CN104672328A - 一种人抗凝血酶ⅲ的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,步骤为:将新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀获得血浆上清,上清液使用DEAE Sephadex-A50凝胶吸附处理;血浆上清杂质蛋白沉淀及血浆深层过滤;Capto Heparin 亲和层析;S/D病毒灭活及Capto Q离子交换层析去除S/D试剂;纳米膜过滤去除病毒,配制、冻干、干热。该工艺仅使用一步亲和层析制备抗凝血酶Ⅲ,回收率可达40%以上,比活可达8~10IU/mg。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品和血液制品生产技术领域,主要涉及血液制品生产中人抗凝血酶Ⅲ分离纯化方法。
背景技术
人抗凝血酶Ⅲ为α2球蛋白,分子量介于58000~65000Da之间,是人体内重要的抗凝物质,可以在没有肝素的条件下发挥抗凝血作用。抗凝血酶Ⅲ在健康成年人血浆中浓度为100~300μg/ml,人体内抗凝血酶Ⅲ水平低于正常水平的70%时,会使血栓形成的风险升高。人抗凝血酶Ⅲ产品适用于治疗抗凝血酶缺乏的病人,如先天遗传性及获得性抗凝血酶缺乏、弥散性血管内出血(DIC)、败血症、外伤、肿瘤、血栓性栓塞、并发性妊娠等。
1975年Thaler使用肝素亲和层析和聚乙二醇(PEG)沉淀进行血浆纯化、再加入硫酸铵沉淀除去PEG;但经由该方法纯化的抗凝血酶Ⅲ中还含有杂蛋白肝素辅助因子的活性。1981年Mckay用硫酸葡聚糖除去血浆中大部分与肝素结合的非特异性蛋白,再用肝素亲和层析分离抗凝血酶Ⅲ,但比活只能达到4IU/mg。上述两种工艺均以血浆为起始原料,通过加入蛋白沉淀剂去除血浆中的杂蛋白,操作步骤繁琐,杂蛋白去除效果不好,导致产品纯度低、比活低,而且影响血浆中其他蛋白的提取,不利于血浆的综合利用。
1989年Hoffman以Cohn FIV-1沉淀为原料,将沉淀复溶澄清后的上清液经过两次肝素亲和层析,抗凝血酶Ⅲ比活达到了6.4IU/mg。在国内现有已公开和授权的专利(CN201210544111X,CN2013100304464,CN2013106047238)生产工艺中,无论是以FⅣ为原料的工艺路线,还是以血浆为原料的工艺路线,均采用两次或两次以上肝素亲和层析制备抗凝血酶Ⅲ,以达到最终制品抗凝血酶Ⅲ的高纯度和高比活标准。由于上述工艺中均未对起始料液进行澄清预处理,因此必须使用两次亲和层析进行纯化,才能保证产品有较高的纯度和比活。但亲和层析的凝胶一般价格昂贵,生产成本高,并且增加一步亲和层析的同时也提高了亲和配基脱落的风险,给产品质量带来隐患。
发明内容
本发明的目的在于针对目前人抗凝血酶Ⅲ生产工艺中存在的不足,提供一种仅需一步亲和层析即可获得高比活抗凝血酶Ⅲ的工艺方法。
本发明所采用的技术方案如下:
(1)新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀, DEAE Sephadex-A50凝胶吸附;(2)血浆上清沉淀杂质蛋白,深层过滤;(3)滤过液Capto Heparin 亲和层析;(4)S/D试剂病毒灭活,Capto Q离子交换层析去除S/D试剂;(5)纳米膜过滤去除病毒,配制、冻干、干热。
本发明中所述的步骤(1)新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀, DEAE Sephadex-A50凝胶吸附;具体的步骤如下:
将新鲜冰冻人血浆融化混匀后,经连续流离心机去除血浆中的冷沉淀,得到离心后的血浆上清液;
血浆上清采用1~10μm的滤芯过滤,调节血浆pH至6.80~7.20;加入平衡好的DEAE Sephadex-A50凝胶搅拌吸附30~60分钟,吸附温度≤15℃;采用0.2~1μm微孔滤芯过滤,滤除凝胶获得吸附处理后的血浆上清;DEAE Sephadex-A50干胶量 1.0~2.0g/kg血浆;0.05~0.1mol/L 氯化钠溶液融胀≥8小时;平衡3~5次;再生用1.0~2.0mol/L氯化钠溶液处理,20%乙醇保存;再生次数不超过10次;所述的平衡液:0.015~0.025mol/L 枸橼酸钠,0.14~0.20mol/L氯化钠,pH 6.8~7.2,温度2~8℃;
加入1~2倍凝胶体积的洗涤液,搅拌洗涤1~3次,将洗涤液采用0.2~1μm微孔滤芯过滤后,与滤除凝胶后的血浆上清合并,得到处理后的血浆上清;洗涤液:0.015~0.025mol/L 枸橼酸钠,0.14~0.20mol/L氯化钠,pH 6.80~7.20,温度2~8℃。
本发明中所述的步骤(2)血浆上清沉淀杂质蛋白,深层过滤;具体步骤如下:
血浆上清沉淀杂质蛋白
将处理后的血浆上清首先升温至8~10℃,添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为60~100mmol/L,搅拌均匀,用0.1~0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为6.80~7.00;降温至4~6℃,补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为120~200mmol/L,搅拌均匀,用0.1~0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为7.40~7.50;降温至0~2℃,搅拌10~30min后静置30~60min;
深层过滤
所采用的过滤材质为药用级别纤维素滤板,可以为一种规格的单层滤板或几种规格的滤板串联叠加使用;滤板型号选择如PALL的PEK1、PEKS、PDH4、PDE2、PDE1,3M的30SP、60SP、90SP、30LA、60 LA、90 LA,以及类似效果的其他型号的滤板,或者其组合;
使用含有0.1%~10%EDTA的溶液对过滤材质进行清洗,用量为100~300L/m2;再用0.1%~10%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗,并洗去残留的EDTA,用量为100~300L/m2;冲洗完成后排干设备内的溶液,用于血浆过滤。
过滤后的血浆上清在进行柱层析的同时,使用0.2μm的滤芯进行在线的膜过滤。
其中,步骤(3)滤过液进行Capto Heparin 亲和层析具体为:
深层过滤后的滤过液,通过装填有Capto Heparin的肝素亲和凝胶的层析柱进行固定床亲和层析,凝胶中结合在琼脂糖基架上的肝素配基将捕获血浆中的抗凝血酶Ⅲ;用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净,用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ;每次上样量控制为20~30个柱床体积;所述的平衡液:含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠0.3~0.6mol/L,pH6.50~7.50;所述的洗脱液:含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠1.5~2.5mol/L,pH6.50~7.50;平衡、上样和洗脱线流速180cm/h~300cm/h;柱再生:分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理;柱保存:20%乙醇溶液保存。
本发明中所述的步骤(4)S/D试剂病毒灭活,Capto Q离子交换层析去除S/D试剂;具体步骤如下:
收集从Capto Heparin肝素层析柱上洗脱得到的制品,进行超滤、脱盐和浓缩,超滤膜孔径10KDa,所述的超滤稀释液:含磷酸氢二钠10~30mmol/L,pH6.50~7.50;超滤后制品电导率值不高于5mS/cm,制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml;超滤后的抗凝血酶Ⅲ溶液用精度不低于1μm滤芯过滤,进行S/D法病毒灭活处理,方法为:聚山梨酯80含量应为1.0±0.3%(g/ml),磷酸三丁酯含量应为0.3±0.1%(g/ml),制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml,灭活温度24±1℃,维持6小时;
S/D灭活后的制品通过平衡好的Capto Q阴离子交换层析柱,制品被吸附在层析柱上,而加入的S/D试剂流穿出层析柱,用平衡液冲洗层析柱,洗涤残留的S/D试剂,再用洗脱液将吸附的制品洗脱下来;平衡液:含磷酸氢二钠10~30mmol/L,pH6.50~7.50;洗脱液:含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠0.4~1.0mol/L,pH6.50~7.50;平衡、上样和洗脱线流速180cm/h~300cm/h;柱再生:分别用0.3mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理;柱保存:20%乙醇溶液或0.01mol/L NaOH保存。
本发明所述的步骤(5)纳米膜过滤去除病毒,配制、冻干、干热;具体步骤如下:
收集从离子交换层析柱上洗脱的制品,进行超滤脱盐和浓缩,超滤膜孔径10KDa,制品蛋白质含量10.0~20.0mg/ml,超滤后制品用0.1μm的滤膜进行预过滤,然后用20nm的纳米膜进行除病毒过滤;按出品规格配制、冻干、制品进行100℃,30min干热灭活病毒处理。
本发明的有益效果是:
(1)以DEAE Sephadex-A50凝胶吸附后的血浆为原料,不影响血浆生产线中冷沉淀和人凝血酶原复合物的生产,也不影响后续人白和免疫球蛋白等其他产品的生产。并且DEAE Sephadex-A50凝胶吸附后的血浆中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子的含量极低,可避免肝素亲和凝胶对上述凝血因子的非特异性吸附,提高目的蛋白抗凝血酶Ⅲ的纯度和凝胶的载量。
(2)血浆澄清处理不使用聚乙二醇(PEG)、硫酸铵、硫酸葡聚糖等蛋白沉淀剂,不引入外源性杂质。通过调整盐浓度、pH值、温度等条件,再经过深层过滤和0.2μm的膜过滤,就可以去除血浆中大部分与肝素亲和层析凝胶结合的杂质蛋白,使血浆料液达到固定床柱层析所要求的接近0.2μm的过滤精度和澄清度,不仅能有效提高上样过程中的线速度,还可进一步提升产品的比活和凝胶载量,同时可进一步实现对凝胶填料的保护,确保昂贵的Capto Heparin肝素亲和凝胶的重复使用次数达到200次以上。
(3)血浆经过去除冷沉淀、DEAE Sephadex-A50凝胶吸附、杂质蛋白沉淀及深层过滤等澄清处理后,仅需一步Capto Heparin凝胶肝素亲和层析,即可实现洗脱液中抗凝血酶Ⅲ比活达到8~10IU/mg,纯度接近100%。
(4)Capto Q凝胶用于去除抗凝血酶Ⅲ中间品中的S/D试剂。该凝胶载量大,处理方便,操作简单,且单步回收率达95%以上,不影响中间品的纯度和比活。
(5)经过该工艺制备的抗凝血酶Ⅲ成品,总回收率可达40%以上,比活可达8~10IU/mg,纯度接近100%。
(6)工艺过程中加入S/D试剂、纳米膜过滤和干热三种不同机制的病毒灭活/去除步骤,可以充分灭活/去除制品中可能出现的脂包膜和非脂包膜病毒,确保了制品的安全性。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案,但是本发明并不局限于此。
实施例1
1新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀, DEAE Sephadex-A50凝胶吸附;
1.1血浆去除冷沉淀
新鲜冰冻血浆经过投料、融浆、离心分离冷沉淀,收集离心后的血浆。过程中血浆温度不超过4℃,离心机出液速度不超过2L/min。
1.2血浆DEAE Sephadex-A50凝胶吸附
去除冷沉淀的血浆采用1μm的滤芯过滤。调节血浆pH至7.00;加入平衡好的A-50凝胶搅拌吸附45min,吸附温度4℃;滤除凝胶。平衡液:0.01mol/L 枸橼酸钠,0.20mol/L氯化钠,pH 7.00,4℃。
加入1倍凝胶体积的洗涤液,搅拌洗涤2次,将洗涤液采用1μm微孔滤芯过滤后,与滤除凝胶后的血浆上清合并,得到处理后的血浆上清。洗涤液:0.01mol/L 枸橼酸钠,0.20mol/L氯化钠,pH 7.00,4℃。
2血浆上清沉淀杂质蛋白,深层过滤
2.1血浆上清沉淀杂质蛋白
血浆上清首先升温至10℃,添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为65mmol/L,搅拌均匀,用0.3mol/L的盐酸调整血浆上清pH为6.80;降温至5℃,补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为200mmol/L,搅拌均匀,用0.3mol/L氢氧化钠调整血浆上清pH为7.40;降温至1℃,搅拌30min后静置60min。
2.2血浆深层过滤
选择PALL的 PEK1滤板。使用含有1%EDTA的水溶液对过滤材质进行清洗,用量为100L/m2。再用1%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗用量为100L/m2,冲洗完成后排干设备内的溶液,进行血浆过滤。
过滤后的血浆在进行柱层析的同时,使用PALL的 EKV型号的0.2μm的双层膜滤芯进行在线的膜过滤。
3滤过液Capto Heparin 亲和层析
深层过滤后的滤过液,通过平衡好的Capto Heparin肝素亲和层析柱。用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净,用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ。血浆上样量控制为25个柱床体积。平衡液:含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠0.5mol/L,pH7.00;洗脱液:含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠2.0mol/L,pH7.00;平衡、上样和洗脱线流速240cm/h。柱再生:分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理。柱保存:20%乙醇溶液。
4S/D试剂病毒灭活,Capto Q离子交换层析去除S/D试剂
4.1超滤脱盐
收集从层析柱上洗脱得到的制品,进行超滤(超滤膜孔径10KDa)脱盐和浓缩。超滤稀释液:含磷酸氢二钠10mmol/L pH7.00。超滤后制品电导率值不高于4mS/cm,制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml。
4.2 S/D法病毒灭活
超滤后的抗凝血酶Ⅲ溶液用精度不低于1μm滤芯过滤后进行S/D法病毒灭活处理。方法为:聚山梨酯80含量应为1.0%(g/ml),磷酸三丁酯含量应为0.3%(g/ml),制品蛋白质浓度20.0mg/ml,灭活温度24℃,维持6小时。
4.3Capto Q离子交换层析
S/D灭活后的制品通过平衡好的Capto Q阴离子交换层析柱;制品被吸附在层析柱上,而加入的S/D试剂和少量杂蛋白流穿出层析柱。用平衡液冲洗层析柱,洗涤残留的S/D试剂和杂蛋白。再用洗脱液将吸附的制品洗脱下来。平衡液:含磷酸氢二钠20mmol/L,pH7.00;洗脱液:含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠0.8mol/L,pH7.00;平衡、上样和洗脱线流速240cm/h。柱再生:分别用0.3mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理。柱保存:20%乙醇溶液。
5灭活病毒,配制,冻干,干热
5.1超滤、脱盐
收集从离子交换层析柱上洗脱的制品,进行超滤(超滤膜孔径10KDa)脱盐和浓缩,控制制品蛋白质含量10.0mg/ml。
5.2病毒去除(纳米膜过滤)
制品蛋用0.1μm的滤膜进行预过滤,然后用20nm的纳米膜进行除病毒过滤。纳米膜在使用前、后都应进行完整性测试。
5.3半成品制备、除菌、分装、冻干,干热灭活,按出品规格配制、冻干、制品进行100℃,30min干热灭活病毒处理。
生产工艺中各阶段的抗凝血酶Ⅲ回收率见表1 。
表1 生产工艺中各阶段的抗凝血酶Ⅲ回收率
生产工艺中各阶段的抗凝血酶Ⅲ比活见表2。
表2 生产工艺中各阶段的抗凝血酶Ⅲ比活
实施例2
血浆深层过滤
过滤材质选择3M的30LA、60LA组合。使用含有5%EDTA的水溶液对过滤材质进行清洗,用量为200L/m2。再用5%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗用量为200L/m2。其中首先使用50L/m2的枸橼酸钠溶液冲洗滤板,再用100L/m2的枸橼酸钠溶液将前述溶液冲出,并循环冲洗30min,最后使用50L/m2的枸橼酸钠溶液将前述溶液冲出。冲洗完成后排干设备内的溶液,进行血浆过滤。
过滤后的血浆在进行柱层析的同时,使用3M的PDA型号0.2μm的双层膜滤芯进行在线的膜过滤。
实施例3
1新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀, DEAE Sephadex-A50凝胶吸附;
1.1血浆去除冷沉淀
新鲜冰冻血浆经过投料、融浆、离心分离冷沉淀,收集离心后的血浆。过程中血浆温度不超过4℃,离心机出液速度不超过1L/min。
1.2血浆DEAE Sephadex A-50吸附
去除冷沉淀的血浆采用1μm的滤芯过滤。调节血浆pH至7.15;加入平衡好的A-50凝胶搅拌吸附60min,吸附温度2℃;滤除凝胶。平衡液:0.01mol/L 枸橼酸钠,0.20mol/L氯化钠,pH 7.15,2℃。
加入1倍凝胶体积的洗涤液,搅拌洗涤2次,将洗涤液采用1μm微孔滤芯过滤后,与滤除凝胶后的血浆上清合并,得到处理后的血浆上清。洗涤液:0.01mol/L 枸橼酸钠,0.20mol/L氯化钠,pH 7.15,2℃。
2血浆上清沉淀杂质蛋白,深层过滤
2.1血浆上清沉淀杂质蛋白
血浆上清首先升温至9℃,添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为100mmol/L,搅拌均匀,用0.1mol/L的盐酸调整血浆上清pH为7.00;降温至4℃,补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为200mmol/L,搅拌均匀,用0.1mol/L氢氧化钠调整血浆上清pH为7.50;降温至1℃,搅拌30min后静置60min。
2.2血浆深层过滤
选择PALL的 PEK1滤板。使用含有0.1%EDTA的水溶液对过滤材质进行清洗,用量为300L/m2。再用0.1%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗用量为300L/m2,冲洗完成后排干设备内的溶液,进行血浆过滤。
过滤后的血浆在进行柱层析的同时,使用0.2μm的滤芯进行在线的膜过滤。选用PALL的UECV型号的0.2μm双层膜滤芯。
3滤过液Capto Heparin 亲和层析
深层过滤后的滤过液,通过平衡好的Capto Heparin肝素亲和层析柱。用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净,用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ。血浆上样量控制为20个柱床体积。平衡液:含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠0.55mol/L,pH7.15;洗脱液:含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠2.0mol/L,pH7.15;平衡、上样和洗脱线流速300cm/h。柱再生:分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理。柱保存:20%乙醇溶液。
对Capto Heparin肝素亲和层析后获得的中间品进行检测,抗凝血酶Ⅲ的比活为9.21IU/mg,纯度为99.78%。
实施例4
离子交换层析去除S/D试剂
S/D灭活后的制品通过平衡好的Capto Q阴离子交换层析柱。用平衡液冲洗层析柱,洗涤残留的S/D试剂和杂蛋白。再用洗脱液将吸附的制品洗脱下来。平衡液:含磷酸氢二钠20mmol/L,pH7.15;洗脱液:含磷酸氢二钠20mmol/L、氯化钠1.0mol/L,pH7.15;平衡、上样和洗脱线流速300cm/h。柱再生:分别用0.3mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理。柱保存:20%乙醇溶液。
由Capto Q离子交换层析进行处理的抗凝血酶Ⅲ制品,S/D试剂量及比活检测结果如表3。
表 3 CaptoQ层析前后制品中S/D试剂及比活检测结果
。
Claims (8)
1.一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,步骤如下:(1)新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀,DEAE Sephadex-A50凝胶吸附;(2)血浆上清沉淀杂质蛋白,深层过滤;(3)滤过液Capto Heparin 亲和层析;(4)S/D试剂病毒灭活,Capto Q离子交换层析去除S/D试剂;(5)纳米膜过滤去除病毒,配制、冻干、干热。
2.根据权利要求1所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,其特征在于,所述的步骤(1)新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀, DEAE Sephadex-A50凝胶吸附;具体的步骤如下:
将新鲜冰冻人血浆融化混匀后,经连续流离心机去除血浆中的冷沉淀,得到离心后的血浆上清液;
血浆上清采用1-10μm的滤芯过滤,调节血浆pH至6.80-7.20;加入平衡好的DEAE Sephadex-A50凝胶搅拌吸附30-60分钟,吸附温度≤15℃;采用0.2-1μm微孔滤芯过滤,滤除凝胶获得吸附处理后的血浆上清;DEAE Sephadex A50干胶量为 1.0-2.0g/kg血浆;0.05-0.1mol/L 氯化钠溶液融胀≥8小时;平衡3-5次;再生用1.0~2.0mol/L氯化钠溶液处理,20%乙醇保存;再生次数不超过10次;所述的平衡液:0.015-0.025mol/L 枸橼酸钠,0.14-0.20mol/L氯化钠,pH 6.80-7.20,温度2-8℃;
加入1-2倍凝胶体积的洗涤液,搅拌洗涤1-3次,将洗涤液采用0.2-1μm微孔滤芯过滤后,与滤除凝胶后的血浆上清合并,得到处理后的血浆上清;所述的洗涤液:0.015-0.025mol/L 枸橼酸钠,0.14-0.20mol/L氯化钠,pH 6.80-7.20,温度2-8℃。
3.根据权利要求1所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,其特征在于,所述的步骤(2)血浆上清沉淀杂质蛋白,深层过滤;具体步骤如下:
血浆上清沉淀杂质蛋白
将处理后的血浆上清首先升温至8-10℃,添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为60-100mmol/L,搅拌均匀,用0.1-0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为6.80-7.00;降温至4-6℃,补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为120-200mmol/L,搅拌均匀,用0.1-0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为7.40-7.50;降温至0-2℃,搅拌10-30min后静置30-60min;
深层过滤
所采用的过滤材质为药用级别纤维素滤板,可以为一种规格的单层滤板或几种规格的滤板串联叠加使用;使用含有0.1%-10%EDTA的溶液对过滤材质进行清洗,用量为100-300L/m2;再用0.1%-10%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗,并洗去残留的EDTA,用量为100-300L/m2;冲洗完成后排干设备内的溶液,用于血浆过滤;
过滤后的血浆上清在进行柱层析的同时,使用0.2μm的滤芯进行在线的膜过滤。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,其特征在于,步骤(3)滤过液Capto Heparin 亲和层析具体为:
深层过滤后的滤过液,通过装填有Capto Heparin的肝素亲和凝胶的层析柱进行固定床亲和层析,凝胶中结合在琼脂糖基架上的肝素配基将捕获血浆中的抗凝血酶Ⅲ;用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净,用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ;每次上样量控制为20-30个柱床体积;所述的平衡液:含磷酸氢二钠10-30mmol/L、氯化钠0.3-0.6mol/L,pH6.50-7.50;所述的洗脱液:含磷酸氢二钠10-30mmol/L、氯化钠1.5-2.5mol/L,pH6.50-7.50;平衡、上样和洗脱线流速180cm/h-300cm/h;柱再生:分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理;柱保存:20%乙醇溶液保存。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,其特征在于,所述的步骤(4)S/D试剂病毒灭活,Capto Q离子交换层析去除S/D试剂;具体步骤如下:
收集从Capto Heparin亲和层析柱上洗脱得到的制品,进行超滤、脱盐和浓缩,超滤膜孔径10KDa,超滤稀释液:磷酸氢二钠10-30mmol/L,pH6.5-7.5;超滤后制品电导率值不高于5mS/cm,制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml;超滤后的抗凝血酶Ⅲ溶液用精度不低于1μm滤芯过滤,进行S/D法病毒灭活处理,方法为:聚山梨酯80含量应为1.0±0.3%(g/ml),磷酸三丁酯含量应为0.3±0.1%(g/ml),制品蛋白质浓度≤20.0mg/ml,灭活温度24±1℃,维持6小时;
S/D灭活后的制品通过平衡好的Capto Q阴离子交换层析柱,制品被吸附在层析柱上,而加入的S/D试剂流穿出层析柱,用平衡液冲洗层析柱,洗涤残留的S/D试剂,再用洗脱液将吸附的制品洗脱下来;所述的平衡液:含磷酸氢二钠10-30mmol/L,pH6.50-7.50;所述的洗脱液:含磷酸氢二钠10-30mmol/L、氯化钠0.5-1.5mol/L,pH6.50-7.50;平衡、上样和洗脱线流速180cm/h-300cm/h;柱再生:分别用0.3mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理;柱保存:20%乙醇溶液保存。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,其特征在于,所述的步骤(5)纳米膜过滤去除病毒,配制、冻干、干热;具体步骤如下:
收集从离子交换层析柱上洗脱的制品,进行超滤脱盐和浓缩,超滤膜孔径10KDa,制品蛋白质含量10.0-20.0mg/ml,超滤后制品用0.1μm的滤膜进行预过滤,然后用20nm的纳米膜进行除病毒过滤;按出品规格配制、冻干、制品进行100℃,30min干热灭活病毒处理。
7.根据权利要求3所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,其特征在于,在血浆深层过滤中,所述的药用级别纤维素滤板型号选择如PALL的PEK1、PEKS、PDH4、PDE2、PDE1,3M的30SP、60SP、90SP、30LA、60 LA、90 LA型号的滤板,或者其组合。
8.根据权利要求1所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法,其特征在于,经过该工艺制备的抗凝血酶Ⅲ,回收率可达40%以上,比活可达8-10IU/mg。
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