CN104686196B - 一种通过阴干子实体保存和分离羊肚菌菌种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种通过阴干子实体保存和分离羊肚菌菌种的方法。本发明要解决的技术问题是提供现有的羊肚菌菌种保存方法受季节限制，且操作复杂、易污染、成本较高。本发明的技术方案是一种通过阴干子实体保存和分离羊肚菌菌种的方法，包括如下步骤：a、菌种保存；b、菌种分离。本发明方法成本低廉、操作简单，不受季节限制，且能有效的保存菌种活力，方便运输和保藏。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种通过阴干子实体保存和分离羊肚菌菌种的方法。
背景技术
羊肚菌是一种名贵珍稀食用菌，目前虽然能进行人工大田栽培，但产量极不稳定，导致其价格一直居高不下。菌种的获取是羊肚菌大田生产第一步，也是关键性的一步。目前羊肚菌菌种分离主要是用新鲜子实体作为分离材料，具体技术路线有2种:在羊肚菌子实体产出季节(每年3-4月份)，取新鲜子实体,倒悬于培养基上方，其子囊孢子自然弹落到培养基上(孢子分离法，常用)；或是取新鲜子实体组织，加无菌水研磨，制备菌悬液后涂布培养基(组织分离法，不常用)。以上方法生长出菌落后，通过数次反复纯化，得到纯净无污染的菌种，4℃保存，到生产时使用。由于新鲜子实体容易腐烂，无法进行长期保存，因此羊肚菌的菌种获取具有很强的季节性，错过了生产季节，就无法得到菌种。且采用该方法保存菌种需使用试管置于4℃冰柜或冰箱保存，成本高；试管保存菌种，隔一定时间需继代一次，以防止培养基养分耗尽，菌种活力退化，操作复杂；新鲜子实体上带线虫等害虫，以及大量杂菌，分离菌种时污染严重。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有的羊肚菌菌种保存方法受季节限制，且操作复杂、成本较高、分离时易污染。
本发明的技术方案是一种通过阴干子实体保存和分离羊肚菌菌种的方法，包括如下步骤：
a、菌种保存：在3-4月，选取成熟、健壮、无病虫害、菌盖饱满、菌盖上棱和凹坑完全展开、菌柄为乳白色、形态正常、体积适中的羊肚菌，在通风良好、温度10～15℃、黑暗、干燥处，摊开摆放，不时翻动，直到晾至子实体完全干燥；用纸袋包装，在室内干燥黑暗阴凉处保存；
b、菌种分离：在需要使用菌种时，于无菌条件下，取0.5—1cm2大小的阴干子实体菌盖组织，用无菌水浸泡，完全软化后，放入灭过菌的研钵，加入无菌水1毫升，研磨制备组织悬液，取组织悬液接种于麦粒培养基中央；在15～25℃避光培养10-20天至羊肚菌气生菌丝或菌核长出，然后用接种针挑取气生菌丝或菌核，接种于PDA培养基，再次培养，此后均在PDA培养基上进行反复纯化培养，直到得到无污染的菌种为止。
优选的，步骤a中，保存前检查已阴干子实体剩余的子囊孢子数量，方法如下：取0.5—1cm2大小的菌盖组织块，清水浸泡，完全软化后，放入研钵，加少量清水，研磨制备组织悬液，在显微镜下镜检，没有子囊孢子或子囊孢子太少的子实体弃去不用，选子囊孢子多的子实体保存。
优选的，步骤b中培养温度为20℃。
优选的，步骤b中培养时间为15d。
优选的，步骤b中，第二次纯化所用接种物为初次分离时得到的菌核。
在步骤a菌种保存的过程中，如果通风不良、温度较高或潮湿的环境，子实体容易发生腐烂，而光照会导致子实体大量弹射子囊孢子，因此需要低温、通风、干燥、黑暗环境。由于在子实体采收前和干燥过程中可能弹射了部分子囊孢子，因此在保存前可先进行剩余子囊孢子数量检查。保存过程中应作好防止虫害鼠害措施。
在步骤b菌种分离过程中，阴干子实体量太少，可萌发的孢子数量太少，不容易长出气生菌丝，量太多，虽然萌发的孢子多，杂菌也更多，0.5--1cm2较合适；无菌水量太少，不容易研磨成菌悬液，无菌水量太多，在麦粒底部形成水层，加速细菌扩散，1ml比较合适。因为阴干子实体菌盖组织非常薄，非常轻，所以在本领域常用面积表示阴干子实体组织的大小。
步骤b中麦粒培养基的制作：选取无病虫害、饱满、较新鲜、去壳带皮的小麦麦粒，清水浸泡24小时，入锅加清水煮至麦粒无白心，无破皮，捞出沥水，盛入平皿，于121℃灭菌30分钟，冷却后备用。
在步骤b中PDA培养基的制作：200克土豆切小块，煮汁过滤，滤液中加入葡萄糖20克，琼脂粉7克，清水定容至1000毫升，121℃灭菌30分钟，倒灭过菌的平皿，冷却凝固后备用。
本发明中，根据以往的认知，子实体干燥后，其中的子囊孢子也会变干，失去菌丝萌发能力。而本发明挑选了很多阴干、含大量子囊孢子的子实体进行孢子萌发实验，发现，虽然很多孢子已失去萌发能力，但仍然有约40-70％的孢子吸水膨胀，萌发菌丝，形成菌落，这一个结果就是本发明的技术基础。而高温烘干的子实体由于其中的孢子受高温损害失去活性，因此不容易再次萌发菌丝。
本发明中，以往的研究常用琼脂+营养物+水的培养基进行羊肚菌菌种分离，主要是常规PDA培养基。由于羊肚菌取自大田，因此携带大量杂菌，包括细菌和真菌。在PDA上生长时，杂菌，尤其是细菌常常长成厚厚一层菌苔，盖过羊肚菌菌丝，导致羊肚菌菌丝难以长出，即使羊肚菌长出气生菌丝，在挑取气生菌丝到新PDA上培养时，气生菌丝携带的细菌长势常常又会盖过羊肚菌菌丝，如此反复，导致分离失败。这一问题在新鲜羊肚菌使用孢子分离法分离菌种时无法解决，使用组织分离法时，虽然用逐级稀释菌悬液后分别进行平板培养基涂布的方法可以缓解污染情况，但这种方法适用于新鲜子实体，而不适用于干子实体。因为新鲜子实体其孢子萌发率几乎达100％，在经试验得到一个合适的稀释水平后，可以将该稀释水平应用于不同子实体个体的分离；而干子实体不同个体之间孢子萌发率相差比较大，针对每一个子实体都需要进行一系列的稀释实验，才可能得到适合该个体的稀释水平，工作量非常大。而本发明的研究发现，干组织制作的组织悬液接种到麦粒培养基上时，羊肚菌能长出大量气生菌丝，且健壮浓密，甚至发育出菌核组织，长势大大优于PDA培养基。这是由于细菌体积远比羊肚菌丝小，它们在培养基上扩展需要连续介质，如琼脂培养基，而麦粒培养基麦粒之间空隙很大，大大阻碍了细菌扩展的速度，且不能形成菌苔，而羊肚菌丝细长，空隙对其几乎没有阻碍作用，而且透气性好利于其生长，因此生长扩散速度比细菌快，虽然也有霉菌污染，但对羊肚菌的抑制能力没有细菌强，因此在小麦培养基上，羊肚菌菌丝比在PDA上生长得更好，更健壮，而取这些气生菌丝到PDA上进行纯化培养时，虽然也有杂菌污染，但羊肚菌菌丝长势优于杂菌，加快了菌种纯化进程。此外，由于麦粒培养基杂菌污染率比PDA低，因此子实体组织的量和无菌水的量只要控制在一个大致的比例范围即可，都可以长出健壮的气生菌丝，不需要做太复杂的稀释水平实验，非常适合于孢子萌发率不一致的干子实体。以上就是本发明的技术基础。
本发明的有益效果：
1、采用本发明方法，在任何时候均可以从干子实体分离得到菌种。干子实体中的干子囊孢子可以在至少48个月内保持萌发活力(因未进行更长时间的保存实验，有可能子囊孢子活力保持时间还会更长)，得到菌种。由此突破了羊肚菌菌种生产的季节性限制；此外，在田间得到优良子实体，可以通过阴干长期保存该菌种；
2、新鲜子实体分离得到的试管菌种必须在4℃冰箱冰柜保存。干子实体可在4℃冰箱冰柜保存，也可以在室温黑暗干燥阴凉处保存，成本低；
3、新鲜子实体分离的试管菌种需要定时转接新的试管，防止养分耗尽，菌种退化。干子实体现用现分离菌种，不用转接试管，操作简便；
4、干子实体体积比试管小很多，而且可捏碎为小碎块存放，即使保存很多品种，也不需要太大空间；
5、新鲜子实体得到的试管菌种在保存过程中易突变，优良种性退化。干子实体中的干子囊孢子突变几率非常低，能长期保持优良种性；
6、如果从外地引种，新鲜子实体长途运输易腐烂，试管种易污染，且包装复杂，如果在高温季节，菌种还会死亡。干子实体在长途运输过程中简单包装即可，活性不受温度限制，且不会发生腐烂；
7、阴干子实体相比新鲜子实体分离菌种，能在一定程度上减轻污染。线虫等微型害虫主要来源于子实体生长的泥土，它们需要啃食新鲜软嫩的子实体而存活，在分离菌种时，这些害虫在培养基中自由活动，传播杂菌，大大增加污染的几率。而干燥的子实体***,不利于害虫啃食和寄生其中，它们会死亡、逃逸或休眠，虽然在以后分离时，休眠的虫体可能再次成活，但数量已经比新鲜子实体大大减少，从而减少了污染几率；杂菌的菌丝生长需要湿润的环境，当环境变干燥时，杂菌菌丝也失水萎缩，失去生长活性，即使以后分离时部分杂菌菌丝遇到潮湿环境再次成活，但数量已经减少，污染几率也比新鲜子实体少；
8、初次分离时用小麦培养基，而不是常规PDA培养基，因小麦粒间空隙很大，大大阻碍了细菌的扩展，因此有利于减少污染，且透气，利于羊肚菌菌丝生长，加快菌种纯化进程。
具体实施方式
实施例1不同保存时间的干子实体分离菌种与新鲜子实体分离菌种比较
3-4月田间选取成熟、健壮、无病虫害、菌盖饱满、菌盖上棱和凹坑完全展开、菌柄为乳白色、形态正常、体积适中的羊肚菌，平均分作2份，1份立即进行菌种分离，另1份在通风良好、温度较低(10-15℃)、黑暗、干燥处，摊开摆放，不时翻动，直到晾至子实体完全干燥，取少量菌盖组织，清水浸泡软化后，研钵碾磨制作组织悬液，镜检后，挑选子囊孢子多的干子实体，装信封，置于室内干燥黑暗阴凉处保存，并作好防止虫害鼠害措施。
由于要镜检孢子萌发情况，因此这里分离时用PDA培养基。PDA培养基制作：200克土豆切小块，煮汁过滤，滤液中加入葡萄糖20克，琼脂粉7克，清水定容至1000毫升，121℃灭菌30分钟，倒灭过菌的平皿，冷却后备用。
新鲜子实体孢子分离菌种方法(孢子分离法)：在超净工作台上，将新鲜子实体菌盖向下，菌柄向上，倒悬于培养基上方，注意子实体不要接触培养基，同时开灯照光，促使子实体弹射子囊孢子。约12小时后，取平皿，于20℃避光培养，定时镜检，记录孢子萌发情况。菌落长出后，接种针挑取少许菌落边缘的菌丝，接种于另一PDA培养基中央，再次培养。这样反复进行纯化培养，直到得到无污染的菌种为止。
干燥子实体分离菌种方法：以前述阴干方法保存了12、24、36、48个月的干子实体，分别取0.5-1cm2大小的菌盖组织块，在超净工作台上用无菌水浸泡，完全软化后，放入灭过菌的研钵，加1ml无菌水，研磨制备组织悬液，用灭过菌的滴管加到PDA培养基上，用L型玻璃棒涂布使组织悬液在培养基表面分布均匀。在20℃避光培养，定时镜检，记录孢子萌发情况。菌落长出后，接种针挑取少许菌落边缘的菌丝，接种于另一PDA培养基中央，再次培养。这样反复进行纯化培养，直到得到无污染的菌种为止。
将以上得到的纯化菌种接种PDA，3皿/处理，记录菌丝生长情况。
表1 不同保存时间的干子实体和新鲜子实体所得菌种生长情况比较
注：上表中“+”是对指标的定量表述，“+”越多，表示长势越好，反之则越差。下同。
从表1结果可见，虽然干孢子由于吸胀过程比新鲜孢子长，萌发较慢，但其菌丝和菌核长势与新鲜孢子没有差异。而不同保存时间的干孢子其菌丝、菌核长势差异也不大，可见干孢子至少能在48个月内保持活力。
实施例2分离培养基对干孢子分离菌种的影响
鉴于以往试验中，发现常规PDA因为养分充足，在羊肚菌菌丝生长的同时，其他杂菌,尤其是细菌也大量生长，污染严重，因此做以下实验，用不含任何养分的纯琼脂培养基、麦粒培养基和常规PDA培养基进行对比。制作以下3种培养基：
培养基1：常规PDA培养基，成分和制作方法同实施例1。
培养基2：纯琼脂培养基，与常规PDA培养基相比，不含土豆汁和葡萄糖，其余成分和制作方法相同。
培养基3：麦粒培养基，选取无病虫害、饱满、较新鲜、去壳带皮的小麦麦粒，清水浸泡24小时，入锅加清水煮至麦粒无白心，无破皮，捞出沥水，盛入平皿，于121℃灭菌30分钟，冷却后备用。
用保存12个月的干子实体分离菌种，方法同实施例1，分别接种3种培养基，3皿/处理，其中接种培养基1和2时，是将菌悬液均匀涂布在培养基表面，接种培养基3时是将菌悬液接种于培养基中央。接种后在20℃避光培养，定时镜检培养基1和2上的孢子萌发情况。菌落长出后，记录气生菌丝长势。
表2 不同分离培养基上羊肚菌菌丝生长情况比较
从以上结果可见，培养基中如果没有养分，虽然杂菌很少，利于纯化，且羊肚菌孢子也能萌发，但萌发到一定程度后，孢子自带的养分耗尽，菌丝就停止生长，不能进一步生长为菌落。而用营养丰富的PDA,细菌污染很严重，虽然能长出气生菌丝，但长势弱，不利于纯化。而麦粒培养基虽然气生菌丝明显长出时间比PDA长，但菌丝粗壮，生长良好，甚至能发育成菌核，且污染小，因此，菌种初次分离还是需要麦粒培养基。
实施例3培养温度对干孢子分离菌种生长的影响。
用保存12个月的干子实体分离菌种，方法同实施例1，接种麦粒培养基中央，分别在15℃、20℃、25℃避光培养，3皿/处理，记录菌丝菌核生长情况。
表3 不同培养温度对干孢子分离菌种生长的影响
25℃时虽然菌丝生长速度较快，但其长势不如20℃，且菌核较少。因为羊肚菌是低温菌类，温度过高易导致菌丝过早老化。而15℃虽然孢子也萌发，且菌落、菌核长势也好，但由于菌丝生长慢，容易被杂菌污染，因此，20℃是最优的生长温度。
实施例4第二次纯化时不同接种物对羊肚菌菌丝生长的比较
在实施例2中，因为麦粒适宜羊肚菌菌丝生长，羊肚菌可以发育出菌核，本研究分别取实施例2中麦粒培养基上长出的羊肚菌菌核、菌丝、带羊肚菌菌丝的麦粒(1-2粒/皿)接种于PDA培养基，比较纯化效果。3皿/处理。20℃，避光培养15天后，观察菌丝生长情况。
表4 第二次纯化时的接种物对羊肚菌菌丝生长的影响
从表4可见，菌核是最好的接种物，因此在第二次分离时，如果麦粒培养基上能发育出菌核，最好用菌核接种，纯化快，所得菌种优良，杂菌污染少。如果没有菌核，可用麦粒接种，要先观察麦粒的污染状况，尽量取羊肚菌菌丝生长健壮，杂菌少的麦粒进行接种。
Claims (4)
1.一种通过阴干子实体保存和分离羊肚菌菌种的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、菌种保存：在3-4月，选取成熟、健壮、无病虫害、菌盖饱满、菌盖上棱和凹坑完全展开、菌柄为乳白色、形态正常、体积适中的羊肚菌，在通风良好、温度10～15℃、黑暗、干燥处，摊开摆放，不时翻动，直到晾至子实体完全干燥，取0.5-1cm2大小的菌盖组织块，清水浸泡，完全软化后，放入研钵，加少量清水，研磨制备组织悬液，在显微镜下镜检，没有子囊孢子或子囊孢子太少的子实体弃去不用，选子囊孢子多的子实体保存，用纸袋包装，在室内干燥黑暗阴凉处保存；
b、菌种分离：在需要使用菌种时，于无菌条件下，取0.5—1cm2大小的阴干子实体菌盖组织，用无菌水浸泡，完全软化后，放入灭过菌的研钵，加入无菌水1毫升，研磨制备组织悬液，取组织悬液接种于麦粒培养基中央；在15～25℃避光培养10-20天至羊肚菌气生菌丝或菌核长出，然后用接种针挑取气生菌丝或菌核，接种于PDA培养基，再次培养，此后均在PDA培养基上进行反复纯化培养，直到得到无污染的菌种为止。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中培养温度为20℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中培养时间为15天。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，第二次纯化所用接种物为初次分离时得到的菌核。
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Citations (5)
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| CN102027857A (zh) * | 2010-09-17 | 2011-04-27 | 朱斗锡 | 羊肚菌大田商业化栽培新方法 |
| CN102687639A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-09-26 | 河南科技大学 | 一种分离羊肚菌菌种的方法 |
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Non-Patent Citations (5)
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| 羊肚菌(Ydj0705)液体发酵工艺方法的研究;张旺璧等;《太原理工大学学报》;20121130;第43卷(第6期);第660-664页 * |
| 羊肚菌冷冻干燥加工技术研究;吴素蕊等;《中国食用菌》;20120915;第31卷(第5期);第49-51页 * |
| 羊肚菌的研究进展;任桂梅等;《延安大学学报(自然科学版)》;19991231;第18卷(第1期);第57-64页 * |
| 羊肚菌菌种分离与人工栽培;丁文奇;《食用菌科技》;19831231(第3期);第14-16页 * |
| 羊肚菌菌种简易保藏方法试验;刘兴蓉等;《四川林业科技》;20041231;第25卷(第4期);第35-37页 * |
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