140r/min，36℃条件下培养28h得发酵液。
上述固体培养基组分为(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，葡萄糖20，柠檬酸氢二钠2，乙酸钠5，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.55，硫酸锰0.25，琼脂18。
种子培养基组分为(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，葡萄糖20，柠檬酸氢二钠2，乙酸钠5，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.55，硫酸锰0.25。
发酵培养基组分为(g/L)：酵母膏18，蔗糖23，柠檬酸氢二钠2，乙酸钠5，磷酸氢二钾2，KCl 0.85，pH6.0。
(2)发酵上清液制备
将发酵液在10000r/min条件下，离心30min，弃去下层菌泥，取发酵上清液备用。
(3)乳酸菌素浓缩液制备
将发酵上清液在真空条件下浓缩得到浓缩液，其中体积浓缩倍数为15倍；向浓缩液中加入硫酸铵溶液，漩涡震荡1.5h，其中溶液中硫酸铵饱和度为45％；19000r/min条件下离心32min，去除上清液，取下层沉淀溶于pH为4.5的柠檬酸缓冲液中，得到乳酸菌素的浓缩液，其中沉淀与柠檬酸缓冲液的比例为1：1000。
(4)抑菌率计算
采用牛津杯法测乳酸菌素浓缩液抑制病原菌的抑菌直径，计算抑菌率。用接种环挑取病原菌菌丝体于1.5mL离心管中，漩涡震荡破碎的病原菌菌丝体液，移取菌丝体液，均匀涂布于PDA培养基上；在含病原菌的平板上等距离放置4个牛津杯，静置5min后，向每个牛津杯中加入150μL乳酸菌素浓缩液；28℃培养24h后测抑菌圈直径。计算病原菌抑制率：
上述病原菌生长抑制率(％)＝(抑菌圈直径－杯碟直径)/(对照菌落直径－杯碟直径)×100％
平板规格为(mm)：直径90，高16。
平板中倒入PDA培养基的量为(mL)：25。
牛津杯规格为(mm)：内径6.0±0.1，外径8.0±0.1，高10.0±0.1。
具体结果见表2：
表2 对不同真菌病害的抑菌率
注：多菌灵与腐霉利浓度均为10μg/mL
由表2可知发酵乳杆菌CGMCC No.8735菌发酵液可以有效抑制棉花黄萎病、番茄灰霉病或水稻纹枯病原菌。其中对棉花黄萎病的抑制效果最好，抑制率为71.41％。
实例三：
(1)菌株培养
将发酵乳杆菌CGMCC No.8735接种于固体培养基中，40℃培养24h。从固体培养基上选取一个菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的250mL锥形瓶中，其中种子液培养基是锥形瓶容量的40％，转速180r/min，40℃条件下培养22h得种子液；取种子液接入装有发酵培养基的250mL锥形瓶中，其中发酵培养基体积为锥形瓶容量的40％，种子液与发酵培养基的体积比为1：10，转速160r/min，40℃条件下培养36h得发酵液。
上述固体培养基组分为(g/L)：蛋白胨11，牛肉膏11，酵母膏5.5，葡萄糖22，柠檬酸氢二钠2.5，乙酸钠5.5，磷酸氢二钾2.5，硫酸镁0.6，硫酸锰0.3，琼脂20。
种子培养基组分为(g/L)：蛋白胨12，牛肉膏12，酵母膏6，葡萄糖24，柠檬酸氢二钠2.5，乙酸钠6，磷酸氢二钾2.5，硫酸镁0.6，硫酸锰0.3。
发酵培养基组分为(g/L)：酵母膏25，蔗糖30，柠檬酸氢二钠2.5，乙酸钠6，磷酸氢二钾2.5，KCl 1.0，pH6.5。
(2)发酵上清液制备
将发酵液在12000r/min条件下，离心40min，弃去下层菌泥，取发酵上清液备用。
(3)乳酸菌素浓缩液制备
将发酵上清液在真空条件下浓缩得到浓缩液，其中体积浓缩倍数为20倍；向浓缩液中加入硫酸铵溶液，漩涡震荡2h，其中溶液中硫酸铵饱和度为50％；20000r/min条件下离心40min，去除上清液，取下层沉淀溶于pH为5.0的柠檬酸缓冲液中，得到乳酸菌素的浓缩液，其中沉淀与柠檬酸缓冲液的比例为1：500。
(4)抑菌率计算
采用牛津杯法测乳酸菌素浓缩液抑制病原菌的抑菌直径，计算抑菌率。用接种环挑取病原菌菌丝体于1.5mL离心管中，漩涡震荡破碎的病原菌菌丝体液，移取菌丝体液，均匀涂布于PDA培养基上；在含病原菌的平板上等距离放置4个牛津杯，静置10min后，向每个牛津杯中加入200μL乳酸菌素浓缩液；28℃培养24h后测抑菌圈直径。计算病原菌抑制率：
上述病原菌生长抑制率(％)＝(抑菌圈直径－杯碟直径)/(对照菌落直径－杯碟直径)×100％
平板规格为(mm)：直径90，高16。
平板中倒入PDA培养基的量为(mL)：25。
牛津杯规格为(mm)：内径6.0±0.1，外径8.0±0.1，高10.0±0.1。
具体结果见表3：
表3 对不同真菌病害的抑菌率
注：多菌灵与腐霉利浓度均为10μg/mL
由表3可知发酵乳杆菌CGMCC No.8735菌发酵液可以有效抑制棉花黄萎病、番茄灰霉病或水稻纹枯病原菌。其中对棉花黄萎病的抑制效果最好，抑制率为61.32％。
本发明用于绿色生物防治，在农业领域具有广阔的应用前景。通过对发酵乳杆菌发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC No.8735发酵产乳酸菌素的工艺开发，降低化学农药使用量、提高农产品安全性，有利于环境保护及农业可持续发展。
Claims (8)
1.一株乳酸菌，其分类命名为发酵乳杆菌，菌种的拉丁学名是：Lactobacillusfermentum，参据的微生物：NJHYHWGY20130877，保藏日期是2014年01月17日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.8735。
2.一种利用如权利要求1所述发酵乳杆菌的发酵方法，其具体步骤如下：将发酵乳杆菌CGMCC No.8735接种于固体培养基中，30～40℃培养12～24h；在固体培养基中选取一个菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，控制转速为100～180r/min，30～40℃条件下培养10～22h得发酵乳杆菌种子液；取种子液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，控制转速为120～160r/min，30～40℃条件下培养24～36h得发酵液。
3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于固体培养基的组分为：蛋白胨9～11g/L，牛肉膏9～11g/L，酵母膏4.5～5.5g/L，柠檬酸氢二钠1.5～2.5g/L，葡萄糖18～22g/L，乙酸钠4.5～5.5g/L，磷酸氢二钾1.5～2.5g/L，硫酸镁0.5～0.6g/L，硫酸锰0.2～0.3g/L，琼脂15～25g/L。
4.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于种子液培养基的组分为：蛋白胨9～12g/L，牛肉膏8～12g/L，酵母膏4～6g/L，葡萄糖16～24g/L，柠檬酸氢二钠1.5～2.5g/L，乙酸钠4～6g/L，磷酸氢二钾1.5～2.5g/L，硫酸镁0.5～0.6g/L，硫酸锰0.2～0.3g/L。
5.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于发酵培养基的组分为：蔗糖20～30g/L，酵母膏15～25g/L，KCl 0.6～1.0g/L，柠檬酸氢二钠1.5～2.5g/L，乙酸钠4～6g/L，磷酸氢二钾1.5～2.5g/L，pH 5.5～6.5。
6.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于种子液培养基体积为锥形瓶容量的16～40％；发酵培养基体积为锥形瓶容量的16～40％，种子液与发酵培养基的体积比为1：(10～100)。
7.一种如权利要求1所述的发酵乳杆菌在植物真菌病害防治方面的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的植物真菌病害为棉花黄萎病、番茄灰霉病或水稻纹枯病。
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