CN104740683A - 一种双层结构角膜修复材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双层结构角膜修复材料及其制备方法，包括以下步骤：(1)分别配制羧甲基壳聚糖溶液和明胶溶液；然后混合，加入交联剂，在37℃水浴锅中搅拌24小时，将交联后的溶液浇铸到模具中；(2)将步骤(1)所浇铸的模具中的溶液在-20℃下预冻4小时，然后在-80℃条件下预冻24小时以上，然后真空冷冻干燥48小时以上；(3)将所得的冷冻干燥产物进行压片，即得到角膜组织修复材料的多孔层；(4)在步骤(3)所得多孔层材料的一面涂覆含交联剂的胶原溶液，在室温下自然风干后形成致密层，即得到一种双层结构角膜修复材料。本材料可用于医疗领域中受损角膜组织的修复和替代，其制备工艺简单，设备简易，原料价廉易得。

Description

一种双层结构角膜修复材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种双层结构角膜修复材料及其制备方法，具体涉及到一种制备具有一面致密，而另一面具有多孔结构的生物材料的制备方法。本发明所得的材料可应用于受损角膜组织的修复和替代。

背景技术

角膜疾病是一种十分常见的眼科病,约有三分之一的失明患者是由于角膜疾病而导致的。由于角膜的内皮细胞是不能自动修复或替代的,因此这些角膜疾病患者必须通过手术用供体的健康角膜来替代其损伤角膜,这就导致了对眼库角膜的极大需求量。但是由于健康的捐赠角膜的数量远少于角膜移植的需求量，所以人工角膜的研发就显得十分必要。

人工角膜发展最快的就是其材料的发展,目前制备人工角膜修复材料的方法有很多，大多数都集中在玻璃，聚甲基丙烯酸甲酯，水凝胶，硅凝胶，丙烯酸酯，多孔聚四氟乙烯等材料上。羧甲基壳聚糖(CMC)是甲壳素的一种重要衍生物，其稳定的理化性质以及抗菌，抗感染，抗病毒和抗肿瘤等药理作用决定了它在医药、化工、环保、保健品等领域有着广泛的用途。明胶(Gel)是一种水溶性蛋白质混合物，由皮肤、韧带和肌腱中的胶原经酸或碱部分水解或在水中煮沸而产生，它具有极其优良的物理性质，如胶冻力、高度分散性、低粘度特性、分散稳定性、持水性、韧性及可逆性等，被大量应用于医用软硬胶囊、外科敷料、止血海棉、罐头、肉冻、食品添加剂、糖果、火腿肠等行业。胶原(Col)是是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，在动物细胞中扮演结合组织的角色，是构成细胞外基质的骨架，胶原在细胞外基质中形成半结晶的纤维，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起作用，胶原是生物科技产业最重要的原材料之一，其应用领域包括生物医用材料、化妆品和食品工业等。

理想的人工角膜应该是一种上皮化的“人工供体角膜”，能像角膜移植术一样被植入。这样的人工角膜材料应该具有透明的光学中央部分和与角膜类似的柔韧性，材料在缝合处应有足够的强度。人工角膜在植入后，其前部表面应能上皮化，而镜柱前表面则要求不被上皮细胞覆盖。人工角膜异质材料与角膜组织之间的长期紧贴，透明以及生物相容性是其植入成败的关键因素，所以材料表面能否上皮化显得十分关键。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种简单有效的角膜组织修复材料的方法。本发明采用羧甲基壳聚糖，明胶和从牛筋中提取的I型胶原，按照一定的比例，经过共混交联，冷冻干燥、压片、涂覆和风干等工艺成型，得到一面致密，而另一面有孔的结构梯度分布材料，材料本体无明显的界面层，且在水中浸泡后不发生分层。本材料与天然角膜具有相似的光学和力学性能，材料在缝合处应有足够的强度。角膜上皮细胞可以在本材料的多孔面上粘附、增殖和分泌细胞外基质，使材料的多孔面上皮化，而致密的一面则可以阻止角膜上皮细胞通过前弹力层向基质层迁移，从而获得具有仿生结构的人工角膜组织。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种双层结构角膜修复材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖和明胶原料溶解，抽滤纯化，用去离子水分别配制羧甲基壳聚糖溶液和明胶溶液；然后混合得共混溶液，加入交联剂，在37℃水浴锅中搅拌24小时，将交联后的溶液浇铸到模具中；

(2)将步骤(1)所浇铸的模具中的溶液在-20℃下预冻4小时，然后在-80℃条件下预冻24小时以上，然后真空冷冻干燥48小时以上；

(3)将步骤(2)所得的冷冻干燥产物进行压片，即得到角膜组织修复材料的多孔层；

(4)在步骤(3)所得多孔层材料的一面涂覆含交联剂的胶原溶液，涂层膜在室温下自然风干后，即得到角膜组织修复材料。

步骤(4)中所述胶原溶液是将从牛筋中提取的Ι型胶原纯化，用乙酸溶液配制的胶原溶液。

所述胶原溶液中胶原的质量体积浓度为6.0～10.0mg/ml。

步骤(1)中所述的羧甲基壳聚糖溶液中的羧甲基壳聚糖的质量分数为2～5％，明胶溶液中明胶的质量分数为3～6％。

步骤(1)、(4)所述交联剂为1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的水溶液，1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为4:1。

步骤(1)所述明胶与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6:1；步骤(4)所述含交联剂的胶原溶液中的胶原与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6:1。

在步骤(1)中所述共混溶液中羧甲基壳聚糖与明胶的质量比为(1.5～3.0):(7.0～8.5)。

在步骤(1)中所述的共混溶液中还加有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或透明质酸(HA)，共混溶液中羧甲基壳聚糖、明胶与聚乙烯吡咯烷酮或透明质酸的质量比为(1.5～3.0):(7.0～8.5):(0.5～1.1)。

步骤(3)中所述进行压片的压力为10Mpa，保持此压力1分钟以上。

上述方法制备的角膜组织修复材料的一面致密，而另一面具有多孔结构。

本发明采用羧甲基壳聚糖，明胶和从牛筋中提取的高纯度I型胶原，按照一定的比例，经过共混交联，冷冻干燥、压片、涂覆和风干等工艺成型，得到一面致密，而另一面有孔的结构梯度分布材料，材料本体无明显的界面层，且在水中浸泡后不发生分层。本发明提出的角膜组织修复材料的生物相容性良好，角膜上皮细胞可以在本材料的多孔面上粘附、增殖和分泌细胞外基质，使材料的多孔面上皮化，而致密的一面则可以阻止角膜上皮细胞通过前弹力层向基质层迁移，从而获得具有仿生结构的人工角膜组织。

与国内外现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明制备了具有一面多孔，而另一面致密的结构的角膜组织修复材料，材料本体无明显的界面层，且在水中浸泡后不发生分层。

(2)本发明所制备的材料具有与天然角膜组织类似的理化性能和生物学性能，可用于医疗领域中受损角膜组织的修复和替代。

(3)本发明所采用的成型工艺简单，成本较低，有利于规模生产。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地说明，但本发明要求保护的范围并不局限于提到的实施例表示的范围。

实施例1

以羧甲基壳聚糖(CMC)和明胶(Gel)和胶原(Col)为原料，制备一种CMC-Gel涂层胶原膜材料。这种CMC-Gel涂层胶原膜材料的制备步骤如下：

(1)将羧甲基壳聚糖(CMC)和明胶(Gel)原料溶解，抽滤纯化后，用去离子水分别配制质量分数为2％的羧甲基壳聚糖溶液，质量分数为4％的明胶溶液；将从牛筋中提取的Ι型胶原纯化，用乙酸溶液配制浓度为6mg/mL的胶原溶液；

(2)按照羧甲基壳聚糖与明胶的质量比为1.5:8.5配制两者的共混溶液，加入EDC-NHS溶液(EDC：NHS＝4:1)进行交联，羧甲基壳聚糖-明胶溶液中的明胶与EDC的质量比为6:1，将加入交联剂后的溶液在37℃水浴锅中搅拌反应24小时，将交联后的溶液浇铸到模具中；

(3)将步骤(2)所浇铸的模具中的溶液在-20℃下预冻4小时，然后在-80℃条件下预冻24小时以上，然后真空冷冻干燥48小时；

(4)将步骤(3)所得的冷冻干燥产物在10MPa的压力下进行压片，保持此压力1分钟，即得到具有多孔结构的一层CMC-Gel膜；

(5)在步骤(4)所得的多孔膜一面涂覆含EDC-NHS的胶原溶液6mg/mL，其中胶原与EDC的质量比为6:1，涂层膜在室温下自然风干后，即得到具有一面多孔，而另一面致密的梯度结构材料。

实施例2

以羧甲基壳聚糖(CMC)、明胶(Gel)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和胶原(Col)为原料，制备一种CMC-Gel-PVP涂层胶原膜材料。聚乙烯吡咯烷酮是一种水溶性的高分子，具有优异的溶解性、成膜性和保护胶作用，被广泛用于生物、医药、化妆品和食品等部门。这种CMC-Gel-PVP涂层胶原膜材料的制备步骤如下：

(1)将羧甲基壳聚糖和明胶原料溶解，抽滤纯化后，用去离子水配制质量分数为3％的羧甲基壳聚糖溶液，质量分数为6％的明胶溶液；用去离子水配制质量分数为10％的聚乙烯吡咯烷酮溶液；将从牛筋中提取的Ι型胶原纯化，用乙酸溶液配制浓度为8mg/mL的胶原溶液；

(2)按照羧甲基壳聚糖、明胶与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为2:7.5:0.5配制三者的共混溶液，加入EDC-NHS溶液(EDC：NHS＝4:1)进行交联，羧甲基壳聚糖-明胶溶液中的明胶与EDC的质量比为6:1，将加入交联剂后的溶液在37℃水浴锅中搅拌反应24小时，将交联后的溶液浇铸到模具中；

(3)将步骤(2)所浇铸的模具中的溶液在-20℃下预冻4小时，然后在-80℃条件下预冻24小时以上，然后真空冷冻干燥48小时；

(4)将步骤(3)所得的冷冻干燥产物在10MPa的压力下进行压片，保持此压力2分钟，即得到具有多孔结构的一层CMC-Gel-PVP膜；

(5)在步骤(4)所得的多孔膜一面涂覆加入含EDC-NHS的8mg/mL的胶原溶液，其中胶原与EDC的质量比为6:1，涂层膜在室温下自然风干后，即得到具有一面多孔，而另一面致密的梯度结构材料。

实施例3

以羧甲基壳聚糖(CMC)、明胶(Gel)、透明质酸(HA)和胶原(Col)为原料，制备一种CMC-Gel-HA涂层胶原膜材料。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，它所具有的独特的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，其生理功能是能使水分进入细胞间隙，并与蛋白质结合而形成蛋白凝胶，将细胞粘在一起，发挥正常的细胞代谢作用，起到保持细胞水分，保护细胞不受病原菌的侵害，加快组织的恢复，提高创口愈合再生能力，现已被广泛应用于医药，保养品和化妆品行业。这种CMC-Gel-HA涂层胶原膜材料的制备步骤如下：

(1)将羧甲基壳聚糖和明胶原料溶解，抽滤纯化后，用去离子水配制质量分数为5％的羧甲基壳聚糖溶液，质量分数为3％的明胶溶液；用去离子水配制质量分数为1％的透明质酸溶液；将从牛筋中提取的Ι型胶原纯化，用乙酸溶液配制浓度为10mg/mL的胶原溶液；

(2)按照羧甲基壳聚糖、明胶与透明质酸的质量比为3:6:1配制三者的共混溶液，加入EDC-NHS溶液(EDC：NHS＝4:1)进行交联，羧甲基壳聚糖-明胶溶液中的明胶与EDC的质量比为6:1，将加入交联剂后的溶液在37℃水浴锅中搅拌反应24小时，将交联后的溶液浇铸到模具中；

(3)将步骤(2)所浇铸的模具中的溶液在-20℃下预冻4小时，然后在-80℃条件下预冻24小时以上，然后真空冷冻干燥48小时；

(4)将步骤(3)所得的冷冻干燥产物在10MPa的压力下进行压片，保持此压力3分钟，即得到具有多孔结构的一层CMC-Gel-HA膜；

(5)在步骤(4)所得的多孔膜一面涂覆加入含EDC-NHS的10mg/mL的胶原溶液，其中胶原与EDC的质量比为6:1，涂层膜在室温下自然风干后，即得到具有一面多孔，而另一面致密的梯度结构材料。

Claims (10)

1.一种双层结构角膜修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖和明胶原料溶解，抽滤纯化，用去离子水分别配制羧甲基壳聚糖溶液和明胶溶液；然后混合得共混溶液，加入交联剂，在37℃水浴锅中搅拌24小时，将交联后的溶液浇铸到模具中；

(2)将步骤(1)所浇铸的模具中的溶液在-20℃下预冻4小时，然后在-80℃条件下预冻24小时以上，然后真空冷冻干燥48小时以上；

(3)将步骤(2)所得的冷冻干燥产物进行压片，即得到角膜组织修复材料的多孔层；

(4)在步骤(3)所得多孔层材料的一面涂覆含交联剂的胶原溶液，在室温下自然风干后，即得到角膜修复材料的致密层。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述胶原溶液是将从牛筋中提取的Ι型胶原纯化，用乙酸溶液配制的胶原溶液。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液中胶原的质量体积浓度为6.0～10.0mg/ml。

4.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的羧甲基壳聚糖溶液中的羧甲基壳聚糖的质量分数为2～5％，明胶溶液中明胶的质量分数为3～6％。

5.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、(4)所述交联剂为1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的水溶液，1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为1:1～4:1。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述明胶与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6:1；步骤(4)所述含交联剂的胶原溶液中的胶原与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6:1。

7.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中所述共混溶液中羧甲基壳聚糖与明胶的质量比为(1.5～3.0):(7.0～8.5)。

8.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的共混溶液中还加有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或透明质酸(HA)，共混溶液中羧甲基壳聚糖、明胶与聚乙烯吡咯烷酮或透明质酸的质量比为(1.5～3.0):(7.0～8.5):(0.5～1.1)。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述进行压片的压力为10Mpa，保持此压力1分钟以上。

10.权利要求1～9任一项方法制备的角膜组织修复材料，其特征在于，该材料的一面致密，而另一面具有多孔结构。