CN104710632A - 一种聚乙二醇化的Cu3BiS3空心纳米球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的制备方法，包括如下步骤：1）制备A混合溶液：将氯化铜CuCl₂、五水硝酸铋Bi(NO₃)₃?5H2O，溶于乙二醇中，搅拌1小时后得到A混合溶液，CuCl₂、Bi(NO₃)₃?5H2O、乙二醇的比例为0.45mmol:0.15mmol:55ml;制备B混合溶液：将L-半胱氨酸、PEG（Mn=2000），溶于乙二醇，搅拌1小时后得到B混合溶液；L-半胱氨酸、PEG、乙二醇的比例为0.6mmol：4mL:5mL；CuCl₂、Bi(NO₃)₃?5H₂O和L-半胱氨酸的摩尔比为3:1:4；2）将步骤1）得到的A混合溶液在200℃条件下油浴回流反应1h，得到A反应液；将步骤1）得到的B混合溶液注入A反应液中，搅拌1小时后转移到高压釜中，在200℃条件下反应1h，冷却，离心，洗涤，干燥，即得聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球。

Description

一种聚乙二醇化的Cu3BiS3空心纳米球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的制备方法。

背景技术

光热消融治疗作为治疗癌症的一种新方法近年来受到极大地关注，选择合适的光热转换材料尤为重要。目前的光热转换材料主要有四大类：贵金属基光热转换材料、碳基光热转换材料、有机化合物光热转换材料、半导体光热转换材料。在具有超强光热转化效率的纳米材料中，广泛研究的是贵金属纳米材料，如金纳米颗粒。但是贵金属材料存在成本较高，光稳定性不好，具有一定的生物毒性等不足。特别是，受光激发下，材料会发生形貌变化甚至发生融化，从而导致等离子共振吸收峰会随着光致而偏移，最终影响到光热效果。碳基光热材料存在光热转化效率低，光热效果差等不足。至于有机化合物光热材料，尽管它们的生物毒性较低，但是存在光热转换效率低、光热性能不稳定、易被光漂白、需要使用高功率激光密度等缺点。

相比而言，铜基半导体光热剂是一类新型近红外响应的光热转换材料，具有生物毒性低、吸收系数大、光稳定性好、价格便宜等优点，在癌症细胞消融方面具有明显优势。但是目前报道的铜基材料存在光学吸收系数小，光热转化率不高；材料尺寸过大不适合生物体系应用；产物未经高分子改性而不稳定、易聚沉；比表面积较小难以载药等不足。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种操作过程简便、所需原材料易得，制造成本低的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的制备方法，该方法制得的Cu₃BiS₃空心纳米球可以负载高剂量的药物，具有高效的光热转化效率。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的制备方法，包括如下步骤： 1）制备A混合溶液：将氯化铜CuCl₂、五水硝酸铋Bi(NO₃)₃5H2O，溶于乙二醇中，搅拌1小时后得到A混合溶液，CuCl₂、Bi(NO₃)₃5H2O、乙二醇的比例为0.45 mmol: 0.15 mmol:55 ml; 制备B混合溶液：将L-半胱氨酸、PEG（Mn=2000），溶于乙二醇，搅拌1小时后得到B混合溶液；L-半胱氨酸、PEG、乙二醇的比例为0.6 mmol：4 mL:5 mL；

CuCl₂、Bi(NO₃)₃5H₂O和L-半胱氨酸的摩尔比为3:1:4；

2）将步骤1）得到的A混合溶液在200 ℃条件下油浴回流反应1 h，得到A反应液；将步骤1）得到的B混合溶液注入A反应液中，搅拌1小时后转移到高压釜中，在200 ℃条件下反应1 h，冷却，离心，洗涤，干燥，即得聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球。

进一步的，所述步骤1）中B混合溶液的PEG分子量为2000，用量为4mL。

进一步的，所述步骤2）中高压釜为150 mL的聚四氟乙烯不锈钢反应釜。

所述步骤2）中洗涤过程采用为水、乙醇各洗涤3-5次。

进一步的，制得的所述Cu₃BiS₃空心纳米球应用于红外光激发的药物传递、热疗、热疗协同化疗杀死癌细胞

本发明制得的纳米Cu₃BiS₃经聚乙二醇修饰后，则可以阻止它们被蛋白质吸附、提高它们的生物相容性及防止它们在生物环境下的团聚;当纳米Cu₃BiS₃制备成空心结构时，则有利于光在其空腔中的多次反射，从而增加了光能利用率;同时，空心纳米球具有大的比表面积，可以负载高剂量的药物;因此，制备聚乙二醇化的空心结构的Cu₃BiS₃纳米球，既可以保证满足生物医学应用要求，又增强了红外光的利用率，表现为提高了其光热转化效率;且具有高比表面积的纳米空心球，又可以负载高剂量的药物，同时实现药物传递、光热释药及光热协同药物疗法来治愈癌细胞。

综上所述，本发明具有以下优点：1）本发明具有环境友好、原材料廉价易得、操作过程简便、重复率高等优点；2）本发明的产物在溶液中的分散性好，稳定性高；可以很好的分散在水、乙醇、甲苯等极性与非极性溶剂中。3）本发明制得的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球具有可以忽略的细胞毒性；4）本发明制得的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球在近红外区有很强的吸收，能有效的将近红外光转换成热；在对人体安全功率为0.72 Wcm^-2的980 nm的激光照射下，5 min内含本发明制得的Cu₃BiS₃空心纳米球的水溶液能升高30 ℃，而纯水仅升高3 ℃；5) 本发明提供的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球具有多功能性,在红外光激发下能够实现药物传递，光热杀死癌细胞，以及光热协同药物杀死癌细胞。

附图说明

图1为本发明制备的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的透射电镜照片。 图2为本发明制备的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的XRD花样。

图3 为本发明制备的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的红外光谱。

图4为本发明制备的Cu₃BiS₃空心纳米球的紫外吸收光谱。

图5为本发明制备的Cu₃BiS₃空心纳米球的细胞毒理性图片。

图6为本发明制备的Cu₃BiS₃空心纳米球在功率为0.72 Wcm^-2的980 nm激光器照射下温度-时间曲线图。

图7为Hela细胞在不同浓度的Cu₃BiS₃纳米球存在下，经功率为0.72 Wcm^-2的980 nm激光照射5 min 后细胞的抑制情况。

图8为不加纳米粒子的正常Hela细胞、本发明制备的Cu₃BiS₃空心纳米球(5g/mL)处理Hela细胞24 h后的显微图像及本发明制备的Cu₃BiS₃空心纳米球(5g/ml)在0.72 Wcm^-2的980 nm激光器照射Hela细胞5 min 显微图像三者间的对比图。

图9 为制备的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球在不同pH条件下，光热释放药物情况。

图10为热疗、药疗及热疗协同药疗杀死癌细胞的情况。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

实施例1

制备聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球

1）制备A混合溶液：将0.45 mmol氯化铜CuCl₂、0.15 mmol五水硝酸铋Bi(NO₃)₃5H2O，溶于55 ml乙二醇中，然后搅拌，得到A混合溶液；

制备B混合溶液：将0.6 mmol L-半胱氨酸、4 ml PEG（Mn=2000），溶于5 ml乙二醇，然后搅拌，得到B混合溶液；其中，CuCl₂、Bi(NO₃)₃5H₂O和L-半胱氨酸的摩尔比为3:1:4。

2）将步骤1）得到的A混合溶液在200 ℃条件下油浴回流反应1 h,得到A反应液中；将步骤1）得到的B混合溶液迅速注入A反应液中，搅拌1小时候，立即转移到150ml的聚四氟乙烯不锈钢反应釜内，于200 ℃条件下反应1 h，冷却，离心，洗涤，干燥，即得所述光热转换材料，其中，所述洗涤为水、乙醇各洗涤3-5次；透射电镜照片显示产物为空心纳米球，粒径为100-150 nm ,如图1所示；粉末X-射线衍射研究表明产物为纯相的Cu₃BiS₃，如图2所示；红外光谱表明，产物表面含有聚乙二醇，如图3所示。紫外漫反射谱测试显示Cu₃BiS₃空心纳米球对红外光有很好的吸收性能，如图4所示。

实施例2

将实施例1制得的12 mg聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球分别超声分散在4 ml水、乙醇与甲苯中。12小时后观察，，聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球仍然可以在中保持很好的分散性与稳定性。

实施例3

1)用96孔细胞培养板培养HeLa细胞，保证每个孔的细胞数为5×10³个，用含胎牛血清培养基（DMEM）在CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养24小时；

2)24小时后吸掉培养液，并用PBS冲洗一次HeLa细胞，洗掉已凋零死亡的HeLa细胞；加入无血清DMEM培养基，在CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养12小时；

3)12小时后吸掉培养液，用含胎牛血清DMEM培养基分散实施例1中制得的Cu₃BiS₃空心纳米球配成浓度为1 mg/ml的Cu₃BiS₃空心纳米球培养基溶液，用DMEM稀释成一系列浓度的溶液（0.5，5，10，20，100 μg/ml），并用这一系列浓度的溶液代替细胞培养基进行HeLa细胞培养，每个浓度都设置10个副孔，同时另外设置10个孔为阴性对照组（加不含Cu₃BiS₃空心纳米球的胎牛血清培养基，随后其余实验条件一致）在CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养24小时；

4)24小时后，每个孔中加入20 μl（5 mg/ml) 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），随后放入CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养4小时；

5)4小时后，出现蓝色大颗粒结晶，加入200μlDMSO，放到低速摇床上震荡10 min，用酶标仪测得490 nm下的光学密度值。细胞毒理性研究表明，Cu₃BiS₃空心纳米球显示可以忽略的毒性,如图图6、图9中的a、b部分所示；

实施例4

1.将实施例1制得的聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球重新分散于高纯水中，浓度为1 mg/ml，取其2 ml加入到石英比色皿（容量3 ml）中，磁子搅拌，用测温仪测得其初始温度为22 ℃；

2.固定980 nm激光器到石英比色皿的距离为5 cm，调节激光器电流大小，控制输出功率为1.2 Wcm^-2，间隔30 s读取测温仪温度示数，记录温度，300 s后测得末温为52 ℃，即5 min中温度升高了30 ℃ ,如图7所示，说明Cu₃BiS₃空心纳米球可以有效的将近红外光转化为热，具有很好的光热转化性能

3.取2 ml高纯水加入同等容量石英比色皿中，磁子搅拌，用测温仪测得初始温度为22 ℃，同样固定980 nm激光器到石英比色皿的距离为5cm，调节激光器电流大小，控制输出功率为1.2 Wcm^-2，间隔30s读取测温仪温度示数，记录温度，300 s后测得末温为25 ℃，即5 min中温度升高了3 ℃，如图7所示，结果表明没有Cu3BiS3空心纳米球存在时，水吸收红外光仅产生有限的热。

实施例5

1）用96孔细胞培养板培养HeLa细胞，保证每个孔的细胞数为5×10³个，用含胎牛血清培养基（DMEM）在CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养24小时；

2）24小时后吸掉培养液，并用PBS冲洗一次HeLa细胞，洗掉已凋零死亡的HeLa细胞；加入无血清DMEM培养基，在CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养12小时；

3）12小时后吸掉培养液，用含胎牛血清DMEM培养基分散实施例1中制得的Cu₃BiS₃空心纳米球，配成浓度为1 mg/ml的Cu₃BiS₃空心纳米球培养基溶液，用DMEM稀释成一系列浓度的溶液（0.1，0.5，1，5，10，25 μg/ml），并用这一系列浓度的溶液代替细胞培养基进行HeLa细胞培养，每个浓度都设置8个副孔，同时另外设置8个孔位阴性对照组（加不含Cu₃BiS₃空心纳米球的胎牛血清培养基，随后其余实验条件一致）在CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养24小时；

4）取出96孔板后，固定980 nm激光器到孔液面距离为5 cm，调节电流大小控制激光器输出功率为0.72 Wcm^-2，从上往下照射每个孔的时间为5 min；

5）照射结束后每个孔中加入20 ul（5 mg/ml) 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），随后放入CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养4小时；

4小时后，出现蓝色大颗粒结晶，加入200 μl DMSO，放到低速摇床上震荡10 min，用酶标仪测得490 nm下的光学密度值。光学密度值分析结果（如图8所示）和显微镜观察（如图9中的c部分所示）表明，5μg/mL浓度的Cu₃BiS₃空心纳米球即可以有效消融癌细胞。

实施例6

1）2 mg DOX分散到20 ml超纯水中，搅拌溶解后，紫外可见分光光度计测得480 nm处最强吸光度值。

2）10 mg Cu₃BiS₃空心纳米球分散到20 ml的DOX水溶液中（0.1 mg/ml)，室温下暗处搅拌48小时，吸附平衡后离心(1000 rpm）10 min，并用超纯水洗两遍，洗去未吸附的DOX，收集上清液，用紫外可见分光光度计测得480 nm处最强吸光度值，剩余固体粉末放于60 ℃的真空干燥箱干燥6小时。

3）取步骤2）中所得的固体粉末（Cu₃BiS₃-DOX）分别分散到2 ml PBS（pH ＝5）和2 ml PBS（pH＝7）溶液中，形成两种浓度为1 mg/ml的溶液。在37 ℃的环境温度下搅拌，间隔1小时后两种溶液各用980 nm激光器（输出功率为0.72 Wcm^-2）照射5 min，各取1 ml上诉照射后的溶液离心取上清液用紫外可见分光光度计测其480 nm吸光度值，同时离心后的粉末用等pH 等体积的新PBS溶液分散补回原来的2 ml溶液中，重复上诉操作继续进行药物释放研究5小时。如图10所示，样品在红外光辐照下，特别是pH = 5时，显示很好的释放性能。

实施例7

1）10 mg Cu₃BiS₃空心纳米球分散到20 ml（0.1 mg/ml)的DOX溶液中，室温下暗处搅拌48小时，吸附平衡后离心(1000 rpm）10 min，并用高纯水洗两遍，洗去未吸附的DOX，剩余黑色固体粉末放于60 ℃的真空干燥箱干燥6小时。

2）取步骤1）所得的黑色固体粉末2 mg分散到DMEM培养基中（1 mg/ml)，并用DMEM稀释成一系列浓度的溶液（0.1，0.5，1，5，10，25 μg/ml），替代细胞培养基进行HeLa细胞培养（5×10³ 个/孔，经24小时培养），每个浓度都设置8个副孔，同时另外设置8个孔为阴性对照组（纯胎牛血清培养基，随后其余实验条件一致）在CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养24小时；

3）取出96孔板后，固定980 nm激光器到孔液面距离为5 cm，调节电流大小控制激光器输出功率为0.72 Wcm^-2，从上往下照射每个孔的时间为5 min；

4）照射结束后每个孔中加入20 ul（5 mg/ml) 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），随后放入CO₂含量5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养4小时；

5）4小时后，出现蓝色大颗粒结晶，加入200 μl DMSO，放到低速摇床上震荡10 min，用酶标仪测得490 nm下的光学密度值。

如图10所示，在光热及药物协同作用下，样品显示最佳的杀死细胞功能。

Claims (5)

1.一种聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 1）制备A混合溶液：将氯化铜CuCl₂、五水硝酸铋Bi(NO₃)₃•5H2O，溶于乙二醇中，搅拌1小时后得到A混合溶液，CuCl₂、Bi(NO₃)₃•5H2O、乙二醇的比例为0.45 mmol: 0.15 mmol:55 ml; 制备B混合溶液：将L-半胱氨酸、PEG（Mn=2000），溶于乙二醇，搅拌1小时后得到B混合溶液；L-半胱氨酸、PEG、乙二醇的比例为0.6 mmol：4 mL:5 mL；

CuCl₂、Bi(NO₃)₃•5H₂O和L-半胱氨酸的摩尔比为3:1:4；

2）将步骤1）得到的A混合溶液在200 ℃条件下油浴回流反应1 h，得到A反应液；将步骤1）得到的B混合溶液注入A反应液中，搅拌1小时后转移到高压釜中，在200 ℃条件下反应1 h，冷却，离心，洗涤，干燥，即得聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球。

2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中B混合溶液的PEG分子量为2000，用量为4mL。

3.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化的Cu_3BiS_{3 空}心纳米球的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中高压釜为150 mL的聚四氟乙烯不锈钢反应釜。

4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中洗涤过程采用为水、乙醇各洗涤3-5次。

5.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化的Cu₃BiS₃空心纳米球的制备方法，其特征在于：制得的所述Cu₃BiS₃空心纳米球应用于红外光激发的药物传递、热疗、热疗协同化疗杀死癌细胞。