CN104726518A - 一种微生物絮凝剂的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种微生物絮凝剂的生产方法,涉及一种絮凝剂的生产方法。本发明是要解决现有的絮凝剂生产方法周期长,絮凝剂的絮凝效果差的问题。方法:一、挑取不动杆菌接种到富培养基中培养得到活化的菌液,接种到产絮培养基中;二、发酵培养,得发酵液;三、将发酵液离心收集菌体沉淀,加入细菌裂解液,超声波破碎,离心收集上清,加入CTAB,静置离心,收集沉淀物,加入无水乙醇和丙酮,离心收集上清,加入乙醇,离心收集沉淀,清洗沉淀,此沉淀即为微生物絮凝剂。本发明方法的生产周期短,微生物絮凝剂的絮凝效果好。用于废水处理领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种絮凝剂的生产方法。
背景技术
絮凝技术是目前给水和废水处理采用的主要方法,其效果主要取决于絮凝剂种类。在絮凝技术发展史上,无机盐类絮凝剂(如硫酸铝、氯化铁等)处理效果不理想。而聚合无机盐型絮凝剂(如聚合氯化铝、聚合硫酸铁等)处理效果虽良好,但用量大,对环境有二次污染。如,铝离子可毒害水生生物和微生物,通过食物链和饮用水,最终危害人类健康。而铁系絮凝剂对金属有腐蚀性,且使水有颜色,这使铝及铁盐絮凝剂的应用大受限制。有机高分子絮凝剂如PAM具有用量少、絮凝速度快,但残留物不易被生物降解,且其单体有强烈的神经毒性和“三致”效应,造成二次污染,也要限制其应用。生物絮凝剂可称为第三代絮凝剂,是一种具有高效絮凝活性的微生物代谢产物或化学改性天然有机高分子絮凝剂,它是利用生物技术,通过微生物的发酵培养,从微生物代谢产物中提取、纯化而获得的新型水处理剂,其主要成分有蛋白质、多糖、脂类、纤维素、DNA及有絮凝活性的菌体。
微生物絮凝剂(Microbial flocculant)是一种对污染物具有吸附、中和和絮凝作用的大分子产品,它具有安全、高效、易生物降解、无二次污染等特点最早发现产絮凝微生物的是美国科学家But-terfield,他于1935年从活性污泥中筛选出菌胶团产生菌。目前国外的研究者已经开发出一系列微生物絮凝剂,有的已经应用到相关废水处理和工业处理中。
传统方法培养菌种时,通常采用营养丰富的培养基,以达到微生物快速生长和最大生物产量,结果分离的大多为生长快速且偏爱丰富营养的微生物,而且在自然界中,除了一些利用高浓度营养的微生物种群外,其余可能是以中低营养甚至寡营养的方式生活,在低营养浓度下,可以吸收足够的有机质维持生长。当微生物从自然环境转移到营养丰富的人工培养是,一些摄取营养能力强的会应运而生,而寡培养的微生物会因浓度高的营养基质而抑制生长。而刚果红是一种染料与具有螺旋构象的多糖可以形成络合物,可与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物。
发明内容
本发明是要解决现有的絮凝剂生产方法周期长,絮凝剂的絮凝效果差的问题,提供一种微生物絮凝剂的生产方法。
本发明微生物絮凝剂的生产方法,按以下步骤进行:
一、挑取不动杆菌接种到富培养基中,于28℃~35℃、140r/min~160r/min、pH6.5~7.5的条件下培养18h~24h,得到活化的菌液,将活化的菌液按照5%的接种量,接入产絮培养基中;
二、按照以下条件进行发酵培养:初始pH为6~8,培养温度为15℃~30℃,摇床转速为120r/min~150r/min,培养时间为20h~30h,得发酵液;
三、将发酵液于3000r/min离心10min,收集菌体沉淀,PBS洗2~3遍,然后加入细菌裂解液,再于冰浴条件进行超声波破碎20min,所得溶液于8000r/min离心5min,收集上清,加入CTAB,混匀后形成沉淀,静置离心,收集沉淀物,用无水乙醇和丙酮分别清洗沉淀2~3次,此沉淀即为微生物絮凝剂;将微生物絮凝剂冷冻干燥保存。
本发明的有益效果如下:
(1)本发明方法的生产周期短,微生物絮凝剂的絮凝效果好。
(2)微生物絮凝剂为微生物菌体或菌体外分泌的生物高分子物质,属于天然有机高分子絮凝剂,它安全无毒,经鉴定其絮凝成分为多糖,可用于食品、医药等行业的发酵后处理对人体和动物无任何毒副作用。
(3)无二次污染,絮凝成分可自行降解。
(4)微生物絮凝剂价格低廉。微生物絮凝剂是微生物菌体或有机高分子,比化学絮凝剂便宜。微生物絮凝剂是靠生物发酵产生的,化学絮凝剂是人工合成的。从生产所用原材料,生产工艺能源消耗等方面考虑,微生物絮凝剂是经济的。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式微生物絮凝剂的生产方法,按以下步骤进行:
一、挑取不动杆菌接种到富培养基中,于28℃~35℃、140r/min~160r/min、pH 6.5~7.5的条件下培养18h~24h,得到活化的菌液,将活化的菌液按照5%的接种量,接入产絮培养基中;
二、按照以下条件进行发酵培养:初始pH为6~8,培养温度为15℃~30℃,摇床转速为120r/min~150r/min,培养时间为20h~30h,得发酵液;
三、将发酵液于3000r/min离心10min,收集菌体沉淀,PBS洗2~3遍,然后加入细菌裂解液,再于冰浴条件进行超声波破碎20min,所得溶液于8000r/min离心5min,收集上清,加入CTAB,混匀后形成沉淀,静置离心,收集沉淀物用无水乙醇和丙酮分别清洗沉淀2~3次,此沉淀即为微生物絮凝剂;将微生物絮凝剂冷冻干燥保存。
本实施方式方法的优点为减少能耗,提高生产效率,有效降低生产成本,为最终实现大规模生物絮凝剂的商品化制备,提供了一种快速的微生物絮凝剂生产方法,用该方法生产的微生物絮凝剂可以获得高的絮凝效率。
本实施方式步骤一所述不动杆菌文件为不动杆菌LLin6(Acinetobacter sp.),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2014年12月15日,保藏编号为CGMCC No.10180。
步骤三所述细菌裂解液为RIPA裂解液,购买自Biosharp公司。
本实施方式不动杆菌是从污泥中筛选得到的,具体步骤如下:
(a)取活性污泥10g加入装有90mL无菌水并加有玻璃珠的灭菌三角瓶内,150r/min摇床震荡20min,使其打散成均匀地悬液,用无菌水稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的梯度,各取0.2mL的稀释液均匀涂布在含刚果红(浓度为10mg/mL)的寡培养基平板上,30℃恒温倒置培养2d~3d,培养后挑出有红色、深红、橙色的菌株在液体富培养基培养后在固体富培养基上进行平板划线分离,连续划线分离纯化得到纯菌种。
(b)初筛:将分离得到的纯菌株接种到富集培养基中置于摇床33℃,150r/min震荡培养24h~48h,取培养液1mL接种到产絮培养基中培养24h。在试管中装入20mL 4g/L高岭土悬浊液,加入几滴絮凝剂样品,观察是否有絮团生成,如果有絮团生成,说明该菌能产生絮凝剂。
(c)复筛:取10mL发酵培养液置于含有5g/L高岭土悬浊液混凝搅拌机中,再加入10%氯化钙,调节pH至中性,取液面下2cm处样品于550nm处测定吸光度,并以加蒸馏水的高岭土悬液做空白对照,计算其絮凝活性。公式如下:
絮凝率(%)=(A-B)/A×100%
A为对照组在550nm处的吸光度,B为样品在550nm处的吸光度,每个样品重复3次,取平均值。
(d)菌种保存在含30%甘油的PBS中于-80℃冰箱中保存。
富集培养基由MgSO4·7H2O 0.2g/L、葡萄糖5g/L、牛肉膏3.8g/L、蛋白胨10g/L、琼脂16g/L、pH 7.2和蒸馏水组成;
产絮培养基由14~18g/L葡萄糖、8~12g/L蔗糖、0.5~0.8g/L酵母膏、0.08~0.15g/L尿素、0.4~0.6g/L硫酸铵、0.8~1.2g/L KH2PO4、2~3g/L K2HPO4、0.2~0.4g/L MgSO4、0.1~0.3g/LNaCl和蒸馏水组成。
寡培养基由酵母膏0.5g/L、蛋白胨0.5g/L、酪蛋白水解物0.5g/L、葡萄糖0.5g/L、可溶性淀粉0.5g/L、K2HPO40.3g/L、MgSO40.005g/L、丙酮酸钠0.3g/L、琼脂15g/L、刚果红10mg/mL和蒸馏水组成,pH7.0~7.2。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一所述富集培养基由0.2g/L MgSO4·7H2O、5g/L葡萄糖、3.8g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、16g/L琼脂和蒸馏水组成,pH为7.2。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤一所述产絮培养基由14~18g/L葡萄糖、8~12g/L蔗糖、0.5~0.8g/L酵母膏、0.08~0.15g/L尿素、0.4~0.6g/L硫酸铵、0.8~1.2g/L KH2PO4、2~3g/L K2HPO4、0.2~0.4g/L MgSO4、0.1~0.3g/L NaCl和蒸馏水组成。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:步骤一中于33℃、150r/min、pH 7.2的条件下培养24h。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:步骤三中细菌裂解液的体积为发酵液体积的10%。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是:步骤三中上清中CTAB的质量百分浓度为1%。其它与具体实施方式一至五之一相同。
为验证本发明的有益效果,进行以下实验:
实施例1:
本实施例微生物絮凝剂的生产方法,按以下步骤进行:
一、挑取不动杆菌接种到富培养基中,于33℃、150r/min、pH 7.2的条件下培养24h,得到活化的菌液,将活化的菌液按照5%的接种量,接入产絮培养基中;
所述富集培养基由0.2g/L MgSO4·7H2O、5g/L葡萄糖、3.8g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、16g/L琼脂和蒸馏水组成,pH为7.2;
所述产絮培养基由15g/L葡萄糖、10g/L蔗糖、0.8g/L酵母膏、0.1g/L尿素、0.5g/L硫酸铵、1g/L KH2PO4、2.5g/L K2HPO4、0.3g/L MgSO4、0.2g/LNaCl和蒸馏水组成;
二、按照以下条件进行发酵培养:初始pH为6,培养温度为30℃,摇床转速为150r/min,培养时间为28h,得发酵液;
三、将发酵液于3000r/min离心10min,收集菌体沉淀,PBS洗3遍,然后加入细菌裂解液,再于冰浴条件进行超声波破碎20min,所得溶液于8000r/min离心5min,收集上清,加入CTAB,混匀后形成沉淀,静置离心,收集沉淀物,用无水乙醇和丙酮分别清洗沉淀3次,此沉淀即为微生物絮凝剂。
步骤一所述不动杆菌文件为不动杆菌LLin6(Acinetobacter sp.),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2014年12月15日,保藏编号为CGMCC No.10180。
制得微生物絮凝剂粗品,经测定其主要成分为荚膜多糖,是该菌生长过程中分泌而来。
采用传统的混凝杯罐试验,测定其对1000mL哈尔滨工业大学实验室排出的污水的絮凝率。投加微生物絮凝剂粗品0.25g,调节pH为6~10,加入10%质量分数的CaCl2溶液。在140r/min~180r/min条件下搅拌100s~140s,再以20r/min~60r/min的速度搅拌100s~140s后,室温下静沉15min~25min,空白对照中不加生物絮凝剂发酵液,其他处理都相同,测定上清液在波长550nm下的吸光度值,按照下式计算絮凝率。
式中A为空白对照上清液的吸光度,B为样品上清液的吸光度。
经计算得到絮凝率为87.66%。
实施例2:
本实施例微生物絮凝剂的生产方法,按以下步骤进行:
一、挑取不动杆菌接种到富培养基中,与33℃、150r/min、pH4.2的条件下培养24h,得到活化的菌液,将活化的菌液按照5%的接种量,接入产絮培养基中;
所述富集培养基由0.2g/L MgSO4·7H2O、5g/L葡萄糖、3.8g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、16g/L琼脂和蒸馏水组成,pH为7.2;
所述产絮培养基由15g/L葡萄糖、8g/L蔗糖、0.8g/L酵母膏、0.2g/L尿素、0.5g/L硫酸铵、1g/L KH2PO4、2.5g/L K2HPO4、0.3g/L MgSO4、0.2g/LNaCl和蒸馏水组成;
二、按照以下条件进行发酵培养:初始pH为6.5,培养温度为25℃,摇床转速为150r/min,培养时间为28h,得发酵液;
三、将发酵液于3000r/min离心10min,收集菌体沉淀,PBS洗3遍,然后加入细菌裂解液,再于冰浴条件进行超声波破碎20min,所得溶液于8000r/min离心5min,收集上清,加入CTAB,混匀后形成沉淀,静置离心,收集沉淀物,用无水乙醇和丙酮分别清洗沉淀3次,此沉淀即为微生物絮凝剂。
步骤一所述不动杆菌文件为不动杆菌LLin6(Acinetobacter sp.),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2014年12月15日,保藏编号为CGMCC No.10180。
制得微生物絮凝剂粗品,经测定其主要成分为荚膜多糖,是该菌生长过程中分泌而来。
采用传统的混凝杯罐试验,测定其对1000mL哈尔滨工业大学食堂洗手间污水的絮凝率。投加微生物絮凝剂粗品0.25g,调节pH为6~10,加入10%质量分数的CaCl2溶液。在140r/min~180r/min条件下搅拌100s~140s,再以20r/min~60r/min的速度搅拌100s~140s后,室温下静沉15min~25min,空白对照除不加生物絮凝剂发酵液之外其他处理都相同,测定上清液在波长550nm下的吸光度值,按照下式计算絮凝率
式中A为空白对照上清液的吸光度,B为样品上清液的吸光度。
经计算得到絮凝率为91.47%。
实施例3:
本实施例微生物絮凝剂的生产方法,按以下步骤进行:
一、挑取不动杆菌接种到富培养基中,与33℃、150r/min、pH 4.2的条件下培养24h,得到活化的菌液,将活化的菌液按照5%的接种量,接入产絮培养基中;
所述富集培养基由0.2g/L MgSO4·7H2O、5g/L葡萄糖、3.8g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、16g/L琼脂和蒸馏水组成,pH为7.2;
所述产絮培养基由15g/L葡萄糖、10g/L蔗糖、0.7g/L酵母膏、0.1g/L尿素、0.5g/L硫酸铵、1g/L KH2PO4、2.5g/L K2HPO4、0.3g/L MgSO4、0.2g/LNaCl和蒸馏水组成;
二、按照以下条件进行发酵培养:初始pH为6,培养温度为20℃,摇床转速为150r/min,培养时间为24h,得发酵液;
三、将发酵液于3000r/min离心10min,收集菌体沉淀,PBS洗3遍,然后加入细菌裂解液,再于冰浴条件进行超声波破碎20min,所得溶液于8000r/min离心5min,收集上清,加入CTAB,混匀后形成沉淀,静置离心,收集沉淀物,用无水乙醇和丙酮分别清洗沉淀3次,此沉淀即为微生物絮凝剂。
步骤一所述不动杆菌文件为不动杆菌LLin6(Acinetobacter sp.),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2014年12月15日,保藏编号为CGMCC No.10180。
制得微生物絮凝剂粗品,经测定其主要成分为荚膜多糖,是该菌生长过程中分泌而来。
采用传统的混凝杯罐试验,测定其对1000mL哈尔滨工业大学四公寓寝室排出的生活污水的絮凝率。投加微生物絮凝剂粗品0.25g,调节pH为6~10,加入10%质量分数的CaCl2溶液。在140r/min~180r/min条件下搅拌100s~140s,再以20r/min~60r/min的速度搅拌100s~140s后,室温下静沉15min~25min,空白对照除不加生物絮凝剂发酵液之外其他处理都相同,测定上清液在波长550nm下的吸光度值,按照下式计算絮凝率
式中A为空白对照上清液的吸光度,B为样品上清液的吸光度。
经计算得到絮凝率为90.91%。
Claims (6)
1.一种微生物絮凝剂的生产方法,其特征在于该方法按以下步骤进行:
一、挑取不动杆菌接种到富培养基中,于28℃~35℃、140~160r/min、pH6.5~7.5的条件下培养18h~24h,得到活化的菌液,将活化的菌液按照5%的接种量,接入产絮培养基中;
二、按照以下条件进行发酵培养:初始pH为6~8,培养温度为15℃~30℃,摇床转速为120r/min~150r/min,培养时间为20h~30h,得发酵液;
三、将发酵液于3000r/min离心10min,收集菌体沉淀,PBS洗2~3遍,然后加入细菌裂解液,再于冰浴条件进行超声波破碎20min,所得溶液于8000r/min离心5min,收集上清,加入CTAB,混匀后形成沉淀,静置离心,收集沉淀物,用无水乙醇和丙酮分别清洗沉淀2~3次,此沉淀即为微生物絮凝剂;将微生物絮凝剂冷冻干燥保存。
2.根据权利要求1所述的一种微生物絮凝剂的生产方法,其特征在于步骤一所述富集培养基由0.2g/L MgSO4·7H2O、5g/L葡萄糖、3.8g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、16g/L琼脂和蒸馏水组成,pH为7.2。
3.根据权利要求1或2所述的一种微生物絮凝剂的生产方法,其特征在于步骤一所发酵培养基由14~18g/L葡萄糖、8~12g/L蔗糖、0.5~0.8g/L酵母膏、0.08~0.15g/L尿素、0.4~0.6g/L硫酸铵、0.8~1.2g/L KH2PO4、2~3g/L K2HPO4、0.2~0.4g/L MgSO4、0.1~0.3g/L NaCl和蒸馏水组成。
4.根据权利要求3所述的一种微生物絮凝剂的生产方法,其特征在于步骤一中于33℃、150r/min、pH 7.2的条件下培养24h。
5.根据权利要求4所述的一种微生物絮凝剂的生产方法,其特征在于步骤三中细菌裂解液的体积为发酵液体积的10%。
6.根据权利要求5所述的一种微生物絮凝剂的生产方法,其特征在于步骤三中上清中CTAB的质量百分浓度为1%。
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