CN104694119A - 一种功能性荧光碳点及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可乐中发现碳点成分（Carbon dots简称CDs）及其此碳点的性质表征和实际应用的方法。它以雀巢原味（1+2）咖啡，百事可乐（330ml）及可口可乐(330ml)为主要原料，通过葡聚糖凝胶G-25柱分离提纯并冷冻干燥24小时收集碳点。咖啡、可乐碳点成本较低，毒性低，提取方法简单，水溶性良好，生物相容性好，可用其作为未来一种新型的荧光碳纳米材料在生物标记方面进行广泛应用。

Description

一种功能性荧光碳点及其制备和应用

技术领域

本发明涉及荧光碳纳米材料，具体地说是在咖啡，可乐中存在的荧光碳纳米粒子。

背景技术

纳米材料具有良好的光学性能并在生物技术领域受到了越来越多的关注。其中,在生物检测、传感、造影、细胞化学、免疫组织化学等诸多的应用领域中,纳米材料的荧光标记技术近年来得到良好的发展,并成为实现上述功能的一种最主要的技术手段。但传统的荧光标记材料有机合成过程较复杂,生物相容性较差,在水中的溶解度很低，使其在水相中的应用受到了一定程度的限制。荧光纳米粒子的相关研究正是在这种背景下逐渐受到国内外学者的关注,并在近年得到了快速发展。荧光纳米材料——半导体量子点的光稳定性和水溶性优越，但是最近通过对纳米粒子在生物体内影响和生物安全性的研究,人们发现除了含毒性元素的纳米粒子(如CdSe)在生物体内具有毒副作用外,其他生物性良好的纳米材料(如Si、ZnO、SiO2、Au等)也表现出了一定的毒性,而且其毒性主要决定于纳米材料的粒径、化学组成、电荷性、亲水性、团聚性以及形貌等。随着对纳米材料的进一步研究发现一种新型的荧光材料——碳纳米荧光材料。碳纳米材料包括：零维的碳点、富勒烯、一维的碳纳米管，二维的石墨烯。碳元素在自然界中广泛存在，并且是广泛存在于有机体中，是生物体构成的重要元素，所以碳纳米材料相对于其他纳米材料的来源可定会更为广泛。碳点就是克莱德森大学研究者2004年在一次实验中发现的一种新型的碳材料，与传统的半导体量子点和传统的有机颜料相比，这位碳家族中的新成员不仅保持了碳材料毒性小，生物相容性良好，粒径较小等优点。另外,碳纳米颗粒还易于实现表面功能化、发光稳定以及荧光上转换等优点,所以荧光碳纳米颗粒被认为是一种最为理想的荧光标记或检测材料。现在已报道碳点合成中存在的问题包括如下几个方面：

（1）合成材料选择问题(文献3：Pin-Che Hsu and Huan-Tsung Chang.ChemComm,2012,48,3984–3986.文献4：Swagatika Sahu,Birendra Behera,Tapas K.ChemComm，2012,48,8835–8837）。碳点合成原料主要有石墨，草木灰，油烟等，原料来源广泛易得并且价格低廉，但量子产率较低，对以后生物材料的应用带来很多问题。天然糖类、EDTA和TRIS量子产率虽然很高，但是合成材料昂贵，不利于碳点的大规模生产及应用。

（2）合成方法问题。现在用的最为普遍的合成方法是水热法和微波法（文献1：SwagatikaSahu,Birendra Behera.ChemComm.,2012,48,8835–8837.文献2：Xinyun Zhai,PengZhang,Changjun Liu.ChemComm.,2012,48,7955–7957.）水热法的合成时间通常较长，并需要在较高温度下反应，但量子产率通常较低。微波法合成时间较短，但合成过程中有辐射，对环境造成污染，并不是一种绿色的合成方法。这两种合成方法通常成本很高。并且这两种方法合成的碳点通常都需要过柱提纯或透析除杂。

食品的主要成分是碳水化合物，而且在其加工过程中，经炒制，发酵，烘焙，高温灭菌等处理，碳点本身以在加工过程中形成，无需进行特意的合成。并且食品被人类食用几十甚至上百年，无毒副作用。人类对于食品来源的碳点安全是无需置疑的。食品来源的碳点的生物相容性优良，在生物成像应用方面将带来巨大的前景。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种在咖啡，可乐中提取的水溶性良好，生物相容性好，安全性高和价格低廉的碳点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

1.咖啡碳点

将2g雀巢原味咖啡溶解在20ml，88℃的热水中，离心分离（14*10³rpm，15min），去除沉淀，得上清液，过滤。通过葡聚糖G-25的凝胶柱子，分离提纯碳点。通过荧光分光光度计在300nm激发，收集有荧光碳点。并将收集的碳点进行真空冷冻干燥。并将样品进行性质表征，细胞标记和活体成像。

2.可乐碳点

将100ml的可口可乐和百事可乐分别放在磁力搅拌器上搅拌4h，搅拌速度为500rpm/min，使CO₂气体释放出去。将样品分别通过0.45μm，0.22μm的滤膜，并将其放入冷冻干燥器中冻干。并将冻干的样品稀释至20ml。通过葡聚糖G-25的柱子分离提纯，通过荧光分光光度计在300nm激发，收集有荧光的组分并进行表征实验。

所述碳点在食品中直接提取无需合成，碳点成分全部来源咖啡，百事可乐，可口可乐中。所述碳点毒性极低基本无毒。

本发明具有如下优点：

(1)本发明的碳点在咖啡，可乐的加工过程中已经形成，无须在进行特意的合成。省略了合成的步骤将大大提升工作效率。

(2)本发明的咖啡，可乐碳点具有良好的生物相容性及荧光性质优越。

(3)本发明的碳点具有极高的安全性。咖啡，可乐具有百年的历史，一直没有出现过安全问题，并被年轻人们所喜爱和饮用，所以可乐来源碳点的安全性是不容置疑的。

附图说明

图1是咖啡，可乐碳点的透射电子显微镜照片：a）咖啡，b）可口可乐，c）百事可乐。

图2是咖啡，可乐碳点的紫外，荧光光谱及荧光照片：a）咖啡，b）可口可乐，c）百事可乐。

图3是咖啡，可乐碳点的荧光寿命图：a）咖啡，b）可口可乐，c）百事可乐。

图4是咖啡，可乐碳点的上转换的荧光光谱：a）咖啡，b）可口可乐，c）百事可乐。

图5是咖啡，可乐碳点的XPS图谱：a）咖啡，b）可口可乐，c）百事可乐。

图6是咖啡，可乐碳点的FTIR图谱：a）咖啡，b）可口可乐和百事可乐。

图7是咖啡，可乐碳点的XRD的图谱：a）咖啡，b）可口可乐，c）百事可乐。

图8是咖啡，可乐碳点的离子强度稳定图：a）咖啡，b）可口可乐，c）百事可乐。

具体实施方式

采用咖啡，可乐作为原料。

咖啡碳点的制作将2g雀巢原味咖啡溶解在20ml，88℃的热水中，离心分离（14*10³rpm，15min），去除沉淀，得上清液，过滤。通过葡聚糖G-25的凝胶柱子，分离提纯碳点。通过荧光分光光度计收集荧光强度较强的碳点。并将收集的碳点进行真空冷冻干燥。

可乐碳点的制作将100ml的可口可乐和百事可乐分别放在磁力搅拌器上搅拌4h，搅拌速度为500rpm/min，使CO₂气体释放出去。样品分别通过0.45μm，0.22μm的滤膜，并将其放入冷冻干燥器中冻干。并将冻干的样品稀释至20ml。通过葡聚糖G-25的柱子分离提纯，通过荧光分光光度计在300nm激发，收集有荧光的组分。并冷冻干燥碳点。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

1.咖啡中碳点的提取

取4g的雀巢原味咖啡溶解于大约90℃的纯净水中并高速离心（14000rpm，15min），依次通过0.45nm和0.22nm的过滤膜。用葡聚糖G-25的凝胶柱子进行分离提取。每次上样量为1ml，用荧光分光光度计在300nm激发测量荧光强度，取有荧光的组分，进行冷冻干燥24h。

2.可乐中碳点的提取

将100ml的可口可乐和百事可乐分别放在磁力搅拌器上搅拌，直至CO₂气体全部释放。样品分别通过0.45μm，0.22μm的滤膜，并将其放入冷冻干燥器中冻干。并将冻干的样品稀释至20ml。通过葡聚糖G-25的柱子分离提纯，每次上样量1ml，将有荧光组分收集并将样品再次进行冷冻干燥。将干燥完成的样品进行表征实验。

3.咖啡，可乐碳点性质的表征

(1)咖啡，可乐碳点的形态及大小尺寸

图1是咖啡，可乐碳点的透射电子显微镜照片，结果表明经过提纯处理的可乐碳点形态呈圆球形，分散状，大小均匀，咖啡碳点粒径尺寸集中在2-3nm，可口可乐粒径尺寸集中在2.0-3.0nm，百事碳点粒径尺寸集中在2.5-3.5nm。

(2)咖啡，可乐碳点的荧光光谱，紫外吸收及荧光照片光谱特性

图2是咖啡，可乐碳点的荧光光谱，紫外吸收及荧光照片光谱。图中咖啡，可见可口可乐和百事可乐碳点的荧光光谱随着激发波长增加出现明显的红移，咖啡碳点的最大激发波长出现在390nm处而可乐碳点在都出现在300nm。但紫外的吸收光谱都出现在280nm有较强的吸收峰，是芳香族化合物的特征吸收峰。

（3）咖啡，可乐碳点的荧光寿命

图3是咖啡，可乐碳点的荧光寿命图。配置150mg/ml的咖啡水溶液，在376nm的激发光下激发，最大发射峰为420nm发射，测得荧光寿命。可乐碳点的实验方法与咖啡相同，但最大的发射峰为365nm。经实验中发现咖啡，可口可乐和百事可乐碳点是三指数猝灭，经计算咖啡的荧光寿命是4.64ns，可口可乐碳点的荧光寿命是4.32ns，百事可乐碳点的荧光寿命是4.26ns。

(4)咖啡，可乐碳点的上转换荧光性质

图4是咖啡，可乐碳点的上转换图谱。取200mg/ml的咖啡喝可乐碳点，用荧光分光光度计在激发波长750nm——800nm激发，在375nm——600nm检测发射光谱的强度及红移状况。图中可见咖啡，可乐碳点具有上转换的性质但强度较弱且最大的发射波长随着激发波长的改变而发生变化，在800nm激发下强度最大。

(5)咖啡，可乐碳点的XPS实验

图5是咖啡，可乐碳点XPS的图谱。图中结果表明咖啡，可乐碳点中主要含有C和O两种元素并且含有很少量的N元素。

(6)咖啡，可乐碳点的红外实验

图6是咖啡，可乐碳点的红外图谱。图（a）中的结果表明经过纯化的3326cm-1含有O-H和N-H的伸缩振动峰，2927cm-1有饱和烷烃的伸缩振动峰，1637cm-1有N-H的变形振动峰，1044cm-1有C-O的伸缩振动峰。而未经纯化的咖啡的除了上述官能团外还在1745cm-1有C=O的伸缩振动峰。这种现象是因为在高速离心的过程中咖啡中含有的植脂末和氢化植物油被去除掉，所以羰基消失。图（b）中表明两种碳点带有的基团基本相同，都含有-OH的基团，这也证明了碳点带有负电。

(7)咖啡，可乐碳点的XRD实验

图7是可乐碳点的XRD的图谱。图（a）中可见晶面间距d=0.43nm，证明碳点是具有无定形碳的结构。晶面间距的增加说明物质中含氧基团的增加。图（b）coca碳点无明显的峰无明显的峰，证明是无定型碳的结构。图（c）百事碳点的图谱d=5.04nm。证明两种碳点都具有无定形碳的结构。而百事碳点晶面间距的增加说明物质中含氧基团的增加。

（8）咖啡，可乐碳点的pH稳定性实验

图8是咖啡，可乐碳点的pH的稳定图。配置咖啡碳点100mg/ml和不同pH（2—11）的B-R缓冲溶液，将250μl分别加入不同的pH溶液中，用荧光分光光度计测荧光强度，每个pH值做三次平行实验。可乐碳点实验方法与咖啡相同。下图（a）中咖啡碳点的pH的稳定性良好，在pH增加荧光强度基本不变。图（b）（c）中可以看出两种碳点在酸性条件先稳定性较稳定，在pH=6出现明显的下降，在pH在碱性的条件下继续出现稳定性，只是比酸性条件下强度弱。

2.咖啡，可乐碳点的应用实验

咖啡碳点细胞标记实验

(1)细胞选用SMMC-7721细胞。选用含有10%的胎牛血清的RPMI-1640培养基并添加抗生素和非必需氨基酸在37℃，5%的CO₂下培养。细胞的接种密度是1×10⁵cells/ml。在培养基中添加咖啡碳点的浓度为15mg/ml。在37℃下培养24h。沉淀的细胞用磷酸盐缓冲溶液清洗。在荧光显微镜下观察细胞标记情况。

(2)细胞的标记实验照片

细胞的标记实验照片表明是对照细胞不添加碳点的。（b）是实验组细胞加入15mg/ml碳点的细胞。在图中可以看出经标记的细胞发出明显的荧光，并且在不同激发波长下都可以观察到明显的荧光。在紫外光的照射下，标记碳点细胞发出明亮的蓝光，而对照组只有较弱的蓝光；在蓝光的照射下，标记碳点的细胞发出明亮的绿光，对照组绿光及其微弱；在绿光的照射下，标记碳点的细胞发出明亮的红光，而对照组几乎无红色的荧光。说明碳点可以进入细胞并且标记细胞，是细胞标记的良好原料，并且碳点可以被各个波长的光激发，为将来的细胞标记提供了更广阔的发展空间。

可乐碳点的细胞标记实验

(1)细胞选用Tca-8113细胞。选用含有10%的胎牛血清的RPMI-1640培养基并添加抗生素和非必需氨基酸在37℃，5%的CO₂下培养。细胞的接种密度是1×10⁵cells/ml。在培养基中添加碳点的浓度为15mg/ml。在37℃下培养24h。沉淀的细胞用磷酸盐缓冲溶液清洗。在双光子显微镜下观察细胞标记情况。

(2)细胞的标记实验照片

细胞的标记实验照片表明两组碳点浓度均为10mg/ml。在图中可以看出经标记的细胞在405nm和488nm激发下均发出明显的蓝光和绿光并且荧光主要集中在细胞质中并没有进入细胞核，而对照组的细胞荧光几乎没有，说明碳点可以进入细胞并且标记细胞，是细胞标记的良好原料，为将来的细胞标记提供了更广阔的发展空间。

Claims (4)

1.一种功能性荧光碳点，其特征在于：采用咖啡或可乐作为原料；

咖啡碳点的制作：将约2g咖啡溶解在20ml—25ml，85—90℃的热水中，离心分离（14*10³rpm，15min），去除沉淀，得上清液，分别通过0.45μm、0.22μm的滤膜过滤；收集滤液通过葡聚糖G-25的凝胶柱子，分离提纯碳点；通过荧光分光光度计340nm激发，收集有荧光的碳点；并将收集的碳点进行真空冷冻干燥；

可乐碳点的制作：将约100ml的可口可乐和百事可乐分别放在磁力搅拌器上搅拌4h，转速为500rpm/min；将样品分别通过0.45μm、0.22μm的滤膜，收集滤液并将其放入冷冻干燥器中冻干；并将冻干的样品稀释至20ml。通过葡聚糖G-25的柱子分离提纯，通过荧光分光光度计340nm激发，收集有荧光强的组份，干燥得碳点。

2.一种权利要求1所述功能性荧光碳点的制备方法，其特征在于：将约2g咖啡溶解在20ml—25ml，85—90℃的热水中，离心分离（14*10³rpm，15min），去除沉淀，得上清液，分别通过0.45μm、0.22μm的滤膜过滤；收集滤液通过葡聚糖G-25的凝胶柱子，分离提纯碳点；通过荧光分光光度计340nm激发，收集有荧光的碳点；并将收集的碳点进行真空冷冻干燥；

可乐碳点的制作：将约100ml的可口可乐和百事可乐分别放在磁力搅拌器上搅拌4h，转速为500rpm/min；将样品分别通过0.45μm、0.22μm的滤膜，收集滤液并将其放入冷冻干燥器中冻干；并将冻干的样品稀释至20ml。通过葡聚糖G-25的柱子分离提纯，通过荧光分光光度计340nm激发，收集有荧光强的组份，干燥得碳点。

3.一种权利要求1所述的功能性碳点在生物标记中的应用。

4.按照权利要求3所述的应用，所述被功能性碳点标记的生物可为细胞。