CN104694532A

CN104694532A - 一种橡胶树白粉病菌rna的提取方法

Info

Publication number: CN104694532A
Application number: CN201510132419.7A
Authority: CN
Inventors: 缪卫国; 梁鹏; 刘文波; 郑服丛; 林春花
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2015-03-25
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2015-06-10

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种橡胶树白粉病菌RNA的提取方法。通过在疏水介质上诱导白粉菌萌发并形成附着胞，便于区分白粉菌发育的不同阶段，从而达到可以分阶段提取RNA的目的。通过提取不同时段橡胶树白粉菌的RNA，经定量测定显示RNA浓度及完整性符合Illumina转录组文库要求，采用RT-PCR扩增18SrRNA基因，为进一步开展转录组测序分析和基因表达研究提供基础。

Description

一种橡胶树白粉病菌RNA的提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种橡胶树白粉病菌RNA的提取方法。

背景技术

橡胶树白粉病是由粉孢属的橡胶粉孢（Oidium heveae B.A.Steinmann)侵染引起的病害，该病菌广泛分布于全球各橡胶种植区，也是我国植胶区早春防治“两病一虫”的重点。橡胶树白粉菌是专性寄生菌，无法在人工培养基离体培养，难遗传操作，更多研究集中于细胞学观察和防治，目前尚未培育出生产上大规模推广的抗白粉菌橡胶树品系，关于橡胶树白粉菌致病基因功能验证的分子实验体系尚未建立，病原菌致病机理缺乏详尽研究。万三连等通过改良Trizol提取方法获取的白粉菌RNA能够满足构建转录组文库要求。改良Trizol提取RNA法，是在Trizol真菌RNA提取法基础上提高提取液的盐浓度，增加溶液中的盐浓度可以减少RNA溶于提取液中，促进多糖及蛋白等溶于溶液。同时，结合OMEGA真菌RNA试剂盒法中的制备管吸附RNA，可以减少挥发乙醇的时间，防止RNA降解。

改进的Trizol方法收集提取的白粉菌实际上是孢子和菌丝组织混合体RNA，无法获得白粉菌在萌发及附着胞形成状态均一的孢子，缺少侵染发育过程中白粉菌组织的培养收集和RNA提取手段，无法开展侵染过程中功能基因的表达研究。

发明内容

本本发明提出一种橡胶树白粉病菌RNA的提取方法，所得的RNA浓度及完整性符合Illumina转录组文库要求。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，包括以下步骤：

（1）采用接菌培养10~12d后24 h龄的新鲜分生孢子作为实验菌源；将疏水介质置于底部有湿润滤纸的保鲜盒中，用软毛刷将橡胶叶片上的白粉菌孢子轻刷于疏水介质表面，培养温度21~23℃，相对湿度50%~80%，保鲜盒避光密封保存；

（2）保鲜盒中培养0~24 h后，加入预冷的Trizol裂解液于介质上，用涂抹棒蘸取裂解液反复涂刮接菌介质表面，待介质上的裂解液内可见白色粉状物或出现浑浊时，用移液器收集裂解液转移到预冷的离心管中，震荡混匀，20~25℃静置8~10 min；

（3）离心管加入氯仿，振荡混匀，20~25℃静置后离心；

（4）离心后，转移上层水相到新的RNase free离心管中，加入醋酸钾，颠倒混匀，离心，20~25℃静置得混合溶液；

（5）加入与混合液等体积的异丙醇，混匀，沉降RNA样品；

（6）经步骤（5）处理后，离心后移去上清液，加入DEPC水溶解沉淀；随后加入RB、70%乙醇和β-巯基乙醇，颠倒混匀；

（7）经步骤（6）处理后，离心后加入DEPC水洗脱RNA，即得橡胶树白粉病菌RNA。

进一步，所述步骤（1）接种前24 h摇动叶片抖落老孢子，以新生24 h龄分生孢子作为接种材料；所述的疏水介质为Parafilm膜。

进一步，所述步骤（2）震荡后确保离心管中无真菌团块。

进一步，所述步骤（3）加入氯仿体积为离心管内液体体积的1/4~1/3；振荡时间为15~20 s，0~25℃静置时间为5~7 min，离心的条件为4℃，10000~12000 g，离心15~20 min；2。

进一步，所述步骤（4）加入醋酸钾溶液的体积为水相体积的1/3，pH值为6.0；离心条件为4oC，8000~10000 g，离心1.0~1.5 min；静置时间为5~7 min。

进一步，所述步骤（5）RNA样品沉降时间为2~10 h，沉降过程中控制温度-80 ℃。

进一步，所述步骤（6）离心操作条件为4 ℃，12000~14000 g，离心10 ~12 min；加入的DEPC水、RB、70%乙醇和β-巯基乙醇的体积比=100~120：350~400：250~300：7~9。

进一步，所述步骤（7）离心操作条件为4 oC，10000~12000 g，离心时间30~40 s； DEPC水的加入量为步骤（6）所得样品总体积的1/7~1/6。

本发明的有益效果：

接种前，通过培养12 d后，新鲜O.heveae孢子形态饱满，活力旺盛，选取同一批次O.heveae新鲜分生孢子接种Parafilm膜，保证O.heveae孢子在介质上侵染发育状态的一致性。在parafilm疏水介质上培养后，观察白粉菌侵染无需染色脱色等步骤，保存了病原菌原始形态，便于区分白粉菌发育的不同阶段，从而达到分阶段提取RNA的目的。观察发现O.heveae 0~24 hpi侵染发育过程可分为未萌发（0 hpi）、萌发（4 hpi）、附着胞形成（6，8 hpi）和次生附着胞形成（16，24 hpi）等4个形态显著的发育阶段，提取相应阶段总RNA即获得该状态下O.heveae转录本，经定量测定显示RNA浓度及完整性符合Illumina转录组文库要求，采用RT-PCR扩增18SrRNA基因，为进一步开展转录组测序分析和基因表达研究提供基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为橡胶树白粉菌不同发育时段的形态特征示意图；

图中，A：0 hpi分生孢子（200×）；B：4 hpi孢子萌发（200×）；C：6 hpi附着胞形成（200×）；D：8 hpi附着胞形成（400×）；E：16 hpi次生附着胞形成（400×）；F：24 hpi次生附着胞形成（200×）。CO：分生孢子；gt：芽管；AP：附着胞

图2为不同时段提取得到的RNA样品电泳；

图3为18S基因在不同时段的表达电泳。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

（1）选取橡胶7-33-97品系嫁接苗7-10天叶龄叶片作为培养O.heveae材料，采用接菌培养12d后HO-73 24h龄新鲜分生孢子作为实验菌源。接种前24 h轻摇叶片抖落老孢子，以新生24 h龄分生孢子作为接种材料，确保实验中孢子活力及侵染结构发育均一性；将Parafilm (美国BEMIS产品)膜置于底部有湿润滤纸的保鲜盒(40 cm×30 cm)中，用软毛刷将橡胶叶片上的白粉菌孢子轻刷于Parafilm膜表面，培养温度22℃，相对湿度50%~80%，保鲜盒避光密封保存；

（2）转移至Parafilm膜表面培养后，立即加2 mL预冷的Trizol（美国Invitrogen 公司）裂解液于Parafilm膜上，用涂抹棒蘸取裂解液反复涂刮接菌介质表面，待介质上的裂解液内可见白色粉状物或出现浑浊时，用移液器收集裂解液转移到预冷的2.0 mL离心管中，每管分装1 mL，震荡混匀30 s，并确保离心管中无真菌团块，20~25℃静置10 min；

（3）每离心管加入250 μL氯仿，剧烈振荡15 s，20~25℃静置,5 min后，在4 ℃，12000 g，离心15 min；

（4）离心后，转移上层水相到新的RNase free 2 mL离心管中；加入1/3溶液体积的醋酸钾(pH=6.0)，颠倒混匀并4 oC，8000 g，离心1 min，20~25℃静置5 min，得混合溶液；

（5）混合溶液加入等体积的异丙醇，充分混匀，置于-80 ℃沉降RNA样品2 h；

（6）经步骤（5）处理后，在4 ℃，14000 g，离心10 min；（7）经步骤（6）处理后，小心移去上清，加入100 μL DEPC水溶解沉淀；随后参照Omega真菌RNA试剂盒（美国Omega公司）提取方法洗脱步骤进行，加入350 μL RB，250 μL 70%乙醇，7 μL β-巯基乙醇，颠倒混匀。

（7）将总体积700 μL样品转移至RNA mini column管中，4 oC，10000 g，30 s离心；最终100 μL DEPC水洗脱RNA，即得橡胶树白粉病菌RNA；所得的RNA-80 ℃保存。

实施例2

（1）选取橡胶7-33-97品系嫁接苗7-10天叶龄叶片作为培养O.heveae材料，采用接菌培养10 d后HO-73 24h龄新鲜分生孢子作为实验菌源。接种前24 h轻摇叶片抖落老孢子，以新生24 h龄分生孢子作为接种材料，确保实验中孢子活力及侵染结构发育均一性；将Parafilm (美国BEMIS产品)膜置于底部有湿润滤纸的保鲜盒(40 cm×30 cm)中，用软毛刷将橡胶叶片上的白粉菌孢子轻刷于Parafilm膜表面，培养温度21℃，相对湿度50%~80%，保鲜盒避光密封保存；

（2）转移至Parafilm膜表面培养后24 h，立即加2 mL预冷的Trizol（美国Invitrogen 公司）裂解液于Parafilm膜上，用涂抹棒蘸取裂解液反复涂刮接菌介质表面，待介质上的裂解液内可见白色粉状物或出现浑浊时，用移液器收集裂解液转移到预冷的2.0 mL离心管中，每管分装1 mL，震荡混匀，并确保离心管中无真菌团块，20~25℃静置8 min；

（3）每离心管加入330 μL氯仿，剧烈振荡20 s，20~25℃静置7min后，在4 ℃，10000 g，离心20 min；

（4）离心后，转移上层水相到新的RNase free 2 mL离心管中；加入溶液体积1/4的醋酸钾(pH=6.0)，颠倒混匀并4 oC，8000 g，离心1.5 min，20~25℃静置7 min，得混合溶液；

（5）混合溶液加入等体积的异丙醇，充分混匀，置于-80 ℃沉降RNA样品10 h；

（6）经步骤（5）处理后，在4 ℃，12000 g，离心12 min；（7）经步骤（6）处理后，小心移去上清，加入120 μL DEPC水溶解沉淀；随后参照Omega真菌RNA试剂盒（美国Omega公司）提取方法洗脱步骤进行，加入400 μL RB，300 μL 70%乙醇，9 μL β-巯基乙醇，颠倒混匀。

（7）将总体积829 μL样品转移至RNA mini column管中，4 oC，10000 g，30 s离心；最终138 μL DEPC水洗脱RNA，即得橡胶树白粉病菌RNA；所得的RNA-80 ℃保存。

实施例3

（2）转移至Parafilm膜表面培养8 h后，加2 mL预冷的Trizol（美国Invitrogen 公司）裂解液于Parafilm膜上，用涂抹棒蘸取裂解液反复涂刮接菌介质表面，待介质上的裂解液内可见白色粉状物或出现浑浊时，用移液器收集裂解液转移到预冷的2.0 mL离心管中，每管分装1 mL，震荡混匀，并确保离心管中无真菌团块，20~25℃静置9 min；

（3）每离心管加入300 μL氯仿，剧烈振荡17 s，20~25℃静置6 min后，在4 ℃，11000 g，离心18 min；

（4）离心后，转移上层水相到新的RNase free 2 mL离心管中；加入溶液体积1/4的醋酸钾(pH=6.0)，颠倒混匀并4 oC，9000 g，离心1.3 min，20~25℃静置6 min，得混合溶液；

（5）混合溶液加入等体积的异丙醇，充分混匀，置于-80 ℃沉降RNA样品5 h；

（6）经步骤（5）处理后，在4 ℃，12000 g，离心12 min；（7）经步骤（6）处理后，小心移去上清，加入110 μL DEPC水溶解沉淀；随后参照Omega真菌RNA试剂盒（美国Omega公司）提取方法洗脱步骤进行，加入370 μL RB，280 μL 70%乙醇，8 μL β-巯基乙醇，颠倒混匀；

（7）将总体积829 μL样品转移至RNA mini column管中，4 oC，10000 g，30 s离心；最终115 μL DEPC水洗脱RNA，即得橡胶树白粉病菌RNA；所得的RNA-80 ℃保存。

白粉菌在各时段的RNA的提取

培养橡胶树白粉菌，按照本发明提供的培养方法和RNA提取方法，分别培养至不同时段（0，4，6，8，16，24 hpi）后将介质取出。每个时段均剪下一小片（1.5 cm×1.5 cm）接菌介质，显微镜下计数孢子萌发和附着胞形成率，并观察白粉菌在各时段的发育特征，同时提取各个时段的RNA样品。其中，0 hpi、8 hpi和24 hpi三个时段橡胶树白粉菌的培养方法和RNA提取方法，分别参照3个实施例进行，4hpi、6hpi和16hpi时段保鲜盒中培养时间分别为4 、6、16h其余操作与实施例1相同。

以芽管长度达到孢子长径的一半记为萌发，统计100个分生孢子的萌发率、附着胞形成率（孢子萌发率=已萌发的孢子数/总孢子数；附着胞形成率=附着胞数/孢子萌发数）。O.heveae在Parafilm膜表面萌发及附着胞形成特征及数据统计分别见图1，表1。

注：平均值以平均值±标准误表示，不同字母表示不同组间差异显著(P＜0.05)。

Note： Mean±SE express average，different letters mean significant difference between different groups(P＜0.05).

结合图1及表1，O.heveae 0~24 hpi侵染发育过程可分为未萌发（0 hpi）、萌发（4 hpi）、附着胞形成（6，8 hpi）和次生附着胞形成（16，24 hpi）4个形态显著的发育阶段。采用本发明提供的方法，观察白粉菌侵染无需染色脱色等步骤，保存了病原菌原始形态，说明Parafilm膜可作为观察病原孢子侵染发育前期形态变化的理想材料。

RNA样品电泳结果显示（见图2），每个侵染阶段样品出现2条条带，分别对应28S和18S rRNA，其中28S条带大约是18S条带亮度的两倍，表明提取的总RNA完整度较好。核酸定量检测结果显示A260/280数值在1.95~2.25之间，浓度达到150 ng·ul^-1以上（见表2），表明提取的RNA纯净且浓度较高。一般构建Illumina转录组测序文库要求浓度≥200 ng/μl，RNA总量≥10μg，采用该方案多次提取并浓缩满足文库要求，检测结果证明该RNA提取方法能够获得与特定发育时段对应高质量的白粉菌总RNA。

表 2 白粉菌侵染发育特征时段RNA质量检测

Table 2. Detection of RNA quality isolated from characteristic development stages of O.heveae

采用Magnus C. Lydolph 等人于2005年发表在《Applied and Environmental Microbiology》上的论文《Beringian Paleoecology Inferred from Permafrost-Preserved Fungal DNA》中涉及的SR7R-SR5引物对扩增O. heveae 18S基因片段，6个时段均能克隆到大约500 bp的片段（见图3），经30个扩增循环10 μL点样所得条带亮度较为一致，证明提取的RNA样品同样可用于橡胶白粉菌基因功能表达验证实验。将扩增测序的橡胶树白粉菌18S序列（518bp）输入NCBI做Blastn比对，结果显示同源序列主要来自白粉菌目白粉菌科物种。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）离心管内加入氯仿，振荡混匀，20~25℃静置后离心；

（5）加入与混合液等体积的异丙醇，混匀，沉降RNA样品；

（6）经步骤（5）处理的样品，离心后移去上清液，加入DEPC水溶解沉淀；随后加入RB、70%乙醇和β-巯基乙醇，颠倒混匀；

（7）经步骤（6）处理的样品，离心后加入DEPC水洗脱RNA，即得橡胶树白粉病菌RNA。

2. 根据权利要求1所述的一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤（1）接种前24 h摇动叶片抖落老孢子，以新生24 h龄分生孢子作为接种材料；所述的疏水介质为Parafilm膜。

3. 根据权利要求1所述的一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤（2）震荡后确保离心管中无真菌团块。

4. 根据权利要求1所述的一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）加入氯仿体积为离心管内液体体积的1/4~1/3；振荡时间为15~20 s，离心的条件为4℃，10000~12000 g，离心15~20 min；20~25℃静置时间为6~7 min。

5. 根据权利要求1所述的一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤（4）加入醋酸钾溶液的体积为水相体积的1/3，pH值为6.0；离心条件为4oC，8000~10000 g，离心1.0~1.5 min；静置时间为5~7 min。

6. 根据权利要求1所述的一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤（5）RNA样品沉降时间为2~10 h，沉降过程中控制温度-60 ℃至-80 ℃。

7. 根据权利要求1所述的一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤（6）离心操作条件为4 ℃，12000~14000 g，离心10 ~12 min；加入的DEPC水、RB、70%乙醇和β-巯基乙醇的体积比=100~120：350~400：250~300：7~9。

8. 根据权利要求1所述的一种橡胶树白粉病菌的RNA的提取方法，其特征在于：所述步骤（7）离心操作条件为4 oC，10000~12000 g，离心时间30~40 s； DEPC水的加入量为步骤（6）所得样品总体积的1/7~1/6。