CN104685057B

CN104685057B - 用于转化猪肺炎支原体的载体，转化的猪肺炎支原体菌株及其用途

Info

Publication number: CN104685057B
Application number: CN201380046932.3A
Authority: CN
Inventors: 路易斯·冈萨雷斯冈萨雷斯; 豪梅·皮诺尔列巴斯; 霍尔迪·蒙塔内格拉特; 玛利亚·卡马特斯马莱特; 恩里克·奎尔罗穆里洛; 玛尔塔·西塔亚阿尔诺
Original assignee: Hipra Scientific SL
Current assignee: Hipra Scientific SL
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2033-07-09
Also published as: CN104685057A

Abstract

本发明涉及猪肺炎支原体突变株，以及用于制备所述突变株的方法。其还涉及用于所述方法的载体、疫苗组合物以及包含用于针对猪地方性肺炎和其他猪疾病的所述突变株的接种试剂盒。本发明还涉及将猪肺炎支原体作为用于表达重组蛋白质和其他目的DNA序列的宿主的应用。

Description

用于转化猪肺炎支原体的载体，转化的猪肺炎支原体菌株及其用途

技术领域

本发明属于开发猪肺炎支原体的遗传操作的方法和工具的领域，其目的是制备所述细菌种的可用作针对猪疾病的疫苗的经转化的突变株。

发明背景

在兽医领域中，由诸如细菌、病毒或寄生虫等微生物引起的疾病导致动物死亡或导致生长或增肥过程低效率，从而带来严重的经济损失。

一种保护动物免于未来感染的方法包括施用疫苗以产生免疫应答。

直至现在，基于失活微生物或活的减毒微生物的疫苗已经成为控制或消灭大多数传染病的主要免疫学基础。

然而，虽然这些类型的疫苗得到好的结果，但是它们存在一些问题，诸如减毒疫苗可能恢复病毒性、无法将经接种的动物与感染动物区分开来，或者难以获得针对所有疾病都有效的疫苗。

开发微生物遗传操作的工具通常允许制备比上述疫苗更有效的疫苗，例如，亚单位疫苗、经遗传修饰的失活疫苗或活疫苗、标记疫苗(DIVA) 或DNA疫苗。

然而，并非兽医领域所有引起疾病的微生物都可容易地进行遗传操作。

支原体是难以在遗传水平进行操作的微生物。

支原体属于柔膜菌纲，是与革兰阳性菌密切相关的广泛类群的微生物。

支原体具有小的环形基因组，大小一般小于1,000kb，基因数范围为 500-1000。

可能由于它们适应寄生生活方式，该类细菌还缺乏许多在所有活生物体中经常发现的代谢通路。结果，支原体是在液体和固体培养基中都难以培养的难养微生物。

支原体包括猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(下文中称为 “Mhyo”)，其是在猪产业中造成巨大经济损失的细菌。虽然大多数猪肺炎支原体感染不严重，但是被猪肺炎支原体感染的动物容易受到呼吸系统的二次感染，后者可降低每日体重增长速率或甚至导致死亡。

猪肺炎支原体是世界范围内广泛传播的慢性呼吸疾病——猪地方性肺炎(下文中称为“PEP”)——的病原体。该疾病的特征是高发病率和低死亡率。PEP的流行度在增肥猪中特别高，并且临床症状的严重程度取决于引起感染的猪肺炎支原体菌株、环境条件、动物的健康条件以及由其他病原体导致的二次感染的发作。在一些情况下，PEP以亚临床的方式存在，没有明显的临床症状。在没有并发症的情况下，该动物显示与降低每日体重增加速率相关的慢性、非痰性咳嗽，随后降低饲料转化效率。当发生二次感染时，临床症状变得更加明显，存在急性呼吸症状和发热，其甚至可引起动物死亡。然而，即使没有由于二次感染导致的并发症，PEP也由于低饲料转化率和来自医疗的成本而导致严重的经济损失。一旦在农场发生该疾病，其通过咳嗽生成的气溶胶横向地传递给其他动物，并且从繁殖的母猪纵向传递给小猪。

除了难以培养外，由于几乎没有可用的工具，支原体的遗传操作受阻。

支原体特别是猪肺炎支原体的遗传操作中的困难已经在现有技术中有描述。

猪肺炎支原体菌株232的基因组序列描述于Minion等的文章，The GenomeSequence of Mycoplasma hyopneumoniae Strain 232,the Agent of SwineMycoplasmosis,J.Bacteriol.,2004,186(21),7123-7133。作者称，猪肺炎支原体是难养的微生物，并且缺乏用于转化猪肺炎支原体的工具和操作方案。

在研究使猪肺炎支原体经历温度变化时进行的猪肺炎支原体改造的环境中，在Madsen等的文章，Transcriptional Profiling of Mycoplasma hyopneumoniae duringHeat Shock Using Microarrays,Infect.Immun.,2006, 74(1),160-166中，作者称，尽管猪肺炎支原体在猪生产中十分重要，但是几乎没有关于其响应环境变化的发病机理的潜在分子机制方面的研究，并且这可能由于其生长困难，并且由于其是难以进行遗传操作的微生物的事实所致。

在Pich等的文章，Comparative analysis of antibiotic resistance markergenes in Mycoplasma genitalium:application to studies of the minimal genecomplement,Microbiology,2006,152,519-527中，描述了通过电穿孔用不同的质粒对生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)遗传改造，但是未发现提及猪肺炎支原体。

B.Machado的论文,de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae-uma ferramenta para estudos genéticos do agente da Pneumonia Enzoótica Suína,Porto Alegre,2007描述了用复制型质粒 pOSTM通过电穿孔转化猪肺炎支原体菌株7448。为了构建该质粒，将猪肺炎支原体的oriC区和包含处于橘螺原体(Spiroplasma citri)启动子基因控制下的四环素抗性基因的表达盒引入pUC18载体。虽然通过PCR实验部分展示了质粒的结合以及所述载体赋予的抗生素抗性，但是该论文中没有提供显示质粒pOSTM确实稳定地并入猪肺炎支原体中的确定性结果，因为没有描述从抗四环素的转化株中分离该质粒。此外，其还描述，在选择性培养基中传两代后，该转化株难以生长。因此，这些结果显示，使用该文件中公开的转化，可能无法稳定地将外源DNA序列引入猪肺炎支原体菌株中，因为在该转化菌传了多代后，不能回收到该外源 DNA序列。

虽然该公开内容发表于2007年，但是在后续研究中猪肺炎支原体的遗传改造的问题未显示得到解决。

在与2009年10月1日至2010年9月30日时期对应的密苏里大学 M.Calcutt的关于题为“Development of genetic manipulation protocols for Mycoplasmahyopneumoniae clade of animal pathogens”的项目报告(从网页http://www.reeis.usda.gov/web/crisprojectpages/220630.html下载，于 16.02.2012检索)中，描述了该项目的目的是开发用于对猪肺炎支原体进行遗传操作的方法。还描述了意图用包含四环素抗性基因的质粒电转化猪肺炎支原体。但是，对转化菌进行的DNA分析的结果不是阳性的，并且使作者认为没有发生转化。也没有描述关于该抗性基因表达的结果。

Browning等的文章，Developing attenuated vaccines to controlmycoplasmoses,Microbiology Australia,2011,121-122描述了开发包含在宿主体温下不生长的温敏支原体菌株的疫苗。通过化学突变从野生型菌株得到所述菌株。作者称，对猪肺炎支原体和滑液囊支原体(M.synoviae) 的直接遗传操作仍然是一个挑战，并且尚未在所述物种中实现。来自相同工作组的国际专利申请WO-A-2010/132932也提到了温敏的猪肺炎支原体菌株。

Maboni等的文章，Mycoplasma hyopneumoniae Transcription UnitOrganization:Genome Survey and Prediction,DNA Research,2011,18, 413-422中，对三种猪肺炎支原体菌株(7448、J和232)的基因组进行了比较性回顾，以鉴定开放阅读框。作者称，尽管开发了用于一些支原体的物种的人工转化工具或其他遗传工具，但是尚未针对猪肺炎支原体开发这些方法。

因此，尽管已经有了几次进行这样的转化的不成功尝试，但是本领域现有技术中尚未描述转化猪肺炎支原体的方法。

因此，仍然需要提供借助遗传工程工具来制备猪肺炎支原体突变株的方法，从而提供适于制备针对猪地方性肺炎的疫苗组合物的突变株，并最终与用于预防和/或治疗其他猪疾病的其他抗原组分组合。

发明概述

本发明的目的是用于制备猪肺炎支原体突变株的方法。

本发明的另一方面是在所述方法中使用的复制型质粒载体。

本发明的另一方面是在所述方法中使用的转座子载体。

本发明的另一方面是所述载体用于制备猪肺炎支原体突变株的用途。

本发明的另一方面是能够通过所述方法得到的猪肺炎支原体突变株。

本发明的另一方面是包含外源DNA序列的猪肺炎支原体突变株。

本发明的另一方面是包含本发明的载体的猪肺炎支原体突变株。

本发明的另一方面是用本发明的载体转化的猪肺炎支原体菌株。

本发明的另一方面是所述突变株作为表达宿主的用途。

本发明的另一方面是包含所述突变株的疫苗。

本发明的另一方面是本发明的猪肺炎支原体突变株用于制备疫苗的用途。

本发明的另一方面是包含所述突变株的接种盒。

本发明的作者开发了用于制备猪肺炎支原体突变株的方法，出乎意料地，可由此将外源DNA序列稳定地引入猪肺炎支原体菌株的细胞质或基因组中，并且表达这些序列的内容。

对于表述“稳定引入猪肺炎支原体的细胞质或基因组中的外源 DNA”，应理解为，这样的序列没有随着已经被所述外源序列转化了的细菌的连续传代而丢失。该稳定性是指外源DNA序列可在转化的细菌及其子代内复制，并且在经转化的细菌多次传代后可回收所述外源DNA序列。

通过所开发的方法，其首次打开了借助遗传工程工具来改造猪肺炎支原体菌株的大门。

可用所述方法制备包含外源DNA序列的猪肺炎支原体突变株。所述突变株可具有不同性质，例如，表达特定的蛋白质，或具有比野生型亲代菌株更低程度的毒力。

所述突变株还可用作疫苗，例如，减毒活疫苗、失活疫苗、可区分接种动物与感染动物的标记疫苗，或者针对猪地方性肺炎和可感染猪的其他另外的疾病(例如由2型猪环状病毒(PCV2)引起的感染)的多价疫苗。

本发明的方法首先使得能够以稳定形式对猪肺炎支原体进行遗传改造，并且随其一起实现的有，使用这些转化的菌株作为外源DNA序列的表达载体等，所述外源DNA序列为例如编码治疗目的或预防目的的蛋白质的核苷酸序列，例如PCV2衣壳的序列等。借助本发明公开的技术，已经设计并制备了还可为多价的新疫苗候选物，因为可通过施用由本发明的方法改造的单一菌株来将其用于预防不同疾病。

在本说明书和权利要求书中，除非上下文另有清楚指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数引用。

类似地，在本发明的上下文中，除非清楚地指明其指氨基酸序列，否则术语“序列”是指DNA序列。

附图说明

图1

图1示出了用于遗传改造猪肺炎支原体和实现产生重组蛋白质或反义转录物的复制型质粒。用箭头标注了启动子、基因和用于克隆操作的限制酶位点。

质粒pOG包含使载体可在猪肺炎支原体中复制并同时使得能够选择所述质粒的载体细胞的必需元件。该质粒含有猪肺炎支原体的oriC区(第 2096-4043位碱基)以及处于猪肺炎支原体P97蛋白基因启动子(pp97，第1823-2087位碱基)控制下的庆大霉素抗性标记基因(acc，第1-1816 位碱基)。

质粒pOGCRE由质粒pOG直接衍生而来，并且其还包含处于启动子 pp97(第1039-1303位碱基)控制下的噬菌体P1(第1-1032位碱基)的 cre基因。

与前一个质粒不同，质粒pOGA159包含处于启动子pp97(第647-938 位碱基)控制下的四环素抗性基因(tetM，第945-2883位碱基)。猪肺炎支原体的oriC区位于第2901-4848位碱基之间。最后，其包含反向的并且处于启动子pp97(第4996-5260位碱基)的控制下的与tlyA基因5'末端对应的猪肺炎支原体基因组的区段(a159，第4855-4980位碱基)。

图2

图2示出了用于遗传改造猪肺炎支原体和实现产生PCV2病毒衣壳蛋白的不同重组版本的复制型质粒。用箭头标注了启动子、基因和用于克隆操作的限制性内切酶位点。

质粒pOGC包含与质粒pOG(图1)所含完全相同的元件，并且还包含启动子pp97的另外的拷贝(第7654-7918位碱基)，其控制编码包含于PCV2病毒衣壳的ORF2V2(第6946-7647位碱基)中的环状病毒衣壳的合成基因的表达。该质粒使PCV2衣壳蛋白在载体细胞的细胞质中表达。

质粒pOGL包含与质粒pOG(图1)所含完全相同的元件，并且还包含猪肺炎支原体P46蛋白基因启动子序列(pp46：第8918-9181位碱基)，其控制编码P46猪肺炎支原体膜蛋白的基因内的PCV2病毒衣壳 (ORF2)蛋白基因的融合体(第6946-7930位碱基，以及第8642-8917 位碱基)的表达。该质粒产生杂合蛋白，其特征是，第1-92位氨基酸来自P46蛋白N末端，第95-327位氨基酸与PCV病毒衣壳的蛋白对应，并且第330-656位氨基酸来自猪肺炎支原体P46蛋白的C末端。

质粒pOGT包含与质粒pOG(图1)所含完全相同的元件，并且还包含启动子序列pp46(第8905-9169位碱基)，其控制处于编码P46猪肺炎支原体膜蛋白(第7648-8904位碱基)的基因3'末端的PCV2病毒衣壳 (ORF2)蛋白基因的融合体的表达。该质粒产生杂合蛋白，其特征是，第1-419位氨基酸来自P46蛋白，并且第420-652位氨基酸与PCV2病毒衣壳即ORF2版蛋白(第6946-7647位碱基)对应。

图3

图3示出了携带用于实现***至猪肺炎支原体染色体中的小转座子的质粒图。用箭头标注了启动子、基因和用于构建质粒的限制酶靶标，以及其他重要的DNA序列。

质粒pTC3包含得到携带转座子***物的猪肺炎支原体菌株的必需元件。已经在质粒pMTn4001的骨架上构建了该质粒。该质粒的第一元件是启动子pp97(第7-271位碱基)，其控制质粒pMTn4001的转座酶(第 284-1261位碱基)的表达。第1461-1486位碱基和第3774-3799位碱基与反向重复对应，并且在图中分别被标注为IRI和IRO。该质粒的最后元件与四环素抗性标记基因(第1761-3692位碱基)对应，所述标记基因处于猪肺炎支原体P97蛋白的启动子(1502-1766)的控制下。

质粒pTC366由质粒pTC3直接衍生而来，并且包含处于四环素抗性标记基因TetM(第1791-3722位碱基)两侧的lox66序列(Cre重组酶的底物，第1485-1518位碱基和第3762-3795位碱基)。

质粒pTC3C由质粒pTC366直接衍生而来，并且包含编码PCV2病毒的PCV2病毒衣壳蛋白ORF2V2的基因(第4078-4779位碱基)，其处于启动子pp97(第3808-4071位碱基)的控制下。该质粒促使合成与被所述质粒转化的猪肺炎支原体菌株的细胞质中的PCV2衣壳蛋白对应的重组蛋白。

质粒pTC3L由质粒pTC366直接衍生而来，并且包含处于编码P46猪肺炎支原体膜蛋白的基因内的PCV2病毒衣壳蛋白(ORF2)基因(分别为第4066至4340位碱基和第5052至6036位碱基，以及第4347至5045 位碱基)的融合体，其处于启动子pp46(第3801-4065位碱基)的控制下。该质粒促使合成杂合蛋白，其特征是，第1-92位氨基酸来自P46蛋白N末端，第95-327位氨基酸与PCV病毒衣壳蛋白对应，并且第330-656 位氨基酸来自猪肺炎支原体P46蛋白的C末端。

质粒pTC3T由质粒pTC366直接衍生而来，并且包含PCV2病毒衣壳蛋白(ORF2)的基因与编码P46猪肺炎支原体膜蛋白的基因(分别为第5322-6031位碱基和第4065-5321位碱基)的融合体，其处于编码猪肺炎支原体P46蛋白的基因(第3801-4065位碱基)的启动子的控制下。该质粒促使合成杂合蛋白，其特征是，第1-419位氨基酸来自P46蛋白，并且第420-652位氨基酸与PCV2病毒衣壳蛋白对应。

图4

图4示出了复制型质粒的稳定性，以及它们在生产重组蛋白质中的用途。

该图分为3个小图(panel)。A图示出了在6V/cm电压下跑了2小时的0.7％琼脂糖凝胶电泳。1kb plus梯式分子量标记物(Invitrogen)在泳道M中。分离自大肠杆菌Xl1-blue并用限制酶ScaI消化了的质粒pOG 在泳道1中。用限制酶ScaI消化了的猪肺炎支原体菌株232POGc9的总 DNA提取物在泳道2中。用限制内切酶ScaI消化了的质粒pOG的期望的条带是3564bp、2225bp和1143bp(图4，A图)。通过与该分子量标记物以及分离自大肠杆菌Xl1-blue的质粒条带进行比较，证实质粒pOG 在菌株232POGc9中稳定遗传。在图的左侧标注了不同的相关DNA标记物片段的长度。

B图示出了用通过噬菌体P1的Cre重组酶的特异性多克隆抗体检测的不同猪肺炎支原体菌株蛋白样品进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的 Western印迹。泳道1示出了菌株232POGCREc1的蛋白提取物，其中观察到预期的39kDa条带。泳道2示出了菌株232的提取物，其中没有观察到条带，并且Precision Plus Protein Dual Xtra(Biorad)分子量标记物在泳道M。图的右侧以kDa示出了相关分子量。这些结果指示，在将其转化至猪肺炎支原体菌株233中后，质粒pOGCRE能够产生Cre蛋白。

C图示出了琼脂糖凝胶电泳，其中分析了猪肺炎支原体亲代菌株 6314(泳道1)和用质粒pOGA159转化菌株6314的产物菌株6314pOGAc4 (泳道2)的DNA样品。箭头标注了由经转化的猪肺炎支原体突变株中的质粒pOGA159采用的两种构象的位置。

图5

图5示出了对携带转座子***物的猪肺炎支原体菌株的回收及其在生产重组蛋白质中的有用性。

该图分为3个小图。A图(泳道M以及1-4)示出了在6V/cm电压下跑了2小时的0.7％琼脂糖凝胶电泳，而A图右侧(泳道5-8)示出了该凝胶在尼龙膜上的Southern印迹。所述Southern印迹中观察到的条带与由针对在猪肺炎支原体P97蛋白启动子控制下的TetM序列设计的探针所识别的条带对应。1kb Plus梯式(Invitrogen)分子量标记物在泳道M中。泳道1和5与来自用限制内切酶EcoRI消化了的菌株232TC3hlyC的总 DNA提取物对应。泳道2和6与来自用限制内切酶EcoRI消化了的菌株 232的总DNA提取物对应。泳道3和7与用限制内切酶EcoRV消化了的菌株232TC3hlyC的总DNA提取物对应。泳道4和8与用EcoRV消化了的菌株232的总DNA提取物对应。泳道5中的6.3kb条带和泳道7中的 2kb条带表明处于猪肺炎支原体基因组中的P97蛋白启动子控制下的含有TetM抗性的转座子的存在，而泳道6和8中没有这些条带则证实了这些结果。

B图示出用INGEZIM PCV DAS试剂盒(Ingenasa，Spain)以及来自猪肺炎支原体的不同蛋白质样品进行的ELISA测定的结果。在该表的左列中标注了各测定中使用的稀释度，而在上行示出了所分析的菌株。数值结果是来自450nm波长处的由各孔中引入的蛋白质的量归一化的吸收读数的值。所有用pTC3C、pTC3L和pTC3T载体转化的猪肺炎支原体菌株都表现出明显比阴性对照更高的吸收，这表明在这些菌株的每一个中都发生了重组PCV2衣壳蛋白的表达。

C图示出了用由PCV2衣壳蛋白的特异性单克隆抗体检测的不同猪肺炎支原体菌株进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的Western印迹。泳道1包含菌株232Cc6的蛋白提取物，其中观察到预期的28kDa条带。泳道2 包含菌株232的蛋白提取，其中未观察到条带。泳道3包含在INGEZIM PCV DAS试剂盒(Ingenasa，Spain)中作为阳性对照提供的PCV2衣壳蛋白样品，其中观察到期望的28kDa条带。泳道4包含菌株6314的蛋白提取物，其中未观察到条带，而菌株6314Cc1的蛋白提取物在泳道5 中，其中观察到预期的28kDa条带，尽管该条带的强度比泳道1和3中的条带强度更弱。这些结果表明，在6314和232两个菌株中，存在于质粒pTC3C中的转座子***到猪肺炎支原体基因组中，诱导了由ORF2v2 编码的PCV2衣壳蛋白的表达。

图6

图6示出了用实施例7.1第1-4组的实验疫苗得到的针对猪肺炎支原体的血清学应答。第5组和第6组分别与未接种但受到感染的对照组以及未接种且未感染的对照组对应。

进行分析时的该研究的天数处于x轴上，并且通过ELISA测量的表达为％的S/P比率(样品/阳性)在y轴上表示为IgG抗体针对猪肺炎支原体响应的指示。

星号指示相对于未接种但受到感染的对照组的差异在统计学上是显著的(根据曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验，p<0.05)。

图7

图7示出了用实施例7.1第1-4组的实验疫苗得到的针对猪环状病毒 (PCV2)的血清学响应。第5组和第6组分别与未接种但受到感染的对照组以及未接种且未感染的对照组对应。

进行分析时的研究天数处于x轴上，并且通过ELISA测量的表达为％的S/P比率(样品/阳性)在y轴上表示为IgG抗体针对PCV2响应的指示。

星号指示相对于未接种但受到感染的对照组的差异在统计学上是显著的(根据单尾方差检验，p<0.05)。

图8

图8示出了实施例7.1的处理组1-4以及对照组5和6中的血清病毒载量。

进行分析时的研究天数处于x轴上，并且y轴上指示以拷贝/ml表达的猪环状病毒的血清病毒载量的log₁₀。

星号指示相对于对照组(未接种但受到感染)的差异在统计学上是显著的(根据曼-惠特尼U检验，p<0.05)。

图9

图9示出了对由根据实施例8.2的猪肺炎支原体感染的血清学响应。第1组与用实施例4.8的突变株感染的动物对应，第2组与用野生型亲代菌株感染的动物对应，并且第3组是非感染的对照组。

星号指示相对于用野生型亲代菌株感染的组的差异在统计学上是显著的(根据单因素方差检验，p<0.05)。

图10

图10示出了实施例8.2的猪肺炎支原体PCR-阳性动物的百分比。第 1组与用实施例4.8的突变株感染的动物对应，第2组与用野生型亲代菌株感染的动物对应，并且第3组是非感染的对照组。

进行分析时的研究天数处于x轴上，其为所分析的样品类型(鼻型或支气管型)，并且在y轴上指示了PCR-阳性的动物的百分比。

星号指示相对于用野生型亲代菌株感染的组的差异在统计学上是显著的(根据Fisher's精确检验，p<0.05)。

图11

图11示出了根据实施例8.2的测定，受到可能因猪肺炎支原体感染导致的损伤影响的平均肺表面。第1组与用实施例4.8的突变株感染的动物对应，第2组与用野生型亲代菌株感染的动物对应，并且第3组是非感染的对照组。

y轴上指示了受影响的肺表面的平均值。

星号指示相对于用野生型亲代菌株感染的组的差异在统计学上是显著的(根据曼-惠特尼U检验，p<0.05)。

图12

图12示出了在实施例7.2的处理组1以及对照组2和3中确定的血清病毒载量。

进行分析时的感染后的天数处于x轴上，并且y轴上指示通过定量 PCR确定的以拷贝/ml表达的猪环状病毒的血清病毒载量的log₁₀。

图13

图13示出了实施例7.2的处理组1以及对照组2和3中显示因PCV2 导致的病毒血症的动物百分比。

进行分析时的感染后的天数处于x轴上，并且y轴上指示了阳性动物的百分比。

图14

图14示出了以百分比表达的感染后第28天实施例7.2的处理组1以及对照组2和3的因类猪肺炎支原体损伤导致的受影响的肺的中间面。

x轴上是组，并且y轴上是因类猪肺炎支原体损伤导致的受影响的肺的中间面。

发明详述

本发明的目的是用于制备猪肺炎支原体突变株的方法，其包括通过使用包含至少一个外源DNA序列的携载载体转化猪肺炎支原体菌株的步骤，使该序列处于与猪肺炎支原体的启动子区具有至少80％同一性的 DNA序列的控制下。

通过本发明的方法可得到猪肺炎支原体突变株，其稳定地包含处于细胞质中或在其基因组中的外源DNA序列，并且表达所述序列的内容。

本发明的方法还包括用于制备细菌突变株的方法的典型步骤，所述步骤是本领域技术人员公知的，并且对所述方法来说并非是必不可少的。

因此，本发明的方法还包括以下步骤：

a)构建载体然后在转化步骤中将所述载体转移至细菌中，以及

b)在所述转化步骤后选择已经被外源DNA序列转化了的突变细菌。

如将在下面的实施例部分中所描述的，通过分离和表征存在于经转化菌株中的DNA序列，以及例如，通过检查突变株的基因型或表型特征，或通过检查所述突变株的重组蛋白生产，来确定本发明方法的效力。

可通过本发明方法中使用的携载载体得到猪肺炎支原体突变株，其稳定地包含处于细胞质中或在其基因组中的外源DNA序列，并且表达所述序列的内容。

在一个优选实施方案中，所述携载载体选自复制型质粒载体和转座子载体。

在一个优选实施方案中，所述携载载体是复制型质粒载体。

在本发明的上下文中，“复制型质粒载体”或“复制型质粒”应理解为携带像宿主细菌中的附加体元件一样复制的DNA序列的载体，其中附加体元件是自我复制的染色体外的单元。

在本发明的上下文中，复制型质粒载体是使得能够以稳定的方式将外源DNA序列并入猪肺炎支原体细菌细胞液中，并且任选地使得能够表达由细菌细胞液中的所述序列编码的RNA或蛋白质的载体。

在一个优选实施方案中，所述携载载体是载体，优选是质粒，其中通过转座(transposition)将所述携载载体中包含的至少一个外源DNA序列并入猪肺炎支原体菌株的基因组中。这意为，使用所述携载载体通过转座来转化所述菌株，从而得到通过转座将所述载体的实质性部分并入到基因组中的猪肺炎支原体突变株，所述实质性部分是包含在被称为IRI 和IRO的反向重复序列之间的部分，并且其包含至少一个外源DNA序列。所述反向重复是转座酶靶序列。

在本发明的上下文中，“转座子载体”应理解为携带DNA序列的载体，其中所述DNA序列中的至少一个通过转座并入到宿主的基因组中。

在本发明的方法中，转座子载体是使外源DNA序列稳定地并入到猪肺炎支原体细菌的基因组中的载体。

所述并入在细菌的基因组中随机发生。因此，根据所述***发生的特定位点，细菌的任何基因可因其序列被***转座子打断而失活。如果失活的基因涉及猪肺炎支原体毒力因子，则所得的菌株可用于制备针对 PEP的减毒疫苗，并且其还可使得能够得到针对PEP的标记疫苗。此外，并且如在复制载体的情况下，所述转座子还可包含处于猪肺炎支原体启动子区控制下的其他基因，以用于表达具有不同功能的重组蛋白质。

由于通过本发明方法实现的遗传改造被整合到基因组中，所以经转化的菌株在接下来的世代中是稳定的。

外源DNA序列

在本发明的上下文中，“外源DNA序列”应理解为被稳定地引入到猪肺炎支原体菌株的细胞质或基因组中的DNA片段。

已经发现，通过本发明的方法，可将外源DNA序列稳定地引入猪肺炎支原体菌株中，因为所述序列不会在用所述外源序列转化的细菌的连续传代过程中丢失。该稳定性是指外源DNA序列可在转化的细菌及其后代内复制，并且可在经转化的细菌多次传代后回收所述序列。

如在下面解释的，所述外源DNA序列可为十分多样的，并且具有广泛的定义。

在本发明的上下文中，所述序列可为例如标记基因。包含所述外源 DNA序列的载体通常包含能够容易地选择已被转化的突变株的所述标记。所述遗传标记可为例如抗生素抗性基因。其可包括例如来自质粒pIVT-1的赋予对四环素抗性的TetM基因(在Dybvig等，J.Bacteriol,2000, 182,4343-4347中描述)，或赋予对氨基糖苷类抗生物素(如庆大霉素)抗性的aac(6')-aph(2")基因(例如在Chow等，Antimicrob.Agents Chemother.,2001,45/10),2691-2694中有描述)。用于表型选择的基因优选是TetM基因。

所述外源DNA序列还可为编码重组蛋白质的基因，例如噬菌体P1 的Cre重组酶，或转座子Tn4001的转座酶，或转座酶靶序列如IRI或IRO。

所述外源DNA序列还可为编码治疗目的或预防目的的重组蛋白的基因。所述蛋白还可与引起猪疾病的微生物的毒力因子或抗原决定簇相关，并且能够诱导或促进针对可感染猪的疾病或病理状况的保护性应答。所述外源DNA优选编码诱导针对由以下微生物引起的感染猪的疾病或病理状况的保护性应答的重组蛋白质：放线杆菌属(Actinobacillussp.)、短螺菌属(Brachyspira sp.)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、等孢子球虫菌属(Isospora sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、梭菌属(Clostridium sp.)、支原体(Mycoplasmasp)、胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)、大肠杆菌、猪生殖与呼吸综合征病毒、流感病毒、接触性胃肠炎病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒、冠状病毒、轮状病毒、猪断奶前后发育停滞综合征病原(porcine periweaning failure to thrive syndrome agent)、典型猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、杯状病毒、细环病毒(torque teno virus,TTV)和猪环状病毒。其中，例如编码猪生殖与呼吸病毒(PRRS)糖蛋白5(gp5)的基因、编码2型猪环形病毒(PCV2)衣壳蛋白的基因、编码典型猪瘟病毒糖蛋白E(gpE)的基因、编码猪细小病毒(PPV)sp1蛋白的基因、编码多杀巴斯德菌毒素的基因、编码支气管炎博德特菌皮肤坏死毒素的基因、编码梭菌属、大肠杆菌或胸膜肺炎放线杆菌的毒素的基因。在一个优选实施方案中，所述蛋白诱导针对所述疾病的保护性响应。

任选地与其他DNA片段重排或重组的来自猪肺炎支原体的DNA片段，也可视为外源DNA序列。该外源DNA序列的例子为，例如猪肺炎支原体的复制起始点oriC、反义RNA序列或编码猪肺炎支原体P97或 P46蛋白的基因，以提高所述基因的转录和翻译速率。

所述外源DNA序列优选选自：抗生素抗性基因、编码重组酶的基因、编码转座酶的基因、转座酶靶序列、来自猪肺炎支原体的DNA片段、优选与一个或几个DNA片段重排或重组的片段、编码引起猪疾病的微生物的抗原组分的基因，及其组合；更优选地，其为赋予抗生素抗性的标记基因、编码引起猪疾病的微生物的抗原组分的基因，或其组合；并且甚至更优选地，其为与编码引起猪疾病的微生物的抗原组分的基因组合的抗生素抗性基因，优选为编码2型猪环状病毒(PCV2)衣壳蛋白的基因，并且任选与编码猪肺炎支原体膜蛋白(优选猪肺炎支原体P46蛋白)的基因组合。

猪肺炎支原体的启动子区

在本发明的上下文中，“猪肺炎支原体的启动子区”应理解为猪肺炎支原体所特有的起始或促进猪肺炎支原体DNA序列转录的DNA序列。

起始或促进外源DNA序列转录的DNA序列与猪肺炎支原体启动子区的同一性为至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，更优选至少99％，并且甚至更优选100％。

在一个特别优选的实施方案中，起始或促进外源DNA序列转录的 DNA序列与猪肺炎支原体的启动子区的同一性为100％。

在被RNA聚合酶全酶鉴定后，诱导向其3'端合成信使RNA(转录物)的序列被视为启动子区。该转录物被正常翻译，并产生具有特定功能的蛋白质，或者其导致干预蛋白质合成或干预所述转录活性调控的 RNA。

本领域技术人员知晓该表述“启动子区”的含义，并且可通过标准方法来鉴定启动子区。

猪肺炎支原体的启动子区与位于已建立的猪肺炎支原体编码序列5' 侧的DNA片段对应，所述DNA片段优选包含至少50个碱基对，优选至少100个碱基对，更优选至少200个碱基对，并且甚至更优选200-300 个碱基对。

在一个特别优选的实施方案中，在本发明的方法和携载载体中用作启动子的DNA序列与包含至少50个碱基对的猪肺炎支原体启动子区的同一性为100％。

在一个甚至更优选的实施方案中，在本发明的方法和携载载体中用作启动子的DNA序列与包含200-300个碱基对的猪肺炎支原体启动子区的同一性为100％。

在本发明的上下文中，“已建立的编码序列”应理解为编码猪肺炎支原体蛋白或猪肺炎支原体基因组的转录活性区的DNA序列，其产生例如参与蛋白质合成或转录活性调控的RNA。这些序列包括例如：Minion等， J.Bacteriol.,2004,186(21),7123-7133中描述的P46、P65、P97和P102 表面蛋白；Vasconcelos等，J.Bacteriol.,2005,187(16),5568-5577描述的 P76、P146、P216粘附素或P95膜蛋白质；或Caron等，J.Clin.Microbiol.,2000,38(4),1390-1396中描述的P36细胞质基质蛋白；或核糖体RNA。

在一个优选实施方案中，猪肺炎支原体的启动子区包含选自以下猪肺炎支原体蛋白的基因的启动子区：P36、P46、P65、P76、P97、P102P146 和P216蛋白，更优选P46和P97蛋白，甚至更优选其选自：编码P97蛋白的猪肺炎支原体菌株J的mhj_0194基因的启动子区并且与包含猪肺炎支原体菌株J的第214293-214557位碱基的DNA序列(SEQ ID NO:1) 对应，以及编码P46蛋白的猪肺炎支原体菌株J的基因mhj_0511的启动子区(SEQ ID NO:2)并且与GenBank数据库中以序号AE017243储存的猪肺炎支原体菌株J第656451-656713位碱基之间包含的DNA序列对应，并且在上述文献Vasconcelos等中有描述。

对于所有序列，控制外源序列的猪肺炎支原体启动子区可相同或不同。优选相同。

本领域技术人员可通过选择这样的DNA序列来容易地鉴定DNA启动子序列并实施本发明的方法，所述DNA序列与位于已建立的猪肺炎支原体编码序列5'端的猪肺炎支原体启动子区的同一性为至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％，并且甚至更优选 100％，所述猪肺炎支原体启动子区优选包含至少50个碱基对，优选至少100个碱基对，更优选至少200个碱基对，并且甚至更优选200-300个碱基对。用于鉴定DNA启动子序列的方法描述于例如Sambrook and Russell manual，Molecular Cloning，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor New York(2001)。

复制型质粒载体

本发明的一个目的是复制型质粒载体，其含有：

1)包含支原体菌株的oriC区的DNA序列，以及

2)包含处于与猪肺炎支原体启动子区具有至少80％、90％、95％、 99％或100％同一性的DNA序列控制下的标记基因和任选另外的外源DNA序列的外源DNA序列。

在一个特别优选的实施方案中，起始或促进外源DNA序列转录的 DNA序列包含200-300个碱基对，并且与猪肺炎支原体的启动子区的同一性为100％。

在本发明的复制型质粒中，优选使用选自包含猪肺炎支原体P97蛋白基因启动子区和猪肺炎支原体P46蛋白基因启动子区的组的猪肺炎支原体启动子区，猪肺炎支原体启动子区优选包含上述猪肺炎支原体P97 蛋白基因启动子区，或可选地猪肺炎支原体P46蛋白基因启动子区。

对于所有序列，控制包含于所述复制型质粒中的序列的猪肺炎支原体启动子区可相同或不同。优选是相同序列。

oriC区使所引入的DNA片段如附加体元件一样复制，并且在使该 DNA片段稳定地维持于经转化的细胞后代中，优选维持用于表型选择的条件。

在本发明的复制型质粒载体中，所述oriC区是支原体菌株的oriC区。

在本发明的上下文中，支原体应理解为支原体属的任何细菌，例如，肺炎支原体(M.pneumoniae)、猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)、人支原体(M.hominis)、生殖器支原体(M.genitalium)、肺尖支原体(M. pulmonis)、山羊支原体(M.capricolum)、丝状支原体(M.mycoides)、绵羊肺炎支原体(M.ovipneumoniae)、猫血支原体(M.haemofelis)、鸡毒支原体(M.gallisepticum)、实验室支原体(M.laboratorium)或牛支原体(M.bovis)等。

在一个优选实施方案中，所述oriC区属于猪肺炎支原体菌株，更优选属于菌株J，并且更优选其包含猪肺炎支原体菌株J的第897262-1802 位碱基之间包含的DNA序列。

所述标记基因还指用于表型选择的基因，如上文解释，其使得能够选择已经并入了具有外源DNA序列的质粒的克隆。

在一个优选实施方案中，所述载体包含另外的外源DNA序列。可借助所述另外的外源DNA序列来得到猪肺炎支原体突变株，所述猪肺炎支原体突变株可用于制备一价或多价疫苗，任选标记疫苗，并且它们还可表达有用的遗传工具以用于对所述突变株进行后续改造，例如，噬菌体 P1的Cre重组酶、酿酒酵母的FLP重组酶、四环素抑制蛋白(TetR)，或者它们可完全或部分地阻断特定猪肺炎支原体基因的翻译。

可并入复制型质粒中的所述另外的外源DNA序列包括，例如噬菌体 P1的编码Cre重组酶的ORF cre基因。

Cre重组酶能够切割夹在loxP型序列之间的DNA区域。因此，例如，如果复制型质粒包含cre ORF基因，以及夹在loxP型序列(例如lox66) 之间的抗生素抗性基因，则当表达Cre重组酶时，抗生素抗性就被经转化的细菌消除。换言之，可在后续步骤中去除所述标记基因。重要的是，在制备具有减弱毒力并且用于制备活疫苗的经转化的猪肺炎支原体突变株的情况下，其中存在抗生素抗性基因是不期望的特征。

在一个优选实施方案中，所述复制型质粒还包含编码治疗或预防目的的重组蛋白的另外的外源DNA序列。所述蛋白还可与引起猪疾病的微生物的毒力因子或抗原决定簇相关，并且能够诱导或促进针对可由上述微生物引起的感染猪的疾病或病理状况的保护性应答。

在一个优选实施方案中，所述复制型质粒包含至少两份编码治疗或预防目的的重组蛋白的另外的外源DNA序列，优选两份，并且更优选两份或三份。以此方式，可引入若干份另外的外源DNA序列，并且提高该蛋白的表达产率。对于所有序列，控制包含于所述复制型质粒中的序列的猪肺炎支原体启动子区可相同或不同。

在一个更优选的实施方案中，所述另外的外源DNA序列选自：编码2型猪环状病毒(PCV2)衣壳蛋白的序列，以及编码包含2型猪环状病毒(PCV2)衣壳蛋白并在所述蛋白N末端携带MetSerGlySer氨基酸的蛋白的外源DNA序列，其中所述衣壳蛋白在GenBank数据库的登录号 AAC61864(SEQ ID NO:6)中有描述。

在一个甚至更优选的实施方案中，所述另外的外源DNA序列使用猪肺炎支原体基因组中与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5 的所述蛋白对应的每个氨基酸最常用的密码子编码所述PCV2衣壳蛋白。

SEQ ID NO:3具有699个碱基对，SEQ ID NO:4具有702个碱基对，并且SEQ ID NO:5具有992个碱基对，SEQ ID NO:5是长度大幅大于另外两者的DNA序列，因为其还包含与猪肺炎支原体菌株J的第 214293-214557位碱基之间包含的DNA序列对应的P97蛋白基因的启动子区，从而简化克隆步骤。在本说明书中，SEQ ID NO:5也指ORF2v2。

在一个优选实施方案中，所述另外的外源DNA序列包含融合至编码猪肺炎支原体膜蛋白的基因最末尾碱基的PCV2病毒衣壳蛋白(ORF2) 的基因，优选地，所述猪肺炎支原体膜蛋白选自P46蛋白和P97蛋白，更优选地其为P46蛋白，更优选处于猪肺炎支原体P46或P97蛋白基因的启动子控制下，并且甚至更优选处于猪肺炎支原体P46蛋白基因的启动子控制下。

在P46蛋白的情况下，在编码所述膜蛋白的基因(第7648-8904位碱基)的3'末端进行所述融合。该质粒指导合成杂合蛋白，其特征是，第1-419位氨基酸来自P46蛋白，并且第420-652位氨基酸与PCV2病毒衣壳ORF2版蛋白(第6946-7647位碱基)对应。

在一个优选实施方案中，所述另外的外源DNA序列包含***至编码猪肺炎支原体膜蛋白环的DNA序列中的编码PCV2衣壳蛋白的基因，优选地，所述猪肺炎支原体膜蛋白选自P46蛋白和P97蛋白，更优选地其为P46蛋白，更优选处于猪肺炎支原体P46或P97蛋白基因的启动子控制下，并且甚至更优选处于猪肺炎支原体P46蛋白基因的启动子控制下。

在具有P46蛋白的优选实施方案的情况下，该质粒指导合成杂合蛋白，其特征是，第1-92位氨基酸来自P46蛋白N末端，第95-327位氨基酸与PCV病毒衣壳蛋白对应，并且第330-656位氨基酸来自猪肺炎支原体P46蛋白的C末端。

通过本领域技术人员公知的方法来鉴定氨基酸序列中的环，借此可以合理的有效性来预测它们的位置。

所述环一般存在高的柔性，并且具有***其他蛋白的氨基酸序列的良好耐受性。此外，因为它们暴露于细菌的表面上，所以它们能够产生良好的免疫原性应答。

在一个优选实施方案中，所述复制型质粒包含另外的的外源DNA序列，其为与猪肺炎支原体启动子区反向的猪肺炎支原体基因，优选地，所述猪肺炎支原体基因编码猪肺炎支原体毒力因子，优选处于猪肺炎支原体P46或P97蛋白启动子的控制下，并且甚至更优选处于猪肺炎支原体P46蛋白启动子控制下。

所述DNA序列能够产生可阻断所述猪肺炎支原体基因翻译的反义 RNA。如果其为编码猪肺炎支原体毒力因子的基因，则该转化可降低该微生物的毒力程度。

在一个更优选的实施方案中，所述复制型质粒包含与猪肺炎支原体启动子区反向的包含猪肺炎支原体菌株J的基因组第194,535-194,654位碱基的序列。

所述序列产生可阻断与猪肺炎支原体溶血素对应的所述菌株的tlyA 基因的翻译。

实施例描述了质粒pOG、pOGCRE、pOGA159、pOGC、pOGL和 pOGT的制备。第一个质粒并入了赋予庆大霉素抗性的aac(6')-aph(2")基因。此外，质粒pOGCRE并入了编码噬菌体P1的Cre重组酶的ORF cre 基因；质粒pOGA159并入了猪肺炎支原体的溶血素a159基因的翻译抑制序列；而质粒pOGC、pOGL和pOGT还并入了编码2型猪环状病毒 (PCV2)衣壳蛋白不同蛋白版本的基因。

转座子载体

本发明的另一个目的是转座子载体，优选质粒，其含有：

1)编码转座酶的DNA序列，

2)包含标记基因的外源DNA序列，以及，

3)任选地，另外的外源DNA序列，

其中所述编码转座酶的DNA序列和至少一个所述外源DNA序列处于与猪肺炎支原体启动子区具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的DNA序列的控制下。

在一个特别优选的实施方案中，起始或促进DNA序列转录的DNA 序列包含200-300个碱基对，并且与猪肺炎支原体的启动子区的同一性为 100％。

编码转座酶的基因包含编码酶的DNA序列，其结合转座子中特定序列，并且催化所述转座子运动至基因组的其他部分。选择编码转座酶的基因不重要。编码转座酶的基因包括并入上述质粒pIVT-1中的转座子 TN4001T，或者在例如Cao等J.Bacteriol.,1994,176(14),4459-4462中描述的并入质粒pAM120中的转座子Tn916。

标记基因或用于表型选择的基因可为抗生素抗性基因，例如上述 TetM基因或aac(6')-aph(2")基因。用于表型选择的基因优选是TetM基因。

所述标记基因夹在两个反向重复之间，例如上述存在于质粒pIVT1 中的转座子的那些。所述序列被转座酶识别，并且如果没有所述序列，用于表型选择的基因将不能运动至细菌染色体，并且将不发生遗传改造。因为所述遗传改造是***至基因组中，所以其将稳定地维持在经转化的细胞的接下来的世代中。

所述反向重复优选为IRO的序列SEQ ID NO:7，以及IRI的序列SEQ ID NO:8。

在本发明的转座子载体中，优选使用如上述选自包含猪肺炎支原体 P97蛋白基因的启动子区和猪肺炎支原体P46蛋白基因启动子区的组的猪肺炎支原体启动子区。所述猪肺炎支原体启动子区优选包含猪肺炎支原体P97蛋白基因的启动子区，或任选地，猪肺炎支原体P46蛋白基因的启动子区。

对于所有序列，控制包含于所述转座子载体中的序列的猪肺炎支原体启动子区可相同或不同。优选相同。

与在复制型质粒的情况下的解释相似，在一个优选实施方案中，所述转座子载体还包含编码目的重组蛋白的另外的外源DNA序列。所述蛋白能够诱导或促进针对可感染猪的疾病或病理状况的保护性应答。

在一个优选实施方案中，所述转座子载体包含至少两份编码治疗或预防目的的重组蛋白的另外的外源DNA序列，优选两份，并且更优选两份或三份。以此方式，可引入若干份另外的外源DNA序列，并且提高该蛋白的表达产率。对于所有序列，控制包含于所述转座子载体中的序列的猪肺炎支原体启动子区可相同或不同。

在一个更优选地实施方案中，所述另外的外源DNA序列选自编码猪环状病毒(PCV2)衣壳蛋白的序列，以及编码包含猪环状病毒(PCV2) 衣壳蛋白并在所述蛋白N末端携带MetSerGlySer氨基酸的蛋白的外源 DNA序列，其中所述猪环状病毒(PCV2)的衣壳蛋白在GenBank数据库的登录号AAC61864(SEQ ID NO:6)中有描述。

在一个甚至更优选的实施方案中，所述另外的外源DNA序列使用猪肺炎支原体基因组中与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5 的所述蛋白对应的每个氨基酸最常用的密码子编码所述PCV2衣壳蛋白，其中每个DNA序列都处于猪肺炎支原体启动子区的控制下。更优选使用已经包含了编码猪肺炎支原体P97蛋白基因的启动子区的SEQ ID NO:5。

在一个优选实施方案中，所述另外的外源DNA序列包含融合至编码猪肺炎支原体膜蛋白的基因最末尾碱基的编码PCV2衣壳蛋白的DNA序列，优选地，所述膜蛋白选自P46蛋白和P97蛋白。更优选地，其为P46 蛋白。用该质粒转化的菌株表达猪肺炎支原体蛋白，其中与PCV2衣壳蛋白对应的氨基酸的位置紧接着其最末尾氨基酸，即，其表达由猪肺炎支原体P46或P97蛋白和PCV2衣壳蛋白形成的杂合蛋白。考虑到其为膜蛋白，用所述质粒转化的猪肺炎支原体菌株在细菌膜上表达两种蛋白质的融合体。所述PCV2衣壳蛋白选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4SEQ ID NO:5，更优选为SEQ ID NO:4。猪肺炎支原体的启动子区优选为编码猪肺炎支原体P97或P46蛋白基因的启动子区，并且甚至更优选为猪肺炎支原体P46蛋白的启动子。

在另一个优选实施方案中，所述另外的DNA序列包含***至编码猪肺炎支原体膜蛋白环的DNA序列中的编码PCV2衣壳蛋白的基因，所述膜蛋白优选地选自P46蛋白和P97蛋白，更优选地其为P46蛋白。用该质粒转化的菌株表达***猪肺炎支原体P46或P97蛋白之间的PCV2衣壳蛋白，即，其表达由猪肺炎支原体P46或P97蛋白和PCV2衣壳蛋白形成的杂合蛋白。所述PCV2衣壳蛋白选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 和SEQ ID NO:5，更优选为SEQID NO:3。

在一个优选实施方案中，将所述PCV2衣壳蛋白***至P46蛋白的第92和93位氨基酸之间。

以下转座子载体，优选质粒是尤其优选的：

1)包含以下的载体：编码转座酶(优选转座子TN4001T)的DNA 序列，任选夹在loxP型序列之间的编码标记基因(优选tetM 基因)的DNA序列，以及编码PCV2衣壳蛋白的DNA序列(优选由SEQ ID NO:5定义)，其中所述DNA序列的每一个都处于选自猪肺炎支原体P97蛋白或P46蛋白的启动子区(优选P97 蛋白的启动子区)的猪肺炎支原体启动子区的控制下。该类型的质粒的例子是称为pTC3C并在实施例节中描述的质粒。

2)包含以下的载体：编码转座酶(优选转座子TN4001T)的DNA 序列，任选夹在loxP序列之间的编码标记基因(优选tetM基因)的DNA序列，以及融合至编码猪肺炎支原体膜蛋白的基因最末尾碱基的编码PCV2衣壳蛋白的DNA序列(优选由SEQ ID NO:4定义)，所述膜蛋白优选选自P46蛋白和P97蛋白，更优选其为P46蛋白，其中所述DNA序列的每一个都处于选自猪肺炎支原体P97蛋白或P46蛋白的启动子区(优选P97蛋白的启动子区)的猪肺炎支原体启动子区的控制下。该类型的质粒的例子是称为pTC3T并在实施例节中描述的质粒。

3)包含以下的载体：编码转座酶(优选转座子TN4001T)的DNA 序列，任选夹在loxP序列之间的编码标记基因(优选tetM基因)的DNA序列，以及融合于猪肺炎支原体膜蛋白环中的编码PCV2衣壳蛋白的DNA序列(优选由SEQ ID NO:3定义)，所述膜蛋白优选选自P46蛋白和P97蛋白，更优选其为P46蛋白，优选***至P46蛋白的第92-93位氨基酸之间，其中所述DNA序列的每一个都处于选自猪肺炎支原体P97蛋白或P46 蛋白的启动子区(优选P97蛋白的启动子区)的猪肺炎支原体启动子区的控制下。该类型的质粒的例子是称为pTC3L并在实施例节中描述的质粒。

在这三种优选载体中，除转座酶的编码序列外，外源DNA序列的组夹在两个反向重复之间，这使得所述组能够并入至待转化的猪肺炎支原体细菌基因组中。所述反向重复优选为IRO的SEQ ID NO:7，以及IRI 的SEQ ID NO:8。

本发明的另一个目的是复制型质粒载体和转座子载体用于制备猪肺炎支原体突变株的用途。

猪肺炎支原体菌株

可在本发明方法中使用任何猪肺炎支原体菌株，即，所述菌株可选自野生菌株、收集的菌株(例如，菌株J或菌株232)或经遗传改造的菌株。

可根据本领域技术人员使用的常用方法，从临床或亚临床情况中分离适于施用本发明方法的猪肺炎支原体菌株，或者其可为选自保藏在典型培养物保藏中心的菌株。在临床情况下，所述菌株呈现PEP的典型病理状况，而在亚临床情况下，所述菌株侵袭动物粘膜但不呈现任何病理状况。可用于应用本发明方法的菌株可显示不同程度的毒力。在本发明方法中优选使用强毒株或表达猪肺炎支原体的主要免疫原性决定簇的菌株。本发明方法中可使用的菌株包括：菌株232，其基因组在Minion等的文章，J.Bacteriol.,2004,186(21),7123-7133中有描述，并且以序号 AE017332收集在GenBank数据库中；菌株J，其基因组在Vasconcelos 等的文章，J.Bacteriol.,2005,187(16),5568-5577中有描述，并且以序号 AE017243收集在GenBank数据库中；或例如野生型菌株6314等，其与属于西班牙海博莱生物大药厂(Laboratorios Hipra,S.A.) (Amer-Girona-Spain)的猪肺炎支原体强毒分离株对应。

菌株的转化

在本发明的上下文中，表述“转化猪肺炎支原体菌株”具有由分子生物学领域的技术人员所理解的通常意义，并且其指用于使细菌(在本案中为支原体细菌)整合外源DNA序列且所述序列执行特定功能的方法。

并入猪肺炎支原体细菌的外源DNA序列可执行的功能包括例如， RNA转录、蛋白表达、与其他DNA序列重组或打断编码宿主生物体基因组中的基因的序列。

转化法是可将外源DNA序列引入细菌的三种方法之一。另外两种方法是：接合，其包括在两个直接接触的细菌之间传递遗传材料；以及转导，其包括将通过噬细菌体病毒将外源DNA序列注射至细菌中。

可在本发明方法中借助本领域技术人员已知的生物化学处理或通过例如电穿孔(也称为电转化)等物理处理或通过基因枪来进行对细菌的转化，所述生物化学处理例如，在包含二价离子的盐例如氯化钙或磷酸钙等的存在下孵育细菌、暴露于聚乙二醇混合物、在聚乙烯醇的存在下孵育、使用其中用脂质覆盖外源DNA序列的脂质体、二乙基氨基乙基右旋糖酐介导的转染。

在本发明的方法中，优选通过以下来转化细菌：在包含二价离子的盐的存在下孵育细菌、使其暴露于聚乙二醇混合物或使其经历电穿孔；并且更优选通过电穿孔来进行。

电穿孔是本领域技术人员公知的方法，其实验操作规程在例如上述 Sambrookand Russell manual中有描述。

在电穿孔方法中，使在包含携带外源DNA序列的携载载体的电穿孔缓冲剂中的细菌混悬剂经历电脉冲，导致细菌膜的结构发生变化，以促进所述序列进入该细菌中。

所述电穿孔缓冲剂可为例如，由蔗糖和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸 (HEPES)形成的pH 7.2的缓冲剂，但是可使用本领域技术人员公知的适于电穿孔的任何缓冲剂，例如在上述Sambrook and Russell manual中描述的缓冲剂。

一般以0.1-5μg/ml，优选0.5-2μg/ml的浓度使用携带外源DNA序列的携载载体。通常使用电穿孔缓冲剂作为所述携载载体的媒介物。

所述细菌混悬剂一般为10⁶-10¹²cfu/ml。

一般可在1-3kV的电压、75-300Ω的电阻和10-40μF的电容下进行电穿孔。在本发明的方法中，优选在2-3kV的电压、100-175Ω的电阻和20-30μF的电容下进行电穿孔。

在一个优选实施方案中，在进行电穿孔之前，使猪肺炎支原体细菌混悬剂经历在具有二价离子螯合剂的电穿孔缓冲剂中的孵育。虽然所述步骤不是本发明方法所必需的，但是据观察，其显著提高转化效率。

可用于所述孵育的螯合剂包括例如：氨基羧酸，如乙二胺四乙酸 (EDTA)、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或其碱盐；羟基乙酸，如柠檬酸、葡糖酸或其碱盐；膦酸，如2-氨基乙基膦酸、1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸(HEDP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、乙二胺四(亚甲基膦)酸(EDTMP)或其碱盐。所述螯合剂优选为EDTA。

在进行电穿孔后，即，在发射电脉冲后，优选用额外量的包含外源 DNA序列的携载载体孵育细菌混悬剂。

通常采用在发射所述电脉冲前添加相同量的携载载体。

通过用冰孵育细菌和携载载体的混悬剂少于约1小时的时间，然后将其保持在37℃的温度和5％二氧化碳气氛下2-5小时，从而进行所述孵育。

在一个更优选实施方案中，在进行电穿孔之前，使猪肺炎支原体细菌混悬剂经历在具有二价离子螯合剂的电穿孔缓冲剂中的孵育，并且在电穿孔后，用额外量的包含外源DNA序列的携载载体孵育所述细菌混悬剂。

在本发明的方法中，可通过使用复制型质粒载体或通过使用载体，优选质粒，来进行所述转化，其中通过转座来并入其至少一部分。

因此，如果通过转座完成了所述转化，则根据本发明方法的对猪肺炎支原体菌株的转化使得能够获得包含***至其基因组中的至少一个外源DNA序列的猪肺炎支原体菌株，或者，如果通过复制型质粒载体来进行所述转化，则本发明方法转化的猪肺炎支原体菌株在染色体外载体(或附加体元件)中含有所述DNA片段，所述染色体外载体在猪肺炎支原体中稳定地自主复制。

获得突变株

本发明的一个目的是能够通过本发明方法得到的猪肺炎支原体突变株。

本发明的另一个目的是包含稳定并入其基因组中或细胞质中的至少一个外源DNA序列的猪肺炎支原体突变株。优选地，所述外源DNA序列由与猪肺炎支原体启动子区的同一性为至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，更优选至少99％，并且甚至更优选100％的DNA序列控制。在一个优选实施方案中，所述外源DNA序列包含于本发明的复制型质粒载体中。

在另一个优选实施方案中，所述外源DNA序列包含于本发明的转座子载体的IRI和IRO反向序列重复之间。

本发明的猪肺炎支原体突变株包含本发明的复制型质粒，或本发明的转座子载体的实质性部分。当使用复制型质粒时，所述猪肺炎支原体的突变株包含处于其细胞质中的所述载体。在使用转座子载体的情况下，猪肺炎支原体的突变株包含所述载体的实质性部分，其为包含于IRI和 IRO反向序列重复之间的部分，并且包含至少一个外源DNA序列。

本发明的另一个目的是由本发明的携载载体转化的猪肺炎支原体菌株。

在本发明的上下文中，“猪肺炎支原体突变株”应理解为已经通过使用遗传工程工具进行遗传改造了的猪肺炎支原体菌株。

通过本发明的方法可得到猪肺炎支原体突变株，其稳定地包含在所述突变株中发挥功能的外源DNA序列。

在本发明的上下文中，应理解，例如当外源DNA序列表达由所述序列编码的蛋白质、转录RNA或遗传改造所述菌株时，则所述外源DNA 序列在猪肺炎支原体突变株中发挥功能。

在用于得到猪肺炎支原体的转化株的本发明方法中，起始材料优选为猪肺炎支原体指数生长期培养物。

优选通过使用包含FriisHS培养基(马血清、酵母菌提取物、心浸液培养基、Hank's平衡盐溶液和PPLO(类胸膜肺炎微生物)液体培养基) 的培养基来得到所述培养物。

优选将所述培养物维持于37℃、100-200rpm振荡下48-144小时，直至达到指数生长期。

然后优选通过离心分离细菌，并使其经历所述转化方法。

转化后，优选将细菌混悬剂散布于添加了琼脂和期望的选择性抗生素的FriisHS培养基平板上。

在37℃温度和5％二氧化碳气氛下孵育2-3周可回收显示对所述培养基的抗生素具有抗性的经转化的克隆。然后优选将所述经转化的克隆接种于添加了选择性抗生素的FriisHS培养基中，并且在约10天或20天后，通过本领域技术人员公知的方法得到它们的基因组DNA或蛋白提取物，以研究所得到的突变株的基因型和/或表型。

可通过本发明方法得到的表达重组蛋白质的经转化的猪肺炎支原体突变株。

在一个优选实施方案中，本发明的猪肺炎支原体的突变株表达由外源DNA序列编码的内容，例如蛋白。所述外源DNA序列可为例如，环状病毒(PCV2)衣壳蛋白、或猪肺炎支原体蛋白，例如P46蛋白，以实现其过表达。它们的例子为在所述细菌基因组中包含外源DNA序列的菌株232Cc6、6314Cc1、232Lc2和232Tc2。

本发明的一个目的是于莱布尼兹研究所(Leibniz-Institut)DSMZ (DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany)由西班牙海博莱生物大药厂(Laboratorios Hipra,S.A.)(Amer,Girona,Spain)在2012年5月29 日以保藏编号DSM 26027保藏的猪肺炎支原体突变株。被称为232Cc6 的所述菌株在猪肺炎支原体菌株232上并入了质粒pTC3C中的转座子。该菌株在细胞质中并且以可通过Western印迹和ELISA测定检测的量表达PCV2衣壳蛋白。

本发明的一个目的是于莱布尼兹研究所DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124 Braunschweig,Germany)由由西班牙海博莱生物大药厂(Laboratorios Hipra,S.A.)(Amer,Girona,Spain)在2012年5月29日以保藏编号DSM 26020保藏的猪肺炎支原体突变株。被称为6314Cc1的所述菌株在野生型猪肺炎支原体菌株6314上并入了质粒pTC3C上的转座子。该菌株在细胞质中并且以可通过Western印迹和ELISA测定检测的量表达PCV2衣壳蛋白。

本发明的一个目的是由莱布尼兹研究所DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124 Braunschweig,Germany)由西班牙海博莱生物大药厂(Laboratorios Hipra, S.A.)(Amer,Girona,Spain)在2012年5月29日以保藏编号DSM 26033 保藏的猪肺炎支原体突变株。被称为232Lc2的所述菌株在野生型猪肺炎支原体菌株232上并入了质粒pTC3L上的转座子。该菌株以可通过ELISA 测定检测的量表达PCV2衣壳蛋白。

本发明的一个目的是于莱布尼兹研究所DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124 Braunschweig,Germany)由西班牙海博莱生物大药厂(Laboratorios Hipra, S.A.)(Amer,Girona,Spain)在2012年5月29日以保藏编号DSM 26034 保藏的猪肺炎支原体突变株。被称为232Tc2的所述菌株在野生型猪肺炎支原体菌株232上并入了质粒pTC3T上的转座子。该菌株以可通过ELISA 测定检测的量表达PCV2衣壳蛋白。

在包含于细菌的细胞质中作为附加体元件的情况下，以下菌株还表达由外源DNA序列编码的蛋白：

-在野生型猪肺炎支原体菌株232上并入了复制型质粒pOG的经转化的猪肺炎支原体菌株232POGc9。已经通过用限制酶消化该猪肺炎支原体菌株的总DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析所得的片段检测了所述并入。

-在野生型猪肺炎支原体菌株232上并入了复制型质粒pOGCRE 的经转化的猪肺炎支原体菌株232POGCREc1。通过Western 印迹和免疫检测检测了Cre重组酶的表达。

通过本发明的方法可得到猪肺炎支原体突变株，其中通过转座并入的外源DNA序列产生可阻断负责所述菌株毒力的基因翻译的反义RNA，所述基因为例如与猪肺炎支原体溶血素对应的基因。

在一个优选实施方案中，所述猪肺炎支原体突变株将外源DNA并入基因组中或细胞质中，使得所述菌株产生针对负责所述菌株毒力的的基因的反义RNA。

可通过本发明的方法得到这样的猪肺炎支原体突变株且其显示减弱的毒力，其中通过转座并入到猪肺炎支原体突变株基因组中的外源DNA 序列打断编码猪肺炎支原体毒力因子的基因。

在一个优选实施方案中，猪肺炎支原体突变株包含打断编码猪肺炎支原体毒力因子(例如溶血素)的基因的外源DNA序列。一个例子是称为232TC3hlyC的菌株。

可通过本领域技术人员公知的方法(例如对所述突变株的基因组进行测序)来选择携带被打断的编码猪肺炎支原体毒力因子的基因的突变株。

本发明的一个目的是于莱布尼兹研究所DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124 Braunschweig,Germany)由西班牙海博莱生物大药厂(Laboratorios Hipra, S.A.)(Amer,Girona,Spain)在2012年5月29日以保藏编号DSM 26049 保藏的猪肺炎支原体突变株。被称为232TC3hlyC的所述菌株在野生型猪肺炎支原体菌株232上并入了质粒TC3上的转座子。该菌株的编码猪肺炎支原体hlyC毒力因子的ORF被打断，因此是用作减毒疫苗菌株的良好候选物。通过Southern印迹和通过直接测序来检测基因组中的所述插入。

从本说明书中包含的信息，本领域技术人员可通过使用本发明方法，以及通过选择除具体描述的那些以外的外源DNA序列来制备其他经转化的猪肺炎支原体菌株。

本发明的一个目的是在其细胞质或基因组中包含外源DNA序列的猪肺炎支原体突变株作为用于表达所述外源DNA序列的宿主的用途。如在本说明书中所解释的，所述外源DNA序列可编码重组蛋白或其他目的序列。

应注意，通过本发明的方法可得到具有非常多样特征的猪肺炎支原体突变株，从而本领域技术人员在他/她的配置下拥有遗传改造猪肺炎支原体菌株和得到具有多种功能的菌株的方法。

实施例5和6显示，根据本发明方法得到的猪肺炎支原体突变株出乎意料地稳定整合了包含于携载载体中的外源DNA序列，并表达其内容，例如通过生产重组蛋白质。

可通过本领域技术人员公知的标准方法来对通过本发明方法得到的菌株进行减毒或失活。以此方式，可将其用于制备疫苗。优选地，以失活形式来使用所述菌株。

通过本发明的方法，得到了迄今未公开的新猪肺炎支原体菌株。它们的特征使得能够制备针对猪肺炎支原体并且同时针对其他猪病原体的新疫苗。即，本发明的突变株使得能够通过使用根据本发明方法转化的单一菌株来制备多价疫苗。

疫苗

本发明的一个目的是用于保护猪免于由猪肺炎支原体引起的猪地方性肺炎并且任选地免于由感染猪的微生物引起的另一种疾病或病理状况的疫苗，其包含免疫有效量的本发明猪肺炎支原体突变株。

在一个优选实施方案中，所述疫苗包含药学上可接受的媒介物，并且任选包含佐剂。

本发明的疫苗中的菌株是失活的或减毒的，优选是失活的。

可通过使病原体失活来得到失活疫苗，在细菌的情况下，通常使用加热；化学化合物如甲醛、BEI(二元亚乙基亚胺)或表面活性剂；使用均质机的机械力等来进行。使病原体失活导致维持其结构但不能复制，或者破坏或崩解其结构。在本发明的上下文中，术语“失活疫苗”包括包含失活但维持其结构的细菌的组合物，以及其中细菌的结构已经被破坏或崩解的组合物。

本发明的另一个目的是本发明的猪肺炎支原体突变株用于制备针对由猪肺炎支原体引起的猪地方性肺炎并且任选地针对感染猪的另一种疾病或另外的病理状况的疫苗的用途。

表述“免疫有效的”意为，在接种方法中施用的细菌量足以在宿主中诱导针对强毒形式猪肺炎支原体的感染的有效免疫应答，并且在经转化的猪肺炎支原体菌株表达能够诱导或促进诱导针对可感染猪的疾病或病理状况的保护性应答的情况下，其还足以在宿主中诱导针对所述微生物引起的感染的有效免疫应答。

所述疫苗优选旨在赋予猪针对例如由以下微生物引起的疾病或病理状况的保护：放线杆菌属、短螺菌属、多杀巴斯德菌、沙门氏菌属、链球菌属、等孢子球虫菌属、猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体属、葡萄球菌属、副猪嗜血杆菌、支气管炎博德特菌、梭菌属、支原体、胞内劳森菌、大肠杆菌微生物、猪生殖与呼吸综合征病毒、流感病毒、接触性胃肠炎病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒、冠状病毒、轮状病毒、猪环状病毒、猪断奶前后发育停滞综合征病原、典型猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、杯状病毒和细环病毒(TTV)。

在一个更优选的实施方案中，所述另外的疾病为由猪环状病毒 (PCV2)引起的PCVAD(猪环状病毒相关疾病)，无论所述PCV2作为单一试剂存在还是与其他相关病原体或微生物一起存在。

还可在单一或不同的容器中使本发明的疫苗与另外的疫苗或抗原性组合物组合。所述另外的疫苗或抗原性组合物疫苗优选旨在赋予猪针对例如由以下微生物引起的疾病或病理状况的保护：放线杆菌属、短螺菌属、多杀巴斯德菌、沙门氏菌属、链球菌属、等孢子球虫菌属、猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体属、葡萄球菌属、副猪嗜血杆菌、支气管炎博德特菌、梭菌属、支原体、胞内劳森菌、大肠杆菌微生物、猪生殖与呼吸综合征病毒、流感病毒、接触性胃肠炎病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒、冠状病毒、轮状病毒、猪环状病毒、猪断奶前后发育停滞综合征病原、典型猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、杯状病毒和细环病毒(TTV)。

本发明的疫苗包含可根据本发明描述的方法得到的免疫有效量的失活猪肺炎支原体菌株或活猪肺炎支原体菌株。

已知，将使用的剂量取决于待接种动物的年龄和体重以及施用路径。

合适的剂量一般为10³-10¹⁰变色单位(ccu)，优选10⁶-10¹⁰ccu，并且更优选10⁸-10⁹ccu。

可在任何合适的时间接种动物。优选在1-12周龄之间施用本发明的疫苗剂量，并且更优选从3周龄开始施用所述疫苗。在特定的情况下，可能需要施用补充剂量来达到令人满意的保护。在这些情况下，优选在第一剂量的1-5周后，更优选在第一剂量的3周后，施用第二剂量。所述疫苗优选是单一施用疫苗。

本发明的疫苗旨在用于猪物种，包括其任何年龄的或生产周期任何时期的家猪、公猪、母猪和仔猪等；其优选旨在用于增肥期的家猪，并且更优选用于其生命的第1-12周的家猪。

所述疫苗可进行鼻内施用、皮内施用、粘膜或粘膜下施用、皮下施用、通过气溶胶施用、肌内施用或经口施用。优选对其进行皮内施用或肌内施用。

还可根据本领域技术人员用于制备适于不同剂型的制剂的典型方法来制备所述疫苗，如例如在手册Remington The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,2000 [ISBN:0-683-306472]中所描述的。

通常将所述疫苗制备为溶液剂、乳剂或液体混悬剂形式的注射用疫苗。其还可制备为适于在注射前溶解或混悬于液体媒介物中的固体形式。

注射用疫苗剂量的典型体积为0.1-5ml，优选0.15-3ml，并且更优选 0.2-2ml。在皮内施用中，通常以0.1-0.5ml，优选0.15-0.4ml，并且更优选0.2ml使用所述疫苗剂量。在肌内施用中，一般以0.5-5ml，优选1-3ml，并且更优选1-2ml使用所述疫苗剂量。

为了用本发明的疫苗免疫动物，通常使猪肺炎支原体突变株与药学上可接受的媒介物混合。

可用于制备所述疫苗的液体媒介物包括例如，水、具有生理学盐浓度的盐水溶液或其中培养细胞的培养液体。

此外，所述媒介物可按需要包含药学上可接受的赋形剂或辅助物质，例如，润湿剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂(例如磷酸缓冲剂)、稳定剂，如碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、淀粉或葡聚糖) 或蛋白质(例如，白蛋白、酪蛋白、牛血清或脱脂奶)。

所述赋形剂的理化性质，以及市售时所用的商品名可在R.C.Rowe 等的书，Handbook of Pharmaceutical Excipients,第4版,Pharmaceutical Press,London,2003[ISBN:0-85369-472-9]中找到。

还可在所述疫苗中任选地掺入佐剂以增强其效力。本发明的疫苗优选还包含佐剂。

佐剂是非特异性免疫***刺激剂，其提高宿主对入侵病原体的免疫应答。佐剂的例子有：氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、维生素E、角鲨烯、植物油、皂苷、人参、酵母聚糖、葡聚糖、二甲基氨基乙基右旋糖酐、右旋糖酐、非离子嵌段聚合物、聚丙烯酸酯(卡波姆)、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、胞壁酰二肽、W/O、O/W、W/OW型乳剂，及其混合物。

在一个优选实施方案中，所述疫苗是注射用疫苗，并且包含由非离子表面活性剂失活的本发明的突变株。其优选使用选自以下的非离子表面活性剂：烷基酚乙氧基酯、乙氧基化的山梨醇酐酯、乙氧基化的脂肪醇、乙氧基化的脂肪酸、脂肪酸链烷醇酰胺、乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺、乙氧基化的脂肪胺、脂肪胺氧化物、脂肪氨酰基胺氧化物、脂肪酸甘油酯、蔗糖酯、烷基多糖苷、氧化乙烯和氧化丙烯共聚物，以及乙氧基化的和丙氧基化的脂肪醇；去更优选选自烷基酚乙氧基酯和乙氧基化的山梨醇酐酯，并且其更优选为烷基酚乙氧基酯，例如售自Dow的 X-100。

在一个更优选的实施方案中，所述疫苗是注射用疫苗，并且包含由非离子表面活性剂和W/O/W型乳剂(例如售自SEPPIC(France)公司的产品ISA 201)作为佐剂失活的本发明的突变株。

在一个优选实施方案中，所述疫苗可包含冻干形式的本发明菌株。通过本领域技术人员公知的方法来进行所述冻干方法。

接种试剂盒

本发明的目的还包括用于针对由猪肺炎支原体引起的感染或疾病并且任选地针对由感染猪的微生物引起的其他疾病或病理状况接种猪的接种试剂盒。

所述接种试剂盒包含装有免疫有效量的本发明突变株或本发明疫苗的容器。

在另一个实施方案中，所述接种试剂盒还包含本发明疫苗与另外的抗原组合物的组合，将所述组合装在单一容器中或装在不同容器中。这样的另外的抗原组合物旨在赋予猪针对例如在本文疫苗部分中提到的疾病或病理状况的保护。

从说明书中显而易见地推断出本发明的工业应用。应指出，PEP是广泛传播的全球性慢性呼吸道疾病，其在猪产业中导致巨大的经济损失，并且以靶向和稳定的方式对猪肺炎支原体菌株进行遗传改造的可能性使得能够制备具有比常规细菌更优异的性能的疫苗。通过本发明的方法可制备，例如适于制备针对PEP和针对其他猪病理的有效疫苗的减毒猪肺炎支原体突变株、过表达特定毒力因子的突变株、抑制特定毒力因子的菌株、或还表达与感染猪的疾病有关的微生物的抗原组分的菌株。

首次以稳定形式对猪肺炎支原体进行的靶向遗传改造，使本发明人能够使用这些经转化的菌株作为外源DNA序列的表达载体，所述外源 DNA序列例如编码治疗目的或预防目的的蛋白质的核苷酸序列，例如 PCV2衣壳蛋白等。借助本发明公开的技术，已经设计并制备了新的疫苗多价候选物，还可通过施用单一菌株来将所述候选物用于预防不同疾病。

对通过本发明方法的经转化的猪肺炎支原体菌株产生重组蛋白质的测定

可使用ELISA来鉴定由本发明的猪肺炎支原体突变株中外源DNA 序列表达的蛋白的存在。

特别地，为了检测PCV2衣壳蛋白的存在，以及为了定量在所得的猪肺炎支原体菌株中的PCV2衣壳蛋白，使用市售的试剂盒，其使得能够通过平板免疫测定(ELISA)以近似的方式检测和评估所述抗原的量。

在每个菌株的指数期培养物中浓缩它们并裂解所得到的细胞后得到蛋白质提取物。

结果为阳性，这指示在所有测定的菌株和质粒中以或多或少的量表达了由ORF2或ORF2v2编码的蛋白质(图5B)。

还通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析了具有来源于质粒pTC3C的版本的菌株(图5C)。检测到分子量与PCV2衣壳蛋白的分子量相同的条带。

可观察到，电泳凝胶中未出现作为重组蛋白质表达中常见问题的蛋白水解降解条带。

为此，猪肺炎支原体中以重组方式表达的PCV2衣壳蛋白可为用于配制多价疫苗的良好抗原。类似地，猪肺炎支原体是重组生产蛋白质的良好宿主。

接种测定

测试了包含根据本发明方法得到的猪肺炎支原体突变株的疫苗的效力，其中所述菌株包含处于所述细菌基因组中的编码PCV2衣壳蛋白的外源DNA序列，并且它们在所述细菌的细胞质中表达所述蛋白质。

为此，测试了包含菌株6314Cc1或232Cc6的疫苗，并且如在本文实施例部分中描述的，用单一剂量接种动物，或用第二剂量再次接种所述动物。

此外，该研究中包含两组动物：未接种但受到感染的组(第5组)，和未接种且未受感染的组(第6组)。

评估了以下应答：针对猪肺炎支原体的免疫应答、针对PCV2的免疫应答，以及动物血清中的PCV2病毒DNA载量。

通过观察图6、7和8中示出的用包含根据本发明方法得到的猪肺炎支原体突变株的疫苗进行的接种测定的结果，可作结论，表达PCV2衣壳蛋白的经转化的猪肺炎支原体菌株产生了显著的针对猪肺炎支原体，并且出人意料地还针对PCV2的显著的免疫应答，这显著降低PCV2病毒载量，从而可用于针对同时由猪肺炎支原体和PCV2引起的感染的疫苗。

还针对由PCV2和猪肺炎支原体引起的感染测试了包含根据本发明方法得到的猪肺炎支原体突变株的疫苗，其中这样的菌株包含处于所述细菌基因组中的编码PCV2衣壳蛋白的外源DNA序列，并且在所述细菌的细胞质中表达这样的蛋白。

如在本文实施例部分中所述，测试了包含6314Cc1菌株的疫苗，用单一剂量接种动物，并用PCV2分离株和猪肺炎支原体病原菌株进行刺激(challenge)。

此外，该测定中包含两组动物：未接种但受到感染的组(第2组)，和未接种且未受感染的组(第3组)。

所评估的应答有：针对猪肺炎支原体的免疫应答、针对PCV2的免疫应答、动物血清中的PCV2病毒DNA载量，以及动物肺中的类猪肺炎支原体损伤。

观察到，与未接种的动物相比，根据本发明方法遗传改造的表达 PCV2衣壳蛋白的猪肺炎支原体菌株产生显著减少的PCV2病毒DNA载量，以及显著减少的动物肺中的类猪肺炎支原体损伤。

还测试了包含根据本发明方法得到的猪肺炎支原体突变株的疫苗，其中这样的菌株包含含有编码PCV2衣壳蛋白的外源DNA序列的复制型质粒载体，并且在所述细菌的细胞质中表达这样的蛋白。如在之前的测试中一样，观察到，根据本发明方法借助复制型质粒遗传改造的表达 PCV2衣壳蛋白的猪肺炎支原体菌株产生显著降低的PCV2病毒载量。

测试突变株的减毒程度

在实施本发明的用于转化猪肺炎支原体菌株的方法后得到的突变株包括菌株232TC3hlyC，其包含通过转座并入编码猪肺炎支原体毒力因子 (由hlyC基因编码的溶血素C)的基因组区域的质粒pTC3。

为了评估所述菌株的减毒程度，选择8周大的猪，并将其分成两组，每组8只动物。第一组用菌株232TC3hlyC的剂量进行气管内感染，并且第二组用改造前的野生型猪肺炎支原体菌株(猪肺炎支原体菌株232)的剂量进行感染。

在感染28天后对动物实施安乐死，并且观察到，在该两组动物的任一组中都没有发生鼻区中的侵袭，而由野生型菌株感染的组中25％的动物显示支气管侵袭。

用经转化的猪肺炎支原体菌株感染的动物没有显示支气管侵袭。

因此，经转化的猪肺炎支原体菌株232TC3hlyC显示了与野生型亲代菌株相关减毒，并且因此，其可在减毒活疫苗中用作接种候选物。

通过本发明的方法得到了猪肺炎支原体突变株6314POGAc4。所述突变株抑制猪肺炎支原体溶血素159基因的表达，因为通过复制型质粒 (pOGA159)并入的外源的DNA序列产生了与编码猪肺炎支原体溶血素的基因对应的反义RNA。当用该菌株感染动物时，观察到，该菌株相对于野生型亲代菌株显示减毒。所述突变株的特征在于，在侵袭上呼吸道和下呼吸道的能力降低，并且引起PEP的典型损伤的能力降低。

描述了以下实施例以给本领域技术人员提供对本发明的足够清楚和完全的解释，但是不应将它们视为限制本说明书前面部分中描述的本发明目的的必需方面。

实施例

以下使用的重组DNA技术和方法详细描述于，Sambrook和Russell 手册，Molecular Cloning第三版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社， Cold SpringHarbor New York 5(2001)，以及Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1998)。

已经使用大肠杆菌XL1-blue菌株(Stratagene)作为基于质粒 pMTn4001或pBluescript II SK的载体的宿主。

除非另有说明，否则本部分中在质粒构建中描述的所有DNA序列都来自GenBank数据库中以序号AE017243储存的序列。该基因组序列与 Vasconcelos等，J.Bacteriol.,2005,187(16),5568-5577描述的猪肺炎支原体菌株J对应。

除非另有说明，否则以下描述的所有寡核苷酸序列都以5'至3'的方向书写。在所有PCR反应中都使用具有校对阅读活性的Phusion热聚合酶 (Finnzymes)。

下划线上的寡核苷酸序列指示存在限制内切酶位点，将其规定为各序列的名称。

实施例1.-选择猪肺炎支原体菌株

所使用的猪肺炎支原体野生型菌株是与来自由西班牙海博莱生物大药厂(Amer-Girona-Spain)的强毒猪肺炎支原体分离株对应的菌株6314 和来自爱荷华州立大学(IowaState University)(Ames-Iowa-USA)的菌株 232。

实施例2.-构建复制型质粒

实施例2.1.-构建复制型质粒pOG

为了得到猪肺炎支原体中的复制型质粒，将通过PCR扩增的猪肺炎支原体的oriC区引入质粒pBluescript II SK。将寡核苷酸5OriCNotI(ATG CGC GGC CGC TTA TTT ATCAGA AAC AGT TAG)(SEQ ID NO:9)和 3OriCXbaI(AGT CGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGGATG ATG GAT TC)(SEQ ID NO:10)用于该扩增，并使用猪肺炎支原体菌株J的基因组DNA作为模板。然后用限制酶NotI和XbaI消化所得到的1.96kb 片段。另一方面，通过PCR使用寡核苷酸5GmORF(ACT GGG ATC CAT GAA TAT AGT TGA AA ATG)(SEQ ID NO:11)和3GmApa(GGATGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGG)(SEQ ID NO:12)并使用质粒pIV-T 作为模板扩增庆大霉素抗性基因(aac(6')-aph(2"))。然后用相应的限制酶消化1.8kb的PCR产物。通过PCR使用寡核苷酸5'p97XbaI(G ATC TCT AGA TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT)(SEQ ID NO:13)和3'p97BamHI(GAT CGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT CAA TTA T)(SEQID NO:14)，使用猪肺炎支原体菌株J的DNA作为模板扩增P97蛋白基因的启动子区。然后用相应的限制酶消化PCR产物 (266bp)。最后，将得到的三个片段连接于之前用限制酶XbaI和BamHI 消化的质粒pBluescript II SK中，并将连接混合物转化至大肠杆菌 XL1-blue细胞中。通过限制图式分析和测序，从转化得到的克隆鉴定出携带期望构建体的克隆。将一个阳性克隆命名为pOG，并选择用于下一步(图1)。

实施例2.2.-构建复制型质粒pOGCRE

通过用限制BamHI和ApaI消化质粒pOG，并回收5.1kb片段得到复制型质粒pOGCRE。另一方面，通过PCR使用寡核苷酸5GmORF和 3GmORFSpeI(ACT GAC TAG TAG CTTGCG CAT CAT TGG)(SEQ ID NO:15)扩增庆大霉素抗性基因(aac(6')-aph(2"))，然后用限制酶BamHI 和SpeI消化得到1.8kb片段。通过PCR使用质粒pSH62(Euroscarf)以及寡核苷酸5CreBglII(ATG CAG ATC TAT GTC CAA TTT ACT GAC CGT ACA CCA AAA TTT G)(SEQ IDNO:16)和3CreApaI(ATG CGG GCC CTTA ATC GCC ATC TTC CAG CAG GCG CAC)(SEQ ID NO:17) 作为模板扩增与Cre重组酶对应的基因。用酶BglII和ApaI切割PCR产物(1.0kb)。最后，再次消化质粒pOG，这次使用限制酶BamHI和XbaI，并回收与P97蛋白基因启动子对应的266bp的条带。使用T4DNA连接酶连接所得的四片段，并将连接反应物转化至大肠杆菌XL1-blue细胞中。通过限制图式分析，从所得的转化克隆中鉴定出携带期望构建体的克隆。选择一个命名为pOGCRE的阳性克隆用于下一步(图1)。

实施例2.3.-构建复制型质粒pOGC

为了得到质粒pOGC，用酶NotI消化质粒pBluescript II SK，在纯化后用碱性磷酸酶将其去磷酸化。同时，通过用限制酶SpeI和NotI消化合成基因ORF2v2(SEQ ID NO:5)得到992bp片段。通过PCR，使用质粒 pOGCRE作为模板，用寡核苷酸3gmORFSpeI和5OriCNotI扩增DNA片段，纯化后用酶SpeI和NotI消化所述PCR产物。使用T4DNA连接酶连接所得的三个片段，并将连接反应物转化至大肠杆菌XL1-blue细胞中。通过限制图谱和测序鉴定阳性克隆(图2)。

实施例2.4.-构建复制型质粒pOGL

为了得到质粒pOGL，用酶NotI和SpeI消化质粒pOGC，并回收2.8 kb和4kb的条带。用碱性磷酸酶将与2.8kb条带对应的DNA片段去磷酸化。同时，通过用限制酶SpeI和NotI消化质粒pTC3L(参见实施例 3.4)得到2.25kb片段。使用T4DNA连接酶连接所得的三个片段，并将连接反应物转化至大肠杆菌XL1-blue细胞中。通过限制图谱和测序鉴定阳性克隆(图2)。

实施例2.5.-构建复制型质粒pOGT

为了得到质粒pOGT，用酶NotI和SpeI消化质粒pOGC，并回收2.8 kb和4kb的条带。用碱性磷酸酶将与2.8kb条带对应的DNA片段去磷酸化。同时，通过用限制酶SpeI和NotI消化质粒pTC3T(参见实施例3.5)得到2.23kb片段。使用T4DNA连接酶连接所得的三个片段，并将连接反应物转化至大肠杆菌XL1-blue细胞中。通过限制图谱和测序鉴定阳性克隆(图2)。

实施例2.6.-构建复制型质粒pOGA159

在两个连续克隆步骤中构建复制型质粒pOGA159。通过PCR反应，使用寡核苷酸5'p97ApaI和3TetMClaI(TGT TAT CGA TACC GTC GAT GCA CCT CGA GCT AAG TTA TTT TATTG)(SEQ ID NO:18)并使用质粒pMTn4001作为模板，扩增与P97蛋白基因启动子对应的2.2kb片段。用限制酶ClaI和ApaI消化该PCR产物。另一方面，使用质粒pOG作为模板，用寡核苷酸5OriCClaI(AGA CAT CGA AAG CTT GAT TAT GCT GAT TGC ATT CTT TCA ATT TG)(SEQ ID NO:19)和5OriCEcoRI(AGA GGA AT CC GAT TTA TTT ATC AGA AAC AGT TAG TCTTTT CC)(SEQ ID NO:20)扩增与猪肺炎支原体oriC对应的1.9kb片段。用限制酶EcoRI 和ClaI消化该PCR产物。随后，通过PCR，用寡核苷酸5XbaIpp97(AGA CTC TAG AAC TAG TGGATC CCC CGG GCC CCT CGA GGA AGA CTG ATT AGA AAT TTA G)(SEQ ID NO:21)和3EcoRIpp97(AGA CGA ATT CGA ATT CCT GCA GGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT C)(SEQID NO:22)扩增P97蛋白基因启动子对应的316bp片段。在纯化后，用酶 EcoRI和BamHI消化该片段。该第一克隆方法的最后一步是用限制酶 XbaI和ApaI消化质粒pBluescript IISK。使用T4DNA连接酶连接这四个DNA片段，并将连接反应物转化至大肠杆菌XL1-blue细胞中。通过限制图式分析，从转化得到的克隆鉴定出携带期望构建体的克隆。从而用限制酶EcoRI消化所述新质粒。最后，通过PCR，用寡核苷酸 5ahlycEcoRI(CAT CGA ATT CAC GAATTA GTG ATT CTG CCT TTT C) (SEQ ID NO:23)和3ahlycEcoRI(CAT CGA ATT CAT TAAAGT TGA TTC GGT GTT TAA TC)(SEQ ID NO:24)扩增设计用于沉默的DNA。在用限制酶EcoRI消化并通过碱性磷酸酶去磷酸化后，使用T4DNA连接酶连接所得的DNA片段，并将连接反应物转化至大肠杆菌XL1-blue 细胞中。通过测序从转化得到的克隆鉴定出携带期望的构建体的克隆(图1)。

实施例3.-用于通过转座来进行转化的质粒的构建

实施例3.1.-用于通过转座来进行转化的质粒pTC3的构建

通过PCR，用寡核苷酸5pMTn4001PstI(CAT GCT GCA GCC CGG GGG ATC CAC TAGTTC TAG AG)(SEQ ID NO:25)和3pMTn4001(GTA CCC AAT TCG CCC TAT AGT GAG TCG)(SEQID NO:26)扩增质粒 pMTn4001(Pich等，Microbiology 152:519-527(2006))。将寡聚3pMTn4001 的5'末端去磷酸化。用限制酶PstI消化该PCR反应的产物(2.98kb)。另一方面，通过PCR，用寡核苷酸5'p97(TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT)(SEQ ID NO:27)和3'p97BamHI，使用猪肺炎支原体菌株J的DNA作为模板扩增P97蛋白基因的启动子。用限制酶BamHI 消化该PCR产物(280bp)，并用碱性磷酸酶去磷酸化。使用第二对寡核苷酸：5'p97ApaI(GAT CGG GCC CTC GAG GAA GAC TGA TTA GAA ATT TAG AAC T)(SEQ ID NO:28)和3'p97BamHI扩增该同样的启动子，并用限制酶ApaI和BamHI消化。通过PCR，使用质粒pMTn4001作为模板，以及寡核苷酸5'TnpBamHI(GAT CGG ATC CAT GAC CCA AGT ACA TTTTAC ACT GAAAAG)(SEQ ID NO:29)和3'TnpApaI(GAT CCT CGA GGG GGG GCC CTT TTA CACAAT TAT ACG GAC)(SEQ ID NO:30)扩增转座酶基因。然后用限制酶BamHI和ApaI消化所得的978bp 条带。最后，使用寡核苷酸5'TetMBamHI(GAT CGG ATC CAT GAA AAT TAT TAA TATTGG AGT T)(SEQ ID NO:31)和3'TetMPstI(GAT CGC TGC AGG AAT TCG ATA TCA AGC TTATCG ATA CCG TCG ATG CAC CT)(SEQ ID NO:32)，从质粒pMTnTetM438(Pich等，Microbiology 152:519-527(2006))扩增与四环素抗原性tetM对应的片段。用限制酶SalI和BamHI消化所得的1.9kb片段，并用碱性磷酸酶去磷酸化。使用T4 DNA连接酶连接所得的五个片段，并将连接反应物转化至大肠杆菌 XL1-blue细胞中。通过限制图式分析和测序，从所得的转化克隆中鉴定出携带期望的构建体的克隆。选择一个命名为pTC3的阳性克隆用于下一步(图3)。

实施例3.2.-用于通过转座来进行转化的质粒pTC366的构建

该质粒通过在四环素抗性基因两侧包含两个34 bplox66序列(ATA ACT TCG TATAGC ATA CAT TAT ACG AAC GGT A)(SEQ ID NO:33) 而直接衍生自pTC3。为此，通过PCR，用寡核苷酸5loxp66Tetp97(GAT TAA GGG CCC ATA ACT TCG TAT AGG ATA CTT TAT ACG AAGTTA TGT CGA CCC CCT CGA GGA AGA CTG)(SEQ ID NO:34)和 3loxp66Tetp97(GGG ACT AGT TAC GGT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TCT GCA GGA TAT CAA GCT TATCGA TAC CGT CG) (SEQ ID NO:35)，扩增质粒TC3的四环素抗性基因序列TetMp97，得到2.2kb PCR片段，用限制酶ApaI和SpeI消化。同时，用相同的限制酶消化质粒TC3，并回收4.4kb的条带。使用T4DNA连接酶连接所得的这两个片段，并将反应混合物转化至大肠杆菌XL1-blue细胞中。通过对转化得到的克隆测序来鉴定正确并入lox66序列的阳性克隆，并命名为 pTC366(图3)。

实施例3.3.-用于通过转座来进行转化的质粒pTC3C的构建

为了得到质粒pTC3C，用酶SpeI和NotI消化质粒pTC366。将用同样的限制酶消化合成基因ORF2v2(SEQ ID NO:5)而得到的992bp片段克隆到该质粒上。通过限制图谱鉴定阳性克隆(图3)。

实施例3.4.-用于通过转座来进行转化的质粒pTC3L的构建

通过PCR反应，用寡核苷酸P46CtFdHindIII(GTG TAA GCT TAA AAA CCA GGA TGCACA AAA TAA C)(SEQ ID NO:36)和P46CtRv-NotI (TGT TGC GGC CGC TTT AGG CAT CAGGAT TAT CAA C)(SEQ ID NO:37)，并使用菌株232的基因组DNA作为模板，扩增与P46蛋白所述3'末端对应的1.0kb片段。用限制酶HindIII和NotI消化该PCR产物。另一方面，通过使用同样的基因组DNA作为模板，用寡核苷酸 P46NtFdSpeI(AGA CAC TAG TTT GAA TTT GTATTT TCC ATA ATC) (SEQ ID NO:38)和P46NtRvBamHI(AGA GGG ATC CTG TAA TTG TTG AAGTTG CTG CCT)(SEQ ID NO:39)扩增276bp片段。该片段与P46 蛋白基因的启动子和5'末端对应，然后用限制酶SpeI和BamHI消化该片段。最后，通过使用模板质粒pTC3C，与寡核苷酸CircRv-NotI(TGT TGC GGC CGC TTA TGG TTC TAA 55 TGG TGG ATC)(SEQ ID NO:40)和Circ2Fd-BamHI(GTG TGG ATC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AAG AT) (SEQ ID NO:41)一起，扩增与PCV2衣壳蛋白对应的基因。然后用限制酶NotI和BamHI消化该712bp DNA片段。将所得的所有片段克隆到先前用酶SpeI和NotI消化了的质粒pTC366中。通过限制图谱鉴定阳性克隆(图3)。

实施例3.5.-用于通过转座来进行转化的质粒pTC3T的构建

在该实施例中，使用寡核苷酸P46NtFdSpeI和P46CIRCRv(ATC TTC TTC TTG GATATG TCA TGG CAT CAG GAT TAT CAA CAT TA)(SEQ ID NO:42)对来源于菌株232基因组DNA的P46蛋白基因的启动子区和 5'末端编码区进行PCR扩增。用限制酶SpeI切割1.25kb的条带。同时，用寡核苷酸P46CIRCFd(TAA TGT TGA TAA TCC TGA TGC CAT GAC ATA TCC AAGAAG AAG AT)(SEQ ID NO:43)和CircRv-NotI在pTC3C 上进行第二PCR反应，得到732bp DNA片段。通过将前述片段用作模板并使用寡核苷酸P46NtFdSpeI和CircRv-NotI的重组PCR反应得到2.2 kb片段。用限制酶SpeI和NotI消化该片段，并使其与先前用酶SpeI和 NotI的质粒pTC366连接。通过限制图谱和测序鉴定阳性克隆(图3)

实施例4.-得到转化细菌

通过高温灭菌、过滤或辐射对本方法中使用的所有产品和试剂进行灭菌。起始材料是指数生长期的猪肺炎支原体培养物。优选通过使用对接种物进行1/100稀释并使培养物在FriisHS培养基(20％(v/v)经辐照的马血清、2.4％(v/v)酵母菌提取物、0.1％(v/v)酚红、0.4％“Hanks' 平衡盐溶液”、0.058％(w/v)“心浸液培养基”、0.054％(w/v)PPLO和终浓度100μg/ml的氨苄青霉素)中生长48-144小时来得到该生长期。在得到约40ml稳定期的猪肺炎支原体培养物后，吸取10次培养*** 内容物以分离细胞，然后用0.45μm过滤器过滤培养物以完成分离细胞。然后使细胞于20,000×g下离心20分钟，重悬于添加有1mMEDTA的电穿孔缓冲剂(272mM蔗糖、200mM pH 7.2的Hepes)中，并在冰中孵育10分钟。在用EDTA孵育10分钟后，重复于20,000×g下离心20分钟，并将细胞重悬于100-300μl体积电穿孔缓冲剂中。将先以0.5-2μg·ml^-1的浓度溶解于电穿孔缓冲剂中的20μg质粒与细胞混悬剂加至终体积为 100μl，并添加至0.2cm电穿孔小杯中。进行电穿孔时，将电穿孔机的变量设置为电压2.5kV，电阻100-175Ω，并且电容25μF。获得的典型“时间常数”值为2.3-3ms。在发射电脉冲后，添加900μl FriisFBS培养基(除了用胎牛血清替换马血清外，与FriisHS培养基的配方完全相同)和另外 20μg质粒。将所得的混悬剂于冰上孵育20分钟，然后于37℃和5％CO₂下孵育3小时。3小时后，将所得的混悬剂分布于(约200μl每板)添加有0.7％(w/v)低熔点琼脂和期望的选择性抗生素(0.5μg/ml四环素和/ 或10μg/ml庆大霉素)的FriisHS平板上。

于37℃和5％CO₂下孵育2-3周后，回收Friis HS平板上的转化子克隆，并将其接种于装有10ml添加有先前指定浓度的选择性抗生素的 FriisHS培养基的50ml烧瓶中。如本领域技术人员已知的，在培养基颜色改变时(于37℃和150rpm下孵育10-20天后)，通过得到基因组DNA 或蛋白质提取物来对所得的突变株进行基因型和/或表型研究。

实施例4.1.至4.8.-得到经转化的猪肺炎支原体突变株

通过基本遵照实施例4中描述的方法，使用也列于表I中的质粒来制备表I中的经转化的猪肺炎支原体突变株。

表I

表中示出的突变株选自根据本发明方法进行的转化中获得的不同突变株。将这些菌株用于不同的接种和减毒程度测定中。

实施例5.-对通过用复制型质粒转化而得到的突变株的分析

实施例5.1.-对通过用复制型质粒pOG转化而得到的突变株的分析

将实施例4.6中的经转化菌株232POGc9用于证实在从Friis琼脂平板的转化回收的并在具有10μg/ml庆大霉素的FriisHS培养基中生长的细胞中存在该质粒。

为此，从细胞中纯化总DNA。用限制酶ScaI消化所得的DNA，在这种情况下，其导致出现在琼脂糖凝胶中可容易地鉴定的条带(图4A)。

出现与该质粒对应的清楚地突出于基因组DNA背景的条带，表明所分析的克隆包含该质粒，并且该质粒稳定地复制，从而每个细胞中产生 25-30个质粒拷贝。

对该结果的分析显示，本发明的复制型质粒稳定地在经转化细菌的后代中增殖。

实施例5.2.-对通过用复制型质粒pOGCRE转化而得到的突变株的分析

实施例4.7中的经转化质粒232POGCREc1包含编码Cre蛋白的基因。

为了检查通过复制型质粒引入的异源基因是否在猪肺炎支原体中以可检测的方式表达了对应的蛋白，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了来自在用质粒pOGCRE进行的转化测定中回收的克隆的总蛋白提取物，然后进行Western印迹，从而通过免疫学方法检测Cre重组酶的存在(图 4B)。

在这种情况下，仅在用质粒pOGCRE转化的菌株中检测到Cre蛋白，因此其显示复制型质粒对猪肺炎支原体中的蛋白质异源表达的有用性。

实施例5.3.-对通过用复制型质粒pOGA159转化而得到的突变株的分析

将实施例4.8中的经转化菌株6314pOGAc4用于证实在从Friis琼脂平板的转化回收的并在具有0.5μg/ml四环素的FriisHS培养基中生长的细胞中存在该质粒。

为此，从细胞中纯化总DNA。通过琼脂糖凝胶来分析所得的DNA，在这种情况下，当与从亲代菌株6314得到的DNA比较时，其导致出现在琼脂糖凝胶中可容易地鉴定的条带(图4C)。

实施例6.-对通过转座进行转化而得到的突变株的分析

实施例6.1.-对通过质粒pTC3的转座进行转化而得到的突变株的分析

通过Southern印迹和直接对基因组DNA进行测序来分析以电穿孔用质粒TC3得到的不同转化子克隆，其显示抗四环素突变株是在细菌染色体中存在转座子***的结果。

为了确保所有克隆都具有单一的转座子***，并且这些***在若干世代后没有被遗失，对由质粒pTC3得到的名为232TC3hlyC的克隆的基因组DNA进行Southern印迹。之所以如此命名该克隆，是因为测序结果指示，转座子已经被***至hlyC基因(菌株232的基因组的第843448 位碱基，GenBank AE017332.1)的编码序列中。为此，用限制酶EcoRI 和EcoRV消化菌株232和菌株232TC3hlyC二者的基因组DNA。在0.7％琼脂糖凝胶中分离所得的片段，并将其转移至尼龙膜。通过PCR反应，用地高辛标记的dUTP，使用质粒pTC3作为模板，用寡核苷酸SondaTet-5 (ATG AGT GGA TCC ATG AAA ATT ATT AAT ATT G)(SEQ IDNO:44) 和SondaTet-3(CTA AGT TAT TTT ATT GAA CAT ATA TCG TAC TTT ATC)(SEQ IDNO:45)生成探针。所述探针识别四环素抗性基因序列 TetM，从而在Southern印迹中检测发生了转座子***的基因组区域(图 5A)。条带的数量和大小与理论上预期的一致，这表明通过本方法得到的突变体以及具有单一拷贝的转座子***的载体以及所述***在若干个世代后保持稳定。

实施例6.2.-对通过质粒pTC3C、pTC3L和pTC3T的转座进行转化而得到的突变株的分析

选择几个来源于每个转座子的突变体，并命名为6314Cc1、232Cc6、232Lc2、232Tc2。如前文所述，选择具有设计成细胞质表达的的质粒的两个突变株(一个为对于菌株6314的6314Cc1，另一个为对于菌株232 的232Cc6)，而设计成定位于膜中的版本仅在菌株232上进行了示范，例如由质粒pTC3L而来的突变体232Lc2和由pTC3T而来的突变体232Tc2。

通过直接基因组DNA测序确定细胞质版本转座子(pTC3C)在细菌染色体中的***位点。对于菌株232的基因组(GenBank AE017332.1)，克隆6314Cc1中转座子插在第224547位碱基处，而克隆232Cc6中转座子插在第569253位碱基处。

为了鉴定PCV2衣壳蛋白的存在，以及在所得到的猪肺炎支原体菌株(232Lc2、232Cc6、232Tc2和6314Cc1)中定量该蛋白质，使用能够通过板上免疫测定(ELISA)来检测和定量所述抗原的市售试剂盒 (Ingenasa)。在各菌株指数期浓缩培养物100×，并在PBS和终浓度0.1％ (v/v)的X-100中裂解所得到的细胞后，得到蛋白质提取物。结果为阳性，这表明所有测试的菌株和质粒以或多或少的量表达了ORF2 或ORF2v2编码的蛋白质(图5B)。

还通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析了具有来自质粒pTC3C的版本的菌株(图5C)。检测到分子量与PCV2衣壳蛋白的分子量相同的条带。有趣的是，不存在作为重组蛋白质表达中常见问题的蛋白水解条带。所有这些表明，猪肺炎支原体中以重组方式表达的PCV2 衣壳蛋白可为有用配制多价疫苗的良好抗原。类似地，证实猪肺炎支原体是用于表达重组蛋白质的良好宿主。

实施例7.-接种测定

实施例7.1.-接种和用PCV2感染(challenge)

测试了包含根据本发明方法制备的经转化的猪肺炎支原体菌株的疫苗效力，其中所述菌株在其细胞质中表达PCV2环状病毒衣壳蛋白，并且用PCV2病原菌株感染动物。

所评估的应答是通过ELISA检测的针对猪肺炎支原体和针对PCV2 的应答，以及动物血清中的PCV2病毒DNA载量。

针对测试，选择了72只28天龄的猪，将其随机分成6组，每组12 只。

根据2²因子设计用四个动物组来测试所述效力，其中待评估的因子是经转化的猪肺炎支原体菌株和接种方案。为此，测试了包含菌株 6314Cc1或232Cc6的疫苗，并且按照单一剂量方案或具有额外剂量的再接种方案来接种动物。

进行的测定组在表II中示出：

表II

组	再接种	菌株
			1	否	6314Cc1
2	是	6314Cc1
			3	否	232Cc6
4	是	232Cc6

所述疫苗包含通过非离子表面活性剂和作为佐剂的W/O/W型乳剂失活的猪肺炎支原体突变株，并且经肌内施用至动物的颈部。

所述接种方案由以下组成：在研究的第0天对所有非对照组部分的动物施用2ml剂量的疫苗，在第一剂量14天后对所述动物的一半进行再接种。

第5组和第6组的动物在第1天和第14天都接受2ml PBS作为安慰剂对照。

为了制备用于疫苗的抗原，使经转化的猪肺炎支原体菌株在含有0.5 μg/ml四环素的Friis培养基中于37℃100-200rpm振荡下生长，直至观察到因培养基的pH变化而发生颜色变化。

离心培养物，并用PBS洗涤两次，以得到30倍浓缩的培养物。与经转化的猪肺炎支原体菌株6314Cc1对应的抗原具有的滴度为9.2变色单位 /ml(CCU/ml log₁₀)，并且与经转化的猪肺炎支原体菌株232Cc6对应的抗原具有的滴度为9.45CCU/ml log₁₀。通过ELISA(Ingezim PCV DAS, Ingenasa,Spain)证实了PCV2衣壳蛋白生产。通过考马斯蓝法确定，各抗原的总蛋白分别为373mg/l和350.2mg/l。

以50:50重量/重量的比率使用非离子表面活性剂和W/O/W型乳剂 (例如ISA 201产品(SEPPIC,France))作为佐剂，用于使所述抗原失活。

在接种前一天(第-1天)、第13天(再接种的前一天)、第27天(感染前)以及感染后的第7、14和21天(分别对应研究的第35、42和49 天)从动物收集血液样品。

得到血清，用于通过PCV2抗体ELISA测试试剂盒(Biocheck,The Netherlands)确定针对PCV2的免疫应答，通过CIVTEST SUIS Myo(Hipra, Girona-Amer,Spain)确定针对猪肺炎支原体的免疫应答；并且还用于 PCV2病毒血症分析。

在第-1、13和27天得到血清样品，由于预期它们是阴性，所以通过如在例如Quintana等，eterinary Record,2001,149,357-361中描述的标准 PCR来分析所述血清样品，而在感染后第7天和第14天收集的样品通过如在例如Olvera等，J.Virol.Meth.,2004,10 117,75-80中描述的定量PCR 来分析。

在施用第一剂量疫苗28天后，用2ml(5.66CCID₅₀/ml log₁₀)强毒野生型PCV2菌株(Sp-107-54-13PCV2，Fort等，Vet.Immunol. Immunopathol.,2010,137,226-234)经鼻内感染第1-5组的动物。第6组的动物经鼻内接受2ml PBS作为安慰剂对照。在研究的第49天，即感染后第21天，使动物安乐死。

在全盲随机的感染-接种试验期间，将动物关养在生物安全水平3的房间中。将第6组放置在单独的房间中以防止交叉感染，因此第6组是唯一由工作人员非盲照顾的一组动物。

考虑到动物具有抗PCV2母体抗体，根据该参数分块处理所述组以防止组间的初始差异。

用于评价PCV2感染效力的初级参数是通过定量PCR确定的PCV2 病毒血症的减少。

确定与猪肺炎支原体有关的效力的初级参数是通过ELISA分析的血清-转化。

图6中示出了对猪肺炎支原体的血清学应答。与未接种的组(第5 组和第6组)相比，所述四种测试疫苗从研究开始的第13天促进显著的血清-转化。

在PCV2感染后，与未接种但是受到感染组相比，除第4组外，接种的组在感染后的第14天以及感染后的第21天显示了更高的免疫应答。

未接种且未受感染的组在感染后的第21天显示了抗PCV2母体抗体的正常降低，这与未接种且受感染的组显著不同。

未观察到与PCV2感染有关的临床信号。PCV2测试模型是标准亚临床模型，并且用于确定病毒效力的关键参数是病毒血症减少。

根据在感染前的标准PCR进行的分析，所有动物对于PCV2都为阴性。图8示出了在感染后第7天和第14天通过实时PCR定量的PCV2 的基因组拷贝。在未接种且未感染的组的血清样品中，未检测到PCV2 的基因组拷贝。

与未接种但受感染的组相比，接种的组中PCV2血症在感染后的第 14天显著更低。

该研究的结果表明，通过本发明方法转化的并且表达PCV2衣壳蛋白的猪肺炎支原体菌株，同时产生针对猪肺炎支原体和2型猪环状病毒 (PCV2)的显著的免疫应答。

在建立PCV2感染后，如从在未接种并且受感染的组(第5组)中观察到的PCV2病毒血症推断，在感染后第14天接种动物中针对PCV2 的差异化免疫应答是明显的。

与猪肺炎支原体发生的不同，在没有实验感染的情况下，抗PCV2 母体抗体的存在妨碍疫苗的免疫原性评价。

因对应于由PCV2感染导致的肉眼可见的损伤的临床信号不能在实验模型中重现，根据通过定量PCR得到的病毒血症来评估PCV2感染的结果，并且通过病毒血症的减少来显示疫苗效力。当病毒血症达到其最高水平后，对于所述四种测试疫苗，都在感染的第14天观察到该减少。

因此，表达PCV2蛋白衣壳的经转化的猪肺炎支原体菌株可用于同时针对由猪肺炎支原体和由2型猪环状病毒(PCV2)的疫苗。

实施例7.2.-接种以及用PCV2和猪肺炎支原体感染

测试了包含根据本发明方法制备的经转化猪肺炎支原体菌株的疫苗效力，其中所述菌株在其细胞质中表达PCV2环状病毒衣壳蛋白。用PCV2 和猪肺炎支原体的病原菌株感染动物。

所评估的应答有：动物血清中的PCV2病毒DNA载量、具有PCV2 病毒血症的动物数量，以及动物肺中的类猪肺炎支原体损伤。

针对测试，选择了36只28天龄的猪，将其随机分成3组，每组12 只。

用包含菌株6314Cc1的疫苗测试了所述效力。按照单一剂量方案接种第1组动物。此外，该研究中包含两组动物：未接种但受到感染的组 (第2组)，和未接种且未受感染的组(第3组)。

所述接种方案由以下组成：在研究的第0天对所有非对照组部分的动物施用2ml剂量的疫苗。

第2组和第3组中的动物接受2ml PBS作为安慰剂对照。

离心培养物，并用PBS重悬，以得到25倍浓缩的培养物。与经转化的猪肺炎支原体菌株6314Cc1对应的抗原具有的滴度为9,325变色单位 /ml(CCU/ml log₁₀)。通过ELISA(Ingezim PCV DAS,Ingenasa,Spain) 证实了PCV2衣壳蛋白生产。

用非离子表面活性剂使所述抗原失活，并且作为佐剂以50:50重量/ 重量的比率使用W/O/W型乳剂(例如，产品ISA 201(SEPPIC, France))。

在接种前一天(第-1天)，接种后的第13、21和27天，以及感染后的第7、14、21和28天(分别对应研究的第35、42、49和56天)，从动物收集血液样品。

得到血清，用于通过使用如在例如已经引用的Olvera等中描述的定量PCR来确定PCV2病毒血症。

用2ml/动物(5.33CCID₅₀/ml log₁₀)强毒野生型PCV2菌株 (Sp-107-54-13PCV2，Fort等，Vet.Immunol.Immunopathol.,2010,137, 226-234)经鼻内感染第1组和第2组的动物，并在施用所述疫苗28天后用10ml/动物猪肺炎支原体3371病原菌株(7.325CCU/mllog₁₀)经气管内感染。第3组的动物经鼻内接受2ml PBS，以及经气管内接受10ml PBS/动物作为安慰剂对照。在研究的第56天，即感染28天后，对动物进行安乐死，此时评估动物肺中类猪肺炎支原体损伤的存在。

在全盲随机的感染-接种试验期间，将动物关养在生物安全水平3的房间中。将第3组放置在单独的房间中以防止交叉感染，因此第6组是唯一由工作人员盲照顾的一组动物。

用于评价PCV2感染效力的初级参数是通过定量PCR确定的PCV2 病毒血症的减少。确定与猪肺炎支原体有关的效力的初级参数是由类猪肺炎支原体损伤影响的肺表面。

根据在实验感染前的标准PCR进行的分析，所有动物对于PCV2都为阴性。图12示出了在感染后第7、14、21和28天通过实时PCR定量的PCV2的基因组拷贝。在未接种并且未感染的组的血清样品中未检测到PCV2的基因组拷贝。与未接种但受感染的组相比，接种的组中PCV2 血症在感染后的第14天和第21天显著更低。

图13中示出了与具有病毒血症(定量PCR为阳性)的动物的以百分比所表达的相同的结果。

在图14中，其示出了被类猪肺炎支原体损伤影响的肺表面百分比的中值。观察到，接种动物中的受影响的肺表面，显著低于未接种但受到感染的动物(第2组)。

该研究的结果得到以下结论：与未接种的动物相比，根据本发明方法遗传转化并且表达PCV2衣壳蛋白的猪肺炎支原体菌株，同时产生在 PCV2病毒血症和类猪肺炎支原体损伤方面的显著减少。

因此，表达PCV2蛋白衣壳的经转化的猪肺炎支原体菌株可用于同时针对由猪肺炎支原体和2型猪环状病毒(PCV2)引起的感染的疫苗。

实施例8.-测试经转化突变株的减毒程度

实施例8.1.-测试携带***于猪肺炎支原体溶血素C基因中的转座子的经转化突变株的减毒程度

通过评估所述菌株侵袭猪上呼吸道和下呼吸道的能力，在该测试中确定通过转座得到的猪肺炎支原体突变株的减毒程度。

实施例4.5中得到的受试突变株232TC3hlyC显示***于猪肺炎支原体溶血素C基因(hlyC)的转座子。

选择8周龄的猪，将其随机分成2组，每组8只动物，并且将每组保持在分离的房间中以防止交叉感染。

在感染前使动物安静。在第0天用10ml突变株232TC3hlyC经支气管内感染一组动物，并用10ml亲代猪肺炎支原体菌株232经气管内感染另一组。接种物的滴度为7CCU/mllog₁₀。在研究的第28天，使动物安乐死。

在第-1(感染前一天)、8、15、21和28天收集鼻型样品以通过巢式 PCR来进行猪肺炎支原体分析。

在第28天从安乐死的动物收集支气管型样品以也通过巢式PCR来进行猪肺炎支原体分析。

在整个研究过程中收集的鼻型样品中，未检测到携带猪肺炎支原体基因组DNA的动物。但是，在25％的动物支气管型样品中检测到猪肺炎支原体野生型菌株232，而经转化的突变株的检出率为0％。

该结果提示，与来自与下呼吸道侵袭相关的亲代菌株相比，突变株 232TC3hlyC显示减毒行为；因此可将其用作针对猪肺炎支原体的疫苗中的减毒候选物。

实施例8.2.-测试显示抑制猪肺炎支原体溶血素159基因表达的经转化突变株的减毒程度

在另一个测试中确定实施例4.8中得到显示抑制猪肺炎支原体溶血素159基因表达的菌株6314POGAc4的减毒程度。

选择8周龄的猪，将其随机分成3组，每组8只动物，并且将其保持在分离的房间中以防止交叉感染。

在测试的第0天，以8CCU/ml log₁₀浓度用10ml菌株6314POGAc4 经气管内接种第1组的动物，并且将相同量的野生型亲代菌株6314施用至第2组的动物。在感染前使动物安静。第3组是未感染的对照组。在研究的第28天，使动物安乐死。

在感染前一天(第-1天)以及第15和28天收集血液样品。通过 CIVTEST SUIS猪肺炎支原体(Hipra-Amer-Girona-Spain)分析猪肺炎支原体血清学。在第-1、8、15、21和28天收集鼻型样品，以通过巢式PCR 来进行猪肺炎支原体分析。

在第28天从安乐死的动物收集支气管型样品，以便也通过巢式PCR 来进行猪肺炎支原体分析。

对与猪肺炎支原体感染相容的肉眼可见的卡他性支气管肺炎肺损伤进行评分。根据具有由猪肺炎支原体引起的损伤的组织的比率来将每片肺叶评为0-5分。

通过应用在以下文献中描述的方法来计算每片肺叶对总影响的肺表面的贡献：Christensen等，Diseases of the respiratory system，于Diseases of Swine.第8版，Straw B.E.,D’Allaire S.,Mengeling W.L.和Taylor D.J. Iowa State University出版社，Ames(IA)1999，第914页。

图9示出了针对猪肺炎支原体感染的血清学应答。可观察到，在感染28天后仅野生型亲代菌株(第2组)显示血清转化，与用经转化突变株6314POGAc4感染的第1组以及与对照组具有显著性差异。

图10示出，在感染21和28天后，仅在第2组的鼻型样品中检测到猪肺炎支原体。在第2组的8只动物中，在第28天收集的支气管样品中检测到猪肺炎支原体，而在施用本发明的经转化突变株的组中，数量显著更低。

在图11中可观察到，在用野生型亲代菌株感染的第2组中由猪肺炎支原体引起的肉眼可见的肺损伤显著更高，而用本发明的突变株感染的动物显示比在未受感染的组中观察到的损伤更小的损伤。

因此，可推断，在该实施例中测试的本发明的经转化突变株显示降低的侵袭上呼吸道和下呼吸道的能力，并且还显示降低的引起PEP相关的肺损伤的能力。

所有这些都提示，所述经转化的突变株可用于制备针对PEP和猪肺炎支原体相关病理的减毒疫苗。

Claims

1.用于制备猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)突变株的方法，其特征在于，所述方法包括通过使用包含至少一个外源DNA序列的携载载体转化猪肺炎支原体菌株的步骤，所述外源DNA序列处于猪肺炎支原体的启动子区的DNA序列的控制下，

其中所述猪肺炎支原体的启动子区与位于编码猪肺炎支原体蛋白的基因的5'侧的包含50个碱基对至300个碱基对的DNA片段对应，所述猪肺炎支原体蛋白选自P36, P46, P65,P76, P97, P102, P146和P216蛋白，

其中所述猪肺炎支原体的启动子区起始或促进猪肺炎支原体DNA序列的转录，

并且其中至少一个外源DNA序列选自：针对抗生素的抗性基因、编码重组酶的基因、编码转座酶的基因、转座酶靶序列、来自猪肺炎支原体的DNA片段、编码诱导针对疾病或病理状况的治疗性或保护性应答的微生物的抗原组分的基因；

其中所述携载载体是复制型质粒载体，其包含：

1)包含支原体菌株的oriC区的DNA序列，所述支原体为猪肺炎支原体，和

2)外源DNA序列，其包含处于猪肺炎支原体启动子区的DNA序列的控制下的标记基因和另外的外源DNA序列；或者

其中所述携载载体是转座子载体，其包含：

1)编码转座酶的DNA序列，和

2)包含标记基因的外源DNA序列，以及

3)另外的外源DNA序列，

其中所述编码转座酶的DNA序列和至少一个所述外源DNA序列处于猪肺炎支原体启动子区的DNA序列的控制下；

其中所述外源DNA序列被稳定地引入猪肺炎支原体菌株的细胞质或基因组中。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源DNA序列是针对抗生素的抗性基因，所述抗性基因与编码引起猪疾病的微生物的抗原组分的基因组合。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述与编码引起猪疾病的微生物的抗原组分的基因组合的针对抗生素的抗性基因进一步与编码猪肺炎支原体膜蛋白的基因组合。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转座子载体是质粒。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述载体包含另外的外源DNA序列，所述另外的外源DNA序列编码诱导针对由以下微生物引起的感染猪的疾病或病理状况的保护性应答的重组蛋白质：放线杆菌属（Actinobacillus sp.）、短螺菌属（Brachyspirasp.）、多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida）、沙门氏菌属（Salmonella sp.）、链球菌属（Streptococcus sp.）、等孢子球虫菌属（Isospora sp.）、猪红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、钩端螺旋体属（Leptospira sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.)、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）、支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）、梭菌属（Clostridium sp.）、支原体（Mycoplasma sp.）、胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis）、大肠杆菌、猪生殖与呼吸综合征病毒、流感病毒、接触性胃肠炎病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒、冠状病毒、轮状病毒、猪断奶前后发育停滞综合征病原、典型猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、杯状病毒、细环病毒（TTV）和猪环状病毒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述另外的外源DNA序列选自：编码2型猪环状病毒（PCV2）衣壳蛋白的DNA序列，以及编码包含2型猪环状病毒（PCV2）衣壳蛋白并在所述蛋白质的N末端额外携带MetSerGlySer氨基酸的蛋白质的DNA序列。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，编码所述PCV2衣壳蛋白的所述另外的外源DNA序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。

8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述另外的外源DNA序列包含融合至编码猪肺炎支原体膜蛋白的基因最末尾碱基的所述PCV2病毒衣壳蛋白ORF2基因。

9.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述另外的外源DNA序列包含***编码猪肺炎支原体膜蛋白的环的DNA序列中的编码所述PCV2衣壳蛋白的基因。

10.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述另外的外源DNA序列是与所述猪肺炎支原体启动子区反向的猪肺炎支原体基因。

11.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述猪肺炎支原体蛋白是P46蛋白。

12.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述猪肺炎支原体蛋白是P97蛋白。

13.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述转座子载体包含编码转座酶的DNA序列，侧接有loxP序列的编码标记基因的DNA序列，以及编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列，其中所述DNA序列的每一个都处于猪肺炎支原体启动子区的控制下，所述启动子区选自猪肺炎支原体P97蛋白或P46蛋白的启动子区。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列为SEQ ID NO:5所示。

15.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述转座子载体包含编码转座酶的DNA序列，侧接有loxP序列的编码标记基因的DNA序列，以及融合至编码猪肺炎支原体P46膜蛋白的基因最末尾碱基的、编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列，其中所述DNA序列的每一个都处于猪肺炎支原体启动子区的控制下，所述启动子区选自猪肺炎支原体P97蛋白或P46蛋白的启动子区。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列为SEQ ID NO:4所示。

17.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述转座子载体包含编码转座酶的DNA序列，侧接有loxP序列的编码标记基因的DNA序列，以及***至猪肺炎支原体P46蛋白第92和93位氨基酸之间的、编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列，其中所述DNA序列的每一个都处于猪肺炎支原体启动子区的控制下，所述启动子区选自猪肺炎支原体P97蛋白或P46蛋白的启动子区。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列为SEQ ID NO:3所示。

19.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，通过在包含二价离子的盐的存在下孵育所述猪肺炎支原体菌株，暴露至聚乙二醇混合物，或电穿孔来实施所述转化猪肺炎支原体菌株的步骤。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，通过电穿孔来实施所述转化猪肺炎支原体菌株的步骤。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，在进行所述电穿孔之前，使所述猪肺炎支原体菌株混悬物经历在具有二价离子螯合剂的电穿孔缓冲剂中的孵育。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在电穿孔后，用额外量的包含由猪肺炎支原体启动子区控制的外源DNA序列的所述携载载体来孵育所述猪肺炎支原体菌株混悬物。

23.复制型质粒载体，其特征在于，其包含：

1)包含支原体菌株的oriC区的DNA序列，所述支原体为猪肺炎支原体，以及

2)外源DNA序列，其包含处于猪肺炎支原体启动子区的DNA序列控制下的标记基因和另外的外源DNA序列，

其中所述猪肺炎支原体的启动子区与位于编码猪肺炎支原体蛋白的基因的5'侧的包含50个碱基对至300个碱基对的DNA片段对应，所述猪肺炎支原体蛋白选自P36, P46, P65,P76, P97, P102, P146和P216蛋白，并且

其中所述猪肺炎支原体的启动子区起始或促进猪肺炎支原体DNA序列的转录。

24.转座子载体，其特征在于，其包含：

1)编码转座酶的DNA序列，和

2)包含标记基因的外源DNA序列，以及，

3)另外的外源DNA序列，

其中所述编码转座酶的DNA序列和至少一个所述外源DNA序列处于猪肺炎支原体启动子区的DNA序列的控制下，

25.如权利要求24所述的载体，其特征在于，所述载体是质粒。

26.如权利要求23-25中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体包含另外的外源DNA序列，所述另外的外源DNA序列编码诱导针对由以下微生物引起的感染猪的疾病或病理状况的保护性应答的重组蛋白质：放线杆菌属、短螺菌属、多杀巴斯德菌、沙门氏菌属、链球菌属、等孢子球虫菌属、猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体属、葡萄球菌属、副猪嗜血杆菌、支气管炎博德特菌、梭菌属、支原体、胞内劳森菌、大肠杆菌、猪生殖与呼吸综合征病毒、流感病毒、接触性胃肠炎病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒、冠状病毒、轮状病毒、猪断奶前后发育停滞综合征病原、典型猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、杯状病毒、细环病毒（TTV）和猪环状病毒。

27.如权利要求26所述的载体，其特征在于，所述另外的外源DNA序列选自：编码2型猪环状病毒（PCV2）衣壳蛋白的序列，以及编码包含2型猪环状病毒（PCV2）衣壳蛋白并且在所述蛋白的N末端额外携带MetSerGlySer氨基酸的蛋白质的序列。

28.如权利要求27所述的载体，其特征在于，编码所述PCV2衣壳蛋白的所述另外的外源DNA序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。

29.如权利要求23-25中任一项所述的载体，其特征在于，所述另外的外源DNA序列包含融合至编码猪肺炎支原体膜蛋白的基因最末尾碱基的所述PCV2病毒衣壳蛋白的ORF2基因。

30.如权利要求23-25中任一项所述的载体，其特征在于，所述另外的DNA序列包含***编码猪肺炎支原体膜蛋白的环的DNA序列中的编码所述PCV2衣壳蛋白的基因。

31.如权利要求30所述的载体，其特征在于，所述猪肺炎支原体膜蛋白选自P46蛋白和P97蛋白。

32.如权利要求23或24所述的载体，其特征在于，其包含作为与所述猪肺炎支原体启动子区反向的猪肺炎支原体基因的另外的外源DNA。

33.如权利要求23-25中任一项所述的载体，其特征在于，所述猪肺炎支原体蛋白是P46蛋白。

34.如权利要求23-25中任一项所述的载体，其特征在于，所述猪肺炎支原体蛋白是P97蛋白。

35.如权利要求24或25所述的载体，其特征在于，所述转座子载体包含编码转座酶的DNA序列，侧接有loxP序列的编码标记基因的DNA序列，以及编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列，其中所述DNA序列的每一个都处于猪肺炎支原体启动子区的控制下，所述启动子区选自猪肺炎支原体P97蛋白或P46蛋白的启动子区。

36.如权利要求35所述的载体，其特征在于，所述编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列为SEQ ID NO:5所示。

37.如权利要求24或25所述的载体，其特征在于，所述转座子载体包含编码转座酶的DNA序列，侧接有loxP序列的编码标记基因的DNA序列，以及融合至编码猪肺炎支原体P46膜蛋白的基因最末尾碱基的、编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列，其中所述DNA序列的每一个都处于猪肺炎支原体启动子区的控制下，所述启动子区选自猪肺炎支原体P97蛋白或P46蛋白的启动子区。

38.如权利要求37所述的载体，其特征在于，所述编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列为SEQ ID NO:4所示。

39.如权利要求24或25所述的载体，其特征在于，所述转座子载体包含编码转座酶的DNA序列，侧接有loxP序列的编码标记基因的DNA序列，以及***至猪肺炎支原体P46蛋白第92和93位氨基酸之间的、编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列，其中所述DNA序列的每一个都处于猪肺炎支原体启动子区的控制下，所述启动子区选自猪肺炎支原体 P97蛋白或P46蛋白的启动子区。

40.如权利要求39所述的载体，其中所述编码PCV2衣壳蛋白的另外的外源DNA序列为SEQ ID NO:3所示。

41.如权利要求23-40中任一项所述的携载载体用于制备猪肺炎支原体突变株的用途。

42.通过权利要求1-22中任一项所定义的方法获得的猪肺炎支原体突变株。

43.由权利要求23-40中任一项所定义的载体转化的猪肺炎支原体突变株。

44.猪肺炎支原体的突变株，其特征在于，其包含如权利要求23和26-34中任一项所述的复制型质粒载体，或如权利要求24-31以及33-40中任一项所述的转座子载体。

45.如权利要求42-44中任一项所述的突变株，其特征在于，其表达由所述外源DNA序列编码的蛋白。

46.如权利要求42-44中任一项所述的突变株，其特征在于，其产生针对负责所述菌株毒力的基因的反义RNA。

47.如权利要求42-44中任一项所述的突变株，其特征在于，所述外源DNA序列打断编码猪肺炎支原体毒力因子的基因。

48.保藏于莱布尼兹研究所DSMZ中的保藏编号为DSM 26020的猪肺炎支原体突变株。

49.保藏于莱布尼兹研究所DSMZ中的保藏编号为DSM 26027的猪肺炎支原体突变株。

50.保藏于莱布尼兹研究所DSMZ中的保藏编号为DSM 26033的猪肺炎支原体突变株。

51.保藏于莱布尼兹研究所DSMZ中的保藏编号为DSM 26034的猪肺炎支原体突变株。

52.保藏于莱布尼兹研究所DSMZ中的保藏编号为DSM 26049的猪肺炎支原体突变株。

53.如权利要求42-52中任一项所定义的猪肺炎支原体突变株，其特征在于，其为减毒形式或失活形式。

54.权利要求42-53中任一项所定义的猪肺炎支原体突变株作为用于表达外源DNA序列的宿主的用途。

55.权利要求42-53中任一项所定义的猪肺炎支原体突变株用于制备针对由猪肺炎支原体引起的猪地方性肺炎并且针对感染猪的另一种疾病或另外的病理状况的疫苗的用途。

56.保护猪免于由猪肺炎支原体引起的猪地方性肺炎并且免于感染猪的另一种疾病或另外的病理状况的疫苗，其包含免疫有效量的权利要求42-53中任一项所定义的猪肺炎支原体突变株。

57.如权利要求56所述的疫苗，其特征在于，所述感染猪的另一种疾病或另外的病理状况由选自以下的微生物引起：放线杆菌属、短螺菌属、多杀巴斯德菌、沙门氏菌属、链球菌属、等孢子球虫菌属、猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体属、葡萄球菌属、副猪嗜血杆菌、支气管炎博德特菌、梭菌属、支原体、胞内劳森菌、大肠杆菌、猪生殖与呼吸综合征病毒、流感病毒、接触性胃肠炎病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒、冠状病毒、轮状病毒、猪断奶前后发育停滞综合征病原、典型猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、杯状病毒和细环病毒（TTV）。

58.如权利要求57所述的疫苗，其特征在于，所述感染猪的另一种疾病或另外的病理状况由猪环状病毒引起。

59.如权利要求56所述的疫苗，其特征在于，其还包含药学上可接受的媒介物，并且包含佐剂。

60.如权利要求59所述的疫苗，其特征在于，所述猪肺炎支原体菌株是失活形式。

61.如权利要求60所述的疫苗，其特征在于，通过非离子表面活性剂使所述猪肺炎支原体菌株失活。

62.如权利要求61所述的疫苗，其特征在于，其包含W/O/W型乳剂作为佐剂。

63.如权利要求56所述的疫苗，其特征在于，将所述疫苗经皮内或经肌内施用。

64.如权利要求56所述的疫苗，其特征在于，将所述疫苗与另外的疫苗或抗原组合物组合。

65.如权利要求64所述的疫苗，其特征在于，所述另外的疫苗或抗原组合物旨在赋予猪针对诸如由以下微生物引起的疾病或病理状况的保护：放线杆菌属、短螺菌属、多杀巴斯德菌、沙门氏菌属、链球菌属、等孢子球虫菌属、猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体属、葡萄球菌属、副猪嗜血杆菌、支气管炎博德特菌、梭菌属、支原体、胞内劳森菌、大肠杆菌微生物、猪生殖与呼吸综合征病毒、流感病毒、接触性胃肠炎病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒、冠状病毒、轮状病毒、猪环状病毒、猪断奶前后发育停滞综合征病原、典型猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、杯状病毒和细环病毒（TTV）。

66.用于针对由猪肺炎支原体引起的感染或疾病并且针对由感染猪的微生物引起另一种疾病或病理状况来接种猪的接种试剂盒，其包含免疫有效量的权利要求42-53中任一项所定义的突变株。

67.用于针对由猪肺炎支原体引起的感染或疾病并且针对由感染猪的微生物引起另一种疾病或病理状况来接种猪的接种试剂盒，其包含权利要求56-65中任一项所定义的疫苗。

68.如权利要求67所述的接种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求56-65中任一项所定义的疫苗与另外的抗原组合物的组合，将所述组合装在单一容器中或装在不同容器中。