CN104744293B - 胆碱类似物及其制备方法和应用、由染料分子标记的四嗪探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胆碱类似物以及由染料分子标记的四嗪探针。本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应在常温、生理环境中就能快速发生，且无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响；本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应后，通过检测所述标记的染料分子可快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪。本发明还提供了一种胆碱类似物以及由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，该方法简单易行，可以进行大规模生产，且生产成本低。本发明还提供了一种胆碱类似物以及由染料分子标记的四嗪探针的应用。

Description

胆碱类似物及其制备方法和应用、 由染料分子标记的四嗪探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及胆碱类似物及其制备方法和应用、由染料分子标记的四嗪探针及其制备方法和应用。
背景技术
胆碱（Cho）是细胞膜结构和脂蛋白构成上的重要组成部分。在真核生物中，磷脂头端最普遍的基团是胆碱，含磷脂胆碱是细胞膜中最丰富的磷脂，也是细胞膜的主要结构成分，在细胞代谢和信号传导中起着至关重要的作用，
Adrian Salic课题组利用胆碱在细胞中的代谢途径，通过对胆碱的末端修饰炔基，在不影响其功能的前提下实现了其对细胞的原位标记，并用带叠氮的染料通过click铜催化对细胞内胆碱的代谢行为进行示踪分析。然而，在该方法采用的是传统叠氮-炔基Husigen[3+3]环加成反应，催化剂铜的存在会引起细胞的毒性，因而在活细胞乃至活体的应用中受到很大的限制。
Hai-Yan Xie课题组采用新型的click无铜催化，改用叠氮修饰胆碱，并用其与细胞共培育，用无铜[3+2]click环加成试剂苯并环辛炔DBCO-荧光素来检测，在无铜的情况下验证叠氮-胆碱成功的标记在细胞膜上。然而该反应的反应速度相对较慢，因而易在体内被清除而影响其结合的效率。
因此，有必要提供一种对细胞毒性低，且反应快速、高灵敏、高分辨率的胆碱示踪方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种胆碱类似物及其制备方法和应用。此外，本发明还提供了一种由染料分子标记的四嗪探针及其制备方法和应用。
本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响，能够快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪。
第一方面，本发明提供了一种胆碱类似物，结构式如P1所示：
式中，k为2～4的自然数。
第二方面，本发明还提供了一种胆碱类似物的制备方法，包括如下步骤：
S10、提供如下结构式表示的化合物A和化合物B：
在催化剂存在的条件下，将所述化合物A和化合物B按1:1～1.5的摩尔比溶于第一有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20～30℃下反应0.5～1小时后，经萃取、干燥、硅胶柱层析分离纯化得到化合物C，其结构式如C所示：
S20、提供如下结构式表示的化合物D：
式中，k为2～4的自然数，
在催化剂存在的条件下，将所述化合物C和化合物D按1:2～5的摩尔比溶于第二有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20～30℃下反应0.5～1小时后，经萃取、干燥、硅胶柱层析分离纯化得到化合物E，其结构式如E所示：
式中，k为2～4的自然数，
S30、将所述化合物E和二甲基乙醇胺按1:1～3的摩尔比溶于第三有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在回流状态下反应12～16小时后，经浓缩、硅胶柱层析分离纯化得到化合物P1，其结构式如P1所示：
式中，k为2～4的自然数。
需要说明的是，本发明涉及的结构式中的为正电荷的符号。
优选地，所述步骤S10中，所述催化剂为吡啶。
优选地，所述步骤S10中，所述催化剂的摩尔浓度为所述化合物A的2～4倍。
优选地，所述步骤S10中，所述萃取的方式为在反应结束后的反应液中加入饱和氯化铵溶液进行萃取。
优选地，所述步骤S10中，所述干燥的方式为将萃取所得有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干。
优选地，所述步骤S10中，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿或N，N-二甲基甲酰胺。
优选地，所述步骤S20中，所述催化剂为三乙胺或N，N-二异丙基乙胺。
优选地，所述步骤S20中，所述催化剂的摩尔浓度为所述化合物C的2～5倍。
优选地，所述步骤S20中，所述纯化的方式为将反应结束后的反应液浓缩后加入二氯甲烷进行稀释，并用NaOH溶液及水溶液洗涤。
优选地，所述步骤S20中，所述干燥的方式为将萃取所得有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干。
优选地，所述步骤S20中，所述第二有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
优选地，所述步骤S30中，所述第三有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
本发明提供的胆碱类似物的合成方法，以非铜催化的双烯体(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇（BCN）为起始化合物，通过对其末端羟基的活化，与溴胺类进行反应得到溴代中间体，并最终与二甲基乙醇胺反应生成胆碱类似物。该方法操作简便、反应条件温和、重现性好。
该方法的优选步骤包括：1）BCN的活化（BCN-pNC）：用对硝基苯基氯甲酸酯（pNC）在吡啶及二氯甲烷的条件下对BCN进行活化；2）中间体BCN-Br的合成：活化后的BCN-pnc与2-溴乙胺在三乙胺的作用下生成中间体溴代BCN-Br；3）BCN修饰的胆碱类似物合成（BCN-Cho）：BCN-Br与二甲基乙醇胺在四氢呋喃（THF）回流得到目标化合物BCN-Cho。
本发明提供的化合物A为双烯体(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇（BCN），化合物B为对硝基苯基氯甲酸酯（pNC），化合物C为BCN-pNC，化合物D为溴胺类，化合物E为BCN-Br。
优选地，所述溴胺类为2-溴乙胺或3-溴丙胺。
第三方面，本发明提供了一种由染料分子标记的四嗪探针，包括染料分子和四嗪分子，所述染料分子与四嗪分子的氨基形成共价键，所述染料分子与四嗪分子通过所述共价键相连，所述染料分子为荧光染料分子或近红外染料分子，所述四嗪分子的结构式如P2所示：
其中，R1为或
R2为H或在所述中，X为CH或N。
优选地，所述荧光染料分子为罗丹明、异硫氰酸荧光素、邻苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、芴甲氧羰酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯或N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐。
本发明采用的荧光染料分子优选为但不限于所述罗丹明、异硫氰酸荧光素、邻苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、芴甲氧羰酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯或N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐。
在本发明采用的荧光染料分子中，所述异硫氰酸荧光素为氰酸酯类荧光染料、所述邻苯二甲醛为芳香邻二醛类荧光染料、所述二甲氨基萘磺酰氯为酰氯类荧光染料、所述芴甲氧羰酰氯为氯甲酸酯类荧光染料质、所述6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯为碳酸酯类荧光染料、所述N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐为酸酐类荧光染料，所述氰酸酯类、芳香邻二醛类、酰氯类、氯甲酸酯类、碳酸酯类或酸酐类荧光染料具有能与蛋白质的氨基反应的活性基团，能对蛋白质进行荧光标记；而本发明提供的四嗪分子含有可供反应的氨基，采用所述荧光染料分子标记所述四嗪分子时，荧光染料分子的活性基团与所述四嗪分子的氨基反应形成共价键，从而得到所述由染料分子标记的四嗪探针。
优选地，当所述荧光染料分子为异硫氰酸荧光素（FITC，结构式如M所示）时，所述共价键为四嗪分子的自由氨基经碳酰氨化而形成的硫碳氨基键。
优选地，当所述荧光染料分子为罗丹明（结构式如N所示），所述共价键为四嗪分子的自由氨基经脱水缩合而形成的酰胺键，
优选地，所述近红外染料分子为吲哚菁染料分子或者二氢卟吩分子。
进一步优选地，所述吲哚菁染料分子的结构式如L所示：
其中，X为Cl、Br、I或ClO4，Y为O、N、S或CH(CH3)2，R1为烷基或芳香基，R2为烷基或芳香基，R3为H、CH3、SO3 —或CH3O，R4为H、CH3、SO3 —或CH3O，n为0、1或2。
更进一步优选地，所述吲哚菁染料分子为Cy3或Cy5.5。
具体地，所述Cy3和Cy5.5的结构式如下所示：
本发明采用的近红外染料分子优选为但不限于所述吲哚菁染料分子。
第四方面，本发明提供了一种由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）、提供四嗪分子，所述四嗪分子的结构式如P2所示：
其中，R1为或
R2为H或在所述中，X为CH或N；
（2）、提供染料分子，所述染料分子为荧光染料分子或近红外染料分子；
（3）、将所述染料分子标记在所述四嗪分子的氨基上，得到由染料分子标记的四嗪探针，所述由染料分子标记的四嗪探针包括染料分子和四嗪分子，所述染料分子与四嗪分子的氨基形成共价键，所述染料分子与四嗪分子通过所述共价键相连。
优选地，所述步骤（2）中，所述荧光染料分子为罗丹明、异硫氰酸荧光素、邻苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、芴甲氧羰酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯或N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐。
本发明采用的荧光染料分子优选为但不限于所述罗丹明、异硫氰酸荧光素、邻苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、芴甲氧羰酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯或N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐。
优选地，所述步骤（2）中，所述近红外染料分子为吲哚类菁染料分子。
进一步优选地，所述吲哚菁染料分子的结构式如L所示：
其中，X为Cl、Br、I或ClO4，Y为O、N、S或CH(CH3)2，R1为烷基或芳香基，R2为烷基或芳香基，R3为H、CH3、SO3 —或CH3O，R4为H、CH3、SO3 —或CH3O，n为0、1或2。
更进一步优选地，所述吲哚菁染料分子为Cy3或Cy5。
本发明采用的近红外染料分子优选为但不限于所述吲哚菁染料分子。
优选地，所述步骤（3）中，当所述荧光染料分子为异硫氰酸荧光素（FITC，结构式如M所示）时，所述共价键为四嗪分子的自由氨基经碳酰氨化而形成的硫碳氨基键。
优选地，所述步骤（3）中，当所述荧光染料分子为罗丹明（结构式如N所示），所述共价键为四嗪分子的自由氨基经脱水缩合而形成的酰胺键，
优选地，所述步骤（3）中，所述将染料分子标记在四嗪分子的氨基上，得到由染料分子标记的四嗪探针的操作为：
在N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶存在的条件下，将染料分子与化合物P2按1:1～1.5的摩尔比溶于有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20～30℃下反应0.5～1小时后，经萃取、干燥、硅胶柱层析分离纯化得到所述由染料分子标记的四嗪探针；其中，所述N,N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶的摩尔浓度分别为所述染料分子的0.9～2.5倍和0.1～0.5倍。
进一步优选地，所述染料分子为罗丹明，所述罗丹明的结构式如N所示：
进一步优选地，所述由染料分子标记的四嗪探针的结构式如P3所示；
在此优选条件下，本发明采用4-[1,2,4,5]四嗪-3-基-苄胺（Tz）对罗丹明B（Rb）进行标记：Tz和Rb在缩合剂N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和催化剂4-二甲胺基吡啶(DMAP)的作用下缩合，生成四嗪-罗丹明（Tz-Rb）。Tz为非铜催化的亲双烯体，能够与双烯体BCN在常温下发生快速的偶联反应，从而能够快速检验细胞膜上是否含有BCN-Cho。
本发明第四方面提供的制备方法采用非铜催化的配体基团(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇（BCN）修饰胆碱，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响；四嗪基团与BCN的非铜催化click化学的高效反应速率使得胆碱的标记有更高的灵敏度和分辨率。
本发明提供的胆碱类似物在细胞内能通过胆碱激酶的磷酸化作用形成含有胆碱类似物的磷脂，该磷脂通过一系列细胞内的代谢作用整合到细胞膜上，从而对细胞进行原位标记。然后采用本发明提供的由染料分子标记的四嗪探针与所述结合在细胞膜表面上的胆碱类似物发生非铜催化click化学反应，再通过检测所述四嗪探针上的染料分子，即可对细胞膜表面的胆碱类似物进行示踪。
本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应在常温、生理环境中就能快速发生，且无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响；其次，通过检测所述标记的染料分子可快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的胆碱类似物或第三方面所述的胆碱类似物的制备方法在制备细胞原位检测试剂盒中的应用。
第六方面，本发明提供了一种如第二方面所述的由染料分子标记的四嗪探针或第四方面所述的由染料分子标记的四嗪探针的制备方法在制备细胞原位检测试剂盒中的应用。
第七方面，本发明提供了一种细胞原位检测化合物，所述细胞原位检测化合物为如第一方面所述的胆碱类似物和如第二方面所述的由染料分子标记的四嗪探针进行偶联反应后得到的化合物。
进一步优选地，所述化合物的结构式如P4所示：
式中，k为2～4的自然数。
本发明提供的胆碱类似物及其制备方法和应用、由染料分子标记的四嗪探针及其制备方法和应用具有如下有益效果：
1)本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应在常温、生理环境中就能快速发生，且无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响；
2)本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应后，通过检测所述标记的染料分子可快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪；
3)本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针的制备方法简单易行，可以进行大规模生产，且生产成本低；
4)本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针可用于制备细胞原位检测试剂盒。
附图说明
图1为本发明实施例1～3提供的胆碱类似物的制备流程图；
图2为本发明实施例1提供的胆碱类似物的质谱图；
图3为本发明实施例4～6提供的由染料分子标记的四嗪探针的制备流程图；
图4为本发明实施例4提供的样品的荧光光谱图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
图1为本发明提供的一种胆碱类似物的制备流程图，结合图1，本发明提供了实施例1～3如下：
实施例1
一种胆碱类似物（BCN-Cho）的合成，包括如下步骤：
1）BCN的活化（BCN-pNC）
在100mL无水二氯甲烷中溶解5mmol的BCN，其中加入10mmol的吡啶，搅拌数分钟后加入对5mmol的对硝基苯基氯甲酸酯（pNC），20℃下反应30min，结束后加入饱和氯化铵溶液，萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC（产率为70%）；
2）中间体BCN-Br的合成
将4.4mmol的BCN-pNC溶解在10mL的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入10mmol的2-溴乙胺盐酸盐和10mmol的三乙胺，在20℃下反应30min。混合物浓缩后加入一定量二氯甲烷，并用1N的NaOH溶液及水溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-Br（产率为70%）；
3）BCN修饰的胆碱类似物合成（BCN-Cho）
将5mmol的BCN-Br溶解在20mL的四氢呋喃（THF）中，加入10mmol的二甲基乙醇胺，充分搅拌后，回流状态下反应12小时。反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体BCN-Cho（产率为60%）。
对BCN-Cho进行质谱检测，得到质谱(MS m/z)：309.2160(M+)。为充分说明本发明的有益效果，本实施例还提供了BCN-Cho的质谱图，如图3所示。
实施例2
一种胆碱类似物（BCN-Cho）的合成，包括如下步骤：
1）BCN的活化（BCN-pNC）
在100mL无水二氯甲烷中溶解5mmol的BCN，其中加入15mmol的吡啶，搅拌数分钟后加入对6mmol的对硝基苯基氯甲酸酯（pNC），25℃下反应40min，结束后加入饱和氯化铵溶液，萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC（产率为74%）；
2）中间体BCN-Br的合成
将4.4mmol的BCN-pNC溶解在10mL的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入20mmol的3-溴丙胺盐酸盐和15mmol的三乙胺，在25℃下反应40min。混合物浓缩后加入一定量二氯甲烷，并用1N的NaOH溶液及水溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-Br（产率为78%）；
3）BCN修饰的胆碱类似物合成（BCN-Cho）
将5mmol的BCN-Br溶解在20mL的四氢呋喃（THF）中，加入15mmol的二甲基乙醇胺，充分搅拌后，回流状态下反应14小时。反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体BCN-Cho（产率为70%）。
对BCN-Cho进行质谱检测，得到质谱(MS m/z)：323.2327(M+)。
实施例3
一种胆碱类似物（BCN-Cho）的合成，包括如下步骤：
1）BCN的活化（BCN-pNC）
在100mL无水二氯甲烷中溶解5mmol的BCN，其中加入20mmol的吡啶，搅拌数分钟后加入对7.5mmol的对硝基苯基氯甲酸酯（pNC），30℃下反应60min，结束后加入饱和氯化铵溶液，萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC（产率为69%）；
2）中间体BCN-Br的合成
将4.4mmol的BCN-pNC溶解在10mL的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入15mmol的4-溴丁胺盐酸盐和20mmol的三乙胺，在30℃下反应60min。混合物浓缩后加入一定量二氯甲烷，并用1N的NaOH溶液及水溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-Br（产率为80%）；
3）BCN修饰的胆碱类似物合成（BCN-Cho）
将5mmol的BCN-Br溶解在20mL的四氢呋喃（THF）中，加入10mmol的二甲基乙醇胺，充分搅拌后，回流状态下反应16小时。反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体BCN-Cho（产率为75%）。
对BCN-Cho进行质谱检测，得到质谱(MS m/z)：337.2607(M+)。
图3为本发明提供的一种由染料分子标记的四嗪探针的制备流程图；结合图3，本发明提供实施例4～6如下：
实施例4
一种由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，包括以下步骤：
将5mmol的罗丹明Rb溶解5mL的DMF当中，加入4.5mmol的N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，0.5mmol的4-二甲胺基吡啶(DMAP)和5mmol四嗪（Tz），20℃下搅拌反应12个小时，反应结束后加入二氯甲烷，用饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离纯化得到红色粉末Tz-Rb（产率为75%）。
对Tz-Rb进行质谱检测，得到质谱(MS m/z)：613.3159(M+)。
实施例5
一种由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，包括以下步骤：
将5mmol的罗丹明Rb溶解一定量的DMF当中，加入7.5mmol的N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，0.25mmol的4-二甲胺基吡啶(DMAP)和7mmol四嗪（Tz），25℃下搅拌反应14个小时，反应结束后加入二氯甲烷，用饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离纯化得到红色粉末Tz-Rb（产率为80%），并采用薄层层析（TLC）对照分析本实施例制备的Tz-Rb。
实施例6
一种由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，包括以下步骤：
将5mmol的罗丹明（Rb）溶解一定量的DMF当中，加入12.5mmol的N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，0.25mmol的4-二甲胺基吡啶(DMAP)和7.5mmol四嗪（Tz），30℃下搅拌反应16个小时，反应结束后加入二氯甲烷，用饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离纯化得到红色粉末Tz-Rb（产率为85%），并采用薄层层析（TLC）对照分析本实施例制备的Tz-Rb。
实施例7
为充分说明本发明的有益效果，本实施例采用实施例1制备的胆碱类似物BCN-Cho与实施例4制备的由染料分子标记的四嗪探针Tz-Rb进行反应，反应方程式如下：
为充分说明本发明的有益效果，本实施例还提供了所述BCN-Cho与所述Tz-Rb进行反应后所得产物的荧光光谱分析，作为对照，同时还对所述Tz-Rb进行了荧光光谱分析，结果如图4所示，其中，曲线1为实施例1制备的胆碱类似物Tz-Rb的荧光光谱，曲线2为所述BCN-Cho与所述Tz-Rb进行反应后所得产物的荧光光谱。有图4可知，曲线1的荧光强度低于曲线2，即所述Tz-Rb的四嗪环与BCN-cho反应后提高了Tz-Rb的荧光强度。
本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应在常温、生理环境中就能快速发生，且无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响。
以上结果充分说明了采用本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针能在无铜催化的条件下快速发生偶联反应，能用于对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪，具有低毒、快速、高灵敏、高分辨率的优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种胆碱类似物，其特征在于，结构式如P1所示：
式中，k为2～4的自然数。
2.一种胆碱类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、提供如下结构式表示的化合物A和化合物B：
在催化剂存在的条件下，将所述化合物A和化合物B按1:1～1.5的摩尔比溶于第一有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20～30℃下反应0.5～1小时后，经萃取、干燥、硅胶柱层析分离纯化得到化合物C，其结构式如C所示：
S20、提供如下结构式表示的化合物D：
式中，k为2～4的自然数，
在催化剂存在的条件下，将所述化合物C和化合物D按1:2～5的摩尔比溶于第二有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20～30℃下反应0.5～1小时后，经萃取、干燥、硅胶柱层析分离纯化得到化合物E，其结构式如E所示：
式中，k为2～4的自然数；
S30、将所述化合物E和二甲基乙醇胺按1:1～3的摩尔比溶于第三有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在回流状态下反应12～16小时后，经浓缩、硅胶柱层析分离纯化得到化合物P1，其结构式如P1所示：
式中，k为2～4的自然数。
3.如权利要求2所述的胆碱类似物的制备方法，其特征在于，所述步骤S10中，所述催化剂为吡啶，所述催化剂的摩尔浓度为所述化合物A的2～4倍；所述步骤S20中，所述催化剂为三乙胺或N，N-二异丙基乙胺，所述催化剂的摩尔浓度为所述化合物C的2～5倍。
4.如权利要求2所述的胆碱类似物的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿或N，N-二甲基甲酰胺；所述第二有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；所述第三有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
5.如权利要求1所述的胆碱类似物在制备细胞原位检测试剂盒中的应用。
6.一种细胞原位检测化合物，其特征在于，所述细胞原位检测化合物为如权利要求1所述的胆碱类似物和一种由染料分子标记的四嗪探针进行偶联反应后得到的化合物，所述染料分子标记的四嗪探针包括染料分子和四嗪分子，所述染料分子与四嗪分子的氨基形成共价键，所述染料分子与四嗪分子通过所述共价键相连，所述染料分子为荧光染料分子或近红外染料分子，所述四嗪分子的结构式如P2所示：
其中，R2为
R3为H或在所述中，X为CH或N。
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