CN104673820B - 一种适用于纤维堆囊菌的talen载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于纤维堆囊菌的TALEN载体及其构建方法。本发明首次将适用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的启动子P43替换适用于真核生物的启动子，将构建成功的靶标目的基因的左右臂TALEN元件和靶标基因共同转入纤维堆囊菌，用Western blot验证重组蛋白是否表达，从而验证所构建的载体能在纤维堆囊菌中行使基因敲除的功能，进一步拓宽TALEN技术的应用范围，促进生物技术的发展。
Description
技术领域：
本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种适用于纤维堆囊菌的TALEN载体及其构建方法。
背景技术：
TALE是来自于植物致病细菌黄色单胞杆菌属的一类具有高度特异性的DNA结合蛋白(Sanjana NE,Cong L,Zhou Y,Cunniff MM,Feng G,Zhang F.A TAL effector toolboxfor genome engineering.Nature Protocols,2012,7:171-192.)，其特异性是由其重复单元中的重复可变区(Repeat Variable Diresidue,RVD)决定的。TALE元件主要包括TALEN元件和TALE-TF元件，TALEN元件由于基因敲除效率高、几乎无脱靶作用等优点已经在哺乳动物细胞、干细胞和植物等真核细胞的基因组编辑方面有着十分广泛的应用，而由于相应载体的缺乏，TALEN在原核生物中的应用尚未见报道。由于纤维堆囊菌其次级代谢产物丰富，构建其基因改造体系对于其代谢产物种类和产量十分重要，但由于相关载体的缺乏及纤维堆囊菌成团生长的特性导致纤维堆囊菌的基因工程改造进展缓慢。因此，构建适用于纤维堆囊菌的TALEN载体将扩大TALEN技术的应用范围，提高原核生物的基因组编辑效率，促进基因组编辑技术的发展。
发明内容：
本发明的目的是提供一种适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体及其构建方法。
本发明的适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体，其特征在于，其是通过以下方法构建的：根据目的基因的碱基序列确定靶标序列，再确定靶标序列上下游的靶标识别域碱基序列，根据上下游的靶标识别域碱基序列设计TAL重复单元，分别得到上游的TALE重复单元和下游的TALE重复单元，将上游的TALE重复单元连接至Ptalen L48载体上，下游的TALE重复单元连接至Ptalen R36载体上；再用内切酶HindIII和SpeI酶切Ptalen L48载体和上下游含有内切酶HindIII和SpeI位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动子代替启动子pGPD***到酶切位点HindIII和SpeI之间，得到载体P43LTALEN；再用内切酶AscI和SpeI酶切Ptalen R36载体和上下游含有内切酶AscI和SpeI位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动子代替启动子pGPD***到酶切位点AscI和SpeI之间，得到载体P43RTALEN；载体P43LTALEN和载体P43RTALEN即为适用于纤维堆囊菌的新型TALEN载体。
所述的纤维堆囊菌优选为纤维堆囊菌So ce M4，也可以是纤维堆囊菌So ce 90、So ce 56和So ce M6。
目前，关于TALEN技术在原核生物中的应用几乎未见报道，本发明首次将适用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的启动子P43替换适用于真核生物的启动子，将构建成功的靶标目的基因的左右臂TALEN元件和靶标基因共同转入纤维堆囊菌，用Western blot验证重组蛋白是否表达，从而验证所构建的载体能在纤维堆囊菌中行使基因敲除的功能，进一步拓宽TALEN技术的应用范围，促进生物技术的发展。
附图说明：
图1为ADH2基因扩增及pET22b-ADH2双酶切鉴定图；
图2为TALEN靶标序列图及TALEN重组载体测序鉴定图；
图3为P43LTALEN及P43RTALEN双酶切鉴定图；
图4为P43LTALEN、P43RTALEN及pET22b-ADH2导入纤维堆囊菌后的质粒及PCR鉴定图；
图5为敲除成功重组菌测序结果与ADH2基因比对图；
图6为导入P43LTALEN、P43RTALEN和pET22b-ADH2后的总蛋白Western blot鉴定图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：pET22b-ADH2重组质粒的构建：
一、ADH2基因的获取。
1.设计引物：
上游引物：GGAATTCCATATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAG
下游引物：GCCCTCGAGTTTAGAAGAGTCAACAACGT
2.用试剂盒提取啤酒酵母As2.4的基因组，按如上引物PCR扩增得到长度约为1024bp的带酶切位点的ADH2基因并测序验证(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，ADH2基因的碱基序列的Genbank登陆号为NM_001182812.1)，
PCR反应体系如下：
PCR扩增程序如下：
所得PCR产物经回收后用NdeI和XohI于37℃处理2h。将pET22b载体用NdeI和XohI于37℃处理2h，回收酶切产物。将两酶切产物于22℃连接5h，转化DH5α感受态细胞，挑取克隆扩大培养，用氨苄青霉素筛选，菌液PCR筛选阳性克隆，NdeI和XohI双酶切测序鉴定，得到5400bp左右和1024bp左右的两条带(图1，泳道1为pET22b载体，泳道2为重组质粒pET22b-ADH2，泳道3为ADH2基因)。所得的重组载体命名为：重组质粒pET22b-ADH2(将ADH2基因***pET22b载体中)。
实施例2：TALEN靶标载体的构建
以测序所得的ADH2基因中17bp序列作为敲除靶标，分别用Ptalen L48和PtalenR36(上海斯丹赛生物科技有限公司,货号：1901/1902/1903-010)载体靶向结合敲除靶标上下游17bp序列(如图2A所示)，当重复单元采用FastTALE TALEN试剂盒(上海斯丹赛生物科技有限公司，货号：1901/1902/1903-010)构建完毕后，连接至Ptalen L48和Ptalen R36载体上，双酶切及测序结果表明敲除载体构建成功(图2B)。以如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为引物，以pBEP43载体为模板，扩增P43启动子序列，用限制性内切酶HindIII和SpeI酶切Ptalen L48载体和该P43启动子，切胶回收双酶切产物，加入T4DNA连接酶于22℃连接5h，连接产物转化至DH5α感受态细胞，卡那霉素进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR鉴定，阳性克隆提取质粒进行双酶切鉴定；以如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为引物，以pBEP43载体为模板，扩增P43启动子序列，用AscI和SpeI酶切Ptalen R36载体和该P43启动子，切胶回收双酶切产物，加入T4DNA连接酶于22℃连接5h，连接产物转化至DH5α感受态细胞，卡那霉素进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR鉴定，阳性克隆提取质粒进行双酶切鉴定，结果如图3所示(图3的泳道1为载体P43LTALEN，泳道2为载体P43RTALEN)。测序结果表明P43启动子成功***Ptalen L48和Ptalen R36载体中，分别命名为P43LTALEN及P43RTALEN。
实施例3：
P43LTALEN、P43RTALEN和pET22b-ADH2共转化
将P43LTALEN、P43RTALEN和pET22b-ADH2各取3μL，调节浓度至150ng/μl，加入至纤维堆囊菌So ce M4感受态细胞中，另取3μL 150ng/μl的pET22b-ADH2单独加入至感受态细胞纤维堆囊菌So ce M4中，冰上放置2min，立即加入冰预冷的电转杯中，1500V，5.0ms的条件进行电转化，转化完毕立即加入6mLG52液体培养基中,30℃，150rpm恢复培养3h,加入三种质粒和单一质粒的菌液分别涂布至含有100μg/ml Amp、50μg/ml Kan的G52平板和仅含有100μg/ml Amp的G52平板上，37℃培养。挑取单克隆扩大培养，菌液PCR鉴定，所采用引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。如图4所示，加入三种质粒的菌液PCR所得片段(Lane 3)比仅加入一种质粒所得PCR片段(Lane 4)略小。提取相应克隆的质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图4所示，Lane 1中可检测到四个片段，对应三种质粒，因为P43LTALEN和P43RTALEN重组载体大小一致，Lane 2中仅检测到对应于pET22b-ADH2的质粒片段。测序结果与ADH2基因进行比对(图5)，表明靶标序列被成功敲除，并未出现非特异性敲除，由此得到靶标序列被敲除的重组菌，以及转有质粒pET22b-ADH2的阳性克隆。
实施例4：重组菌的Western blot鉴定
将敲除成功的重组菌和pET22b-ADH2的阳性克隆扩大培养至OD为0.6左右，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃培养3h，超声破碎，所得总蛋白加入上样缓冲液制备电泳样品，以不加入IPTG的样品作为对照，各取10μl蛋白样品进行SDS-PAGE，电泳完毕后转移至硝酸纤维素薄膜上(100V，50min)，5％脱脂奶粉封闭2.5h，用鼠源Anti-His单克隆抗体(1:2000)于4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜3次，每次15min，用羊抗鼠IgG二抗(1:2500)于37℃孵育1h,TBST洗膜，用ECL发光试剂盒于暗室曝光于X-胶片上，如图6所示，pET22b-ADH2的阳性克隆在诱导前并未出现任何条带(泳道1)，诱导后于40kD处出现乙醇脱氢酶目的条带(泳道2)，而敲除成功的重组菌于40kD出并未出现目的条带(泳道3)，说明ADH2基因被成功敲除，改造后的载体适用于纤维堆囊菌。
Claims (2)
1.一种TALEN载体在纤维堆囊菌行使基因敲除中的应用，其特征在于，所述的TALEN载体是通过以下方法制备的：根据目的基因的碱基序列确定靶标序列，再确定靶标序列上下游的靶标识别域碱基序列，根据上下游的靶标识别域碱基序列设计TALE重复单元，分别得到上游的TALE重复单元和下游的TALE重复单元，将上游的TALE重复单元连接至Ptalen L48载体上，下游的TALE重复单元连接至Ptalen R36载体上；再用内切酶HindIII和SpeI酶切Ptalen L48载体和上下游含有内切酶HindIII和SpeI位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动子代替启动子pGPD***到酶切位点HindIII和SpeI之间，得到载体P43LTALEN；再用内切酶AscI和SpeI酶切Ptalen R36载体和上下游含有内切酶AscI和SpeI位点的P43启动子，再进行连接反应，使P43启动子代替启动子pGPD***到酶切位点AscI和SpeI之间，得到载体P43RTALEN；载体P43LTALEN和载体P43RTALEN即为适用于纤维堆囊菌的TALEN载体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌So ceM4。
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| Talen or Cas9-Rapid,efficient and specific choices for Genome modifications;Chuanxian Wei et al.;《Journal of Genetics and Genomics》;20130412;第40卷;全文 * |
| Talen表达载体构建技术研究进展;杨潇;《西华大学学报（自然科学版）》;20140731;第33卷(第4期);全文 * |
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