CN104725531A - 一种高效提取肝素钠的生产工艺 - Google Patents

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董浩
张秀民
罗志良
符绍辉
程榆茗
夏毅强
高振宏
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Abstract

本发明涉及一种高效提取肝素钠的生产工艺，以终产物肝素钠效价做为指标，以猪小肠黏膜做为原料，通过酶解-树脂吸附/洗脱-膜分离-乙醇沉淀-干燥的生产工艺方法，从中提取高效价的抗凝血药物肝素钠。与传统的盐解-离子交换-乙醇沉淀法相比，酶法与膜分离技术和沉淀技术的有效结合，可以有效提高所提取肝素钠的效价至160U/mg，比传统方法提高近64%，最后回收率提高29%。同时，可以缩短后续精制工序，降低生产成本，提高肝素钠分离的收率和效率。

Description

一种高效提取肝素钠的生产工艺
（一）技术领域
本发明涉及一种高效提取肝素钠的方法，具体涉及一种利用酶法与膜分离技术和沉淀技术有效结合，从而高效提取肝素钠的生产工艺。
（二）背景技术
肝素是一种由D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和L-艾杜糖醛酸多种糖类组成的酸性黏多糖，广泛存在于哺乳动物肠黏膜、心脏、肝脏、肺、血液、胰腺和胎盘等组织中。具有良好的抗凝血、降血脂、促纤维蛋白溶解、抗中膜平滑肌细胞增殖等方面的活性,被广泛用于心脑血管疾病的治疗。肝素钠是肝素的钠盐形式，在肝素提取过程中将其以钠盐的形式制备，便于药效和活性的保存，同时可作为药物制剂使用。目前，肝素钠的工厂规模化生产多以猪、羊、牛的小肠黏膜及牛肺等为原料，采用盐解-树脂吸附/洗脱-乙醇沉淀的工艺方法进行。而这种工艺生产出的肝素钠产率低、效价低，且肝素钠精品的获得还需经过复杂的氧化、纯化等工艺过程，工作繁琐、成本居高。
（三）发明内容
本发明的目的提供一种酶解-树脂吸附/洗脱-膜分离-乙醇沉淀-干燥的生产工艺方法，通过酶法与膜分离技术和沉淀技术的有效结合，改善肝素钠提取工艺，获得高效价的肝素钠精品。
如上构思，本发明的技术方案是：一种高效提取肝素钠的生产工艺，其特征在于：包括如下步骤：
①肠黏膜酶解：将收集的肠黏膜加水稀释至波美度为8-9，调节pH至8.0-10.0，加热煮沸变性10-20min，待温度降至50-55℃时，酶解，酶解液离心后，收集上清液；
②树脂吸附：调节上清液pH至9-9.5，浓度调节至波美度为8-9，加入6%树脂，于室温下搅拌吸附10-12h；
③树脂洗涤与洗脱：吸附完成后，静置20-40min，吸去上层液体，然后漂洗树脂，最后搅拌洗脱树脂2次，每次时间4-5h，将两次洗脱液合并；
④膜分离：将步骤④洗脱液边搅拌边用PAN膜浓缩，滤速为30-40mL/min，至膜上部分占总体积的10-15%时，停止浓缩过程，收集膜上残留部分；
⑤乙醇沉淀：将步骤⑤收集物中边搅拌边加入1.5倍体积的95%乙醇，密封静置过夜，使之充分沉淀，除去上层乙醇溶液；再分别用2倍体积的95%乙醇和无水乙醇各沉淀一次，收集沉淀，将所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥，即得分离纯化的肝素钠。
上述步骤①的酶解条件是：加入1%(m/v)蛋白复合酶酶解，收集上清液；酶解保温2h；离心的条件是：酶解液于4℃、4000r/min离心15min。
上述步骤②的树脂采用6%D254型树脂。
上述步骤②搅拌速度为50-60r/min
上述步骤③用分别用蒸馏水和1.2mol/L氯化钠漂洗树脂，加入1倍树脂体积的4mol/L氯化钠溶液洗脱。
上述PAN膜截留分子量为3000-4000。
上述蛋白复合酶为包含胃蛋白酶和胰蛋白酶的商用复合酶。
本技术方案与传统工艺相比优点在于：
酶法与膜分离技术和沉淀技术的有效结合，可以有效提高所提取肝素钠的效价至160U/mg，比传统的盐解-离子交换-乙醇沉淀法提高近64%，最后回收率提高29%。
第1，本技术方案中，高温的碱性环境，可以使与肝素结合在一起的蛋白分子充分变性，酶解可以促使蛋白分子进一步变为小分子的多肽，因而更容易与肝素分离，同时，酶解温度为50-55℃，温和的酶解环境，可以保证蛋白酶的高活性，又有效保护肝素钠较少受蛋白酶的破坏，保持肝素钠产物的效价。
第2，本技术方案中，酶解液先经过树脂吸附分离过程，可以将分子量大于肝素分子的蛋白、核酸、色素等其它杂质有效去除，减少下一步膜分离的负荷。
第3，本技术方案中，膜分离所用PAN膜截留分子量为3000-4000，可以将分子量大于肝素分子的小分子杂质有效去除，同时保证肝素钠产物的效价。
第4，本技术方案中，膜分离的截留量保持在总体积15%左右，可以使大部分的小分子蛋白质、核酸及其他一些杂质被有效去除，又不使肝素钠效价丢失。
（四）具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明：
一种高效提取肝素钠的生产工艺，包括如下步骤：
1、材料预处理
新鲜猪小肠冲洗干净，剪开，用刀片刮取肠黏膜，收集至自封袋中，4℃保存备用。
2、酶解
将步骤1中收集的肠黏膜50kg加水稀释至波美度为8-9(波美计测量，4mol/L氯化钠调节浓度)，调节pH至8.0-10.0，加热煮沸变性15min，待温度降至50-55℃左右时，加入1%(m/v)蛋白复合酶，酶解保温2h，酶解液于4℃、4000r/min离心15min，收集上清液。
3、树脂吸附
调节上清液pH至9-9.5，浓度调节至波美度为8-9(波美计测量，4mol/L氯化钠调节浓度)，加入6%D254型树脂，于室温下搅拌吸附10-12h，搅拌速度为50-60r/min。
4、树脂洗涤与洗脱
吸附完成后，静置30min，虹吸吸去上层液体，分别用蒸馏水和1.2mol/L氯化钠漂洗树脂。然后加入1倍树脂体积的4mol/L氯化钠溶液，搅拌洗脱2次，每次时间5h，将两次洗脱液合并。
5、膜分离
将步骤4洗脱液边搅拌边用PAN膜(Mr3000-4000)浓缩，滤速为30-40mL/min，至膜上部分占总体积的15%左右时，停止浓缩过程，收集膜上残留部分。
6、乙醇沉淀
将步骤5收集物中边搅拌边加入1.5倍体积的95%乙醇，密封静置过夜，使之充分沉淀，采用虹吸法除去上层乙醇溶液。再分别用2倍体积的95%乙醇和无水乙醇各沉淀一次，收集沉淀。将所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥8h，即得分离纯化的肝素钠15kg。

Claims (7)

1.一种高效提取肝素钠的生产工艺，其特征在于：包括如下步骤：
①肠黏膜酶解：将收集的肠黏膜加水稀释至波美度为8-9，调节pH至8.0-10.0，加热煮沸变性10-20min，待温度降至50-55℃时，酶解，酶解液离心后，收集上清液；
②树脂吸附：调节上清液pH至9-9.5，浓度调节至波美度为8-9，加入树脂，于室温下搅拌吸附10-12h；
③树脂洗涤与洗脱：吸附完成后，静置20-40min，吸去上层液体，然后漂洗树脂，最后搅拌洗脱树脂2次，每次时间4-5h，将两次洗脱液合并；
④膜分离：将步骤④洗脱液边搅拌边用PAN膜浓缩，滤速为30-40mL/min，至膜上部分占总体积的10-15%时，停止浓缩过程，收集膜上残留部分；
⑤乙醇沉淀：将步骤⑤收集物中边搅拌边加入1.5倍体积的95%乙醇，密封静置过夜，使之充分沉淀，除去上层乙醇溶液；再分别用2倍体积的95%乙醇和无水乙醇各沉淀一次，收集沉淀，将所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥，即得分离纯化的肝素钠。
2.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺，其特征在于：上述步骤①的酶解条件是：加入1%(m/v)蛋白复合酶酶解，收集上清液；酶解保温2h；离心的条件是：酶解液于4℃、4000r/min离心15min。
3.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺，其特征在于：上述步骤②的树脂采用D254型树脂。
4.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺，其特征在于：上述步骤②搅拌速度为50-60r/min
5.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺，其特征在于：上述步骤③用分别用蒸馏水和1.2mol/L氯化钠漂洗树脂，加入1倍树脂体积的4mol/L氯化钠溶液洗脱。
6.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺，其特征在于：上述PAN膜截留分子量为3000-4000。
7.根据权利要求2所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺，其特征在于：上述蛋白复合酶为包含胃蛋白酶和胰蛋白酶的商用复合酶。
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