CN104695205A - 胶原纤维膜制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胶原纤维膜的制备方法及其应用，采用该方法制备的胶原纤维膜具有优良的生物相容性，同时还具有较好的力学强度。该产品可用于人体软组织损伤修复，具体使用时能够达到可缝合的要求。

Description

胶原纤维膜制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种胶原纤维膜制备方法及其应用。

背景技术

胶原纤维具有优良的生物安全性，与细胞亲和力较强，同时还具有一定的细胞诱导能力，能够引导细胞分化增值，是一种前景非常的组织工程支架材料。目前以胶原为原料的膜产品主要有脱细胞基质、胶原冻干海绵、胶原电纺膜等，但是他们具有自身不可避免的缺陷。

脱细胞基质：机械强度好，并且具有非常合理的空隙结构，能够为细胞的生长提供绝佳的环境。但脱细胞基质是由动物皮肤、心包膜、腹膜、小肠膜等为原料通过物理化学的方法去除细胞成分而得，该过程没有将上述组织分散，很难将有可能会导致宿主发生免疫反应的物质去除干净。

胶原冻干海绵：由从动物组织中提取的胶原溶液冻干而得。它具有优异的生物相容性、有利于细胞长入的空隙结构，但其强度较低，限制了他作为牙膜、疝气补片、可缝合脑膜等的使用。

胶原电纺膜：由胶原溶液通过静电纺丝而得。它具有较好的生物相容性、较好的力学性能和一定的空隙结构，但胶原电纺会用到六氟异丙醇等有机溶剂，其毒性较大、不易除净。另外有文献报道电纺会破坏胶原的三股螺旋结构。

因此，本领域技术人员致力于克服现有的以胶原为原料制备的产品强度低，不可缝合，不能承力的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胶原纤维膜制备方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种制备胶原纤维膜的方法，所述方法包括步骤：

(1)将胶原纤维溶于酸性介质中，获得胶原原纤维溶液；

(2)将所述胶原原纤维溶液倒入容器中，放在挥发性碱环境下熏蒸，制得所述胶原纤维膜；

其中，所述容器的底部为滤网结构；所述滤网为50-500目的滤网，所述滤网允许所述样品溶液中的水流出所述容器，而所述胶原原纤维形成的胶原纤维基质保留在所述滤网之上。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述胶原原纤维溶液中胶原原纤维的浓度为1g/L－200g/L，优选地为10g/L－100g/L，更优选地为15g/L－50g/L。

在另一优选例中，所述酸性介质的pH为0-6；优选地pH为0.5-5.5；更优选地pH为1.0-5.0；最优地pH为2.0-4.0。

在另一优选例中，所述酸性介质为酸的水溶液。

在另一优选例中，所述酸性介质选自：盐酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液、醋酸水溶液或其组合。

在另一优选例中，所述挥发性碱选自下组：氨水。

在另一优选例中，所述挥发性碱为氨水；优选地，所述氨水浓度为0.1％(w/w)－5％(w/w)；更优选地，所述氨水浓度为0.5％(w/w)－2％(w/w)。

在另一优选例中，所述步骤(2)中的熏蒸时间为8h－48h；优选地，所述熏蒸时间为12h－36h；更优选地，所述熏蒸时间为18h－30h。。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，还包括分散步骤，使用匀浆机进行匀浆，使得胶原纤维充分溶于酸性介质中，形成胶原原纤维溶液；优选地，转速为100r/min-5000r/min，优选为500r/min-3000r/min。

在另一优选例中，所述匀浆时间为1min-30min，优选为5min-20min。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，还包括离心除泡步骤，使用离心机对所述胶原原纤维溶液进行离心去除气泡；优选地，离心转速为1000r/min-10000r/min，更优选地为2000r/min-8000r/min。

在另一优选例中，所述离心时间为1min-30min，更优选为5min-20min。

在另一优选例中，所述容器的底部为滤网结构；优选地，所述滤网为50-500目的滤网；更优选地所述滤网为100-400目的滤网；最优选地，所述滤网为150-250目的滤网。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，将所述胶原原纤维溶液涂覆在所述滤网上，然后放在挥发性碱环境下熏蒸。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述胶原原纤维溶液的涂覆厚度为 2-20mm；优选地涂覆厚度为4-15mm；更优选地涂覆厚度为5-10mm。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，熏蒸完成后将所述胶原纤维膜取出干燥。

在另一优选例中，所述步骤(2)之后还包括步骤：

(3)将所述胶原纤维膜置于磷酸盐缓冲液中溶胀，纯水清洗后冷冻干燥。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤，将所述胶原纤维膜进行热交联。所述热交联的方法为本领域中的常规方法。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤，将所述胶原纤维膜灭菌处理。

在另一优选例中，所述胶原纤维为用酸浸提的方法获得。

本发明的第二方面，提供了一种胶原纤维膜，所述胶原纤维膜通过权利要求1所述的方法制备而得。

在另一优选例中，所述胶原纤维膜拉伸强度在5MPa-7MPa之间。

在另一优选例中，所述胶原纤维膜的厚度为0.5mm－1.5mm。

本发明的第三方面，提供了一种制备胶原纤维膜的装置，所述装置包括：样品容器和挥发性碱容器，所述样品容器置于所述挥发性碱容器的上方；

其中，所述样品容器被设置为用于盛放胶原原纤维样品溶液，所述样品容器的底部为滤网结构。

在另一优选例中，所述滤网选自：尼龙滤网、不锈钢滤网。

在另一优选例中，所述滤网为50-500目的滤网；更优选地所述滤网为100-400目的滤网；最优选地，所述滤网为150-250目的滤网。

在另一优选例中，所述样品容器的侧壁由不锈钢材料制成。

在另一优选例中，所述挥发性碱容器被设置用于盛放挥发性碱溶液。

在另一优选例中，所述挥发性碱为氨水。

在另一优选例中，所述装置还包括壳体，所述样品容器和所述挥发性碱容器位于所述壳体内部。

在另一优选例中，所述壳体包括主体和盖体，当所述盖体盖合在所述主体上时，所述主体和所述盖体构成一密闭的空间，所述样品容器和所述挥发性碱容器位于所述密闭空间内。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了胶原纤维膜生物安全性(免疫原性)检测结果。 

图2为本发明较佳实施方式的制备胶原纤维膜的装置结果示意图。

图3A、图3B分别显示了实施例1中制备的胶原纤维膜照片。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种胶原纤维膜的制备方法，首先将胶原纤维溶解于酸性水溶液中，然后采用挥发性碱熏蒸，诱导胶原原纤维形成较长的胶原纤维，并均匀的分布，风干得到硬质胶原膜,胶原膜在水体系中溶胀后冻干即可获得胶原纤维膜成品。如有需要可将溶胀后的胶原凝胶先做交联处理然后再冻干。采用这种方法制备的胶原膜最大限度的保存了胶原的活性，同时具有较好的力学性能和孔隙结构，而且非胶原成分容易去除干净，生物安全性优异。在此基础上，完成了本发明。

与传统胶原纤维膜制备方法相比，本发明所提出的方法能够保留胶原纤维长度，最大可能地保留材料的力学强度和生物相容性。传统胶原纤维成膜方法，要通过匀质机粉碎胶原纤维束，得到胶原纤维悬浊液，然后再做后期处理。这样将较长的胶原纤维打断了，破坏了其成型后的力学强度，而且强烈的机械作用有将胶原变性的风险。

本发明的方法采用酸处理的方式制备胶原溶液(胶原原纤维溶液、样品溶液)，然后将胶原原纤维溶液在碱性蒸汽等其他外界条件的诱导作用下发生自组装，形成长纤维。将纤维溶液风干，然后溶胀，视情况交联，最后将样品冻干包装灭菌、或直接包装在含有保存液的包材中并灭菌。

按照这种方法可以非常容易制备出具有较好强度的胶原纤维膜，其厚度、孔隙率都可按照需求调控。最终得到的产品可用于硬脑膜补片、牙膜、骨膜、神经导管、疝气补片等产品。

本发明的胶原纤维膜的制备方法，属于医用生物材料领域，能够解决目前胶原纤维膜强度低的问题，拓展胶原纤维膜的应用范围。采用本发明中的方法 所制备的胶原纤维膜可广泛的用于体内各种软组织的修补，如硬脑膜补片、疝气补片、牙膜、皮肤修复膜、神经补片、肌腱修补等。

在一优选地实施方式中，本发明操作方法包括步骤：

1.将胶原纤维溶解于酸性(pH0－4.8)水溶液中，得到均一的胶原原纤维溶液样品。

2.将样品倒入不锈钢框架中，不锈钢框架底面用200目尼龙滤网封闭。

3.将样品放在密闭容器中，密闭容器底部盛有1％氨水，待样品pH到6.0±0.5时取出(约放置20h)，风干，获得胶原纤维膜。

4.将风干后的胶原纤维膜在0.01M，pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中溶胀，待厚度达到1mm左右后，取出，用纯水清洗干净，冻干，如有需要可进行热交联。

5.样品裁剪后包装，灭菌即可。

本发明还提供了一种制备胶原纤维膜的装置(如图2所示)，所述装置包括：样品容器1和挥发性碱容器2,所述样品容器1置于所述挥发性碱容器2的上方；

其中，所述样品容器1被设置为用于盛放胶原原纤维溶液11，所述样品容器的底部为滤网结构；所述挥发性碱容器2被设置用于盛放挥发性碱溶液21。

本实施方式中，所述样品容器1可以悬挂于所述挥发性碱容器2内部，并在设置一个盖体3，当盖体3盖合在所述挥发性碱容器2上时，形成一个密闭的空间，避免挥发性碱外泄。

在一较佳的实施方式中，所述装置还包括壳体，所述样品容器和所述挥发性碱容器位于所述壳体内部；优选地，所述壳体包括主体和盖体，当所述盖体盖合在所述主体上时，所述主体和所述盖体构成一密闭的空间，所述样品容器和所述挥发性碱容器位于所述密闭空间内。

在其它的实施方式中，可以在所述样品容器的上方设置一盖体，当所述盖体盖合在所述样品容器上方时，形成一个密闭的空间，避免挥发性碱外泄。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的方法能够保留胶原纤维长度，最大可能地保留材料的力学强度和生物相容性；

(2)采用本发明的方法制备的胶原纤维膜较其他方法制备的胶原膜力学性能优异，完全可用于体内软组织修补手术；

(3)本发明在胶原原纤维提取过程中，采用均浆的方式将胶原原纤维分散在酸液中，熏蒸以后胶原原纤维会发生自组装形成较粗大的胶原纤维束，对胶原纤维束不再做匀浆处理，而传统的方法为了方便后续的加工处理，在成型前要对胶原纤维束进行匀浆处理。本发明的方法采用诱导自组装的的方式原位获得胶原纤维，得到的胶原纤维分布均匀，避免了胶原纤维在成型过程中匀浆导致较长的胶原纤维被打断，保留了其成型后的力学强度，而且避免了强烈的机械作用有将胶原变性的风险。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例1 胶原纤维膜的制备

取10g胶原纤维样品(其制备方法可以参考美国专利5997895)，溶胀在500ml、0.1M的醋酸溶液(pH2.5)中，然后用匀浆机将胶原纤维彻底分散，使得胶原纤维完全溶于醋酸溶液中，得到胶原原纤维溶液(该过程为胶原原纤维提取过程，采用匀浆的方式将胶原原纤维分散在酸液中，熏蒸以后胶原原纤维会发生自组装形成较粗大的胶原纤维束，对胶原纤维束不再做匀浆处理，而传统的方法在成型前要对胶原纤维束进行匀浆处理，这样才便于后面的加工处理)，离心除泡后得到胶原原纤维样品溶液。将这种样品溶液涂覆在200目的不锈钢滤网上，厚度控制在5mm－7mm。

将滤网放到盛有1％的氨水的密封容器中进行熏蒸，24小时后取出样品，并风干。0.01M的PBS缓冲液溶胀后，用纯水充分清洗所得胶原纤维膜，冷冻干燥，然后裁剪样品，包装后辐照即可。

本实施例，在氨水熏蒸的条件下诱导胶原原纤维组装成较粗的胶原纤维，组装得到的胶原纤维较粗，电镜观察有明暗条纹，具有很好的力学性能，比较接近于体内胶原纤维正常存在的状态。

实施例2 胶原纤维膜的生物安全性(细胞毒性)

1、浸提液制作 

按照GB/T 16886的规定，本次测试的胶原纤维膜材料由于厚度在5mm以下，浸提液体积按照材料表面积进行计算，6cm²/ml进行浸提。每一类样品均需要24h、48h和72h的浸提液。浸提温度为37℃。操作均在细胞房的超净台进行。浸提液为被用来培养L929细胞的含10％FBS的1640培养基。

2、细胞培养 

提前一周复苏培养好L929细胞(购自上海拜力生物科技有限公司)，消化后铺入96孔板中，每孔2×10⁵个细胞。次日吸出孔板中的培养基，加入浸提液，做6个复孔。对照组，用含6.4％的苯酚-培养基溶液培养细胞。

3、数据监测 

采用cck-8法检测培养48h检测、72h检测、及相应的2个对照组板。检测方式均为在酶标仪上测定450nm吸光度。

4、数据分析 

细胞增殖率的计算方法为(实验组吸光度-空白组吸光度)/(普通培养基培养组吸光度-空白组吸光度)*100％，增殖率大于等于80％说明无细胞毒性。

最终数据计算如下：

结果：使用苯酚的阳性对照组细胞生长率分别为4.6％和4.3％。

得到的检测结果均显示细胞活性大于80％，证明所得浸提液无细胞毒性，从而说明所检测的胶原纤维膜无可溶性细胞毒性物质残留。而且部分数据远大于100％，暗示可能对细胞新陈代谢有促进作用。

实施例3、胶原纤维膜生物安全性(免疫原性)

1、细胞铺板：在96孔板中6×4方阵内铺入RAW264.7细胞(购自上海谷研科技有限公司)，每孔100μl细胞悬液，2×10⁴个细胞，置于37℃细胞培养箱内培养过夜。

2、浸液制作：取待测的胶原纤维膜样品置入离心管中制作浸提液。样品重1.1g，加入11ml浸提原液。本次试验使用的浸提原液为1640培养基。

3、加样刺激：4列分别加入的浸提液或对照液体分别：纤维膜样品浸提液、 空白对照(1640培养基)、阴性对照(BSA，40ug/ul)和阳性对照(ConA，40ug/ul和100ug/ml)。当日吸净细胞培养液，用DPBS清洗细胞三次后，分别在8列中加入各自样品，每个样品6孔，每孔100μl。再培养4h，然后用DPBS洗涤3次，加入0.1％的中性红溶液100ul，继续培养30min。吸弃中性红溶液，洗涤3次，加入裂解液(冰醋酸与无水乙醇＝1:1)200ul，静置过夜。

4、吸光度检测：12小时后，细胞已完全裂解，在酶标仪上检测540nm吸光度。

5、研究过程及结果：

检测结果如图1所示，数据显示胶原纤维膜样品浸提液对巨噬细胞的刺激性均很低，接近于空白的1640培养基，比阴性对照BSA溶液还要低，说明被检测的四种样品均无可刺激巨噬细胞的免疫原性。

实施例4 胶原纤维膜强度检测

参照实施例1的工艺方法，按照表1设计的技术参数，制备胶原膜，并按照国家法规要求测定其力学性能(具体测定方法如实施例5所述)，其结果如下表所示：

表1

经过反复验证，在其它实施方式中，使用pH为2.0-4.0的酸性介质溶解胶原纤维，胶原原纤维样品溶液中胶原的浓度为10g/L－100g/L，使用100-400目的滤网，在浓度为0.5％(w/w)－2％(w/w)的氨水条件下进行熏蒸，熏蒸时间为12h－36h，均可制备出性能较佳的，符合本发明要求的胶原纤维膜。

实施例5 胶原纤维膜强度重现性检测

随机选取胶原纤维膜(通过实施例1的方法制备)和胶原海绵(采用酶法从牛跟腱中提取胶原，然后以冻干的方式制备成胶原海绵，制备方法参考文献：酶法提取牛腱胶原的研究，叶易春等，《中国皮革》第34卷第7期)各3片，将样品裁剪成10mm宽和80mm长的长条状，放置在温度23℃，湿度50％的环境下直至样品稳定。

设定拉伸试验仪的名义夹持距离为50mm±1mm，在夹持器中心位置夹持式样。预张力设定为2N。

开动机器，以10mm/min的恒定伸长速度拉伸试样直至断裂，记录每块试 样的强力-伸长曲线，计算试样的断裂强力(曲线最高点对应的力)。

按照以下公式计算产品的拉伸强度：

拉伸强度＝断裂强力÷(样条宽×样条厚)

测试结果如下：

上述检测结果表明，根据本发明方法制备的胶原纤维膜其拉伸强度是胶原海绵的将近6倍，说明通过本发明的方法制备的胶原纤维膜具有极高的拉伸强度。

对比例1

按照实施例1中的方法制备胶原纤维膜，不同在于，将样品溶液涂覆在200目的不锈钢滤网上后，使用氨水熏蒸30min，其它条件基本相同，制得5组胶原膜。按照实施例4中方法检测所得胶原膜的强度，经检测，所得胶原膜的平均强度小于2.5Mpa。

对比例2

按照实施例1中的方法制备胶原纤维膜，不同在于，将样品溶液涂覆在200目的不锈钢滤网上，再使用氨水熏蒸30min，然后静置干燥20h,其它条件基本相同，制得5组胶原膜。按照实施例5中方法检测所得胶原膜的强度，经检测，所得胶原膜的平均强度小于2Mpa。

对比例3

按照实施例1中的方法制备胶原纤维膜，不同在于，将样品溶液涂覆在200目的不锈钢滤网上，静置干燥20h，然后再使用氨水熏蒸30min，其它条件基本相同，制得5组胶原膜。按照实施例5中方法检测所得胶原膜的强度，经检 测，所得胶原膜的平均强度小于1.5Mpa。

对比例4

按照实施例1中的方法制备胶原纤维膜，不同在于，将样品溶液涂覆在不具有孔的平板上，进行胶原纤维膜的制备，其它条件基本相同，制得5组胶原纤维膜。按照实施例5中方法检测所得胶原纤维膜的强度，经检测，所得胶原纤维膜的平均强度小于3Mpa；重复试验发现其多个样品未能在样品中部断裂，显示其产品均一度较差，不符合国家法规要求，同时通过肉眼观察，与本发明提供的方法相比，其获得的产品厚度不均一，色泽均匀性也较差。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备胶原纤维膜的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)将胶原纤维溶于酸性介质中，获得胶原原纤维溶液；

(2)将所述胶原原纤维溶液倒入容器中，放在挥发性碱环境下熏蒸8h－48h，制得所述胶原纤维膜；

其中，所述容器的底部为滤网结构；所述滤网为50-500目的滤网，所述滤网允许所述样品溶液中的水流出所述容器，而所述胶原原纤维形成的胶原纤维基质保留在所述滤网之上。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述胶原原纤维溶液中胶原原纤维的浓度为10g/L－100g/L，优选地为15g/L－50g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性介质的pH为0-6；优选地pH为0.5-5.5；更优选地pH为1.0-5.0；最优地pH为2.0-4.0。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述挥发性碱为氨水；优选地，所述氨水浓度为0.1％(w/w)－5％(w/w)；更优选地，所述氨水浓度为0.5％(w/w)－2％(w/w)。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的熏蒸时间为12h－36h；优选地，所述熏蒸时间为18h－30h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滤网为100-400目的滤网；优选地，所述滤网为150-250目的滤网。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将所述胶原原纤维溶液涂覆在所述滤网上，然后放在挥发性碱环境下熏蒸。

8.一种胶原纤维膜，其特征在于，所述胶原纤维膜通过权利要求1所述的方法制备而得。

9.一种制备胶原纤维膜的装置，其特征在于，所述装置包括：样品容器和挥发性碱容器，所述样品容器置于所述挥发性碱容器的上方；

其中，所述样品容器被设置为用于盛放胶原原纤维样品溶液，所述样品容器的底部为滤网结构。

10.如权利要求9所述的制备胶原纤维膜的装置，其特征在于，所述滤网为50-500目的滤网；更优选地所述滤网为100-400目的滤网；最优选地，所述滤网为150-250目的滤网。