CN104726594A - 食源性致病菌五重荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

食源性致病菌五重荧光pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒，主要包括五对特异性引物、EvaGreen PCR预混液、超纯水和阳性对照，特异性引物包括金黄色葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlyA基因、沙门氏菌的invA基因、副溶血性弧菌的tlh基因和志贺氏菌的ipaH基因的特异性引物。本发明所述试剂盒检测周期短、检测成本低、检测结果可靠。

Description

食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒和检测方法。
技术背景
民以食为天，食以安为先。食品安全与人们的生活息息相关，食品安全没有保障，不仅会影响人类的健康与生存，而且还会严重影响社会与经济的发展。2000年世界卫生大会通过了《食品安全决议》，制定了全球食品安全战略，将食品安全列为公共卫生的优先领域。但是食品安全事件时有发生，特别是近年来，由食源性致病菌引起的食物中毒事件在世界范围内大多数国家的发生率显著上升，已成为一个重要的公共卫生问题。引起食源性疾病的金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌等致病菌，很容易通过直接或间接对食物进行污染，导致中毒事件频发。如2009年1月美国的鼠伤寒沙门菌花生酱污染事件，波及43个州，致3人死亡。快速、准确地检测和鉴定食源性致病菌是有效地控制与预防食源性疾病爆发的前提条件。但是有关食源性致病菌快速检测技术平台在我国还比较薄弱，加强食源性致病菌快速检测技术平台的建设具有重要的经济和社会意义。
目前食源性致病菌检测的“金标准”还是传统的分离培养方法，但其检测周期长、检测程序繁琐，不能达到快速检测的目的。实时荧光PCR技术是1996年由美国ABI公司推出的一种新型检测技术，由于实时荧光PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速等优点，在食源性致病菌检测方面已取得了***的成果。但是目前运用于食源性致病菌检测的实时荧光PCR检测试剂盒大部分是基于Taqman探针技术开发的，不但检测成本高，而且进行多重检测时对实时荧光PCR仪的通道数量有一定的要求。熔解曲线（resolution melting）技术是不同于探针技术的又一种实时荧光PCR检测技术，在常规PCR的基础上加入荧光染料，当荧光染料与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱，如果升高温度使DNA变性，以温度为横坐标对荧光信号作图，可得到熔解曲线。把50%DNA分子发生变性的温度称为融点温度(melting temperature，Tm)。如果扩增产物长度不同、其GC比值不同，进行溶解分析时就会有其独特的熔解曲线，并且熔解曲线性质、位置和Tm值都是不同的。如果不同病原菌扩增产物长度不同、其GC比值不同，进行熔解分析时就会有其独特的熔解曲线。由于早期使用的荧光染料SYBR Green I为不饱和染料，稳定性差而且存在着染料重分布问题，从而限制了熔解曲线技术的应用。随着饱和荧光染料LC Green和Eva Green的发明，解决了不饱和染料稳定性差而且存在着染料重分布的问题，基于熔解曲线技术的多重荧光PCR已经在检验检测领域显示出了巨大的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于熔解曲线技术的食源性致病菌五重实时荧光PCR检测试剂盒，通过一次反应快速、经济和可靠的完成金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌等五种食源性致病菌的检测。
本发明基于熔解曲线技术，以金黄色葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlyA基因、沙门氏菌的invA基因、副溶血性弧菌的tlh基因和志贺氏菌的ipaH基因为靶基因。
食源性致病菌五重实时荧光PCR检测试剂盒包括五对特异性引物、EvaGreen PCR预混液、超纯水和阳性对照，其中EvaGreen PCR预混液包括PCR缓冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶和饱和荧光染料EvaGreen，阳性对照为金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌标准菌株DNA提取液。超纯水可同时作为阴性对照。
所述五对特异性引物的序列如下：
nuc上游引物：5’-AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC-3’
nuc下游引物：5’-CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA-3’
hlyA上游引物：5’-AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3’
hlyA下游引物：5’-TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG-3’
invA上游引物：5’-CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3’
invA下游引物：5’-GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3’
tlh上游引物：5’-CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3’
tlh下游引物：5’-CGGGTTAGGGAAGCGCCATT-3’
ipaH上游引物：5’-GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3’
ipaH下游引物：5’-TTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG-3’ 。
本发明的关键在于扩增引物的设计，染料类实时荧光PCR能用于多重检测是因为如果不同的扩增产物长度不同、其GC比值不同，进行溶解曲线分析时就会有其独特的溶解曲线，并且溶解曲线性质、位置和Tm值都是不同的。因此引物设计时不但要采用blast分析保证引物的特异性，还要考虑扩增产物的长度和GC比值，保证进行溶解曲线分析时不同的靶基因的能产生具有不同Tm值的溶解曲线。除引物外本发明所需其他试剂，如EvaGreen PCR预混液，包括PCR缓冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶和饱和荧光染料EvaGreen，EvaGreen PCR预混液可购买商品化的EvaGreen PCR预混液，也可自行配制，本发明中使用商品化的Bio-Rad SsoFast EvaGreen预混液；阳性对照为金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌标准菌株DNA提取液；超纯水可同时作为阴性对照。
本发明还涉及五种食源性致病菌五重实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)取特异性引物和EvaGreen PCR预混液，分别加入阴性对照、阳性对照或待测样品DNA形成扩增反应体系；
所述步骤(2)的优选扩增体系见表1。
(3)将扩增反应体系置于实时荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应条件为：95℃预变性2min，95℃5s、62.3℃30s进行30个循环，在退火阶段采集荧光，最后进行熔解曲线监测，即完成上述最后一个循环后，温度升至73℃，保温5s后以0.1℃/s的升温速率逐渐升至88℃，在此升温过程中进行荧光强度的连续检测。并根据熔解曲线判断样品中是否含有这五种致病菌，金黄色葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlyA基因、沙门氏菌的invA基因、副溶血性弧菌的tlh基因和志贺氏菌的ipaH基因扩增产物的Tm值分别为75.5 ± 0.3 ℃、78.5 ± 0.2 ℃、80.8 ± 0.5 ℃、84 ± 0.1 ℃和86.5 ± 0.2 ℃。
本发明的优势主要体现在：(1)具有实时荧光PCR快速、灵敏和自动化程度高的优点；(2)不需要合成昂贵的检测探针，检测成本低；(3)探针法五重实时荧光PCR需要5个不同的荧光通道才能完成5个靶基因的检测，因此不适用于部分只有两个荧光通道的实时荧光PCR仪，如Bio-Rad MyiQ 2，本发明只需最为常规的FAM/SYBR通道即可完成5个靶基因的检测，几乎适用于所有市售实时荧光PCR仪。
附图说明
图1是金黄色葡萄球菌标准菌株的熔解曲线分析图。
图2是单增李斯特菌标准菌株的熔解曲线分析图。
图3是沙门氏菌标准菌株的熔解曲线分析图。
图4是副溶血性弧菌标准菌株的熔解曲线分析图。
图5是志贺氏菌标准菌株的熔解曲线分析图。
图6是金黄色葡萄球菌标准菌株不同浓度DNA模板对应的标准曲线。
图7是单增李斯特菌标准菌株不同浓度DNA模板对应的标准曲线。
图8是沙门氏菌标准菌株不同浓度DNA模板对应的标准曲线。
图9是副溶血性弧菌标准菌株不同浓度DNA模板对应的标准曲线。
图10是志贺氏菌标准菌株不同浓度DNA模板对应的标准曲线。
具体实施方式
    本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1：五种食源性致病菌实时荧光PCR检测方法的建立
提取金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌标准菌株DNA为模板，用五对特异性引物在实时荧光PCR仪上进行扩增反应，20μL扩增反应体系为：模板DNA1μL，Bio-Rad SsoFast EvaGreen预混液10μL，10μmol/L nuc上下游引物各1.4μL，10μmol/L hlyA上下游引物各1.2μL ，10μmol/L invA上下游引物各1μL，10μmol/L tlh上下游引物各0.8μL， 10μmol/L ipaH上下游引物各0.8μL，超纯水补足至20μL。扩增反应条件为：95℃预变性2min，95℃5s、62.3℃30s进行30个循环，在退火阶段采集荧光，最后进行熔解曲线监测，即完成上述最后一个循环后，温度升至73℃，保温5s后以0.1℃/s的升温速率逐渐升至88℃，在此升温过程中进行荧光强度的连续检测。并根据熔解曲线判断样品中是否含有这五种致病菌，金黄色葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlyA基因、沙门氏菌的invA基因、副溶血性弧菌的tlh基因和志贺氏菌的ipaH基因扩增产物的Tm值分别为75.5 ± 0.3 ℃、78.5 ± 0.2 ℃、80.8 ± 0.5 ℃、84 ± 0.1 ℃和86.5 ± 0.2 ℃，熔解曲线分析结果如图1-5所示。
实施例2：特异性实验
以阪崎肠杆菌(ATCC 51329)、大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞杆菌(ATCC 27853)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC 23715)、蜡样芽孢杆菌(ATCC 11778)、拟态弧菌（ATCC 33653）、溶藻弧菌（ATCC 17749）作为待测样品，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、伤寒沙门菌(ATCC 50097)、福氏志贺氏菌(ATCC 12022)、副溶血性弧菌（ATCC 33847）和单增李斯特菌(CMCC 54006)作为阳性对照，超纯水作为阴性对照。阪崎肠杆菌(ATCC 51329)、大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞杆菌(ATCC 27853)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC 23715)、蜡样芽孢杆菌(ATCC 11778)、拟态弧菌（ATCC 33653）、溶藻弧菌（ATCC 17749）、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、伤寒沙门菌(ATCC 50097)、福氏志贺氏菌(ATCC 12022)和副溶血性弧菌（ATCC 33847）来源于美国模式培养物集存库；单增李斯特菌(CMCC 54006)来源于中国医学细菌保藏管理中心；按照实施方案1所述方法进行检测，阳性对照均产生了明显的扩增曲线，其他菌株和阴性对照均无扩增曲线产生。
实施例3：灵敏度实验
以金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌标准菌株DNA提取液为模板，用超纯水稀释形成一系列稀释度，每个稀释度各取1μL模板DNA按照前面所述方法进行检测，每个稀释度各做3个复孔，按照实施方案1所述方法进行检测。结果显示，各标准菌株模板DNA的浓度与Cq值有良好的线性关系，浓度越高Cq值越低，检测结果参见图6-10。
实施例4：人工模拟污染食物样本的检测
    采用人工模拟污染经GB4789检测五种致病菌为阴性的食物样本，将金黄色葡萄球菌(ATCC 25923) 、单增李斯特菌(CMCC 54006)、伤寒沙门菌(ATCC 50097)、副溶血性弧菌（ATCC 33847）和福氏志贺氏菌(ATCC 12022)标准菌株菌悬液接种到五种致病菌为阴性的食物样本，加改良SSSLE培养液过夜培养，按照实施例1所述方法进行检测。各份样本均能准确检测出所接种的致病菌的特异性熔解曲线峰，无非特异性熔解曲线峰出现。
实施例5：市售食物样本的检测
将市场上购买的80份食物样本加改良SSSLE培养液过夜培养，按照实施方案1所述方法进行检测。其中21份样本被1种或多种致病菌污染，3份样本沙门氏菌阳性，5份样本李斯特菌阳性，5份样本金黄色葡萄球菌阳性，6份样本副溶血性弧菌阳性，2份样本沙门氏菌和副溶血性弧菌阳性，1份样本金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌阳性，志贺氏菌未检出。同时平行按照GB4789进行检测的结果也与本发明的检测结果一致。
<110>嘉兴市疾病预防控制中心
<120>食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒
<160>10
 
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC    28
 
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA    29
 
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT     28
 
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG     24
 
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC     25
<210>6
 
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
GCCGCCAAACCTAAAACCAGC     21
 
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
CGAACGAGAACGCAGACATTACG    23
 
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
CGGGTTAGGGAAGCGCCATT    20
 
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC    26
 
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
TTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG    24

Claims (2)

1.一种食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括五对特异性引物、EvaGreen PCR预混液、阳性对照和超纯水，其中EvaGreen PCR预混液包括PCR缓冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶和饱和荧光染料EvaGreen，阳性对照为金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌标准菌株DNA提取液，所述五对特异性引物序列如下：
nuc上游引物：5’-AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC-3’
nuc下游引物：5’-CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA-3’
hlyA上游引物：5’-AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3’
hlyA下游引物：5’-TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG-3’
invA上游引物：5’-CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3’
invA下游引物：5’-GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3’
tlh上游引物：5’-CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3’
tlh下游引物：5’-CGGGTTAGGGAAGCGCCATT-3’
ipaH上游引物：5’-GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3’
ipaH下游引物：5’-TTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG-3’。
2.   根据权利要求1所述的一种食源性致病菌五重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，超纯水同时作为阴性对照。
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