CN104745488B - 一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法 - Google Patents

一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于病原菌的分离鉴定领域，特别涉及一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法。该方法的步骤包括：病残植株采集、孢子悬液配制、回接、寄生菌分离、产孢、单孢系分离。本发明的寄生菌分离步骤采用的植株是人工回接步骤中得到的自然发病的植株，而不是采用田间病株，寄生菌分离步骤之后仅经过一次转皿即可用单孢进行超低温贮藏，获得具有良好的活力的单胞子系；本发明得到一批菌系(7～9个单孢系)所需要时间将从半年缩短到1个月，较前分离的速度得到显著提高；本发明有效地剔除了腐生菌的存在，能够准确获得万寿菊黑斑病病原菌。

Description

一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法
技术领域
本发明属于病原菌的分离鉴定领域，特别涉及一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法。
背景技术
万寿菊(Tagetes erecta L.)为菊科(Compusitae)万寿菊属(Tagetes)一年生草本植物，不仅可用于城市的园林美化，同时也是提取天然叶黄素的重要原料。随着种植面积的不断推广和扩大，万寿菊黑斑病害的发生日益严重，特别是气候异常年份如连阴雨天或高温干旱等。北京延庆地区大面积种植的色素万寿菊，2010年和2011年两年病害的严重发生已成为其发展的一个限制因素。在发展万寿菊的生产中，病害已成了重要的限制因素之一。
目前对万寿菊黑斑病原菌的鉴定多采用传统分类鉴定方法，因形态、地域的差异，结论并不一致。我国有一些文献上对万寿菊黑斑病有过报道，他们都用了不同的种名：如高洁(高洁，白庆荣，董然，等.2002.万寿菊细菌性叶斑病的发生与病原菌鉴定[J].吉林农业大学学报，24(2)：94-96，107)等通过形态学、生理生化性状及生态学特征将万寿菊细菌性叶斑病的致病菌确定为丁香假单胞菌万寿菊致病变种(Pseudomonas syringaepv.tagetes)；王龙等则将甘肃地区万寿菊叶斑病的病原鉴定为链格孢属(Alternariasp.)物种；王婷等通过形态鉴定将万寿菊叶斑病的病原菌鉴定为细极链格孢(A.tenuissima)。
上述方法所需的时间较长，操作繁琐，得到一批菌系(7～9个单孢系)需要半年。并且，传统分类鉴定方法在分离病原菌的时候往往无法有效地剔除腐生菌，准确性有限，导致不同人的鉴定结果不同。因此，目前的科研和实践中需要一种操作简便、时间短、准确性高的万寿菊黑斑病病原菌单孢系的分离方法。
发明内容
本发明提供一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
病残植株采集步骤：
采集田间的万寿菊黑斑病的病残植株；
孢子悬液配制步骤：
取所述病残植株的茎段上的黑霉，配制成孢子悬液；
回接步骤：
将所述孢子悬液接种于万寿菊幼苗，得到自然发病的植株；
寄生菌分离步骤：
选取生长于所述自然发病的植株的带有病斑的部分，消毒后培养得到疑似寄生菌的菌落；
产孢步骤：
将所述疑似寄生菌的菌落进行扩繁，诱发产生孢子；再将所述孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，选取有寄生性的菌株；
单孢系分离步骤：
将所述有寄生性的菌株进行单孢系分离处理，得到黑斑病病原菌单孢系。
上述方法的优选的实施方式中，所述病残植株采集步骤中，还将所述病残植株进行保湿处理。
上述方法的优选的实施方式中，所述保湿处理为：将所述病残植株在清水中浸泡3-6小时，优选为4小时，再放入湿度为100％的密闭空间里保湿40-60小时，优选为48小时。
上述方法的优选的实施方式中，所述孢子悬液配制步骤中，所述孢子悬液的孢子浓度为5000-15000个孢子/毫升，优选为10000个孢子/毫升。
上述方法的优选的实施方式中，所述回接步骤中，所述接种为：将喷洒有所述孢子悬液的万寿菊幼苗置于封闭的保湿容器中，所述保湿容器内的空气湿度为100％。
上述方法的优选的实施方式中，所述回接步骤中，所述保湿容器中装有40-60℃，优选为50℃的水；优选地，所述回接步骤中，所述保湿容器中水面的高度达到装有万寿菊幼苗的容器的高度的0.3-0.8，进一步优选为0.6。
上述方法的优选的实施方式中，所述寄生菌分离步骤中，采用PDA培养基；所述PDA培养基中，PDA培养基粉末的浓度为30-50g/L，进一步优选为39g/L。
上述方法的优选的实施方式中，所述产孢步骤中，采用玉米培养基；所述玉米培养基中，玉米培养基粉末的浓度为70-80g/L，进一步优选为75g/L。
上述方法的优选的实施方式中，所述单孢系分离步骤中，所述单孢系分离处理为：取所述有寄生性的菌株的产生孢子，涂布于水琼脂培养基上，观察后挑取孢子；再将挑取的孢子于PDA培养基上培养5-8天，得到所述单孢系。
上述方法的优选的实施方式中，所述单孢系分离步骤中，水琼脂培养基中，琼脂粉浓度为20-40g/L，进一步优选为30g/L。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的寄生菌分离步骤采用的植株是人工回接步骤中得到的自然发病的植株，而不是采用田间病株，寄生菌分离步骤之后仅经过一次转皿即可用单孢进行超低温贮藏，获得具有良好的活力的单胞子系。
2、本发明得到一批菌系(7～9个单孢系)所需要时间将从半年缩短到1个月，较前分离的速度得到显著提高。
3、本发明有效地剔除了腐生菌的存在，能够准确获得万寿菊黑斑病病原菌。
附图说明
图1：实施例1中叶部带有大型病斑的植株的照片。
图2：实施例1中叶部带有小型病斑的植株的照片。
图3：实施例1中茎部带有病斑的植株的照片。
图4：实施例1中PDA培养基平板上的疑似寄生菌的菌落。
图5：实施例1中显微镜(40x10)下看到的未接种成功的孢子(40x10)的照片。
图6：实施例1中显微镜(40x10)下看到的接种成功的孢子(40x10)的照片。
图7：实施例1中作为单孢系的孢子在PDA培养基平板长出的菌落的照片。
图8：实施例1中万寿菊黑斑病田间发病症状的照片；其中，(a)(b)为叶片发病症状，(c)为茎发病症状，(d)为田间发病中后期。
图9：实施例1中万寿菊黑斑病病原菌鉴定的照片；其中，(a)为PDA培养基上的病原菌正面菌落形态，(b)为PDA培养基上的病原菌反面菌落形态，(c)为菌丝、孢子形态(10×20)，(d)为孢子形态(10×40)，(e)为回接后万寿菊幼苗叶片发病症状，(f)为回接后万寿菊幼苗植株发病症状。
具体实施方式
一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
步骤一、病残植株采集：采集万寿菊杂交种幼苗的黑斑病的田间病残植株，常温下干燥保存。
在步骤三的接种前，可以保湿诱发混有杂菌的寄生菌；该保湿诱发的操作为：将该病残植株在无菌水中浸泡3-6小时(比如：3小时、5小时、6小时中任意或任意之间的范围，优选为4小时)，使病残植株完全湿润，再将湿润的病残植株放在密闭空间里保湿40-60小时(比如：40小时、50小时、60小时中任意或任意之间的范围，优选为4小时)，湿度为100％。
步骤二、孢子悬液配制：选取黑霉比较明显的病残植株，刮取其茎段上的黑霉(即混有杂菌的寄生菌)，用蒸馏水配制成孢子浓度为5000-15000个孢子/毫升(比如：5000个孢子/毫升、8000个孢子/毫升、12000个孢子/毫升、15000个孢子/毫升中任意或任意之间的范围，优选为10000个孢子/毫升)的孢子悬液。
步骤三、回接(优选为人工回接)：将该孢子悬液接种于万寿菊幼苗，得到自然发病的植株。
上述接种的操作为：
取孢子悬液，用微型喷雾器喷洒在健康的万寿菊幼苗上；以喷洒无菌水的健康的万寿菊幼苗为对照，将喷洒后所有的幼苗放入保湿桶中，为保证叶面长时间的为水膜所覆盖，桶内盛有40-60℃(比如：40℃、45℃、55℃、60℃中任意或任意之间的范围，优选为50℃)的无菌水，水面高度达到种植有万寿菊幼苗的营养钵高度的0.3-0.8(比如：0.3、0.4、0.45、0.5、0.7.0.8中任意或任意之间的范围，优选为0.6)；再将空气加湿器放入保湿桶内，然后将保湿桶封严，使桶内空气湿度达到100％；待30-50小时(比如：30小时、25小时、45小时、48小时、50小时中任意或任意之间的范围，优选40小时)后，从保湿桶中取出所有的万寿菊幼苗，让植株自然发病，得到自然发病的植株。
上述保湿桶优选为60L的塑料整理箱。
步骤四、寄生菌分离：选取生长于该自然发病的植株的带有病斑的部分，消毒后接种于PDA培养基粉末浓度为30-50g/L(比如：30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L中任意或任意之间的范围，优选为39g/L)，的PDA培养基进行培养；7-10天后，得到疑似寄生菌的菌落。
上述PDA培养基的制备方法为：
称取PDA培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容，灭菌后冷却凝固成PDA培养基平板，4℃保存待用；
上述接种的操作为：
取自然发病的植株的叶片，用清水冲两遍，吸水纸吸干水分，选取较典型的病斑，剪成大约一厘米见方的小块；再用75％酒精溶液洗30秒，然后再使用15％的次氯酸钠溶液消毒1～3分钟；再用无菌水漂洗两次后，剪成约2～3毫米见方的小块，再用无菌水洗一次，分别放在PDA培养基平板上培养。
本步骤采用的植株是人工回接步骤中得到的自然发病的植株，而不是采用田间病株，之后仅经过一次转皿即可用单孢进行超低温贮藏，可以获得具有良好的活力的单胞子系。
步骤五、产孢：将该疑似寄生菌的菌落转到玉米培养基粉末浓度为70-80g/L(比如：70g/L、72g/L、76g/L、78g/L、80g/L中任意或任意之间的范围，优选为75g/L)，玉米培养基进行扩繁，诱发产生孢子，将孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，选取有寄生性的菌株。
上述验证方法按照科赫氏法则，从接种后发病的植株上再进行病原菌分离以及再次接种，以确定分离物是否为致病菌。该玉米培养基的制备方法为：
称取玉米培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容，灭菌后冷却凝固成玉米培养基平板，4℃保存待用；
上述诱发产生孢子的操作为：待菌落长满玉米培养基后，采用“刮开法”诱发产生孢子，即在无菌条件下刮除菌落表面菌系，开皿培养，培养2-6天即能产孢子。
步骤六、单孢系分离：将该有寄生性的菌株进行单孢系分离处理，得到黑斑病病原菌单孢系，于零下80℃用纸碟法保存。
该单孢系分离处理的操作为：
在超净工作台上，将诱发产生孢子的玉米培养基平板中加入无菌水，用灭过菌的油画笔刷下孢子，得到孢子液；再用移液枪吸取孢子液，加在琼脂粉浓度为20-40g/L(比如：20g/L、25g/L、28g/L、35g/L、40g/L中任意或任意之间的范围，优选为30g/L)的水琼脂的平板上，用三角玻棒将孢子液涂匀；然后在显微镜的低倍镜(4倍)下观察：如果每个视野里的孢子不超过1个，并在视野中检查周围没有其他孢子的情况下，可用挑针连同培养基将视野里的这1个孢子挑下，植入另外的PDA培养基(其中，PDA培养基粉末浓度为35-45g/L，可以为30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L中任意或任意之间的范围，优选为39g/L)里培养5-8天，优选为7天，即得到1个单孢系。
上述水琼脂平板的制备方法为：
称取琼脂粉，用蒸馏水加热溶解，定容，灭菌后冷却凝固成水琼脂平板，4℃保存待用。
以上方法得到一批菌系(7～9个单孢系)所需要时间将从半年缩短到1个月，较前分离的速度得到显著提高；以上方法可以有效地剔除了腐生菌的存在，能够准确获得万寿菊黑斑病病原菌。
实施例1：
本实施例的获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
(1)、病残植株采集：采集万寿菊杂交种幼苗的黑斑病的田间病残植株，常温下干燥保存。
如图8所示，图8-a、图8-b为田间万寿菊杂交种幼苗的叶片发病症状，图8-c为田间万寿菊杂交种幼苗的茎发病症状，图8-d为田间万寿菊杂交种幼苗发病中后期。
(2)、保湿诱发：将该病残植株在无菌水中浸泡4小时，使病残植株完全湿润，再将湿润的病残植株放在密闭容器里，于湿度为100％的条件下保湿48小时，得到诱发出黑霉的病残植株。
(3)、孢子悬液配制：选取黑霉比较明显的病残植株，刮取其茎段上的黑霉(即混有杂菌的寄生菌)，用无菌水配制成孢子浓度为10000个孢子/毫升的孢子悬液。
(4)、人工回接：取约15ml的孢子悬液，用微型喷雾器喷洒在5株健康的万寿菊幼苗上，以另外的5株喷洒无菌水的健康的万寿菊幼苗为对照，所有的万寿菊幼苗都种植于营养钵中；将喷洒后所有的幼苗放入60L的塑料整理箱中，为保证叶面长时间的为水膜所覆盖，箱内盛有50℃的无菌水，水面高度达到营养钵高度的0.6；再将空气加湿器放入塑料整理箱内，然后将塑料整理箱封严，使箱内空气湿度达到100％；40小时后从塑料整理箱中取出所有的万寿菊幼苗，让植株自然发病，得到自然发病的植株。自然发病的植株的外表如图1、图2、图3、图9-e、图9-f所示：图1的植株的叶部带有大型病斑，图2的植株的叶部带有小型病斑，图3的植株的茎部带有病斑，图9-e为回接后万寿菊幼苗叶片发病症状，图9-f为回接后万寿菊幼苗植株发病症状。
(5)、寄生菌分离：取自然发病的植株的叶片，用清水冲两遍，吸水纸吸干水分，选取较典型的病斑，剪成大约一厘米见方的小块；再用75％酒精溶液洗30秒，然后再使用15％的次氯酸钠溶液消毒1～3分钟；再用无菌水漂洗两次后，剪成约2～3毫米见方的小块，再用无菌水洗一次，分别放在PDA培养基粉末浓度为39g/L的PDA培养基平板(制备方法为：称取9.75g PDA培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成PDA培养基平板，4℃保存待用)上培养7-10天后，得到疑似寄生菌的菌落。
疑似寄生菌的菌落的特征为：如图4、图9-a、图9-b所示，菌株在PDA培养基平板上生长第2-3天为白色，之后中央出现灰色区域，菌丝白色绒毛状；如图9-c、图9-d所示，镜检发现其分生孢子梗单生或丛生，黄褐色；如图6、图9-c和图9-d所示，分生孢子单生或串生，褐色，孢身缢缩明显，大小(65～140)μm×(15～42)μm，横隔数3～8个，纵隔数0～7个；如图6、图9-d所示，喙与孢身区别明显，大小(7～110)μm×(3～10)μm，横隔数0～3个。
(6)、产孢：将该疑似寄生菌的菌落转到玉米培养基粉末浓度为75g/L的玉米培养基平板(制备方法为：称取18.75g玉米培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成玉米培养基平板，4℃保存待用)进行扩繁，待菌落长满玉米培养基后，采用“刮开法”诱发产生孢子，即在无菌条件下刮除菌落表面菌系，开皿培养，培养2-6天即能产孢子；将诱发出的孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，按照科赫氏法则选取有寄生性的菌株。
(7)、单孢系分离：在超净工作台上，将生长有有寄生性的菌种的玉米培养基平板中加入2ml的无菌水，用灭过菌的油画笔刷下孢子，得到孢子液；再用移液枪吸取50μl的孢子液，加在琼脂粉浓度为30g/L的水琼脂培养基平板(制备方法为：称取7.5g琼脂粉，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成水琼脂平板，4℃保存待用)上，用三角玻棒将孢子液涂匀，然后立刻在显微镜的低倍镜(4倍)下观察：如果每个视野里的孢子不超过1个，并在视野中检查周围没有其他孢子的情况下，可用挑针连同培养基将视野里的这1个孢子挑下，植入另外的PDA培养基(PDA培养基粉末浓度为39g/L)里培养7天，即得到1个单孢系；将该单孢系于零下80℃用纸碟法保存。
本实施例的步骤(5)镜检疑似黑斑病病原菌单孢系的孢子被描述为：孢身缢缩明显：长65～140微米，宽15～42微米，横隔数3～8个，纵斜隔0～7个；喙：与孢身区别明显，长7～110微米，宽3～10微米，横隔数0～3个。(据张天宇记载为：孢身：72.5～109x15.5～25.0微米，孢身：横膈8～13个，纵斜隔0～5个；喙：淡褐～无色，46.5～133.0x2.5～4.5微米)。从测量的数值上看，我们的与《中国真菌志》上张天宇(张天宇.2003.中国真菌志第十六卷链格孢属[M].科学出版社：86)报道的接近。结合接种发病的情况证明，本实施例中分离到的病菌应当就是《中国真菌志》的记载的万寿菊黑斑病的病原菌(如图9-c、图9-d所示图)。
步骤(7)单孢系分离中，图7中为作为单孢系的孢子在另外的PDA培养基上培养8天后长出的菌落；步骤(6)产孢中，图5为显微镜(40x10)下看到的未接种成功的孢子(40x10)，图6为显微镜(40x10)下看到的接种成功的孢子(40x10)。
表1：本实施例分离到的黑班病菌Altrnaria tagitica大小的测量结果(长度单位为微米)
我国已有的文献上对万寿菊黑斑病有过报道，王龙(王龙，张霄凌，何东云，等.2007.万寿菊叶斑病的发生及病原鉴定[J].南方农业(园林花卉版)，2(4)：7-9)只说他们得到的的万寿菊病原菌与《中国真菌志》报道的不同，故未加以定名(Alternaria sp.)。王婷(王婷，王龙，王生荣.2010.万寿菊叶斑病病原鉴定及其生物学特性研究[J].甘肃农业大学学报，3：66-68)将其定为极细链格孢[Alternaria tenuissima(Fr)Wiltshire]。此外，2002年吉林农大的吴新颖(吴新颖.2002.万寿菊链格孢叶斑病研究[D].吉林农业大学：1-2)的硕士论文将其定名为石竹链格孢(Alternaria gypsophilae)。从他们提供的显微照片看都和本实施例中未接种成功的腐生菌相似；因此，很可能不是本实施例中所要的万寿菊黑斑病的病原。
表2、本实施例得到的万寿菊黑斑病菌孢子文献上记载的万寿菊黑斑病大小比较
实施例2：
本实施例的获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
(1)、病残植株采集：采集万寿菊杂交种幼苗的黑斑病的田间病残植株，常温下干燥保存。
(2)、保湿诱发：将该病残植株在无菌水中浸泡3小时，使病残植株完全湿润，再将湿润的病残植株放在密闭容器里，于湿度为100％的条件下保湿40小时，得到诱发出黑霉的病残植株。
(3)、孢子悬液配制：选取黑霉比较明显的病残植株，刮取其茎段上的黑霉(即混有杂菌的寄生菌)，用无菌水配制成孢子浓度为5000个孢子/毫升的孢子悬液。
(4)、人工回接：取约15ml的孢子悬液，用微型喷雾器喷洒在5株健康的万寿菊幼苗上，以另外的5株喷洒无菌水的健康的万寿菊幼苗为对照，所有的万寿菊幼苗都种植于营养钵中；将喷洒后所有的幼苗放入60L的塑料整理箱中，为保证叶面长时间的为水膜所覆盖，箱内盛有40℃的无菌水，水面高度达到营养钵高度的0.3；再将空气加湿器放入塑料整理箱内，然后将塑料整理箱封严，使箱内空气湿度达到100％；40小时后从塑料整理箱中取出所有的万寿菊幼苗，让植株自然发病，得到自然发病的植株。
(5)、寄生菌分离：取自然发病的植株的叶片，用清水冲两遍，吸水纸吸干水分，选取较典型的病斑，剪成大约一厘米见方的小块；再用75％酒精溶液洗30秒，然后再使用15％的次氯酸钠溶液消毒1～3分钟；再用无菌水漂洗两次后，剪成约2～3毫米见方的小块，再用无菌水洗一次，分别放在PDA培养基粉末浓度为39g/L的PDA培养基平板(制备方法为：称取9.75g PDA培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成PDA培养基平板，4℃保存待用)上培养7-10天后，得到疑似寄生菌的菌落。
镜检该菌落，疑似黑斑病病原菌单孢系的孢子被描述为：孢身缢缩明显：长110～120微米，宽30～35微米，横隔数6～9个，纵斜隔3～6个；喙：与孢身区别明显，长7～110微米，宽5～10微米，横隔数0～3个。
(6)、产孢：将该疑似寄生菌的菌落转到玉米培养基粉末浓度为70g/L的玉米培养基平板(制备方法为：称取17.5g玉米培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成玉米培养基平板，4℃保存待用)进行扩繁，待菌落长满玉米培养基后，采用“刮开法”诱发产生孢子，即在无菌条件下刮除菌落表面菌系，开皿培养，培养2-6天即能产孢子；将诱发出的孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，按照科赫氏法则选取有寄生性的菌株。
(7)、单孢系分离：在超净工作台上，将生长有有寄生性的菌种的玉米培养基平板中加入2ml的无菌水，用灭过菌的油画笔刷下孢子，得到孢子液；再用移液枪吸取50μl的孢子液，加在琼脂粉浓度为20g/L的水琼脂培养基平板(制备方法为：称取5g琼脂粉，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成水琼脂平板，4℃保存待用)上，用三角玻棒将孢子液涂匀，然后立刻在显微镜的低倍镜(4倍)下观察：如果每个视野里的孢子不超过1个，并在视野中检查周围没有其他孢子的情况下，可用挑针连同培养基将视野里的这1个孢子挑下，植入另外的PDA培养基(PDA培养基粉末浓度为39g/L)里培养7天，即得到1个单孢系；将该单孢系于零下80℃用纸碟法保存。
实施例3：
本实施例的获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
(1)、病残植株采集：采集万寿菊杂交种幼苗的黑斑病的田间病残植株，常温下干燥保存。
(2)、保湿诱发：将该病残植株在无菌水中浸泡6小时，使病残植株完全湿润，再将湿润的病残植株放在密闭容器里，于湿度为100％的条件下保湿60小时，得到诱发出黑霉的病残植株。
(3)、孢子悬液配制：选取黑霉比较明显的病残植株，刮取其茎段上的黑霉(即混有杂菌的寄生菌)，用无菌水配制成孢子浓度为15000个孢子/毫升的孢子悬液。
(4)、人工回接：取约15ml的孢子悬液，用微型喷雾器喷洒在5株健康的万寿菊幼苗上，以另外的5株喷洒无菌水的健康的万寿菊幼苗为对照，所有的万寿菊幼苗都种植于营养钵中；将喷洒后所有的幼苗放入60L的塑料整理箱中，为保证叶面长时间的为水膜所覆盖，箱内盛有60℃的无菌水，水面高度达到营养钵高度的0.8；再将空气加湿器放入塑料整理箱内，然后将塑料整理箱封严，使箱内空气湿度达到100％；40小时后从塑料整理箱中取出所有的万寿菊幼苗，让植株自然发病，得到自然发病的植株。
(5)、寄生菌分离：取自然发病的植株的叶片，用清水冲两遍，吸水纸吸干水分，选取较典型的病斑，剪成大约一厘米见方的小块；再用75％酒精溶液洗30秒，然后再使用15％的次氯酸钠溶液消毒1～3分钟；再用无菌水漂洗两次后，剪成约2～3毫米见方的小块，再用无菌水洗一次，分别放在PDA培养基粉末浓度为39g/L的PDA培养基平板(制备方法为：称取9.75g PDA培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成PDA培养基平板，4℃保存待用)上培养7-10天后，得到疑似寄生菌的菌落。
镜检该菌落，疑似黑斑病病原菌单孢系的孢子被描述为：孢身缢缩明显：长65～140微米，宽15～42微米，横隔数3～8个，纵斜隔0～7个；喙：与孢身区别明显，长7～110微米，宽3～10微米，横隔数0～4个。
(6)、产孢：将该疑似寄生菌的菌落转到玉米培养基粉末浓度为80g/L的玉米培养基平板(制备方法为：称取20g玉米培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成玉米培养基平板，4℃保存待用)进行扩繁，待菌落长满玉米培养基后，采用“刮开法”诱发产生孢子，即在无菌条件下刮除菌落表面菌系，开皿培养，培养2-6天即能产孢子；将诱发出的孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，按照科赫氏法则选取有寄生性的菌株。
(7)、单孢系分离：在超净工作台上，将生长有有寄生性的菌种的玉米培养基平板中加入2ml的无菌水，用灭过菌的油画笔刷下孢子，得到孢子液；再用移液枪吸取50μl的孢子液，加在琼脂粉浓度为40g/L的水琼脂培养基平板(制备方法为：称取10g琼脂粉，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成水琼脂平板，4℃保存待用)上，用三角玻棒将孢子液涂匀，然后立刻在显微镜的低倍镜(4倍)下观察：如果每个视野里的孢子不超过1个，并在视野中检查周围没有其他孢子的情况下，可用挑针连同培养基将视野里的这1个孢子挑下，植入另外的PDA培养基(PDA培养基粉末浓度为39g/L)里培养7天，即得到1个单孢系；将该单孢系于零下80℃用纸碟法保存。
实施例4：
本实施例的获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
(1)、病残植株采集：采集万寿菊杂交种幼苗的黑斑病的田间病残植株，常温下干燥保存。
(2)、保湿诱发：将该病残植株在无菌水中浸泡3小时，使病残植株完全湿润，再将湿润的病残植株放在密闭容器里，于湿度为100％的条件下保湿60小时，得到诱发出黑霉的病残植株。
(3)、孢子悬液配制：选取黑霉比较明显的病残植株，刮取其茎段上的黑霉(即混有杂菌的寄生菌)，用无菌水配制成孢子浓度为12000个孢子/毫升的孢子悬液。
(4)、人工回接：取约15ml的孢子悬液，用微型喷雾器喷洒在5株健康的万寿菊幼苗上，以另外的5株喷洒无菌水的健康的万寿菊幼苗为对照，所有的万寿菊幼苗都种植于营养钵中；将喷洒后所有的幼苗放入60L的塑料整理箱中，为保证叶面长时间的为水膜所覆盖，箱内盛有40℃的无菌水，水面高度达到营养钵高度的0.8；再将空气加湿器放入塑料整理箱内，然后将塑料整理箱封严，使箱内空气湿度达到100％；40小时后从塑料整理箱中取出所有的万寿菊幼苗，让植株自然发病，得到自然发病的植株。
(5)、寄生菌分离：取自然发病的植株的叶片，用清水冲两遍，吸水纸吸干水分，选取较典型的病斑，剪成大约一厘米见方的小块；再用75％酒精溶液洗30秒，然后再使用15％的次氯酸钠溶液消毒1～3分钟；再用无菌水漂洗两次后，剪成约2～3毫米见方的小块，再用无菌水洗一次，分别放在PDA培养基粉末浓度为39g/L的PDA培养基平板(制备方法为：称取9.75g PDA培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成PDA培养基平板，4℃保存待用)上培养7-10天后，得到疑似寄生菌的菌落。
镜检该菌落，疑似黑斑病病原菌单孢系的孢子被描述为：孢身缢缩明显：长65～140微米，宽15～42微米，横隔数3～8个，纵斜隔0～7个；喙：与孢身区别明显，长7～110微米，宽3～10微米，横隔数0～4个。
(6)、产孢：将该疑似寄生菌的菌落转到玉米培养基粉末浓度为77g/L的玉米培养基平板(制备方法为：称取19.25g玉米培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成玉米培养基平板，4℃保存待用)进行扩繁，待菌落长满玉米培养基后，采用“刮开法”诱发产生孢子，即在无菌条件下刮除菌落表面菌系，开皿培养，培养2-6天即能产孢子；将诱发出的孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，按照科赫氏法则选取有寄生性的菌株。
(7)、单孢系分离：在超净工作台上，将生长有有寄生性的菌种的玉米培养基平板中加入2ml的无菌水，用灭过菌的油画笔刷下孢子，得到孢子液；再用移液枪吸取50μl的孢子液，加在琼脂粉浓度为35g/L的水琼脂培养基平板(制备方法为：称取8.75g琼脂粉，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成水琼脂平板，4℃保存待用)上，用三角玻棒将孢子液涂匀，然后立刻在显微镜的低倍镜(4倍)下观察：如果每个视野里的孢子不超过1个，并在视野中检查周围没有其他孢子的情况下，可用挑针连同培养基将视野里的这1个孢子挑下，植入另外的PDA培养基(PDA培养基粉末浓度为39g/L)里培养7天，即得到1个单孢系；将该单孢系于零下80℃用纸碟法保存。
实施例5：
本实施例的获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
(1)、病残植株采集：采集万寿菊杂交种幼苗的黑斑病的田间病残植株，常温下干燥保存。
(2)、保湿诱发：将该病残植株在无菌水中浸泡6小时，使病残植株完全湿润，再将湿润的病残植株放在密闭容器里，于湿度为100％的条件下保湿40小时，得到诱发出黑霉的病残植株。
(3)、孢子悬液配制：选取黑霉比较明显的病残植株，刮取其茎段上的黑霉(即混有杂菌的寄生菌)，用无菌水配制成孢子浓度为8000个孢子/毫升的孢子悬液。
(4)、人工回接：取约15ml的孢子悬液，用微型喷雾器喷洒在5株健康的万寿菊幼苗上，以5株喷洒无菌水的健康的万寿菊幼苗为对照，所有的万寿菊幼苗都种植于营养钵中；将喷洒后所有的幼苗放入60L的塑料整理箱中，为保证叶面长时间的为水膜所覆盖，箱内盛有45℃的无菌水，水面高度达到营养钵高度的0.7；再将空气加湿器放入塑料整理箱内，然后将塑料整理箱封严，使箱内空气湿度达到100％；40小时后从塑料整理箱中取出所有的万寿菊幼苗，让植株自然发病，得到自然发病的植株。
(5)、寄生菌分离：取自然发病的植株的叶片，用清水冲两遍，吸水纸吸干水分，选取较典型的病斑，剪成大约一厘米见方的小块；再用75％酒精溶液洗30秒，然后再使用15％的次氯酸钠溶液消毒1～3分钟；再用无菌水漂洗两次后，剪成约2～3毫米见方的小块，再用无菌水洗一次，分别放在PDA培养基粉末浓度为39g/L的PDA培养基平板(制备方法为：称取9.75g PDA培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成PDA培养基平板，4℃保存待用)上培养7-10天后，得到疑似寄生菌的菌落。
镜检该菌落，疑似黑斑病病原菌单孢系的孢子被描述为：孢身缢缩明显：长78～135微米，宽18～25微米，横隔数3～8个，纵斜隔1～7个；喙：与孢身区别明显，长55～100微米，宽4～9微米，横隔数1～2个。
(6)、产孢：将该疑似寄生菌的菌落转到玉米培养基粉末浓度为72g/L的玉米培养基平板(制备方法为：称取18g玉米培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成玉米培养基平板，4℃保存待用)进行扩繁，待菌落长满玉米培养基后，采用“刮开法”诱发产生孢子，即在无菌条件下刮除菌落表面菌系，开皿培养，培养2-6天即能产孢子；将诱发出的孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，按照科赫氏法则选取有寄生性的菌株。
(7)、单孢系分离：在超净工作台上，将生长有有寄生性的菌种的玉米培养基平板中加入2ml的无菌水，用灭过菌的油画笔刷下孢子，得到孢子液；再用移液枪吸取50μl的孢子液，加在琼脂粉浓度为32g/L的水琼脂培养基平板(制备方法为：称取8g琼脂粉，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成水琼脂平板，4℃保存待用)上，用三角玻棒将孢子液涂匀，然后立刻在显微镜的低倍镜(4倍)下观察：如果每个视野里的孢子不超过1个，并在视野中检查周围没有其他孢子的情况下，可用挑针连同培养基将视野里的这1个孢子挑下，植入另外的PDA培养基(PDA培养基粉末浓度为39g/L)里培养7天，即得到1个单孢系；将该单孢系于零下80℃用纸碟法保存。
实施例6：
本实施例的获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，包括以下步骤：
(1)、病残植株采集：采集万寿菊杂交种幼苗的黑斑病的田间病残植株，常温下干燥保存。
(2)、保湿诱发：将该病残植株在无菌水中浸泡5小时，使病残植株完全湿润，再将湿润的病残植株放在密闭容器里，于湿度为100％的条件下保湿50小时，得到诱发出黑霉的病残植株。
(3)、孢子悬液配制：选取黑霉比较明显的病残植株，刮取其茎段上的黑霉(即混有杂菌的寄生菌)，用无菌水配制成孢子浓度为14000个孢子/毫升的孢子悬液。
(4)、人工回接：取约15ml的孢子悬液，用微型喷雾器喷洒在5株健康的万寿菊幼苗上，以5株喷洒无菌水的健康的万寿菊幼苗为对照，所有的万寿菊幼苗都种植于营养钵中；将喷洒后所有的幼苗放入60L的塑料整理箱中，为保证叶面长时间的为水膜所覆盖，箱内盛有45℃的无菌水，水面高度达到营养钵高度的0.45；再将空气加湿器放入塑料整理箱内，然后将塑料整理箱封严，使箱内空气湿度达到100％；40小时后从塑料整理箱中取出所有的万寿菊幼苗，让植株自然发病，得到自然发病的植株。
(5)、寄生菌分离：取自然发病的植株的叶片，用清水冲两遍，吸水纸吸干水分，选取较典型的病斑，剪成大约一厘米见方的小块；再用75％酒精溶液洗30秒，然后再使用15％的次氯酸钠溶液消毒1～3分钟；再用无菌水漂洗两次后，剪成约2～3毫米见方的小块，再用无菌水洗一次，分别放在PDA培养基粉末浓度为39g/L的PDA培养基平板(制备方法为：称取9.75g PDA培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成PDA培养基平板，4℃保存待用)上培养7-10天后，得到疑似寄生菌的菌落。
镜检该菌落，疑似黑斑病病原菌单孢系的孢子被描述为：孢身缢缩明显：长65～100微米，宽20～40微米，横隔数3～5个，纵斜隔2～5个；喙：与孢身区别明显，长8～100微米，宽6～10微米，横隔数0～3个。
(6)、产孢：将该疑似寄生菌的菌落转到玉米培养基粉末浓度为76g/L的玉米培养基平板(制备方法为：称取19g玉米培养基粉末，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成玉米培养基平板，4℃保存待用)进行扩繁，待菌落长满玉米培养基后，采用“刮开法”诱发产生孢子，即在无菌条件下刮除菌落表面菌系，开皿培养，培养2-6天即能产孢子；将诱发出的孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，按照科赫氏法则选取有寄生性的菌株。
(7)、单孢系分离：在超净工作台上，将生长有有寄生性的菌种的玉米培养基平板中加入2ml的无菌水，用灭过菌的油画笔刷下孢子，得到孢子液；再用移液枪吸取50μl的孢子液，加在琼脂粉浓度为38g/L的水琼脂培养基平板(制备方法为：称取9.5g琼脂粉，用蒸馏水加热溶解，定容至250ml，灭菌后冷却凝固成水琼脂平板，4℃保存待用)上，用三角玻棒将孢子液涂匀，然后立刻在显微镜的低倍镜(4倍)下观察：如果每个视野里的孢子不超过1个，并在视野中检查周围没有其他孢子的情况下，可用挑针连同培养基将视野里的这1个孢子挑下，植入另外的PDA培养基(PDA培养基粉末浓度为39g/L)里培养7天，即得到1个单孢系；将该单孢系于零下80℃用纸碟法保存。

Claims (12)

1.一种通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
病残植株采集步骤：
采集田间的万寿菊黑斑病的病残植株；
还将所述病残植株进行保湿处理；
将所述病残植株在清水中浸泡3-6小时，再放入湿度为100％的密闭空间里保湿40-60小时；
孢子悬液配制步骤：
取所述病残植株的茎段上的黑霉，配制成孢子悬液；所述孢子悬液的孢子浓度为5000-15000个孢子/毫升；
回接步骤：
将所述孢子悬液接种于万寿菊幼苗，得到自然发病的植株；
所述接种为：将喷洒有所述孢子悬液的万寿菊幼苗置于封闭的保湿容器中30-50小时，所述保湿容器内的空气湿度为100％；
所述保湿容器中装有40-60℃的水；
所述保湿容器中水面的高度达到装有万寿菊幼苗的容器的高度的0.3-0.8；寄生菌分离步骤：
选取生长于所述自然发病的植株的带有病斑的部分，消毒后培养得到疑似寄生菌的菌落；
产孢步骤：
将所述疑似寄生菌的菌落进行扩繁，诱发产生孢子；再将所述孢子接种于万寿菊幼苗验证寄生性，选取有寄生性的菌株；
单孢系分离步骤：
将所述有寄生性的菌株进行单孢系分离处理，得到黑斑病病原菌单孢系。
2.根据权利要求1所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：
将所述病残植株在清水中浸泡4小时，再放入湿度为100％的密闭空间里保 湿48小时。
3.根据权利要求1所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：
所述孢子悬液的孢子浓度为10000个孢子/毫升。
4.根据权利要求1所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：
所述保湿容器中装有50℃的水。
5.根据权利要求1所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：
所述保湿容器中水面的高度达到装有万寿菊幼苗的容器的高度的0.6。
6.根据权利要求1所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：所述寄生菌分离步骤中，采用PDA培养基；所述PDA培养基中，PDA培养基粉末的浓度为30-50g/L。
7.根据权利要求6所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：所述PDA培养基粉末的浓度为39g/L。
8.根据权利要求1所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：所述产孢步骤中，采用玉米培养基；所述玉米培养基中，玉米培养基粉末的浓度为70-80g/L。
9.根据权利要求8所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：所述玉米培养基粉末的浓度为75g/L。
10.根据权利要求1所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：所述单孢系分离步骤中，所述单孢系分离处理为：取所述有寄生性的菌株的产生孢子，涂布于水琼脂培养基上，观察后挑取孢子；再将挑取的孢子于PDA培养基上培养5-8天，得到所述单孢系。
11.根据权利要求10所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：所述单孢系分离步骤中，水琼脂培养基中，琼脂粉浓度为20-40g/L。
12.根据权利要求11所述通过回接分离获得万寿菊黑斑病病原菌单孢系的方法，其特征在于：所述琼脂粉浓度为30g/L。
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