CN104707136A - 新型双功能抗体偶联物及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型双功能抗体偶联物及其制法和用途。本发明的双功能抗体偶联物包括以下结构：特异性针对免疫细胞的第一抗体和特异性针对肿瘤标志物的第二抗体，二者通过偶联臂偶联在一起，该双功能抗体偶联物与免疫细胞(如CIK)结合后可以显著提高杀瘤活性。本发明还提供了新型双功能抗体偶联物在***等疾病治疗中的作用。本发明还提供了一种抗HER2阳性癌症的双特异性抗体及其制备工艺，不仅可简便快速地生产高偶联率、高活性的双特异性抗体，而且可使CIK杀瘤活性提高2～6倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药和抗体化学偶联技术领域。更具体地，本发明涉及新型双功能抗体偶联物及其制法和用途。
背景技术
据世界卫生组织统计，全世界每年死于恶性肿瘤的人数已超过700万，将逐渐成为威胁人类生存的头号杀手。
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段。
双特异性抗体治疗作为当今细胞治疗领域一项热门的技术，结合了抗体与细胞治疗的优点，在国外已经应用于癌症、自身免疫性疾病及干细胞治疗，一部分已进入临床试验并取得了显著的抗肿瘤功效。双特异性抗体利用抗体与抗原特异性结合原理将杀伤性细胞靶向定位于肿瘤细胞部位，技术成熟可靠，副作用小，特异性强，是细胞治疗的首选方案。
据统计，2010年全球单抗药物市场已经达到500亿美元的规模，2009～2011年双特异性抗体的总交易量也已经超过35亿，推测比单抗药物药效更好的双特异性抗体将在以后占据更大的市场份额，成为销售额最大的生物医药。
目前，已经有超过40种不同形式的双特异性抗体在实验室得到合成，并且还有更多的双特异性抗体在不断合成。截至目前已有十余种双特异性抗体已经进入临床I期或II、III期研究，其中Herceptin/OKT3双特异性抗体已进入临床I/II期研究，CD20/CD3双特异性抗体已进入临床I期研究，双特异性抗体“Catumaxomab”已经在2009年被欧洲药品管理局正式批准作为治疗恶性胸腹水的药物。
目前，随着研究的逐渐深入，双特异性抗体在治疗及辅助治疗免疫相关性疾病的作用机制日趋明确，具有显著疗效，亦已成为抗体工程研究领域的热点，因此，双特异性抗体在免疫性疾病的治疗中具有广阔的应用前景。
然而，到目前为止，双特异性抗体的化学偶联效率还不能令人满意。因此，本领域迫切需要开发新的生产双特异性抗体的工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的、偶联效率高、方法简便的生产双特异性抗体的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种1.一种双功能抗体偶联物，所述双功能抗体偶联物具有式Ia或式Ib所述结构：
A-B-C (Ia)，或
C-B-A (Ib)
其中，
A为特异性针对免疫细胞的第一抗体；
B为位于A和C之间的偶联臂；
C为特异性针对肿瘤标志物的第二抗体；
“-”表示连接上述元件的化学键。
在另一优选例中，所述的第一抗体选自下组：抗CD3的抗体、抗CTLA4抗体或其组合；和/或
所述的第二抗体选自下组：抗HER2的抗体、抗EGFR的抗体或其组合。
在另一优选例中，所述的第一抗体和/或第二抗体是单克隆抗体。
在另一优选例中，所述抗体偶联物具有以下一种或多种特性：
a)可以同时与CIK细胞和肿瘤细胞这两种细胞结合；
b)在4℃或-20℃条件下可长时间(6、12、24个月或更长)保存。
在另一优选例中，所述的偶联臂选自下组：
式中，各结构式两侧的“-”表示分别与第一抗体和第二抗体相连的键(化学键或共价键)。
在另一优选例中，所述的双功能抗体偶联物结构如下：
式中，
X为第一抗体A或第二抗体C；
Z为第一抗体A或第二抗体C；并且，X和Z中一个为第一抗体，另一个为第二抗体；
并且与X和Z相连的－HN-或－NH－表示衍生自抗体的－NH2基团的亚胺基。
如本发明第一方面所述的双功能抗体偶联物，所述的第一抗体是抗CD3抗体，而所述的第二抗体是抗HER2抗体。
在本发明第二方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有本发明第一方面所述的双功能抗体偶联物，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面，提供了一种制备药物组合物的方法，包括步骤：将本发明第一方面所述的双功能抗体偶联物与药学上可接受的载体进行混合，从而制得药物组合物。
在本发明的第四方面，提供了一种制备抗肿瘤药物的方法，包括步骤：
(a)将本发明第一方面所述的双功能抗体偶联物与免疫细胞进行混合，从而形成“双功能抗体偶联物－免疫细胞”的复合物，
(b)将所述复合物制成抗肿瘤药物。
在另一优选例中，所述的药物为液态形式。
如本发明第一方面所述的双功能抗体偶联物的用途，用于制备治疗疾病的药物。
在另一优选例中，所述的疾病包括肿瘤。
在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明第一方面所述的双功能抗体偶联物的方法，它包括步骤：
(a)提供式II所示的第一中间体；和式III所示的第二中间体
式中，
X为第一抗体A或第二抗体C；
Z为第一抗体A或第二抗体C；并且，X和Z中一个为第一抗体，另一个为第二抗体；
(b)将式II所示的第一中间体与式III所示的第二中间体进行偶联反应，从而形成式IV所示的双功能抗体偶联物：
式中，
X为第一抗体A或第二抗体C；
Z为第一抗体A或第二抗体C；并且，X和Z中一个为第一抗体，另一个为第二抗体。
在另一优选例中，所述方法包括：
(1)将抗CD3的单克隆抗体溶解于反应缓冲液A；Traut’s reagent溶解于ddH2O配制成母液，使用时用反应缓冲液A或ddH2O稀释。
(2)将抗HER2的单克隆抗体溶解于反应缓冲液B；Sulfo-SMCC溶解于ddH2O配制成母液，使用时用反应缓冲液B或ddH2O稀释。
(3)将Traut’s reagent与抗CD3单克隆抗体以摩尔比5:1-10:1混合，Sulfo-SMCC与抗HER2单克隆抗体以摩尔比4:1-20:1混合。
(4)将步骤（2）（3）中混合后反应物于10-35℃（较佳地15-28℃）下反应20-240分钟（较佳地30-120分钟）；用Zeba脱盐柱离心脱盐，去除多余未交联的Traut’sreagent及Sulfo-SMCC，脱盐用缓冲液成分为反应缓冲液B。
(5)将步骤（4）中获得的与偶联剂Traut’sreagent偶联后的抗CD3单克隆抗体和与偶联剂Sulfo-SMCC偶联后的抗HER2单克隆抗体，以1:2－2:1的摩尔比（较佳地约1:1的等摩尔比）混合后，在10-42℃（较佳地15-37℃）下反应10-90分钟（较佳地20-60分钟）。在另一优选例中，步骤（1）中所述的反应缓冲液A的成分为：150mM NaCl，2mM EDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH8.0。
在另一优选例中，步骤（2）中所述的反应缓冲液B的成分为：150mM NaCl，2mM EDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2。
在另一优选例中，步骤（3）中所述的Traut’s reagents与抗CD3单克隆抗体摩尔比为5:1-10:1；Sulfo-SMCC与抗HER2单克隆抗体摩尔比为4:1-20:1。
在另一优选例中，步骤（4）中所述的单克隆抗体与偶联剂反应条件为15-28℃下反应60分钟；脱盐用缓冲液成分为反应缓冲液B（150mM NaCl，2mM EDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2）。
在另一优选例中，步骤（5）中与偶联剂Traut’s reagent偶联后的抗CD3单克隆抗体和与偶联剂Sulfo-SMCC偶联后的抗HER2单克隆抗体等摩尔比混合后进行偶联后，可使双特异性抗体偶联率高达40%。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了双特异性抗体偶联CIK细胞治疗工艺流程图。
图2显示了双特异性抗体偶联技术原理图。
图3显示了双特异性抗体偶联CIK细胞结构示意图。
图4显示了偶联剂与抗体反应摩尔比对偶联效率的影响。其中：M代表分子量标准(Marker)；1代表抗CD3单克隆抗体；2代表抗HER2单克隆抗体；3代表，Traut’s reagent:抗CD3单克隆抗体=10:1×Sulfo-SMCC:抗HER2单克隆抗体=20:1；4代表，Traut’s reagent:抗CD3单克隆抗体=10:1×Sulfo-SMCC:抗HER2单克隆抗体=40:1；5代表，Traut’s reagent:抗CD3单克隆抗体=10:1×Sulfo-SMCC:抗HER2单克隆抗体=60:1；6代表其它抗体偶联结果对比。
图5显示了反应温度、反应时间、反应摩尔比对抗体偶联效率的影响。其中，M：Marker；1：抗CD3单克隆抗体；2：抗HER2单克隆抗体；3：偶联Traut’s reagent后的抗CD3单克隆抗体37℃孵育30分钟；4：Traut’s reagent:抗CD3单克隆抗体=10:1×Sulfo-SMCC:抗HER2单克隆抗体=20:1在37℃下反应30分钟；5：Traut’s reagent:抗CD3单克隆抗体=5:1×Sulfo-SMCC:抗HER2单克隆抗体=4:1在37℃下反应30分钟；6：偶联Traut’s reagent后的抗CD3单克隆抗体4℃孵育过夜（16个小时）；7：Traut’s reagent:抗CD3单克隆抗体=10:1×Sulfo-SMCC:抗HER2单克隆抗体=20:1在4℃下反应过夜（16个小时）；8：Traut’s reagent:抗CD3单克隆抗体=5:1×Sulfo-SMCC:抗HER2单克隆抗体=4:1在4℃下反应过夜（16个小时）。
图6显示了抗体偶联效率电泳检测图谱。其中，M：Marker；1：抗CD3单克隆抗体；2：抗HER2单克隆抗体；3：偶联Traut’s reagent后的抗CD3单克隆抗体；4：偶联Sulfo-SMCC后的抗HER2单克隆抗体；5：Traut’s reagent:抗CD3单克隆抗体=10:1×Sulfo-SMCC:抗HER2单克隆抗体=20:1在室温下反应30分钟。
图7显示了双特异性抗体最终工艺产品电泳检测图谱。其中，M：Marker；1：抗CD3单克隆抗体；2：抗HER2单克隆抗体；3：抗CD3×抗HER2双特异性抗体。
图8显示了双特异性抗体对SK-BR-3及CIK的特异性检测。其中，PBS：PBS处理组；OKT3：125ng抗CD3单克隆抗体/106CIK细胞处理组；Herceptin：125ng抗HER2单克隆抗体/106CIK细胞处理组；OKT3+Herceptin：（125ng抗CD3单克隆抗体+125ng抗HER2单克隆抗体）/106CIK细胞处理组；BsAb：50ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK细胞处理组。
图9显示了双特异性抗体与CIK细胞偶联饱和度的检测情况。
图10显示了CIK表面抗CD3单抗的检测情况。
图11显示了CIK表面抗HER2单抗的检测情况。
图12显示了双特异性抗-CIK细胞与肿瘤细胞的比例对杀伤效果的影响。
图13显示了双特异性抗体剂量对肿瘤杀伤效果的影响。
图14显示了最优条件下双特异性抗体杀瘤活性检测。
图15显示了双特异性抗体对SK-BR-3及MCF-7的杀伤活性对比。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过改进偶联工艺，首次提供了一种偶联效率高、方法简便的制备双特异性抗体的方法。用本发明方法制备的双特异性抗体，不仅偶联率非常高(高达约40%)，而且很好地保留了第一抗体和第二抗体的各自活性。此外，本发明的双特异性抗体可显著提高CIK的杀瘤活性，提高幅度高达2-6倍或更高。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人以医用单克隆抗体莫罗莫那-CD3（抗CD3单克隆抗体药物）和赫赛汀（抗HER2单克隆抗体药物）为原材料，通过抗体与偶联剂偶联、脱盐、抗体与抗体偶联等步骤，制备具有增强CIK肿瘤杀伤活性的高偶联率抗CD3×抗HER2双特异性抗体。试验表明，抗CD3×抗HER2双特异性抗体偶联率高达到40%，远高于约10%的现有技术水平；此外，将抗CD3×抗HER2双特异性抗体与CIK孵育偶联后，能够将CIK杀瘤活性显著提高约6倍。
术语
如本文所用，术语“双特异性抗体”、“双功能抗体偶联物”可互换使用，指由第一抗体和第二抗体通过偶联臂所形成的偶联物，该偶联物保留了各自抗体的活性，故具有双功能和双特异性。在本发明中，第一抗体和第二抗体通常是不同的抗体。例如，第一抗体是特异性结合免疫细胞的抗体，而第二抗体是特异性针对肿瘤标志物或肿瘤细胞的抗体。
抗体
本发明中，“抗体”指对本发明蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能分别结合于本发明蛋白或其片段。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
在本发明中，不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
HER2
人类表皮生长因子受体2（英语：human epidermal growth factor receptor2，缩写为HER2，亦称为Neu、ErbB-2、CD340（分化群340）或p185）是一种由ERBB2基因编码的蛋白质。HER2是表皮生长因子受体（EGFR/ErbB）家族中的成员之一。
大约有20-30%的乳癌会有HER-2过度表现的现象。HER-2是细胞膜上的一种接受器，与人类表皮生长因子EGF有高度专一性。当EGF与HER-2结合后，会造成HER-2的双聚体化，进而引发自体磷酸化而传递细胞内讯息传递，最后维持正常的细胞生长与***。当HER-2过度表现，细胞会因过度刺激而造成不正常的快速生长，最终造成癌症发生。
第一抗体
可用于本发明的第一抗体没有特别限制，可以是任何特异性结合于免疫细胞(如CIK)的抗体、或识别免疫细胞表面标志物的任何抗体。
在本发明中，典型的免疫细胞包括(但并不限于)：细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK细胞）、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltratinglymphocyte,TIL细胞）、细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）、树突状细胞（dendritic cell，DC）、或其组合。其中，特别优选的免疫细胞是CIK细胞。
在本发明中，一类优选的第一抗体包括(但并不限于)：抗CD3的抗体、抗CTLA4或其组合。
在本发明中，一类优选的第一抗体是特异性结合于CIK细胞的抗体(如抗CD3的抗体)。
第二抗体
可用于本发明的第二抗体没有特别限制，可以是所有特异性结合于肿瘤标志物或肿瘤细胞的抗体。
一类优选的第二抗体包括(但并不限于)：抗HER2的抗体、抗EGFR的抗体或其组合。
偶联臂和偶联方法
可用于本发明的偶联臂没有特别限制，可以是所有能够将第一抗体和第二抗体连接在一起的基团。在本发明中，通常偶联臂与第一和第二抗体恒定区(尤其是位于恒定区末端或末端附近)的－NH2进行连接，从而形成结构为“第一抗体－偶联臂－第二抗体”的偶联物。通常，抗体上的－NH2被转变为-NH-,一侧与抗体连接，一侧与偶联分子连接。在本发明中，所述的衍生自抗体的－NH2基团的亚胺基通常被视为仍是抗体的一部分，当然，也可视为偶联臂的一部分。
偶联臂通常通过偶联剂形成。然而，不同的偶联剂的偶联效率不同，并且对抗体的影响也不尽相同。
在本发明中，代表性的偶联臂包括(但并不限于)：由Traut氏试剂（Traut’sreagent）和Sulfo-SMCC所形成的偶联臂。
基于不同的偶联剂，可采用不同的方法。在本发明中，一种优选的方法是采用Traut氏试剂和Sulfo-SMCC来进行偶联。
一种典型的偶联方法如图2所示。一种优选的抗CD3×抗HER2双特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）抗体的溶解：将商品化抗CD3单克隆抗体溶解于反应缓冲液A（150mMNaCl，2mM EDTA˙Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH8.0）；将抗医用HER2单克隆抗体溶解于反应缓冲液B（150mM NaCl，2mM EDTA˙Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2）。
（2）偶联剂的溶解：迅速称取Traut’s reagent和Sulfo-SMCC并分别溶解于超纯水中，制备成母液。
（3）抗CD3单克隆抗体与Traut’s reagent的偶联：将配制好的Traut’sreagent母液与抗CD3单克隆抗体以摩尔比5:1～10:1的比例混合均匀；将混合均匀的混合物置于恒温反应摇床上，保持温度在15～28℃条件下反应60分钟。
（4）抗HER2单克隆抗体与Sulfo-SMCC的偶联：将配制好的Sulfo-SMCC母液与抗HER2单克隆抗体以摩尔比4:1～20:1的比例混合均匀；将混合均匀的混合物置于恒温反应摇床上，保持温度在15～28℃条件下反应60分钟。
（5）脱盐柱脱盐：将Zeba脱盐柱预先用反应缓冲液B（150mM NaCl，2mMEDTA˙Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2）平衡，按照脱盐柱使用说明将上述步骤（3），（4）中反应完的抗CD3单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体上样于脱盐柱，经离心洗脱后测定抗体蛋白浓度。
抗CD3单克隆抗体与抗HER2单克隆抗体的偶联：将步骤（5）中已知浓度的抗CD3单克隆抗体与抗HER2单克隆抗体等摩尔比混合后在28～37℃条件下反应30分钟，或者4℃条件下反应过夜（16个小时），最终得到目的产物抗CD3×抗HER2双特异性抗体。
双功能蛋白及其制备
在本发明中，“双功能抗体偶联物”、“本发明偶联物”、“本发明双特异性抗体”、“双特异性偶联物”、“BsAb”可互换使用，指具有式Ia或Ib所述结构，含有特异性针对免疫细胞的第一抗体、偶联臂和特异性针对肿瘤标志物的第二抗体的双功能抗体偶联物。一个代表性的例子是抗CD3×抗HER2双特异性抗体。本发明偶联物可以是偶联物(即二聚体)或由偶联物进一步形成的多聚体。此外，应理解，所述术语还包括双功能抗体偶联物的活性片段和衍生物。
一种典型的偶联物是抗CD3×抗HER2双特异性抗体，其结构示意图如图3所示。该偶联物是含有抗CD3和抗HER2两种特异性抗原结合位点的人工合成抗体，能在HER2阳性细胞和肿瘤杀伤细胞细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-inducedkiller，CIK）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
药物组合物及施用方法
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的双功能抗体偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将本发明的双功能抗体偶联物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.000001-90wt%；较佳的0.1-50wt%；更佳的，5-40wt%。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的双功能抗体偶联物以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成溶液剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。
本发明所述的双功能抗体偶联物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的双功能抗体偶联物的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的双功能抗体偶联物每天以约0.0001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
一种优选的利用本发明偶联物进行细胞治疗的方法，如图1所示。即将本发明的偶联物(如抗CD3×抗HER2双特异性抗体)与免疫细胞(如CIK)进行孵育，从而形成“偶联物－免疫细胞”复合物(如BsAb－CIK复合物)。然后，可将“偶联物－免疫细胞”复合物进一步制成适合给药的剂型，并进行给药。
此外，在本发明中，本发明偶联物与免疫细胞(如CIK)的混合比例通常为20-100ng：0.5×106～5×107细胞，较佳地为20-100ng：0.5×106～5×106细胞，如50ng：1×106细胞。
一种代表性的抗CD3×抗HER2双特异性抗体偶联CIK细胞的方法，包括以下步骤：抗OKT3×抗HER2双特异性抗体偶联CIK细胞：将CIK细胞浓度调整到1×106个/mL，按照50ng双特异性抗体/106个CIK细胞比例加入抗OKT3×抗HER2双特异性抗体，在4℃条件下孵育1小时或者室温条件下孵育30分钟后用PBS清洗1～2次。
本发明所述的双功能抗体偶联物的主要优点包括：
1）制备工艺简单、操作性强；
2）通过本发明工艺合成得到的抗CD3×抗HER2双特异性抗体偶联率达到40%，远高于目前仅约10%的现有技术水平；
3）将本发明双特异性抗体与CIK孵育偶联后，能够将CIK杀瘤活性提高2－6倍。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
抗CD3×抗HER2双特异性抗体的制备
实验步骤：
取鼠抗人CD3单克隆抗体132μg溶解于反应缓冲液A（150mM NaCl，2mMEDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH8.0），称取Traut’s reagent1.2mg溶解在120μL的反应缓冲液A，配制成10mg/mL母液，使用时用稀释50倍到0.2mg/mL，将Traut’s reagent与抗CD3单克隆抗体以摩尔比10:1比例混合在室温条件下孵育1小时；
取鼠抗HER2单克隆抗体30μg溶解于反应缓冲液B（150mM NaCl，2mMEDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2），称取Sulfo-SMCC1.5mg溶解在300μL的反应缓冲液B，配制成母液，使用时稀释10倍到0.5mg/mL，将Sulfo-SMCC与抗HER2单克隆抗体以摩尔比20:1、40:1、60:1比例混合在室温条件下孵育1小时；
将Zeba脱盐柱预先用反应缓冲液B（150mM NaCl，2mM EDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2）平衡，按照脱盐柱使用说明将上述步骤中反应完的抗CD3单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体上样于脱盐柱，经离心洗脱后测定抗体蛋白浓度。
将以上步骤获得的已知浓度的抗CD3单克隆抗体与抗HER2单克隆抗体等摩尔比混合后在28℃条件下反应30分钟，最终得到目的产物抗CD3×抗HER2双特异性抗体。
抗体的浓度采用Nanodrop2000仪器中IgG参数可以得到快速、准确的测定，大大缩短了抗体浓度测定时间，其准确性和可靠性已经过BCA蛋白浓度测定方法校准。
实验结果：
如图4所示，Traut’s reagent与抗CD3单克隆抗体以摩尔比10:1，Sulfo-SMCC与抗HER2单克隆抗体以摩尔比20:1条件下，抗体偶联效率达到50%左右。
实施例2
抗CD3×抗HER2双特异性抗体的制备
与实施例1不同，具体步骤如下：
取鼠抗人CD3单克隆抗体OKT3抗体133μg溶解于反应缓冲液A（150mM NaCl，2mM EDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH8.0），称取Traut’s reagent1.3mg溶解在130μL的反应缓冲液A，配制成10mg/mL母液，使用时稀释50倍到0.2mg/mL，将Traut’s reagent与抗CD3单克隆抗体以摩尔比5:1或10:1比例混合在室温条加下孵育1小时；
取鼠抗HER2单克隆抗体31μg溶解于反应缓冲液B（150mM NaCl，2mMEDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2），称取Sulfo-SMCC1.0mg溶解在100μL的反应缓冲液B，配制成母液，使用时稀释20倍到0.5mg/mL，将Sulfo-SMCC与抗HER2单克隆抗体以摩尔比4:1或20:1比例混合在室温条加下孵育1小时；
将Zeba脱盐柱预先用反应缓冲液B（150mM NaCl，2mM EDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2）平衡，按照使用说明将上述步骤中反应完的抗CD3单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体上样于脱盐柱，经离心洗脱后测定抗体蛋白浓度。
将以上步骤获得的已知浓度的抗CD3单克隆抗体与抗HER2单克隆抗体等摩尔比混合后在37℃条件下反应30分钟或4℃条件下反应过夜（16个小时），最终得到目的产物抗CD3×抗HER2双特异性抗体。
实验结果：
如图5所示，37℃条件下反应30分钟或4℃条件下反应过夜（16个小时）并不影响抗体的偶联效率，将偶联剂与抗体摩尔比降低后会降低抗体的偶联率。
实施例3
抗CD3与抗HER2单克隆抗体偶联率的检测
具体实验步骤：
取鼠抗人CD3单克隆抗体OKT3抗体600μg溶解于反应缓冲液A（150mM NaCl，2mM EDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH8.0），称取Traut’s reagent1.2mg溶解在120μL的反应缓冲液A，配制成母液，使用时稀释100倍到0.1mg/mL，将Traut’s reagent与抗CD3单克隆抗体以摩尔比10:1比例混合在室温条加下孵育1小时；
取鼠抗HER2单克隆抗体600μg溶解于反应缓冲液B（150mM NaCl，2mMEDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2），称取Sulfo-SMCC0.3mg溶解在300μL的反应缓冲液B，配制成母液，使用时稀释10倍到0.1mg/mL，将Sulfo-SMCC与抗HER2单克隆抗体以摩尔比20:1比例混合在室温条加下孵育1小时；
将Zeba脱盐柱预先用反应缓冲液B（150mM NaCl，2mM EDTA·Na2，100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2）平衡，按照使用说明将上述步骤中反应完的抗CD3单克隆抗体和抗HER2单克隆抗体上样于脱盐柱，经离心洗脱后测定抗体蛋白浓度。
将以上步骤获得的已知浓度的抗CD3单克隆抗体与抗HER2单克隆抗体等摩尔比混合后在室温条件下反应30分钟，最终得到目的产物抗CD3×抗HER2双特异性抗体。
取偶联前抗体（抗CD3及抗HER2单克隆抗体）、与偶联剂偶联后抗体（偶联Traut’s reagent的抗CD3单克隆抗体及偶联Sulfo-SMCC的抗HER2单克隆抗体）和单克隆抗体相互偶联后产物各15μL与5μL上样缓冲液混合，70℃处理样品10min或100℃处理样品5-10min，上样于NuPAGE Tris-Acetate Mini Gels进行非还原性SDS-PAGE电泳分析。200V电压下电泳60-80min。电泳结束后取胶用考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后拍照，BIORAD凝胶成像软件分析单体、二聚体及多聚体所含的大致比例。
实验结果
如图6所示，显示抗单克隆抗体在与偶联剂偶联后自身交联度较低，抗体之间交联后显示获得30%偶联率的双特异性抗体。
如图7所示，经过优化后的最终抗CD3×抗HER2双特异性抗体偶联率达到40%左右，其中单体占40%，二聚体占40%，多聚体占20%，高于目前报道水平。
实施例4
抗CD3×抗HER2双特异性抗体对CIK细胞及HER2阳性肿瘤细胞特异性结合检测
实验具体步骤如下：
将CIK细胞浓度调整到2×106个/mL，各取1mL等分为5组，分加入PBS、250ng抗CD3单克隆抗体、250ng抗HER2单克隆抗体、250ng抗CD3单克隆抗体+250ng抗HER2单克隆抗体、100ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体，在室温条加下孵育30分钟，用完全培养基清洗2次后，每组分取100μL（2×105个细胞）加入96孔细胞培养板中。调整乳腺癌HER2阳性细胞SK-BR-3浓度到2×105个/mL，每孔中加入50μL（1×104）使E:T达到20:1，置于细胞培养箱中培养12小时后镜检。
实验结果：
如图8所示，抗CD3×抗HER2双特异性抗体能够有效地将CIK细胞靶向定位于肿瘤细胞。
实施例5
抗CD3×抗HER2双特异性抗体与CIK细胞偶联饱和度的检测
实验具体步骤如下：
将CIK细胞浓度调整到1×106，分成5份，分别加入PBS、5ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK细胞、50ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK细胞、100ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK细胞、500ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK细胞。置于4℃孵育1小时后，用含有1%BSA的PBS清洗2次，加入PE标记的羊抗鼠IgG流式抗体4℃避光条件下孵育30分钟后用PBS清洗2次，调整最后体积大约在200μL，上样于流式细胞仪进行检测。
实验结果：
如图9所示，50ng双特异性抗体与106个CIK细胞赋予后能够接近饱和，提示50ng双特异性抗体/106个CIK细胞能够在最大程度上降低药物用量基础上结合CIK细胞，发挥抗瘤活性。
实施例6
抗CD3×抗HER2双特异性抗体与CIK细胞结合率的检测
具体实验步骤如下：
1.细胞表面抗CD单克隆抗体的检测：将CIK细胞浓度调整到1×106，等分成3份，分别加入PBS、125ng抗CD3单克隆抗体/106CIK细胞、50ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK细胞。置于4℃孵育1小时后，用含有1%BSA的PBS清洗2次，加入流式抗体PE标记的羊抗鼠IgG2a，4℃避光孵育30分钟后用PBS清洗2次，调整体积大约在200μL，上样于流式细胞仪进行检测。
2.细胞表面抗HER2单克隆抗体的检测：将CIK细胞浓度调整到1×106，等分成3份，分别加入PBS、125ng抗CD3单克隆抗体/106CIK细胞、50ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK细胞。置于4℃孵育1小时后，用含有1%BSA的PBS清洗2次，加入流式抗体FITC标记的羊抗鼠IgG1，4℃避光孵育30分钟后用PBS清洗2次，调整体积大约在200μL，上样于流式细胞仪进行检测。
实验结果：
如图10所示，双特异性抗体与CIK细胞孵育后荧光信号强度与抗CD3单独孵育细胞基本一致。
如图11所示，细胞表面抗HER2单克隆抗体结合率达到约10%，表明部分双特异性抗体已经偶联到CIK细胞表面。
实施例7
抗CD3×抗HER2双特异性抗体偶联CIK后对HER2阳性乳腺癌细胞SK-BR-3的杀伤作用
具体实验步骤如下：
将CIK细胞浓度调整到4×106个/mL（即四角大方格细胞数目共计1600个，每个大格400个细胞），共8mL。每份2mL，按照0、5、50、100ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK分别加入0、40、400、800ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体（按照抗CD3×抗HER2双特异性抗体初始浓度为1mg/mL，即1000ng/μL，按比例稀释抗体，加入CIK中，室温条件下孵育15分钟，用完全培养基清洗两次，每次离心转速400g，5分钟。将SK-BR-3细胞浓度调整到4×105个/mL（即四角大方格细胞数目共计160个，每个大格40个细胞），共3.5mL，96孔细胞培养板中每孔加入50μL。将CIK与SK-BR-3肿瘤细胞按照5：1、10：1、20：1、30：1的比例加入96孔细胞培养板中，按照Promega试剂盒说明书要求进行细胞毒性检测。
实验结果
如图12所示，在CIK细胞饱和偶联抗CD3×抗HER2双特异性抗体条件下，不同的E:T实验表明，在E:T达到20:1时，双特异性抗体偶联的CIK杀瘤活性达到30%以上，而未偶联双特异性抗体的CIK杀瘤活性仅达到5%左右，双特异性抗体使CIK的杀瘤活性显著提高，至少提高了6倍。
如图13所示，在E:T达到20:1条件下，50ng双特异性抗体/106CIK能够使CIK的杀瘤活性提高到40%左右，并且随着双特异性抗体剂量的提高肿瘤杀伤活性不再提高。
如图14所示，单独用单克隆抗体或未偶联的两种单克隆抗体孵育CIK细胞并不能够提高CIK对肿瘤细胞的杀伤活性，进一步验证了双特异性抗体在肿瘤杀伤过程中发挥的作用。
实施例8
抗CD3×抗HER2双特异性抗体对HER2高表达量及低表达量肿瘤细胞杀伤作用的比较
具体实验步骤如下：
将CIK细胞浓度调整到4×106个/mL，按照50ng抗CD3×抗HER2双特异性抗体/106CIK量孵育后按照实施例7步骤处理，96孔细胞培养板中加入100μL/孔；将HER2高表达量的SK-BR-3乳腺癌细胞及HER2低表达量的MCF-7乳腺癌细胞浓度分别调整到4×105个/mL，加入50μL/孔，按照Promega试剂盒说明书要求进行细胞毒性检测。
实验结果：
如图15所示，双特异性抗体偶联后的CIK细胞对HER2低表达量的MCF-7同样具有杀伤作用，但低于HER2高表达量的SK-BR-3。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种双功能抗体偶联物，其特征在于，所述双功能抗体偶联物具有式Ia或式Ib所述结构：
A-B-C (Ia)，或
C-B-A (Ib)
其中，
A为特异性针对免疫细胞的第一抗体；
B为位于A和C之间的偶联臂；
C为特异性针对肿瘤标志物的第二抗体；
“-”表示连接上述元件的化学键。
2.如权利要求1所述的双功能抗体偶联物，其特征在于，所述的第一抗体选自下组：抗CD3的抗体、抗CTLA4抗体或其组合；和/或
所述的第二抗体选自下组：抗HER2的抗体、抗EGFR的抗体或其组合。
3.如权利要求1所述双功能抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物具有以下一种或多种特性：
a)可以同时与CIK细胞和肿瘤细胞这两种细胞结合；
b)在4℃或-20℃条件下可长时间(6、12、24个月或更长)保存。
4.如权利要求1所述的双功能抗体偶联物，其特征在于，所述的偶联臂选自下组：
式中，各结构式两侧的“-”表示分别与第一抗体和第二抗体相连的键(化学键或共价键)；
较佳地，所述的双功能抗体偶联物结构如下：
式中，
X为第一抗体A或第二抗体C；
Z为第一抗体A或第二抗体C；并且，X和Z中一个为第一抗体，另一个为第二抗体；
并且与X和Z相连的－HN-或－NH－表示衍生自抗体的－NH2基团的亚胺基。
5.如权利要求1所述的双功能抗体偶联物，其特征在于，所述的第一抗体是抗CD3抗体，而所述的第二抗体是抗HER2抗体。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1－4中任一所述的双功能抗体偶联物，以及药学上可接受的载体。
7.一种制备药物组合物的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求1－4中任一所述的双功能抗体偶联物与药学上可接受的载体进行混合，从而制得药物组合物。
8.一种制备抗肿瘤药物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将权利要求1所述的双功能抗体偶联物与免疫细胞进行混合，从而形成“双功能抗体偶联物－免疫细胞”的复合物，
(b)将所述复合物制成抗肿瘤药物。
9.如权利要求1所述的双功能抗体偶联物的用途，其特征在于，用于制备治疗疾病的药物；
较佳地，所述的疾病包括肿瘤。
10.一种产生权利要求1所述的双功能抗体偶联物的方法，其特征在于，它包括步骤：
(a)提供式II所示的第一中间体；和式III所示的第二中间体
式中，
X为第一抗体A或第二抗体C；
Z为第一抗体A或第二抗体C；并且，X和Z中一个为第一抗体，另一个为第二抗体；
(b)将式II所示的第一中间体与式III所示的第二中间体进行偶联反应，从而形成式IV所示的双功能抗体偶联物：
式中，
X为第一抗体A或第二抗体C；
Z为第一抗体A或第二抗体C；并且，X和Z中一个为第一抗体，另一个为第二抗体。
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