CN104672328A

CN104672328A - 一种人抗凝血酶ⅲ的生产方法

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Publication number: CN104672328A
Application number: CN201510078211.1A
Authority: CN
Inventors: 周安; 朱孟沼; 席智赢; 张翠萍; 马杰; 陈振; 陈晨; 菅长永; 马山
Original assignee: Shandong Taibang Biological Product Co Ltd
Current assignee: Shandong Taibang Biological Product Co Ltd
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: CN104672328B

Abstract

本发明涉及一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，步骤为：将新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀获得血浆上清，上清液使用DEAE Sephadex-A50凝胶吸附处理；血浆上清杂质蛋白沉淀及血浆深层过滤；Capto Heparin 亲和层析；S/D病毒灭活及Capto Q离子交换层析去除S/D试剂；纳米膜过滤去除病毒，配制、冻干、干热。该工艺仅使用一步亲和层析制备抗凝血酶Ⅲ，回收率可达40%以上，比活可达8~10IU/mg。

Description

一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法

技术领域

本发明涉及生物制品和血液制品生产技术领域，主要涉及血液制品生产中人抗凝血酶Ⅲ分离纯化方法。

背景技术

人抗凝血酶Ⅲ为α₂球蛋白，分子量介于58000~65000Da之间，是人体内重要的抗凝物质，可以在没有肝素的条件下发挥抗凝血作用。抗凝血酶Ⅲ在健康成年人血浆中浓度为100~300μg/ml，人体内抗凝血酶Ⅲ水平低于正常水平的70%时，会使血栓形成的风险升高。人抗凝血酶Ⅲ产品适用于治疗抗凝血酶缺乏的病人，如先天遗传性及获得性抗凝血酶缺乏、弥散性血管内出血（DIC）、败血症、外伤、肿瘤、血栓性栓塞、并发性妊娠等。

1975年Thaler使用肝素亲和层析和聚乙二醇（PEG）沉淀进行血浆纯化、再加入硫酸铵沉淀除去PEG；但经由该方法纯化的抗凝血酶Ⅲ中还含有杂蛋白肝素辅助因子的活性。1981年Mckay用硫酸葡聚糖除去血浆中大部分与肝素结合的非特异性蛋白，再用肝素亲和层析分离抗凝血酶Ⅲ，但比活只能达到4IU/mg。上述两种工艺均以血浆为起始原料，通过加入蛋白沉淀剂去除血浆中的杂蛋白，操作步骤繁琐，杂蛋白去除效果不好，导致产品纯度低、比活低，而且影响血浆中其他蛋白的提取，不利于血浆的综合利用。

1989年Hoffman以Cohn FIV-1沉淀为原料，将沉淀复溶澄清后的上清液经过两次肝素亲和层析，抗凝血酶Ⅲ比活达到了6.4IU/mg。在国内现有已公开和授权的专利（CN201210544111X，CN2013100304464，CN2013106047238）生产工艺中，无论是以FⅣ为原料的工艺路线，还是以血浆为原料的工艺路线，均采用两次或两次以上肝素亲和层析制备抗凝血酶Ⅲ，以达到最终制品抗凝血酶Ⅲ的高纯度和高比活标准。由于上述工艺中均未对起始料液进行澄清预处理，因此必须使用两次亲和层析进行纯化，才能保证产品有较高的纯度和比活。但亲和层析的凝胶一般价格昂贵，生产成本高，并且增加一步亲和层析的同时也提高了亲和配基脱落的风险，给产品质量带来隐患。

发明内容

本发明的目的在于针对目前人抗凝血酶Ⅲ生产工艺中存在的不足，提供一种仅需一步亲和层析即可获得高比活抗凝血酶Ⅲ的工艺方法。

本发明所采用的技术方案如下：

（1）新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀， DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；（2）血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤；（3）滤过液Capto Heparin 亲和层析；（4）S/D试剂病毒灭活，Capto Q离子交换层析去除S/D试剂；（5）纳米膜过滤去除病毒，配制、冻干、干热。

本发明中所述的步骤（1）新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀， DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；具体的步骤如下：

将新鲜冰冻人血浆融化混匀后，经连续流离心机去除血浆中的冷沉淀，得到离心后的血浆上清液；

血浆上清采用1~10μm的滤芯过滤，调节血浆pH至6.80~7.20；加入平衡好的DEAE Sephadex-A50凝胶搅拌吸附30~60分钟，吸附温度≤15℃；采用0.2~1μm微孔滤芯过滤，滤除凝胶获得吸附处理后的血浆上清；DEAE Sephadex-A50干胶量 1.0~2.0g/kg血浆；0.05~0.1mol/L 氯化钠溶液融胀≥8小时；平衡3~5次；再生用1.0～2.0mol/L氯化钠溶液处理，20%乙醇保存；再生次数不超过10次；所述的平衡液：0.015~0.025mol/L 枸橼酸钠，0.14~0.20mol/L氯化钠，pH 6.8~7.2，温度2~8℃；

加入1~2倍凝胶体积的洗涤液，搅拌洗涤1~3次，将洗涤液采用0.2~1μm微孔滤芯过滤后，与滤除凝胶后的血浆上清合并，得到处理后的血浆上清；洗涤液：0.015~0.025mol/L 枸橼酸钠，0.14~0.20mol/L氯化钠，pH 6.80~7.20，温度2~8℃。

本发明中所述的步骤（2）血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤；具体步骤如下：

血浆上清沉淀杂质蛋白

将处理后的血浆上清首先升温至8~10℃，添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为60~100mmol/L，搅拌均匀，用0.1~0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为6.80~7.00；降温至4~6℃，补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为120~200mmol/L，搅拌均匀，用0.1~0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为7.40~7.50；降温至0~2℃，搅拌10~30min后静置30~60min；

深层过滤

所采用的过滤材质为药用级别纤维素滤板，可以为一种规格的单层滤板或几种规格的滤板串联叠加使用；滤板型号选择如PALL的PEK1、PEKS、PDH4、PDE2、PDE1，3M的30SP、60SP、90SP、30LA、60 LA、90 LA，以及类似效果的其他型号的滤板，或者其组合；

使用含有0.1%~10%EDTA的溶液对过滤材质进行清洗，用量为100~300L/m²；再用0.1%~10%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗，并洗去残留的EDTA，用量为100~300L/m²；冲洗完成后排干设备内的溶液，用于血浆过滤。

过滤后的血浆上清在进行柱层析的同时，使用0.2μm的滤芯进行在线的膜过滤。

其中，步骤（3）滤过液进行Capto Heparin 亲和层析具体为：

深层过滤后的滤过液，通过装填有Capto Heparin的肝素亲和凝胶的层析柱进行固定床亲和层析，凝胶中结合在琼脂糖基架上的肝素配基将捕获血浆中的抗凝血酶Ⅲ；用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净，用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ；每次上样量控制为20~30个柱床体积；所述的平衡液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠0.3~0.6mol/L，pH6.50~7.50；所述的洗脱液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠1.5~2.5mol/L，pH6.50~7.50；平衡、上样和洗脱线流速180cm/h~300cm/h；柱再生：分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理；柱保存：20%乙醇溶液保存。

本发明中所述的步骤（4）S/D试剂病毒灭活，Capto Q离子交换层析去除S/D试剂；具体步骤如下：

收集从Capto Heparin肝素层析柱上洗脱得到的制品，进行超滤、脱盐和浓缩，超滤膜孔径10KDa，所述的超滤稀释液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L，pH6.50~7.50；超滤后制品电导率值不高于5mS/cm，制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml；超滤后的抗凝血酶Ⅲ溶液用精度不低于1μm滤芯过滤，进行S/D法病毒灭活处理，方法为：聚山梨酯80含量应为1.0±0.3%(g/ml)，磷酸三丁酯含量应为0.3±0.1%(g/ml)，制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml，灭活温度24±1℃，维持6小时；

S/D灭活后的制品通过平衡好的Capto Q阴离子交换层析柱，制品被吸附在层析柱上，而加入的S/D试剂流穿出层析柱，用平衡液冲洗层析柱，洗涤残留的S/D试剂，再用洗脱液将吸附的制品洗脱下来；平衡液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L，pH6.50~7.50；洗脱液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠0.4~1.0mol/L，pH6.50~7.50；平衡、上样和洗脱线流速180cm/h~300cm/h；柱再生：分别用0.3mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理；柱保存：20%乙醇溶液或0.01mol/L NaOH保存。

本发明所述的步骤（5）纳米膜过滤去除病毒，配制、冻干、干热；具体步骤如下：

收集从离子交换层析柱上洗脱的制品，进行超滤脱盐和浓缩，超滤膜孔径10KDa，制品蛋白质含量10.0~20.0mg/ml，超滤后制品用0.1μm的滤膜进行预过滤，然后用20nm的纳米膜进行除病毒过滤；按出品规格配制、冻干、制品进行100℃，30min干热灭活病毒处理。

本发明的有益效果是：

（1）以DEAE Sephadex-A50凝胶吸附后的血浆为原料，不影响血浆生产线中冷沉淀和人凝血酶原复合物的生产，也不影响后续人白和免疫球蛋白等其他产品的生产。并且DEAE Sephadex-A50凝胶吸附后的血浆中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子的含量极低，可避免肝素亲和凝胶对上述凝血因子的非特异性吸附，提高目的蛋白抗凝血酶Ⅲ的纯度和凝胶的载量。

（2）血浆澄清处理不使用聚乙二醇(PEG)、硫酸铵、硫酸葡聚糖等蛋白沉淀剂，不引入外源性杂质。通过调整盐浓度、pH值、温度等条件，再经过深层过滤和0.2μm的膜过滤，就可以去除血浆中大部分与肝素亲和层析凝胶结合的杂质蛋白，使血浆料液达到固定床柱层析所要求的接近0.2μm的过滤精度和澄清度，不仅能有效提高上样过程中的线速度，还可进一步提升产品的比活和凝胶载量，同时可进一步实现对凝胶填料的保护，确保昂贵的Capto Heparin肝素亲和凝胶的重复使用次数达到200次以上。

（3）血浆经过去除冷沉淀、DEAE Sephadex-A50凝胶吸附、杂质蛋白沉淀及深层过滤等澄清处理后，仅需一步Capto Heparin凝胶肝素亲和层析，即可实现洗脱液中抗凝血酶Ⅲ比活达到8~10IU/mg，纯度接近100%。

（4）Capto Q凝胶用于去除抗凝血酶Ⅲ中间品中的S/D试剂。该凝胶载量大，处理方便，操作简单，且单步回收率达95%以上，不影响中间品的纯度和比活。

（5）经过该工艺制备的抗凝血酶Ⅲ成品，总回收率可达40%以上，比活可达8~10IU/mg，纯度接近100%。

（6）工艺过程中加入S/D试剂、纳米膜过滤和干热三种不同机制的病毒灭活/去除步骤，可以充分灭活/去除制品中可能出现的脂包膜和非脂包膜病毒，确保了制品的安全性。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

1新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀， DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；

1.1血浆去除冷沉淀

新鲜冰冻血浆经过投料、融浆、离心分离冷沉淀，收集离心后的血浆。过程中血浆温度不超过4℃，离心机出液速度不超过2L/min。

1.2血浆DEAE Sephadex-A50凝胶吸附

去除冷沉淀的血浆采用1μm的滤芯过滤。调节血浆pH至7.00；加入平衡好的A-50凝胶搅拌吸附45min，吸附温度4℃；滤除凝胶。平衡液：0.01mol/L 枸橼酸钠，0.20mol/L氯化钠，pH 7.00，4℃。

加入1倍凝胶体积的洗涤液，搅拌洗涤2次，将洗涤液采用1μm微孔滤芯过滤后，与滤除凝胶后的血浆上清合并，得到处理后的血浆上清。洗涤液：0.01mol/L 枸橼酸钠，0.20mol/L氯化钠，pH 7.00，4℃。

2血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤

2.1血浆上清沉淀杂质蛋白

血浆上清首先升温至10℃，添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为65mmol/L，搅拌均匀，用0.3mol/L的盐酸调整血浆上清pH为6.80；降温至5℃，补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为200mmol/L，搅拌均匀，用0.3mol/L氢氧化钠调整血浆上清pH为7.40；降温至1℃，搅拌30min后静置60min。

2.2血浆深层过滤

选择PALL的 PEK1滤板。使用含有1%EDTA的水溶液对过滤材质进行清洗，用量为100L/m²。再用1%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗用量为100L/m²，冲洗完成后排干设备内的溶液，进行血浆过滤。

过滤后的血浆在进行柱层析的同时，使用PALL的 EKV型号的0.2μm的双层膜滤芯进行在线的膜过滤。

3滤过液Capto Heparin 亲和层析

深层过滤后的滤过液，通过平衡好的Capto Heparin肝素亲和层析柱。用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净，用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ。血浆上样量控制为25个柱床体积。平衡液：含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠0.5mol/L，pH7.00；洗脱液：含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠2.0mol/L，pH7.00；平衡、上样和洗脱线流速240cm/h。柱再生：分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理。柱保存：20%乙醇溶液。

4S/D试剂病毒灭活，Capto Q离子交换层析去除S/D试剂

4.1超滤脱盐

收集从层析柱上洗脱得到的制品，进行超滤（超滤膜孔径10KDa）脱盐和浓缩。超滤稀释液：含磷酸氢二钠10mmol/L pH7.00。超滤后制品电导率值不高于4mS/cm，制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml。

4.2 S/D法病毒灭活

超滤后的抗凝血酶Ⅲ溶液用精度不低于1μm滤芯过滤后进行S/D法病毒灭活处理。方法为：聚山梨酯80含量应为1.0%(g/ml)，磷酸三丁酯含量应为0.3%(g/ml)，制品蛋白质浓度20.0mg/ml，灭活温度24℃，维持6小时。

4.3Capto Q离子交换层析

S/D灭活后的制品通过平衡好的Capto Q阴离子交换层析柱；制品被吸附在层析柱上，而加入的S/D试剂和少量杂蛋白流穿出层析柱。用平衡液冲洗层析柱，洗涤残留的S/D试剂和杂蛋白。再用洗脱液将吸附的制品洗脱下来。平衡液：含磷酸氢二钠20mmol/L，pH7.00；洗脱液：含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠0.8mol/L，pH7.00；平衡、上样和洗脱线流速240cm/h。柱再生：分别用0.3mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理。柱保存：20%乙醇溶液。

5灭活病毒，配制，冻干，干热

5.1超滤、脱盐

收集从离子交换层析柱上洗脱的制品，进行超滤（超滤膜孔径10KDa）脱盐和浓缩，控制制品蛋白质含量10.0mg/ml。

5.2病毒去除（纳米膜过滤）

制品蛋用0.1μm的滤膜进行预过滤，然后用20nm的纳米膜进行除病毒过滤。纳米膜在使用前、后都应进行完整性测试。

5.3半成品制备、除菌、分装、冻干，干热灭活，按出品规格配制、冻干、制品进行100℃，30min干热灭活病毒处理。

生产工艺中各阶段的抗凝血酶Ⅲ回收率见表1 。

表1 生产工艺中各阶段的抗凝血酶Ⅲ回收率

生产工艺中各阶段的抗凝血酶Ⅲ比活见表2。

表2 生产工艺中各阶段的抗凝血酶Ⅲ比活

实施例2

血浆深层过滤

过滤材质选择3M的30LA、60LA组合。使用含有5%EDTA的水溶液对过滤材质进行清洗，用量为200L/m²。再用5%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗用量为200L/m²。其中首先使用50L/m²的枸橼酸钠溶液冲洗滤板，再用100L/m²的枸橼酸钠溶液将前述溶液冲出，并循环冲洗30min，最后使用50L/m²的枸橼酸钠溶液将前述溶液冲出。冲洗完成后排干设备内的溶液，进行血浆过滤。

过滤后的血浆在进行柱层析的同时，使用3M的PDA型号0.2μm的双层膜滤芯进行在线的膜过滤。

实施例3

1新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀， DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；

1.1血浆去除冷沉淀

新鲜冰冻血浆经过投料、融浆、离心分离冷沉淀，收集离心后的血浆。过程中血浆温度不超过4℃，离心机出液速度不超过1L/min。

1.2血浆DEAE Sephadex A-50吸附

去除冷沉淀的血浆采用1μm的滤芯过滤。调节血浆pH至7.15；加入平衡好的A-50凝胶搅拌吸附60min，吸附温度2℃；滤除凝胶。平衡液：0.01mol/L 枸橼酸钠，0.20mol/L氯化钠，pH 7.15，2℃。

加入1倍凝胶体积的洗涤液，搅拌洗涤2次，将洗涤液采用1μm微孔滤芯过滤后，与滤除凝胶后的血浆上清合并，得到处理后的血浆上清。洗涤液：0.01mol/L 枸橼酸钠，0.20mol/L氯化钠，pH 7.15，2℃。

2血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤

2.1血浆上清沉淀杂质蛋白

血浆上清首先升温至9℃，添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为100mmol/L，搅拌均匀，用0.1mol/L的盐酸调整血浆上清pH为7.00；降温至4℃，补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为200mmol/L，搅拌均匀，用0.1mol/L氢氧化钠调整血浆上清pH为7.50；降温至1℃，搅拌30min后静置60min。

2.2血浆深层过滤

选择PALL的 PEK1滤板。使用含有0.1%EDTA的水溶液对过滤材质进行清洗，用量为300L/m²。再用0.1%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗用量为300L/m²，冲洗完成后排干设备内的溶液，进行血浆过滤。

过滤后的血浆在进行柱层析的同时，使用0.2μm的滤芯进行在线的膜过滤。选用PALL的UECV型号的0.2μm双层膜滤芯。

3滤过液Capto Heparin 亲和层析

深层过滤后的滤过液，通过平衡好的Capto Heparin肝素亲和层析柱。用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净，用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ。血浆上样量控制为20个柱床体积。平衡液：含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠0.55mol/L，pH7.15；洗脱液：含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠2.0mol/L，pH7.15；平衡、上样和洗脱线流速300cm/h。柱再生：分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理。柱保存：20%乙醇溶液。

对Capto Heparin肝素亲和层析后获得的中间品进行检测，抗凝血酶Ⅲ的比活为9.21IU/mg，纯度为99.78%。

实施例4

离子交换层析去除S/D试剂

S/D灭活后的制品通过平衡好的Capto Q阴离子交换层析柱。用平衡液冲洗层析柱，洗涤残留的S/D试剂和杂蛋白。再用洗脱液将吸附的制品洗脱下来。平衡液：含磷酸氢二钠20mmol/L，pH7.15；洗脱液：含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠1.0mol/L，pH7.15；平衡、上样和洗脱线流速300cm/h。柱再生：分别用0.3mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理。柱保存：20%乙醇溶液。

由Capto Q离子交换层析进行处理的抗凝血酶Ⅲ制品，S/D试剂量及比活检测结果如表3。

表 3 CaptoQ层析前后制品中S/D试剂及比活检测结果

。

Claims

1.一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，步骤如下：（1）新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀，DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；（2）血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤；（3）滤过液Capto Heparin 亲和层析；（4）S/D试剂病毒灭活，Capto Q离子交换层析去除S/D试剂；（5）纳米膜过滤去除病毒，配制、冻干、干热。

2.根据权利要求1所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，所述的步骤（1）新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀， DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；具体的步骤如下：

血浆上清采用1-10μm的滤芯过滤，调节血浆pH至6.80-7.20；加入平衡好的DEAE Sephadex-A50凝胶搅拌吸附30-60分钟，吸附温度≤15℃；采用0.2-1μm微孔滤芯过滤，滤除凝胶获得吸附处理后的血浆上清；DEAE Sephadex A50干胶量为 1.0-2.0g/kg血浆；0.05-0.1mol/L 氯化钠溶液融胀≥8小时；平衡3-5次；再生用1.0～2.0mol/L氯化钠溶液处理，20%乙醇保存；再生次数不超过10次；所述的平衡液：0.015-0.025mol/L 枸橼酸钠，0.14-0.20mol/L氯化钠，pH 6.80-7.20，温度2-8℃；

加入1-2倍凝胶体积的洗涤液，搅拌洗涤1-3次，将洗涤液采用0.2-1μm微孔滤芯过滤后，与滤除凝胶后的血浆上清合并，得到处理后的血浆上清；所述的洗涤液：0.015-0.025mol/L 枸橼酸钠，0.14-0.20mol/L氯化钠，pH 6.80-7.20，温度2-8℃。

3.根据权利要求1所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，所述的步骤（2）血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤；具体步骤如下：

血浆上清沉淀杂质蛋白

将处理后的血浆上清首先升温至8-10℃，添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为60-100mmol/L，搅拌均匀，用0.1-0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为6.80-7.00；降温至4-6℃，补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为120-200mmol/L，搅拌均匀，用0.1-0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为7.40-7.50；降温至0-2℃，搅拌10-30min后静置30-60min；

深层过滤

所采用的过滤材质为药用级别纤维素滤板，可以为一种规格的单层滤板或几种规格的滤板串联叠加使用；使用含有0.1%-10%EDTA的溶液对过滤材质进行清洗，用量为100-300L/m²；再用0.1%-10%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗，并洗去残留的EDTA，用量为100-300L/m²；冲洗完成后排干设备内的溶液，用于血浆过滤；

4.根据权利要求1或2或3所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，步骤（3）滤过液Capto Heparin 亲和层析具体为：

深层过滤后的滤过液，通过装填有Capto Heparin的肝素亲和凝胶的层析柱进行固定床亲和层析，凝胶中结合在琼脂糖基架上的肝素配基将捕获血浆中的抗凝血酶Ⅲ；用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净，用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ；每次上样量控制为20-30个柱床体积；所述的平衡液：含磷酸氢二钠10-30mmol/L、氯化钠0.3-0.6mol/L，pH6.50-7.50；所述的洗脱液：含磷酸氢二钠10-30mmol/L、氯化钠1.5-2.5mol/L，pH6.50-7.50；平衡、上样和洗脱线流速180cm/h-300cm/h；柱再生：分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理；柱保存：20%乙醇溶液保存。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，所述的步骤（4）S/D试剂病毒灭活，Capto Q离子交换层析去除S/D试剂；具体步骤如下：

收集从Capto Heparin亲和层析柱上洗脱得到的制品，进行超滤、脱盐和浓缩，超滤膜孔径10KDa，超滤稀释液：磷酸氢二钠10-30mmol/L，pH6.5-7.5；超滤后制品电导率值不高于5mS/cm，制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml；超滤后的抗凝血酶Ⅲ溶液用精度不低于1μm滤芯过滤，进行S/D法病毒灭活处理，方法为：聚山梨酯80含量应为1.0±0.3%(g/ml)，磷酸三丁酯含量应为0.3±0.1%(g/ml)，制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml，灭活温度24±1℃，维持6小时；

S/D灭活后的制品通过平衡好的Capto Q阴离子交换层析柱，制品被吸附在层析柱上，而加入的S/D试剂流穿出层析柱，用平衡液冲洗层析柱，洗涤残留的S/D试剂，再用洗脱液将吸附的制品洗脱下来；所述的平衡液：含磷酸氢二钠10-30mmol/L，pH6.50-7.50；所述的洗脱液：含磷酸氢二钠10-30mmol/L、氯化钠0.5-1.5mol/L，pH6.50-7.50；平衡、上样和洗脱线流速180cm/h-300cm/h；柱再生：分别用0.3mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理；柱保存：20%乙醇溶液保存。

6.根据权利要求1或2或3所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，所述的步骤（5）纳米膜过滤去除病毒，配制、冻干、干热；具体步骤如下：

收集从离子交换层析柱上洗脱的制品，进行超滤脱盐和浓缩，超滤膜孔径10KDa，制品蛋白质含量10.0-20.0mg/ml，超滤后制品用0.1μm的滤膜进行预过滤，然后用20nm的纳米膜进行除病毒过滤；按出品规格配制、冻干、制品进行100℃，30min干热灭活病毒处理。

7.根据权利要求3所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，在血浆深层过滤中，所述的药用级别纤维素滤板型号选择如PALL的PEK1、PEKS、PDH4、PDE2、PDE1，3M的30SP、60SP、90SP、30LA、60 LA、90 LA型号的滤板，或者其组合。

8.根据权利要求1所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，经过该工艺制备的抗凝血酶Ⅲ，回收率可达40%以上，比活可达8-10IU/mg。